JPH0517838B2 - - Google Patents
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- JPH0517838B2 JPH0517838B2 JP59210238A JP21023884A JPH0517838B2 JP H0517838 B2 JPH0517838 B2 JP H0517838B2 JP 59210238 A JP59210238 A JP 59210238A JP 21023884 A JP21023884 A JP 21023884A JP H0517838 B2 JPH0517838 B2 JP H0517838B2
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- JP
- Japan
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- reagent
- glucose
- g6pdh
- glck
- reagents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Immunology (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、生体液中のクレアチンキナーゼ（以
下CKと略記する。）の定量用試薬に関するもので
ある。
下CKと略記する。）の定量用試薬に関するもので
ある。
（従来の技術）
CKは、全身の筋組織及び脳に存在し、臨床検
査の領域においてCK活性の測定は、筋疾患、神
経性疾患、中枢神経系疾患、精神病、心疾患など
の診断に日常的に測定されている重要な項目の一
つである。
査の領域においてCK活性の測定は、筋疾患、神
経性疾患、中枢神経系疾患、精神病、心疾患など
の診断に日常的に測定されている重要な項目の一
つである。
CKは、(1)式の左右両方向の反応を触媒する酵
素である。
素である。
CP＋ADPCK
Ｃ＋ATP (1)
（略号は、CP：クレアチンリン酸、Ｃ：クレア
チン、ADP：アデノシン二リン酸、ATP：アデ
ノシン二リン酸である。） 従来から、種々のCK測定法が提案されてきた。
その一つは、左方向の活性を測定するという方法
で、これらの中にはCPの加水分解で生ずる無
機リン酸を測定する方法、ADPをピルビン量
酸キナーゼ（以下PKと略記する。）と乳酸脱水素
酵素（以下LDHと略記する。）の作用で還元型β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHと略記する。）に導き、吸収減少として測
定する方法、ADPをPKでピルピン酸に導き、
次いで、２，４−ジニトロフエニルヒドラジンと
の反応で生成したヒドラゾンを測定する方法など
がある。しかしながら、これらの方法はいずれも
感度が低いため、あるいは発色が不安定なため
に、近年ほとんど使用されていない。また、右方
向の活性を測定する方法には、生成したＣを色
素と反応させて比色する、あるいは螢光を測定す
る方法、ルシフエラーゼを用いる方法（特開昭
51−41597号公報、特開昭55−120796号公報、特
開昭56−26200号公報、特開昭57−105199号公報
参照。）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下
PGKと略記する。）とグリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（以下GAPDHと略記す
る。）を用いる方法（特公昭59−34119号公報、特
開昭56−155000号公報参照。）、ヘキソキナーゼ
（以下HKと略記する。）とグルコース−６−リン
酸脱水素酵素（以下G6PDHと略記する。）を用
いる方法などがある。これらのうち、の比色法
あるいは螢光法は測定値の信頼性が劣ること、
のルシフエラーゼ法は高価なルシフエラーゼを使
用しなければならなく、また測定装置が特殊なも
のとなること、のPGK／GAPDH法はPK／
LDH法と同じく吸収減少系であり、PK／LDH
法と同様の欠点を有し、しかもPK、LDHよりも
高価なPGK、GAPDHを使用しなければならな
いこと、などからいずれも実用に供するには十分
とはいえない。ところが、のHK／G6PDH法
は原理的に最も優れ、感度、再現性も良いこと、
及び多数検体処理も可能なことから最も多用され
ている。その測定原理は、 CP＋ADPCK ―→ Ｃ＋ATP (1) ATD＋グルコース＋HK ―→ ADP＋Ｇ−６−Ｐ (2) Ｇ−６−Ｐ＋NAD(P)G6PDH ―――――→ ６−PGA ＋NAD(P)Ｈ (3) （上記略号のうち、Ｇ−６−Ｐはグルコース−６
−リン酸、NAD(P)はβ−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（リン酸）、NAD(P)Ｈは還元型
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リ
ン酸）、６−PGAは６−ホスホグルコンン酸であ
る。）で示される。このHK／G6PDH法において
は、HKが生体液中に存在するグルコース以外の
糖、たとえばフラクトース、マンノースなどにも
作用することから測定値に正の誤差をもたらすこ
とがある。しかも、アルブミンなどの安定化剤添
加にもかかわらず、この方法では溶液状態での室
温保存安定性が乏しく、液状化してからの試薬の
室温（18〜35℃）での寿命は非常に短く、しかも
PH6.5〜7.0のPH領域で試薬を２つの容器に分け
る、謂る２試薬系にしてもそれほど安定性は向上
せず、臨床検査の分野での長期使用に耐えるもの
ではなかつた。このようなHK／G6PDH法の欠
点を改良すべく、HKの代わりにグルコースに極
めて特異性の高い耐熱性のグルコキナーゼ（以下
Glckと略記する。）を使用する１試薬系Glck／
G6PDH法が提案され、CK定量用試薬の試薬溶
解後の室温保存安定性も改善されている。（特開
昭56−169598号公報及び特開昭59−151899号公報
参照。） （発明が解決しようとする問題点） ところが、このGlck／G6PDH法は、一応上記
HK／G6PDH法の欠点を克服したかに思われた
が、その安定性はいまだ十分とはいえず、しかも
長期間安定に保つためには比較的多量の酵素が必
要であつた。しかも、近年、臨床検査の分野にお
いては、心筋梗塞など緊急に測定しなければなら
ない病態の増加とともに、生体液中のCK活性を
より正確、かつ迅速に測定できる試薬の開発が強
く要望されるようになつた。すなわち、測定誤剤
を極力少なくするために測定の際、試薬の調整作
業を必要としない、かつ緊急時いつでも測定でき
るような溶液状態での長期安定性に富む試薬が望
まれている。
チン、ADP：アデノシン二リン酸、ATP：アデ
ノシン二リン酸である。） 従来から、種々のCK測定法が提案されてきた。
その一つは、左方向の活性を測定するという方法
で、これらの中にはCPの加水分解で生ずる無
機リン酸を測定する方法、ADPをピルビン量
酸キナーゼ（以下PKと略記する。）と乳酸脱水素
酵素（以下LDHと略記する。）の作用で還元型β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHと略記する。）に導き、吸収減少として測
定する方法、ADPをPKでピルピン酸に導き、
次いで、２，４−ジニトロフエニルヒドラジンと
の反応で生成したヒドラゾンを測定する方法など
がある。しかしながら、これらの方法はいずれも
感度が低いため、あるいは発色が不安定なため
に、近年ほとんど使用されていない。また、右方
向の活性を測定する方法には、生成したＣを色
素と反応させて比色する、あるいは螢光を測定す
る方法、ルシフエラーゼを用いる方法（特開昭
51−41597号公報、特開昭55−120796号公報、特
開昭56−26200号公報、特開昭57−105199号公報
参照。）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下
PGKと略記する。）とグリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（以下GAPDHと略記す
る。）を用いる方法（特公昭59−34119号公報、特
開昭56−155000号公報参照。）、ヘキソキナーゼ
（以下HKと略記する。）とグルコース−６−リン
酸脱水素酵素（以下G6PDHと略記する。）を用
いる方法などがある。これらのうち、の比色法
あるいは螢光法は測定値の信頼性が劣ること、
のルシフエラーゼ法は高価なルシフエラーゼを使
用しなければならなく、また測定装置が特殊なも
のとなること、のPGK／GAPDH法はPK／
LDH法と同じく吸収減少系であり、PK／LDH
法と同様の欠点を有し、しかもPK、LDHよりも
高価なPGK、GAPDHを使用しなければならな
いこと、などからいずれも実用に供するには十分
とはいえない。ところが、のHK／G6PDH法
は原理的に最も優れ、感度、再現性も良いこと、
及び多数検体処理も可能なことから最も多用され
ている。その測定原理は、 CP＋ADPCK ―→ Ｃ＋ATP (1) ATD＋グルコース＋HK ―→ ADP＋Ｇ−６−Ｐ (2) Ｇ−６−Ｐ＋NAD(P)G6PDH ―――――→ ６−PGA ＋NAD(P)Ｈ (3) （上記略号のうち、Ｇ−６−Ｐはグルコース−６
−リン酸、NAD(P)はβ−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（リン酸）、NAD(P)Ｈは還元型
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リ
ン酸）、６−PGAは６−ホスホグルコンン酸であ
る。）で示される。このHK／G6PDH法において
は、HKが生体液中に存在するグルコース以外の
糖、たとえばフラクトース、マンノースなどにも
作用することから測定値に正の誤差をもたらすこ
とがある。しかも、アルブミンなどの安定化剤添
加にもかかわらず、この方法では溶液状態での室
温保存安定性が乏しく、液状化してからの試薬の
室温（18〜35℃）での寿命は非常に短く、しかも
PH6.5〜7.0のPH領域で試薬を２つの容器に分け
る、謂る２試薬系にしてもそれほど安定性は向上
せず、臨床検査の分野での長期使用に耐えるもの
ではなかつた。このようなHK／G6PDH法の欠
点を改良すべく、HKの代わりにグルコースに極
めて特異性の高い耐熱性のグルコキナーゼ（以下
Glckと略記する。）を使用する１試薬系Glck／
G6PDH法が提案され、CK定量用試薬の試薬溶
解後の室温保存安定性も改善されている。（特開
昭56−169598号公報及び特開昭59−151899号公報
参照。） （発明が解決しようとする問題点） ところが、このGlck／G6PDH法は、一応上記
HK／G6PDH法の欠点を克服したかに思われた
が、その安定性はいまだ十分とはいえず、しかも
長期間安定に保つためには比較的多量の酵素が必
要であつた。しかも、近年、臨床検査の分野にお
いては、心筋梗塞など緊急に測定しなければなら
ない病態の増加とともに、生体液中のCK活性を
より正確、かつ迅速に測定できる試薬の開発が強
く要望されるようになつた。すなわち、測定誤剤
を極力少なくするために測定の際、試薬の調整作
業を必要としない、かつ緊急時いつでも測定でき
るような溶液状態での長期安定性に富む試薬が望
まれている。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、このような要求を満足すべく鋭
意研究を重ねた結果、Glck、G6PDH、NAD(P)、
ADP、グルコースを主成分とする第一試薬と、
CPを主成分とする第二試薬とに分け、しかも第
二試薬のPHを特定の範囲に管理することにより、
両試薬の調製後の安定性が飛躍的に向上すること
を見い出し本発明を完成した。さらに、引続き鋭
意研究した結果、上記第一試薬中のGlck及びグ
ルコースを上記第二試薬に含めると、さらに安定
性が向上することを見い出し、本発明を完成し
た。
意研究を重ねた結果、Glck、G6PDH、NAD(P)、
ADP、グルコースを主成分とする第一試薬と、
CPを主成分とする第二試薬とに分け、しかも第
二試薬のPHを特定の範囲に管理することにより、
両試薬の調製後の安定性が飛躍的に向上すること
を見い出し本発明を完成した。さらに、引続き鋭
意研究した結果、上記第一試薬中のGlck及びグ
ルコースを上記第二試薬に含めると、さらに安定
性が向上することを見い出し、本発明を完成し
た。
すなわち、本発明はGlck、G6PDH、NAD(P)、
ADP、グルコースを主成分とする第一試薬と、
CPを主成分とする第二試薬とからなり、第二試
薬のPHが7.5〜10であることを特徴とするCK定量
用試薬及びG6PDH、NAD(P)、ADPを主成分と
する第一試薬と、Glck、CP、グルコースを主成
分とする第二試薬とからなり、第二試薬のPHが
7.5〜10であることを特徴とするCK定量用試薬で
ある。
ADP、グルコースを主成分とする第一試薬と、
CPを主成分とする第二試薬とからなり、第二試
薬のPHが7.5〜10であることを特徴とするCK定量
用試薬及びG6PDH、NAD(P)、ADPを主成分と
する第一試薬と、Glck、CP、グルコースを主成
分とする第二試薬とからなり、第二試薬のPHが
7.5〜10であることを特徴とするCK定量用試薬で
ある。
本発明に用いられるGlckとしては、その給源
が限定されるものではなく、エーロバクター エ
ー ロゲネスなどの微生物由来のもの、動物由来
のものなどの各種のものを使用することができる
が、なかでも最適生育温度が50℃ないし85℃であ
る微生物の産性するものが好ましい。そのような
微生物としては、例えばバチルス ステアロサー
モフイルス、バチルス、サーモプロテオリテイカ
ス、バチルス アシドカルダリウスなどのバチル
ス属、サーモアクチノマイセス属、サーマス属、
サーモミクロビウム属、などの微生物があげられ
る。これらの中でも特に好ましい微生物として
は、バチルス ステアロサーモフイルスがあげら
れ、その具体例としてはATCC7933、7954、
8005、10194、12980、NCA1503、UK563株（微
工研菌寄第7275号、FERM Ｐ−7275、昭和58年
９月25日寄託）などがある。
が限定されるものではなく、エーロバクター エ
ー ロゲネスなどの微生物由来のもの、動物由来
のものなどの各種のものを使用することができる
が、なかでも最適生育温度が50℃ないし85℃であ
る微生物の産性するものが好ましい。そのような
微生物としては、例えばバチルス ステアロサー
モフイルス、バチルス、サーモプロテオリテイカ
ス、バチルス アシドカルダリウスなどのバチル
ス属、サーモアクチノマイセス属、サーマス属、
サーモミクロビウム属、などの微生物があげられ
る。これらの中でも特に好ましい微生物として
は、バチルス ステアロサーモフイルスがあげら
れ、その具体例としてはATCC7933、7954、
8005、10194、12980、NCA1503、UK563株（微
工研菌寄第7275号、FERM Ｐ−7275、昭和58年
９月25日寄託）などがある。
G6PDHについても、Glckと同様に、その給源
が限定されるものではないが、好ましくは補酵素
としてNADPだけでなく、NADにも作用する
G6PDH（例えばロイコノストツクメセンテロイ
デス、シユードモナス フルオレツセンス由来な
ど）、さらに好ましくはNAD、NADP共に作用
でき、かつ安定性、保存性に富む好熱性細菌由来
のG6PDHが望ましい。
が限定されるものではないが、好ましくは補酵素
としてNADPだけでなく、NADにも作用する
G6PDH（例えばロイコノストツクメセンテロイ
デス、シユードモナス フルオレツセンス由来な
ど）、さらに好ましくはNAD、NADP共に作用
でき、かつ安定性、保存性に富む好熱性細菌由来
のG6PDHが望ましい。
また、これらGlckやG6PDHを製造する場合
は、抽出、精製法などについて、公知技術を適宜
組み合わせればよい。
は、抽出、精製法などについて、公知技術を適宜
組み合わせればよい。
本発明のCK定量用試薬は、CKに酵素反応を行
わせ、UV吸収を測定するのに必要なNAD(P)Ｈ
の生成に導く酵素反応に係る試薬を第一試薬と第
二試薬に分けることが必要である。
わせ、UV吸収を測定するのに必要なNAD(P)Ｈ
の生成に導く酵素反応に係る試薬を第一試薬と第
二試薬に分けることが必要である。
まず、本発明の第一の態様について説明する
と、第一試薬はGlck、G6PDH、NAD(P)、ADP、
グルコースなどが主成分であり、その他に通常、
促進剤、賦活剤などの添加剤なるものを含ませる
ことができる。添加剤としては、酢酸マグネシウ
ム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩類、
Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、２−ア
ミノエチルイソチオウロニウム臭化物、チオグリ
コール酸、システイン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトール、ジチオエリスリトールなど
のチオール化合物、又は防腐剤としてのアジ化ナ
トリウムなど公知のものを支障なく使用すること
ができる。さらに、安定化剤として可溶性澱粉、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
などの多糖類とその誘導体、アルブミン、γ−グ
ロブリンなどの蛋白質、ポリビニルアルコール、
ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子化合
物を適宜使用することもできる。
と、第一試薬はGlck、G6PDH、NAD(P)、ADP、
グルコースなどが主成分であり、その他に通常、
促進剤、賦活剤などの添加剤なるものを含ませる
ことができる。添加剤としては、酢酸マグネシウ
ム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩類、
Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、２−ア
ミノエチルイソチオウロニウム臭化物、チオグリ
コール酸、システイン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトール、ジチオエリスリトールなど
のチオール化合物、又は防腐剤としてのアジ化ナ
トリウムなど公知のものを支障なく使用すること
ができる。さらに、安定化剤として可溶性澱粉、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
などの多糖類とその誘導体、アルブミン、γ−グ
ロブリンなどの蛋白質、ポリビニルアルコール、
ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子化合
物を適宜使用することもできる。
また、第二試薬はCPを主成分とするものであ
り、この他に防腐剤としてアジ化ナトリウムなど
公知の物質を支障なく使用することができる。
り、この他に防腐剤としてアジ化ナトリウムなど
公知の物質を支障なく使用することができる。
次に、本発明の第二の態様について説明する
と、第一試薬はG6PDH、NAD(P)、ADPなどが
主成分であり、その他に通常促進剤、賦活剤など
の添加剤なるものを含ませることができる。添加
剤としては、前記した化合物がすべて利用でき
る。さらに、安定化剤も前記した化合物がすべて
利用できる。
と、第一試薬はG6PDH、NAD(P)、ADPなどが
主成分であり、その他に通常促進剤、賦活剤など
の添加剤なるものを含ませることができる。添加
剤としては、前記した化合物がすべて利用でき
る。さらに、安定化剤も前記した化合物がすべて
利用できる。
また、第二試薬はGlck、CP、グルコースなど
を主成分とするものであり、その他に通常促進
剤、賦活剤などの添加剤なるものを含ませること
ができる。添加剤としては、酢酸マグネシウム、
硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩類、Ｎ−
アセチルシステイン、グルタチオン、２−アミノ
エチルイソチオウロニウム臭化物、チオグリコー
ル酸、システイン、メルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、ジチオエリスリトールなどのチ
オール化合物、また防腐剤としてのアジ化ナトリ
ウムなどの公知ものを支障なく使用することがで
きる。さらに、安定化剤として可溶性澱粉、メチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど
の多糖類とその誘導体、アルブミン、γ−グロブ
リンなどの蛋白質、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコールなどの水溶性高分子化合物を
適宜使用することもできる。
を主成分とするものであり、その他に通常促進
剤、賦活剤などの添加剤なるものを含ませること
ができる。添加剤としては、酢酸マグネシウム、
硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩類、Ｎ−
アセチルシステイン、グルタチオン、２−アミノ
エチルイソチオウロニウム臭化物、チオグリコー
ル酸、システイン、メルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、ジチオエリスリトールなどのチ
オール化合物、また防腐剤としてのアジ化ナトリ
ウムなどの公知ものを支障なく使用することがで
きる。さらに、安定化剤として可溶性澱粉、メチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど
の多糖類とその誘導体、アルブミン、γ−グロブ
リンなどの蛋白質、ポリビニルアルコール、ポリ
エチレングリコールなどの水溶性高分子化合物を
適宜使用することもできる。
本発明の第一の態様、並びに第二の態様におい
て、第一試薬の主成分及び添加剤などはPH5.5〜
7.4の緩衝液に溶解されるが、緩衝液の種類とし
ては、例えばイミダゾール酢酸、トリス−酢酸、
トリエタノールアミン−酢酸、トリエタノールア
ミン−NaOH、モルホリノプロパンスルホン酸
（MOPS）、モルホリノエタンスルホン酸などの
通常の使用範囲がPH5.5〜7.4のものであればよ
い。より好ましくは前４者のものが有利に使用さ
れる。
て、第一試薬の主成分及び添加剤などはPH5.5〜
7.4の緩衝液に溶解されるが、緩衝液の種類とし
ては、例えばイミダゾール酢酸、トリス−酢酸、
トリエタノールアミン−酢酸、トリエタノールア
ミン−NaOH、モルホリノプロパンスルホン酸
（MOPS）、モルホリノエタンスルホン酸などの
通常の使用範囲がPH5.5〜7.4のものであればよ
い。より好ましくは前４者のものが有利に使用さ
れる。
また、第二試薬の主成分及び添加剤などは、PH
7.5〜10の緩衝液に溶解させることが必要である
が、緩衝液の種類としては、トリス−酢酸、トリ
エタノールアミン−NaOH、グリシン−KOH、
ビシンなどの通常の使用範囲がPH7.5〜10のもの
であればよい。より好ましくは前２者のものが有
利に使用される。
7.5〜10の緩衝液に溶解させることが必要である
が、緩衝液の種類としては、トリス−酢酸、トリ
エタノールアミン−NaOH、グリシン−KOH、
ビシンなどの通常の使用範囲がPH7.5〜10のもの
であればよい。より好ましくは前２者のものが有
利に使用される。
このようにして調製した第一試薬と第二試薬は
一定の比率で混合した後に、目的測定物質である
CKの至適作用PH６〜7.2となるように、第一試薬
と第二試薬のそれぞれの緩衝液の濃度を設定すれ
ばよい。第一試薬と第二試薬の混合液比として
は、第一試薬：第二試薬が２：１〜10：１（容量
比、以下同じ。）であり、より好ましくは２：１
〜８：１である。第一試薬と第二試薬の緩衝液の
濃度は、例えば第一試薬と第二試薬の混混合比率
を４：１、第一試薬のPHを6.7、第二試薬のPHを
8.5、第一試薬と第二試薬を混合した後の最終反
応液のPHを6.7〜6.8という条件を設定すれば、簡
単な実験によつて求めることができる。例えば、
第一試薬を150ｍＭイミダゾール−酢酸緩衝液
（PH6.7）、第二試薬を25ｍＭトリス−酢酸緩衝液
（PH8.5）とすることによつて目的を達することが
できる。
一定の比率で混合した後に、目的測定物質である
CKの至適作用PH６〜7.2となるように、第一試薬
と第二試薬のそれぞれの緩衝液の濃度を設定すれ
ばよい。第一試薬と第二試薬の混合液比として
は、第一試薬：第二試薬が２：１〜10：１（容量
比、以下同じ。）であり、より好ましくは２：１
〜８：１である。第一試薬と第二試薬の緩衝液の
濃度は、例えば第一試薬と第二試薬の混混合比率
を４：１、第一試薬のPHを6.7、第二試薬のPHを
8.5、第一試薬と第二試薬を混合した後の最終反
応液のPHを6.7〜6.8という条件を設定すれば、簡
単な実験によつて求めることができる。例えば、
第一試薬を150ｍＭイミダゾール−酢酸緩衝液
（PH6.7）、第二試薬を25ｍＭトリス−酢酸緩衝液
（PH8.5）とすることによつて目的を達することが
できる。
本発明の第一の態様、並びに第二の態様の含有
試薬成分の具体例を示すと以下のごとくなる。
試薬成分の具体例を示すと以下のごとくなる。
第一の態様
第一試薬
イミダゾール酢酸緩衝液
酢酸マグネシウム
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）
ADP
NAD(P)
AMP
グルコース
アデノシンペンタホスフエート（Ap5A）
Ｎ−アセチルシステイン
Glck
G6PDH
アジ化ナトリウム
第二試薬
トリス−酢酸緩衝液
CP
アジ化ナトリウム
第二の態様
第一試薬
イミダゾール酢酸緩衝液
酢酸マグネシウム
EDTA
ADP
NAD(P)
AMP
Ap5A
Ｎ−アセチルシステイン
G6PDH
アジ化ナトリウム
第二試薬
トリス−酢酸緩衝液
酢酸マグネシウム
EDTA
CP
グルコース
Glck
アジ化ナトリウム
本発明では、もちろん上記２つの具体例にのみ
限定されるのではない。
限定されるのではない。
本発明のCK定量用試薬の各成分の濃度は、公
知技術を適用すればよいが、一般には次のような
濃度が好ましい。例えば、Glckを0.1〜40ユニツ
ト／ml、G6PDHを0.1〜40ユニツト／ml、CPを
２〜70ｍＭ、ADPを0.1〜20ｍＭ、NAD(P)を0.05
〜20ｍＭ、グルコースを１〜200ｍＭ、マグネシ
ウム塩類を0.5〜30ｍＭ、チオール化合物を0.5〜
50ｍＭ、AMPを0.2〜20ｍＭ、Ap5Aを１〜
100μM、EDTAを0.1〜20ｍＭ、アジ化ナトリウ
ムを0.5〜50ｍＭ使用すればよい。より好ましく
は、Glck0.2〜20ユニツト／ml、G6PDH0.2〜20
ユニツト／ml、CP5〜40ｍＭ、ADP0.2〜10ｍＭ、
NAD(P)0.1〜10ｍＭ、グルコース２〜100ｍＭ、
マグネシウム塩類２〜15ｍＭ、チオール化合物２
〜30ｍＭ、AMP0.5〜15ｍＭ、Ap5A2〜50μM、
EDTAを0.2〜10ｍＭ、アジ化ナトリウム１〜30
ｍＭを使用すればよい。
知技術を適用すればよいが、一般には次のような
濃度が好ましい。例えば、Glckを0.1〜40ユニツ
ト／ml、G6PDHを0.1〜40ユニツト／ml、CPを
２〜70ｍＭ、ADPを0.1〜20ｍＭ、NAD(P)を0.05
〜20ｍＭ、グルコースを１〜200ｍＭ、マグネシ
ウム塩類を0.5〜30ｍＭ、チオール化合物を0.5〜
50ｍＭ、AMPを0.2〜20ｍＭ、Ap5Aを１〜
100μM、EDTAを0.1〜20ｍＭ、アジ化ナトリウ
ムを0.5〜50ｍＭ使用すればよい。より好ましく
は、Glck0.2〜20ユニツト／ml、G6PDH0.2〜20
ユニツト／ml、CP5〜40ｍＭ、ADP0.2〜10ｍＭ、
NAD(P)0.1〜10ｍＭ、グルコース２〜100ｍＭ、
マグネシウム塩類２〜15ｍＭ、チオール化合物２
〜30ｍＭ、AMP0.5〜15ｍＭ、Ap5A2〜50μM、
EDTAを0.2〜10ｍＭ、アジ化ナトリウム１〜30
ｍＭを使用すればよい。
（実施例）
次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
実施例１、比較例１
生化学工業株式会社市販のバチルス ステアロ
サーモフイルス由来のGlck1.4ユニツト／ml、ロ
イコノストツク メセンテロイデス由来の
G6PDH（オリエンタル酵母工業株式会社より購
入）1.2ユニツト／ml、ADP・二ナトリウム塩
1.25ｍＭ、NADP・ナトリウム塩0.75ｍＭ、グル
コース25ｍＭ、AMP6.25ｍＭ、Ap5A12.5μM、
Ｎ−アセチルシステイン12.5ｍＭ、酢酸マグネシ
ウム12.5ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、
EDTA2.5ｍＭ、イミダゾール−酢酸緩衝液（PH
6.7）150ｍＭよりなる第一試薬を調製し、次いで
CP100ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、トリス−
酢酸緩衝液（PH8.5）25ｍＭよりなる第二試薬を
調製した（実施例１）。
サーモフイルス由来のGlck1.4ユニツト／ml、ロ
イコノストツク メセンテロイデス由来の
G6PDH（オリエンタル酵母工業株式会社より購
入）1.2ユニツト／ml、ADP・二ナトリウム塩
1.25ｍＭ、NADP・ナトリウム塩0.75ｍＭ、グル
コース25ｍＭ、AMP6.25ｍＭ、Ap5A12.5μM、
Ｎ−アセチルシステイン12.5ｍＭ、酢酸マグネシ
ウム12.5ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、
EDTA2.5ｍＭ、イミダゾール−酢酸緩衝液（PH
6.7）150ｍＭよりなる第一試薬を調製し、次いで
CP100ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、トリス−
酢酸緩衝液（PH8.5）25ｍＭよりなる第二試薬を
調製した（実施例１）。
両試薬を30℃の恒温槽に放置し、使用時に第一
試薬と第二試薬とを４：１に混合して血清中の
CK活性を測定した。
試薬と第二試薬とを４：１に混合して血清中の
CK活性を測定した。
別に比較のために市販のGlck3ユニツト／ml、
市販のロイコノストツクメセンロイデス由来の
G6PDH3ユニツト／ml、ADP・二ナトリウム塩
1.0ｍＭ、NADP・ナトリウム塩1.6ｍＭ、グルコ
ース20ｍＭ、AMP5ｍＭ、Ap5A10μM、Ｎ−ア
セチルシステイン10ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、EDTA2ｍＭ、イ
ミダゾール−酢酸緩衝液（PH6.7）120ｍＭよりな
るCK定量用試薬を調製し、30℃の恒温槽に放置
し、使用時に必要量を採つて血清中のCK活性を
測定した（比較例１）。
市販のロイコノストツクメセンロイデス由来の
G6PDH3ユニツト／ml、ADP・二ナトリウム塩
1.0ｍＭ、NADP・ナトリウム塩1.6ｍＭ、グルコ
ース20ｍＭ、AMP5ｍＭ、Ap5A10μM、Ｎ−ア
セチルシステイン10ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、EDTA2ｍＭ、イ
ミダゾール−酢酸緩衝液（PH6.7）120ｍＭよりな
るCK定量用試薬を調製し、30℃の恒温槽に放置
し、使用時に必要量を採つて血清中のCK活性を
測定した（比較例１）。
測定は、上記各CK定量用試薬を30℃に保温し、
その0.5mlを光路長１cmのセルに入れ、次に市販
の標準血清20μを添加し、セル室を同じく30℃
の恒温に保つた分光光度計にて340nｍの吸光度
変化より検体中のCK活性を求める方法で実施し
た。各試薬調製日を０日目とし、その時のCK活
性測定値を100％として、30℃保存における各試
薬による測定値の相対値を追跡した。
その0.5mlを光路長１cmのセルに入れ、次に市販
の標準血清20μを添加し、セル室を同じく30℃
の恒温に保つた分光光度計にて340nｍの吸光度
変化より検体中のCK活性を求める方法で実施し
た。各試薬調製日を０日目とし、その時のCK活
性測定値を100％として、30℃保存における各試
薬による測定値の相対値を追跡した。
その結果、実施例１においては、試薬調製日か
ら18日間にわたつてCK活性が100％検出できるこ
とが判明したが、比較例１においては、試薬調製
日から10日間しかCK活性が100％検出できないこ
とが判明した。
ら18日間にわたつてCK活性が100％検出できるこ
とが判明したが、比較例１においては、試薬調製
日から10日間しかCK活性が100％検出できないこ
とが判明した。
このように、実施例１のごとく第一試薬と第二
試薬とに分け、第二試薬のPHを管理することによ
り、溶液状態での試薬の安定性が著しく向上し、
かつGlck、G6PDH、NADPなどの高価な試薬の
削減が計れることが明らかである。
試薬とに分け、第二試薬のPHを管理することによ
り、溶液状態での試薬の安定性が著しく向上し、
かつGlck、G6PDH、NADPなどの高価な試薬の
削減が計れることが明らかである。
比較例 ２
実施例１と同様にして、第一試薬を調製し、次
いでCP100ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、トリ
ス−酢酸緩衝液（PH7.0）25ｍＭよりなる第二試
薬を調製した。
いでCP100ｍＭ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、トリ
ス−酢酸緩衝液（PH7.0）25ｍＭよりなる第二試
薬を調製した。
両試薬を30℃の恒温槽に放置し、使用時に第一
試薬と第二試薬とを４：１に混合して、血清中の
CK活性を実施例１と同様にして測定した。
試薬と第二試薬とを４：１に混合して、血清中の
CK活性を実施例１と同様にして測定した。
その結果、試薬調製日から12日間しかCK活性
が100％検出できないことが判明した。
が100％検出できないことが判明した。
実施例 ２
市販のロイコノストツク メセンテロイデス由
来のG6PDH1.2ユニツト／ml、ADP・二ナトリ
ウム塩1.25ｍＭ、NADP・ナトリウム塩0.75ｍ
Ｍ、AMP6.25ｍＭ、Ap5A12.5μM、Ｎ−アセチ
ルシステイン12.5ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、EDTA2ｍＭ、イ
ミダゾール−酢酸緩衝液（PH6.7）150ｍＭよりな
る第一試薬を調製し、次いでCP100ｍＭ、アジ化
ナトリウム10ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍＭ、
EDTA2ｍＭ、グルコース100ｍＭ、市販の
Glck5.6ユニツト／ml、トリス−酢酸緩衝液（PH
8.5）25ｍＭよりなる第二試薬を調製した。
来のG6PDH1.2ユニツト／ml、ADP・二ナトリ
ウム塩1.25ｍＭ、NADP・ナトリウム塩0.75ｍ
Ｍ、AMP6.25ｍＭ、Ap5A12.5μM、Ｎ−アセチ
ルシステイン12.5ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム10ｍＭ、EDTA2ｍＭ、イ
ミダゾール−酢酸緩衝液（PH6.7）150ｍＭよりな
る第一試薬を調製し、次いでCP100ｍＭ、アジ化
ナトリウム10ｍＭ、酢酸マグネシウム10ｍＭ、
EDTA2ｍＭ、グルコース100ｍＭ、市販の
Glck5.6ユニツト／ml、トリス−酢酸緩衝液（PH
8.5）25ｍＭよりなる第二試薬を調製した。
両試薬を30℃の恒温槽に放置し、実施例１と同
様にして、血清中のCK活性を測定した。
様にして、血清中のCK活性を測定した。
その結果、試薬調製日から20日間にわたつて
CK活性が100％検出できることが判明した。
CK活性が100％検出できることが判明した。
実施例 ３、４
実施例１と同様の試薬を４℃に保存し（実施例
３）、また実施例２と同様の試薬も４℃に保存
（実施例４）して、CK活性測定値の経日変化を追
跡した。
３）、また実施例２と同様の試薬も４℃に保存
（実施例４）して、CK活性測定値の経日変化を追
跡した。
その結果、実施例３では約60日にわたり、また
実施例４では約70日にわたりCKが100％検出でき
ることが判明した。
実施例４では約70日にわたりCKが100％検出でき
ることが判明した。
実施例 ５
実施例２の第二試薬中のCPを150ｍＭとした以
外は実施例２と同様の実験をした。
外は実施例２と同様の実験をした。
その結果、試薬調製日から24日間にわたつて
CK活性が100％検出できることが判明した。
CK活性が100％検出できることが判明した。
（発明の効果）
本発明のCK定量試薬は、Glck、G6PDH、
NAD(P)、ADP、グルコース、CPを含む試薬成
分を２試薬に分け、しかも第二試薬のPHを特定域
に管理したことにより、溶液状態での安定性を著
しく高めることができる。そのため、一度に大量
の試薬を調製しておくことができ、緊急検査にも
迅速に対応できる。また、大量調製が可能になつ
たため、作業効率が改善される他、余剰の試薬を
廃棄する頻度も減少させることが可能となる。こ
のように、本発明によりCK定量用試薬の臨床検
査分野への寄与ははかりしれないものがある。ま
た、別の観点から見れば、測定用試薬に用いる酵
素量や他の高価な試薬の量も軽減することも可能
になるなど、省資源の点からも本発明の効果は大
である。
NAD(P)、ADP、グルコース、CPを含む試薬成
分を２試薬に分け、しかも第二試薬のPHを特定域
に管理したことにより、溶液状態での安定性を著
しく高めることができる。そのため、一度に大量
の試薬を調製しておくことができ、緊急検査にも
迅速に対応できる。また、大量調製が可能になつ
たため、作業効率が改善される他、余剰の試薬を
廃棄する頻度も減少させることが可能となる。こ
のように、本発明によりCK定量用試薬の臨床検
査分野への寄与ははかりしれないものがある。ま
た、別の観点から見れば、測定用試薬に用いる酵
素量や他の高価な試薬の量も軽減することも可能
になるなど、省資源の点からも本発明の効果は大
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱
水素酵素、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（リン酸）、アデノシン二リン酸、グルコ
ースを主成分とする第一試薬と、クレアチンリン
酸を主成分とする第二試薬とからなり、かつ第二
試薬のPHが7.5〜10であることを特徴とするクレ
アチンキナーゼ定量用試薬。 ２ グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、
アデノシン二リン酸を主成分とする第一試薬と、
グルコキナーゼ、クレアチンリン酸、グルコース
を主成分とする第二試薬とからなり、かつ第二試
薬のPHが7.5〜10であることを特徴とするクレア
チンキナーゼ定量用試薬。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59210238A JPS6188899A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 |
| CA000491777A CA1252700A (en) | 1984-10-05 | 1985-09-27 | Reagent for assaying creatine kinase |
| EP85307003A EP0178113B1 (en) | 1984-10-05 | 1985-10-01 | Reagent for assaying creatine kinase |
| DE8585307003T DE3569941D1 (en) | 1984-10-05 | 1985-10-01 | Reagent for assaying creatine kinase |
| US06/784,432 US4740458A (en) | 1984-10-05 | 1985-10-04 | Reagent for assaying creatine kinase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59210238A JPS6188899A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188899A JPS6188899A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0517838B2 true JPH0517838B2 (ja) | 1993-03-10 |
Family
ID=16586066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59210238A Granted JPS6188899A (ja) | 1984-10-05 | 1984-10-05 | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4740458A (ja) |
| EP (1) | EP0178113B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6188899A (ja) |
| CA (1) | CA1252700A (ja) |
| DE (1) | DE3569941D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62104598A (ja) * | 1985-11-01 | 1987-05-15 | Yatoron:Kk | クレアチンキナ−ゼ測定用試薬 |
| JPH0690202B2 (ja) * | 1988-04-06 | 1994-11-14 | ユニチカ株式会社 | クレアチンキナーゼ活性測定用試薬およびそれを用いる測定方法 |
| US5804394A (en) * | 1988-04-06 | 1998-09-08 | Unitika Ltd. | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| ES2180632T3 (es) * | 1994-05-06 | 2003-02-16 | Beckman Coulter Inc | Activador de tiol estable en un liquido. |
| US5962340A (en) * | 1994-11-02 | 1999-10-05 | Wako Pure Chemical Industries Ltd. | Homogeneous immunoassay method utilizing 5-300 mM magnesium |
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| US5817467A (en) * | 1995-11-16 | 1998-10-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitatively determining creatinine kinase and a reagent therefor |
| JP3750955B2 (ja) * | 1997-04-18 | 2006-03-01 | 富士写真フイルム株式会社 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
| US5908864A (en) * | 1998-05-28 | 1999-06-01 | Dymatize Enterprises | Creatine gel |
| EP0989191B1 (en) * | 1998-09-22 | 2002-11-27 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase or its MB isozyme |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3413198A (en) * | 1966-06-30 | 1968-11-26 | Calbiochem | Reagents and method for assaying biological samples |
| US4277562A (en) * | 1976-09-13 | 1981-07-07 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions |
| GB2021594B (en) * | 1978-05-22 | 1982-10-20 | Atkinson A | Glycerol dehydrogenase |
| US4250254A (en) * | 1978-09-11 | 1981-02-10 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized liquid enzyme and coenzyme compositions |
| JPS5934119B2 (ja) * | 1978-12-12 | 1984-08-20 | 三菱油化株式会社 | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 |
| JPS56169598A (en) * | 1980-05-26 | 1981-12-26 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Measuring composition |
| JPS5995900A (ja) * | 1982-11-24 | 1984-06-02 | Unitika Ltd | 測定用組成物 |
| JPS59151899A (ja) * | 1983-02-16 | 1984-08-30 | Unitika Ltd | 測定用組成物 |
-
1984
- 1984-10-05 JP JP59210238A patent/JPS6188899A/ja active Granted
-
1985
- 1985-09-27 CA CA000491777A patent/CA1252700A/en not_active Expired
- 1985-10-01 DE DE8585307003T patent/DE3569941D1/de not_active Expired
- 1985-10-01 EP EP85307003A patent/EP0178113B1/en not_active Expired
- 1985-10-04 US US06/784,432 patent/US4740458A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4740458A (en) | 1988-04-26 |
| EP0178113A1 (en) | 1986-04-16 |
| DE3569941D1 (en) | 1989-06-08 |
| EP0178113B1 (en) | 1989-05-03 |
| CA1252700A (en) | 1989-04-18 |
| JPS6188899A (ja) | 1986-05-07 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |