JPH0420288A - フッ化物イオンに耐性な細菌カタラーゼ及びそれを生産するミクロコッカスｓｐ．ｋｗｉ‐５菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なフッ化物イオン耐性カタラーゼ及びそれ
を生産するミクロコツカス属に属する新菌株に関する。

（従来技術） ゛］′導体プロセス等過酸化水素を含むＪＪＩ水の水処
理分野、カズノコの漂白に伴う残存過酸化水素の分解等
の食品分野においてカタラーゼは広く利用され−Ｃいる
。カタラーゼは過酸化水素の分解を触媒する酵素であっ
て、多くの生物により生産されることが知られている。

例えばウマ（Ｄｅｕｔｓ（：ｈ、１．９５２　）、サツ
カロミセス　セレビシェ（Ｓｅａｈら、１．９７３　）
、バチルス　Ｎｏ、ＫＵ］（Ｋ　ＩＪ　ｒ　Ｏｎ　ｏら
、１９７３）、エスケリツチアコリ（Ｃｌ　ａ　ｊ、　
ｂ　ｏ　ｒ　ｎ　ｅら、１．９７９　）等が報告されて
いる。

（発明が解決しようとする問題点） カタラーゼは一般にフッ化物イオン、シアンイオン、ア
ジ化ナトリウム、β−メルカプトエタノール等によって
１５１１害を受けることが知られている。

水処理分野へのカタラーゼの適用においては、排水に含
まれるフッ化物イオンに耐性なカタラーゼを使用するこ
とが求められていた。フッ化物イオンに耐性のあるカタ
ラーゼとしてはＲａｃｉａｌｕｓ　　Ｎｏ、ＫＵ］が知
られ−（イたが作用至適ｐ　Ｉ−Ｉがアルカリのため、
フッ化物イオンに耐性てかつ巾着て活性を有するカタラ
ーゼを生産する菌株が求められていた。

（問題を解決するための手段） 本発明者らはフッ化物イオン耐性を有するカタラーゼを
生産する微生物を広く自然界より探索し、製紙工場排水
より単離したミクロコツカス　ｓｐ。

ＫＷ　王−５菌株が前述の要求を満たずカタラーゼを生
産することを見いだし本発明を完成した。

次に活性測定法、本発明のフッ化物イオン剛性カタラー
ゼの理化学的１１′質、本発明のミクロコツカスｓｐ、
　ＫＷ　Ｉ　−５菌の菌学的性質について述べる。

（活性測定法） 過酸化水素３５０ｐｐｍを含むリン酸緩衝液（ｐ　Ｉ−
Ｉ　６．８　）　］−ｍ　Ｑを］、　ｍ　Ｑの酵素溶液
と混合し、３０　”Ｃで５分間反応させた後、１ｍＱの
硫酸チタンン容液（０，８％硫酸第２チタン硫酸溶液を
含む２０％硫酸溶液）を加えて反応停止及び発色を行い
、４４０　ｎ　ｍでの吸光度を？ｉ！ＩＩ定する。この
測定値を下記の式に代入して活性（Ｋ　ａｔ−ｆ値）を
求める。　（赤堀四部ら茗「酵素研究法」第２巻、朝倉
ｔ）店１９５６年発行、第３２４〜３２５頁）Ｋａｔ−
ｆ＝　Ｑｏｇ（Ａ／Ｂ）　ｘＣ／Ｄ　　！ｎ１ｎｌ−’
［ｎｇｌただし、Ａ：対照（カタラーゼを含まない）の
吸光度 ■３ ：試料（カタラーゼを入れて反応 させた）の吸光度 ：酵素溶液の各駅率 ：反応時間 本発明のフッ化物イオン耐性カタラーゼの理化学的性τ
′Ｉは次のとおりである。

（理化学的性質） （］）イ１用及び基質特異性 過酸化水素に作用し、水と酸素に分解する。

パーオキシダーゼ活性はない。

（２）至適ｐ　ｒ＋及び安定ｐ　Ｈ範囲＋ｉｉＪ記の活
性測定法に基き、［１＋−（に対する影響を調べた。第
１図に活性の最大値を１００とした各ｐ　Ｈでの相対活
１１・を示した。至適ｐ　Ｔ（はｐ　Ｈ５，５〜１１．
０であることがわかる。

次にｐ　Ｈの安定性について第２図に示した。酵素を各
ｐＨで３０　’Ｃで１時間保持したのちｐ　Ｈ６，８，
３０℃において測定した残存活性を、未処理の酵素活性
を１００として示した。

第２図から、本発明のカタラーゼはｐ　Ｈ５，５〜１０
で安定である。なお用いた緩衝液は、ｐ　’ｆ（４、、
５−５、５（５（）ｍＭ酢酸緩衝成）、Ｉ）　Ｈ５、５
〜８　、０　（５０ｍＭリン酸緩衝液）、　ｐＨ７，５
−９、Ｏ（５０ｍＭ　トリス緩衝液）、ｐＨ９，０−］
、３．０　（５０ｍＭグリシン緩衝瀾緩衝液る。

（３）作用適温の範囲 前記の活性測定法に従い、各温度にて５分間酵素反応を
行なった。第３図は３０　’Ｃにおける活性を１（］Ｏ
としたときの各温度における活性比を表ノ〕ず。第７３
図から本酵素の作用最ｉＭ温度は３０〜３５℃であるこ
とがわかる。また、至適温度のＪ（０％以１−の活性を
示す作用温度は、２０〜５０℃程度であることがわかる
。

（４）熱安定性 ｐ　Ｉ−１６，８で２０分間各温度にて熱処理後、残存
活性を調べた。未処理の酵素活性を１００とし、その残
存活性を第４図に示した。第４Ｍから本酵素は］　０　
’Ｃ〜５０℃て安定であることわかる。

（５）失活の条件 第２図に示したＪ：うにｐ　Ｉ（４，、Ｏにおいて、３
　ｏ　°ｃ　１１１ｙ間処理すると不発明のカタラーゼ
は完全に失活する。また第：３図に示ずＪ：うにｐＨ６
，８において、７０″Ｃ２０分の処理にて完全に失活す
る。

（６）阻害 第１表に示す薬品の存在Ｆにカタラーゼ活性を４１１γ
し、非存９Ｆの活性を１００として、残存活性を白′分
・本で小した。表かられかるように本酵素ばフッ化物イ
オンに対し名しい耐性を有する。

第１ 表 等電点 ｐ　＋（：３　、５〜９．５のグラジェントポリアクリ
ルアミ１−ゲルを用いて等電点電気泳動を行なった結果
、等電点けｐ　Ｔ−１４、４であった。なお、標準物質
としてＢ］’０ＲＡＤネ１のＩＥＦスタンダードを用い
た。

（８）分子量 Ｐ　ｈ　；］、　ｒ　ｍ　ａ　＜ニーｉａネ土のスーパ
ーローズ１０を用いたゲルろ過にＪ：す、分子量２１０
　０００を得た。なお分子量マーカーとしてチログロブ
１ノン（分子−１Ｔｌ６６４　．０００　）、アポフェ
リチン（分？−１ｉｉ４４６　．０００　）、β−７ミ
ラーゼ（分子−晴２　Ｄ　Ｏ、ＯＯＯ）　、γ−グロブ
１ノン（分子量＋５（１，０００）、ウシ血清アルブミ
ン（分子量６７　．０００）、オハルフ゛ミン（分子量
４５　　、０００　）　、：／　ｈり０−ムＣ（分子量
１２　．４００）を用いた。

（９）サブユニッ１へ＋Ｒ造 Ｓ　Ｉ）　Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、本
発明のカタラーゼ１分子は分子量５８０００のサブ；１
．ニラ［・４個から構成されていた。なお分子量マーカ
ーとしてウシ血清アルブミン（分子量６７　．０００）
、オハルブミン（分子量４５．０００）、α−キモＩ・
リプシノーゲン（分′−ｆ−量２５　．７００　）、リ
ボヌクレアーゼ（分子量１４．７００）、シトクローム
Ｃ（分子量１２　、イ００）を用いた。

（１０）比活性 精製された本酵素の比活性は、４，００（］Ｋａｔ、−
ｆ／ｍｇ蛋白て゛ある〇 酵素の精製は、培養終了後の培養液に溶菌剤を加えて抽
出した接、当分野公知の分＃精製手段、例えばイオン交
換体、ゲルろ過材等を用いて精製することができる。本
酵素の製造法については後記実施例で具体的に説明する
。

上記各特性を示す本発明にＪ：す（１すられるカタラゼ
と従来公知のカタラーゼとの比較を、第２表に示す。

１［］ 本発明のカタラーゼを生産するにはミクロコツカス属に
属するミクロコツカス　ｓｐ、ＫＷＩ−５菌株を利用す
ることができる。

この菌株の菌学的性質を以丁に示す。なお、菌学的性質
の試験及び分類方法は下記の文献に基づいて行なった。

長谷部武治ら著、学会出版センター発行「く改訂版〉微
生物の同定Ｊ（１９８４）及びバージェズ・マニュアル
・オブ・システマチイックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’　ｓ　　Ｍａｎｕ　ａ　］、　　ｏ　ｆ　　Ｓ　
ｙ　ｓ　ｔ　ｅ　ｍ　ａ　ｔ　ｉ　ｃ　　Ｂ　ａ　ｃし
ｅｒｉｏ］、ｏｇｙ）（１９８／ｌ）（］）形態 ■細胞の形及び大きさ ０．８〜１．２μｍの球菌で鞭毛を持たない。

■運動性：なし。

■胞子二なし。

■ダラム染色は陽性である。

■抗酸性は陰性である。

（２）生育状１ｉ！ｊ　（培地ｐ　Ｈ：　６　、８　）
■肉汁寒天平板培養 円形、偏平状または隆起状で縁はなめらかで光沢がある
。培養時間の経過につれて黄色を呈する。

■肉汁寒天斜面培養 拡帯状に生育し、縁はなめらかで光沢がある。培養時間
の経過につれて黄色を呈する。

培地には色素を分泌しない。

■肉汁液体培養 生育良好でうすい黄色を呈する。

■リドマスミルク アルカリ性を呈する。

（３）生理学的性質 ■硝酸塩の還元；陽性。

■脱窒反応；陰性。

■ＭＲテスト；陰性。

■ｖｐテスト：陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：ｌＩａ性。

■デンプンの加水分解：陰性。

■クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地：利用する。

Ｃｈ　ｒ　ｊ、　ｓ　ｔ　ｅ　ｎ　ｓ　ｅ　ｎの培地：
利用する。

Ｓｉｍｏｎｓの培地：利用する。

■無機窒素源の利用 硝酸塩：陰性。

アンモニウム塩：陽性。

［相］色素の生成；陰性。

■ウレアーゼ：弱い陽性。

■オキシダーゼ：陰性。

■カタラーゼ：陽性。

■生育の範囲 ｐＨ：６〜１１で生育。６〜８で最適。

温度：　１５−３０℃で生育。３０℃で最適。

■酸素に対する態度：好気性。

［相］Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕ　ｇ　ｈ　　Ｌ　ｅ　ｉ　ｆ
　ｓ　ｏ　ｎ法による）：００ ■糖類から酸及びガスの生成の有無 Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マルトース、
グリセロールを利用し、酸を生成するが、ガスの発生は
認められない。Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ
−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−トレハロース、
Ｄ−シュークロース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−ソルビトー
ル、Ｄ−マンニトール、Ｄ−イノシトールおよびデンプ
ンは利用しない。

（４）その他の性質 ■塩化ナナトリウム耐性＝１０％塩化ナトリウム存在下
でも生育する。

■ゼラチンの液化：陽性。

■Ｔｗｅｅｎの分解：Ｔｗｅｅｎ４０．６０及び８０を
分解する。

■チロシン分解；陽性。

■カゼイン分解：陽性。

上記の菌学的性質から前記した文献の分類方法に従って
ミクロコツカス属の公知の菌種と比較すると、本発明の
菌株はミクロコツカスパリアンスと類似している。しか
しながらグリセロールの利用（ミクロコツカスハリアン
スは利用しない）、食塩の耐性（ミクロコツカスハリア
ンスは１０％の塩化すＩ・リウムに耐性を持たない）と
いう点で明らかに相違する。また本発明の菌株はミクロ
コツカスロゼウスともその生理学的性質がよく似ている
が、コロニーの色（ミクロコツカスロゼウスは赤色に対
し、本菌株は黄色）、ゼラチンの分解（ミクロコツカス
ロゼウスはしない）、クエン酸の利用（ミクロコツカス
ロゼウスはＳｊｍｏｎｓ培地で増殖しない）という点て
明らかに異なる。

以−にの通り、本菌株は公知の菌株とは区別されるため
、ミクロコツカス属に属する新菌株と判断し、ミクロコ
ツカスｓｐ、に、ＷＨ−５と命名した。

本菌株は、平成２年２月６目に通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託した。

微生物受託番号は、微工研菌寄第１．１２５８号である
。

（作用） 本発明のフッ化物イオン耐性カタラーゼは１０ｍＭのフ
ッ化物イオン存在下でも活性があり、しかも広範囲のｐ
　ＦＴで作用する。従ってフッ化物イオンを含むＪＪＩ
水中で過酸化水素を分解することができる。また、本発
明のミクロコツカス　ｓｐＫ　Ｗ　：Ｉ　−５菌を用い
て、本発明のフッ化物イオン耐性カタラーゼを生産する
ことがてきる。

フッ化物イオン１ｔｉｔ　＋１カタラーゼを生産するた
めの培養条件は、次の通りである。まず培地としては炭
素源、窒素源、無機塩等、微生物の生育に必要な成分を
含むものを用いる。炭素源としては、グルコース、オレ
イン酸、　リンゴ酸、グリセロル等が使用でき、窒素Δ
９としては魚肉エキス、ペブ［ヘン、カザミノ酸、コー
ンスチープリカー、大豆粉等、無機塩としては、リン酸
二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等を用
いる。培地のｐ　Ｈは６．８付近にすることが望ましい
。

−１〕記の培地で３０℃で本菌株を好気的に培養すれば
、１Δ養開始後約２４時間でカタラーゼの生産量が最大
となる。培養温度が高いと、例えば３７℃ては生産量が
３０″Ｃの６０％になり、また温度が低くてもその生産
量が低下する。

このようにして得られた培養液は、ン容菌酵素、核酸分
解酵素、１１機溶媒などで処理して菌体を破壊した後、
遠心分離などで固形分を分離して粗酵素液とすることが
できる。粗酵素液は、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換
、電気泳動などの公知の手段によって精製し、精製酵素
を得ることができる。

（実施例） 実施例１ グルコース２％、ボリベブＩ・ン１，６％、酵母エキス
０４４％よりなる滅菌された液体培地（１、＋　ＩＩ　
（５，８）　Ｉ　Ｏ（）　ＨＩ　Ｉ！　　を坂［１フラ
スコに入れ、ミクロコ・ソカスｓｐ、ＫＷ丁−５を接種
し、ロタリーシェイカーにて３０　’Ｃで培養した。こ
の培養液を溶菌酵素、核酸分解酵素、４１機溶媒で処理
後、遠心分離して固形分を除き、粗酵素液を得た。

カタラーゼ活性は４００　Ｋ　ａｔ−ｆ／　ｍ　ｇであ
った。

実施例２ 実施例１の１１酵素液２０ｍＱを、分取用液体クロマト
グラフィーにてゲルろ過（カラムは東ソーＫＫ、ＴＳＫ
’ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ）分画した。

得られた酵素画分をＯ，’０５Ｍリン酸緩衝液中で２４
時間透析後、分取用液体クロマトグラフィにてイオン交
換（カラムは東ソーＫＫ、　、　Ｔ　Ｓ　ＫｇｅｌＤＥ
ＡＥ５ＰＷ）分画した。こうして得られた酵素はポリア
クリルアミド電気泳動において単一ハントを示した。な
お、比活性は、ｌ　　、０００Ｋ　ａｔ−ｆ／　ｍ　ｇ
蛋白であった。

（効果） 本発明によれば、ミクロコツカスｓｐ、ＫＷＩ５菌株を
培養し、その培養液からフッ化物イオン耐性カタラーゼ
を得ることができる。このカタラーゼはフッ化物イオン
に対する優れた耐性を有しているので、半導体工業をは
じめとする過酸化水素を含む排水の水処理に広く利用す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の酵素の至適ｐ　Ｈを表わし、第２図
は本発明の酵素の安定ｐ　Ｈ範囲を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するフッ化物イオンに耐
   性な細菌カタラーゼ。 ［１］作用及び基質特異性 過酸化水素に作用し、水と酸素に分解す る反応を触媒する。 ［２］至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５〜１１．０、安定ｐＨは ５．０〜１０である。 ［３］作用適温の範囲 至適温度は３０〜３５℃である。 ［４］阻害 アジ化ナトリウム（１ｍＭ）で著しい阻 害を受ける。フッ化カリウム、ヒドラジン、β−メルカ
   プトエタノール、エチレンジア ミン四酢酸ナトリウム（各１ｍＭ）では阻 害されない。 ［５］分子量 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 によると本酵素は分子量５８，０００のサブユニット４
   個からなり、ゲルろ過法による分子 量は２１０，０００である。 ［６］等電点 等電点電気泳動による等電点は、ｐＨ ４．４である。 ［７］比活性 比活性は４，０００Ｋａｔ−ｆ／ｍｇ蛋白である。 （２）ミクロコッカス属に属し、請求項（１）記載のフ
   ッ化物イオン耐性カタラーゼ生産 能を有するミクロコッカスｓｐ．ＫＷＩ−５菌株。