JPH0212558B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アルドース−１−エピメラーゼを効
率良く製造する方法に関する。 従来、アルドース−１−エピメラーゼ
〔EC5.1.3.3〕（以下ムタロターゼと略する）は、
ベニシリウム・ノタツム（Penicillium
notatum）および種々の動物組織（特に腎蔵、
腸、肝蔵、水晶体など）及び植物組織に存在が知
れ、その作用は、α−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−
グルコースの変換を触媒する酵素である。 ムタロターゼはグルコー・オキシダーゼ
（EC1.1.3.4：β−Ｄグルコースのみを基質とす
る）と組み合わせることにより、血清中のグルコ
ースをより迅速に定量することが知られており、
安定性の優たメタロターゼを安価に工業的に製造
する方法を提供することが強く望まれている。 本発明者等はかゝる要望に応えるべく工業的に
安価にムタロターゼを製造する方法について鋭意
研究を重ねた結果、アスペルギルス属に属する微
生物を培養したとき、菌体中に安定性の優れたム
タロターゼが著量に生産されることを見出し、本
発明を完成するに到つた。すなわち本発明はアス
ペルギルス属に属し、ムタロターゼ生産能を有す
る微生物を栄養培地に培養し、該培養物からムタ
ロターゼを採取することを特徴とするムタロター
ゼの製造法である。 本発明において使用可能な菌株は、例えばアス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
ATCC6274（微工研菌寄第10948号）アスペルギル
ス・ニガー（Asp.niger）IAM2020等アスペルギ
ルス属に属し、ムタロターゼを生産する菌はすべ
て本発明方法において使用することができる。 本発明によれば、アスペルギルス属に属する糸
状菌類を栄養培地で培養することにより、ムタロ
ターゼが菌体外又は菌体中に生産蓄積されるの
で、公知の方法及び今後開始されるであろう改良
方法で精製、乾燥することによつて酵素粉末を得
ることが出来る。 更に具体的に説明すると、前記アスペルギルス
属のムタロターゼ生産菌を適当な栄養培地、例え
ば適当な糖質、窒素源、無機塩類を含む培地で培
養し、ムタロターゼを菌体中に蓄積せしめるので
あるが、ここで糖質には、グルコース、シユーク
ロース、マルトース、デン粉加水分解物、デンプ
ンなどの精糖、更にはグリセロール、ソルビトー
ルなどの糖アルコール類、及びクエン酸、コハク
酸などの有機酸などが使用出来る。窒素源として
は、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
チーブリカー、カゼイン加水分解物、脱脂大豆、
アンモニウム塩、硝酸塩などが使用される。無機
塩類としては、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カルシウムなどの金属塩類や硫酸、リン
酸、塩酸、硝酸などの塩類が使用出来る。 ムタロターゼが菌体外に生産された場合は、菌
体分離後、通常の方法で精製されるが、菌体内に
生産される場合には得られたムタロターゼを含む
菌体を濾過または遠心分離によつて分別し、適当
な緩衝液に懸濁後、磨砕、超音波処理、機械的圧
縮または自行消化などの公知の方法で破砕して酵
素を抽出する。 その抽出液から不溶物を濾過または遠心分離に
よつて分別した後、得られた濾液または上清から
硫酸アンモニウム、芒硝などによる塩析あるいは
アセトン、アルコール等を用いる溶媒沈殿などの
公知の方法で酵素標品を得る。 さらに高度に精製された酵素標品を得るには、
イオン交換を応用した吸着溶出法およびゲル濾過
法及び安定pH範囲内で加熱処理を行い、熱に不
安定な不純蛋白質及び他の酵素を熱失活させる熱
処理を行うとよい。特に、この熱処理は精製の
種々の段階で使用することにより、該酵素の比活
性を大幅に上げる有効な方法である。 ムタロターゼの活性測定は、調製直後のグルコ
ース溶液（グルコース試薬特級、和光製）を使用
する。グルコース溶液（0.2mg／ml）0.5mlにグル
コース測定試薬（ダイヤカラーGC，東洋紡績株
式会社製）２mlと酵素液0.5mlを加え、島津製作
所製ダブルビーム分光光度計UV−210Aで、30
℃、558nmの吸孔度の増加速度よりグルコース酸
化速度を測定する。一方、対照として、上記組成
で酵素無添加で同様な操作を行い、α−Ｄ−グル
コースからβ−Ｄ−グルコースへの自然の変換速
度を測定し、この量を差引いて１分間に1μモル
のβ−Ｄ−グルコースに変換する酵素量を１単位
とする。 第１図にグルコースの酸化に及ぼすムタロター
ゼの効果を示す。第１図中、−△−はムタロター
ゼによるα−グルコース、−〇−はムタロターゼ
による平衡状態のグルコース−●−は平衡状態の
グルコース、−▲−はα−グルコース示す。 第２図にグルコース酸化速度に及ぼすムタロタ
ーゼ濃度の影響を示す。反応速度が２×10^-2
（μmole／ml、min）を超える範囲では直線性か
らはずれてくるため、酵素濃度はこの測定範囲に
入るように希釈して測定する。 又、至適pH、基質特異性の測定は旋光度計で
記録して行う。測定方法は基質として１％α−Ｄ
−グルコース溶液の変旋光の経時変化を一次反応
と仮定して、ムタロターゼの添加、無添加におけ
る反応速度定数を求め、ムタロターゼ添加の場合
の反応速度定数から無添加の場合の反応速度定数
を差引いて酵素活性とした。 本発明によつて得られるムタロターゼの理化学
的性質をアスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）ATCC6274（微工研菌寄第10948号）の生
産する酵素について示す。 (1) 作用 本酵素は、α−Ｄ−グルコースをβ−Ｄ−グ
ルコースに、又はβ−Ｄ−グルコースをα−Ｄ
−グルコースに変換する反応を触媒する。 (2) 基質特異性 本酵素はα−Ｄ−グルコース以外にも、α−
Ｄ−ガラクトース、β−Ｄ−フルクトース、β
−Ｌ−アラビノース及びα−Ｄ−キシロース、
β−マルトース、β−ラクトース、β−Ｄ−セ
ロビオースに作用する（第１表参照）。

【表】 (3) 至適pHおよび安定pH範囲 本酵素の至適pHは前記の活性測定条件下に
おいて、4.0〜8.0の間にある（第３図参照）。
第３図中、−〇−は相対活性、−△−は触媒速度
定数および−▲−は自然速度定数を示す。 本酵素の安定pH域は、20℃、24時間処理で
pH5〜10の範囲にある（第４図参照）。更に最
も安定なpHは5.5〜９付近である。 (4) 作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の活性測定条件
下において、60℃付近にある。 (5) pH、温度などによる失活条件 本酵素はpH6.0、30分間の処理の場合、50℃
まで安定で、60℃、70℃では夫々95％、75％の
活性が残存するが、75℃の処理では殆んど失活
する（第５図参照）。本酵素の75℃における失
活の経時的変化は一分子反応的であり、熱失活
速度定数は0.053mm^-1で、即ち６分間で活性の
50％が失活する（第６図参照）。 (6) 分 子 量 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、本酵素の分子量は130000と算出された（第
７図参照）。第７図中、〇印は左上から順に
RNA・P_T−β′，RNA・Ｐ−β′，RNA・Ｐ−
β，RNA・P_T−β，RNA・P_T ^-I，血清アルブ
ミン、RNA・P_T−α，RNA・Ｐ−α，
RNA・P_T−Ｉ，トリブシン・インヒビターを
示す。△印はムタロターゼを示す。 又、セフアデツクスＧ−200のゲル濾過法に
より分子量を測定すると、260000であつた（第
８図参照）。よつて、この酵素は分子量130000
の２個のサブユニツトからなるダイマーと決定
された。第８図中、〇印は左上から順に、フエ
リチン、カタラーゼ、アルドラーゼ、α−アミ
ラゼ、血清アルブミン、卵アルブミンを示す。
△印はムタロターゼを示す。 次に本発明による新規なムタロターゼの製造法
をアスベルギルス・ニガーATCC6274株（微工研
菌寄第10948号）を用いた実施例で説明する。 実施例 シユークロース３％、馬鈴薯でん粉５％、酵母
エキス（オリエンタル酵母製）0.2％，NaNO₃2
％，MgSO₄・7H₂O0.5％を500mlマイヤーフラス
コに仕込み、120℃10分間蒸気滅菌した。種菌と
しては、アスペルギルス・ニガーATCC6274（微
工研菌寄第10948号）のスラント１本に無菌水15
mlを加えブレンダーにかけて胞子懸濁液を調整
し、その５mlを植菌して30℃２日間180nm振巾10
cmの条件で培養して種菌とする。 前述と同様な培地（但しでん粉を抜く）に上記
培養した液５mlを植菌して30℃１日間培養した。 本培養としては、100フアーメンター（丸菱
製、液量70、培地組成は種培養と同一）に種培
養５％を植菌し、30℃で24時間通気（35／分）
撹拌（240rpm）培養しながらpHを5.0〜5.3にな
るように10％NaOHで調製した。 培養終了後、培養液を氷中で冷却しながらガー
ゼで濾過して集菌4.2Kgの湿潤菌体を得た。 この湿潤菌体3.6Kgを0.02Mトリス・0.05M酢酸
緩衝液（pH6.0）と共にホモゲナイザーで破壊
し、さらにダイノミル（シンマルエンタプライズ
製）ですりつぶした8.2の菌体懸濁液を
10000rpmで20分間冷却遠心分離機（トミー精工
製RS−18）で分離して7.78の粗酵素液を得
た。得られた粗酵素液に硫酸アンモニウムを40％
飽和になるように加え一夜放置後、8000rpmで10
分間冷却遠心分離して沈殿を除き、上清液にさら
に硫酸アンモニウムを80％飽和になるように加え
一夜放置後、8000rpmで10分間冷却遠心分離をし
て新規なムタロターゼを沈殿として回収した。 この沈殿に500mlの0.02Mトリス、0.05M酢酸
緩衝液（pH6.0）を加え、数回同一な緩衝液をと
りかえながら一夜透析して生じた沈殿を遠心分離
して除き530mlの酵素液を得た。透析後の酵素液
530mlを緩衝液（pH6.0）で平衡化したDEAE−
セフアデツクスＡ−50（フアルマシアフアイン
ケミカル社製）を充填したカラム（6.0φ×40cm）
に通して新規なムタロターゼを吸着させ、同緩衝
液で洗浄した後、緩衝液中の食塩濃度を0.05Mか
ら0.5Mに直線的に増加させて、溶出液2.4のう
ち食塩濃度0.35M付近の活性区分（フラクシヨン
No.122〜134）320mlを集めた（第９図参照）。 320mlのうち120mlに硫酸アンモニウムを90％飽
和になるように加え、得られた塩析物を同じ緩衝
液で溶解し、20.8mlに濃縮し、この液５mlをセロ
フアンチユーブで0.02Mトリス・0.05M酢酸緩衝
液（pH6.0）中で一夜透析した。この透析液を70
℃10分間熱処理した後、12000rpmで10分間遠心
分離して沈殿を除き上清液５mlを得た。この液５
mlを、あらかじめ0.02Mトリス・0.05M酢酸緩衝
液（pH6.0）で平衡化したセフアクリルＳ−300
（フアルマシア製・スエーデン）を充填したカラ
ム（2φ×72cm）に通して活性区分を集めた。 フラクシヨンNo.25は熱処理のため変性した蛋白
質であると考えれる。ここで、フラクシヨンNo.35
の蛋白質のピークとムタロターゼ活性のピークが
一致していることがわかる（第１０図参照）。 次いで分子量20000カツトの限外濾過装置（東
洋濾紙製 UHP−76）を用いてフラクシヨンNo.
35の５mlを１mlまで濃縮した。 以上の精製段階の酵素活性を第２表に示す。 蛋白質濃度は、280320nmの吸光度を測定し、
OD₈₀−OD₃₂₀を算出し、ΔOD＝１を酵素液ml当
りの蛋白質0.5mgとして表示した。

【表】 硫安分画から精製酵素液までの段階で比活性は
4.91U／mg蛋白となり、粗酵素液に比べて約270
倍に増加した。 精製した酵素をデイスクポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及びSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけた。第１１図に示すように、蛋白的に
ほぼ単一バンドまで精製されていることがわか
る。第１１図中、Ａはデイスクポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、ＢはSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を示す。 なお、デイスクポリアクリルアミドゲル電気泳
動法は、pH9にて濃縮用ゲル2.5％、分離用ゲル
7.5％を使用した。試料の量は200μｇを基準とし、
泳動用電流はゲル当り4mA、指示色素としてブ
ロムフエノール・ブルーを使用し、染色はアミド
ブラツクで１時間染色の後、７％酢酸につけて、
時々酢酸をとりかながら脱染色を行つた。 又、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
は、7.5％アクリルアミドゲル（pH7.2）を使用し
た。試料（0.1％SDS溶液で希釈）の量はゲル当
り2μｇを基準とし、泳動用電流はゲル当り8mA、
指示色素としてブロムフエノール・ブルーを使用
し、染色はコマジーブルーで１時間染色後、７％
酢酸（25％メタノールを含む）に一晩浸漬後、ゲ
ル当り10mAの電流を通じて脱染色を行つた。

【図面の簡単な説明】

第１図はグルコースの酸化に及ぼすムタロター
ゼの効果を示す。第２図はムタロターゼ濃度のグ
ルコース酸化速度に及ぼす影響を示す。第３図は
本発明の方法により得られるムタロターゼの至適
pHを示す。第４図は上記酵素の安定pHを示す。
第５図は上記酵素のpH6.0における温度による失
活条件を示す。第６図は上記酵素の75℃における
熱失活速度を示す。第７図はSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による分子量の測定を示す。第
８図はセフアデツクスＧ−200のゲル濾過法によ
る分子量の測定を示す。第９図はDEAE−セフア
デツクスＡ−50によるムタロターゼの精製を示
す。第１０図はセフアクリル−Ｓ−300によるム
タロターゼの精製を示す。第１１図はムタロター
ゼのデイスクリポリアクリルアミドゲル電気泳動
及びSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｂを
示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アスペルギルス属に属し、アルドース−１−
   エピメラーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
   培養し、該培養物からアルドース−１−エピメラ
   ーゼを採取することを特徴とするアルドース−１
   −エピメラーゼの製造法。