JPH05192172A - 外来遺伝子を導入した植物根培養による物質製造方法 - Google Patents
外来遺伝子を導入した植物根培養による物質製造方法Info
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- JPH05192172A JPH05192172A JP826692A JP826692A JPH05192172A JP H05192172 A JPH05192172 A JP H05192172A JP 826692 A JP826692 A JP 826692A JP 826692 A JP826692 A JP 826692A JP H05192172 A JPH05192172 A JP H05192172A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】物質を他の物質に変換する酵素をコードする外
来遺伝子を発現する植物根を用いて、培地に添加した物
質を他の物質に変換させることを特徴とする、また、そ
の変換物を培地中に漏出させることを特徴とする物質の
製造方法に関する。 【効果】物質を他の物質に変換する酵素をコードする外
来遺伝子を発現する植物根を培養することにより、本来
その植物では変換が起こらない、あるいはきわめて変換
率が低い物質を培地に加えることにより、効率よく変換
させ製造することが可能となる。さらに、その植物根が
生産した中間物質を、より効率よく変換させることによ
り最終産物を産生し、培地に漏出させ製造することが可
能となる。
来遺伝子を発現する植物根を用いて、培地に添加した物
質を他の物質に変換させることを特徴とする、また、そ
の変換物を培地中に漏出させることを特徴とする物質の
製造方法に関する。 【効果】物質を他の物質に変換する酵素をコードする外
来遺伝子を発現する植物根を培養することにより、本来
その植物では変換が起こらない、あるいはきわめて変換
率が低い物質を培地に加えることにより、効率よく変換
させ製造することが可能となる。さらに、その植物根が
生産した中間物質を、より効率よく変換させることによ
り最終産物を産生し、培地に漏出させ製造することが可
能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、物質を他の物質に変換
する酵素をコードする外来遺伝子を発現する植物根を用
いて、培地に添加した物質を他の物質に変換させること
を特徴とする、また、その変換物を培地中に漏出させる
ことを特徴とする物質の製造方法に関する。
する酵素をコードする外来遺伝子を発現する植物根を用
いて、培地に添加した物質を他の物質に変換させること
を特徴とする、また、その変換物を培地中に漏出させる
ことを特徴とする物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】不定根、毛状根を培養している培地に物
質を添加することにより、添加した物質を変換すること
が可能であることが知られている。しかし、この方法で
は、増殖した植物根を収穫し、そこから目的とする成分
を抽出・精製といった煩雑な工程を要するので、それに
替わる方法として、培養不定根、毛状根から代謝産物を
培地に漏出させ、それを培養液から回収する方法が開発
されている。
質を添加することにより、添加した物質を変換すること
が可能であることが知られている。しかし、この方法で
は、増殖した植物根を収穫し、そこから目的とする成分
を抽出・精製といった煩雑な工程を要するので、それに
替わる方法として、培養不定根、毛状根から代謝産物を
培地に漏出させ、それを培養液から回収する方法が開発
されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、不定根、毛状
根を培養している培地に物質を添加することにより、添
加した物質を変換しようと試みても、その植物に本来変
換活性がない場合、あるいは、きわめて低い場合、物質
変換をすることは不可能である。また、培養不定根、毛
状根から代謝産物を培地に漏出させ、それを培養液から
回収する方法では、どのような物質が、どの程度生産さ
れるかは、培養に用いた植物が持つ性質により限定され
る。
根を培養している培地に物質を添加することにより、添
加した物質を変換しようと試みても、その植物に本来変
換活性がない場合、あるいは、きわめて低い場合、物質
変換をすることは不可能である。また、培養不定根、毛
状根から代謝産物を培地に漏出させ、それを培養液から
回収する方法では、どのような物質が、どの程度生産さ
れるかは、培養に用いた植物が持つ性質により限定され
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記のように植物の種類により限定され、あるいはその
植物に本来変換活性がない、あるいは、きわめて低い場
合等の問題、また、植物根が内在する物質を変換させる
方法を見いだすべく鋭意努力し、物質を所望の他の物質
に変換する酵素をコードする遺伝子を植物に導入するこ
とにより得た、その遺伝子を発現する植物根を用いて、
培地に添加した物質を他の物質に変換させることを特徴
とする、またその変換物を培地中に漏出させることを特
徴とする本発明の物質の製造方法を完成した。
前記のように植物の種類により限定され、あるいはその
植物に本来変換活性がない、あるいは、きわめて低い場
合等の問題、また、植物根が内在する物質を変換させる
方法を見いだすべく鋭意努力し、物質を所望の他の物質
に変換する酵素をコードする遺伝子を植物に導入するこ
とにより得た、その遺伝子を発現する植物根を用いて、
培地に添加した物質を他の物質に変換させることを特徴
とする、またその変換物を培地中に漏出させることを特
徴とする本発明の物質の製造方法を完成した。
【０００５】
【発明の効果】本発明により、物質を他の物質に変換す
る酵素をコードする外来遺伝子を発現する植物根を用い
て、その植物根を培養することにより、本来その植物で
は変換が起こらない、あるいはきわめて変換率が低い物
質を培地に加えることにより、効率よく変換させ製造す
ることが可能となる。さらに、その植物根が変換した変
換物を培地に漏出させ、回収を簡便化した製造法が可能
となる。
る酵素をコードする外来遺伝子を発現する植物根を用い
て、その植物根を培養することにより、本来その植物で
は変換が起こらない、あるいはきわめて変換率が低い物
質を培地に加えることにより、効率よく変換させ製造す
ることが可能となる。さらに、その植物根が変換した変
換物を培地に漏出させ、回収を簡便化した製造法が可能
となる。
【０００６】以下、本発明の方法についてさらに詳細に
解説する。本発明に使用する外来遺伝子は、植物根で発
現するプロモーター配列と、所望の物質への変換能を有
する構造遺伝子配列とを融合させた遺伝子を意味する。
その構造遺伝子として、ヒヨシアミンをスコポラミンに
変換するヒヨシアミン水酸化酵素をコードする遺伝子、
デチオビオチンをビオチンに変換するビオチン合成酵素
をコードする遺伝子、ステロール、テルペン、ジベレリ
ン、イソフラボノイドを水酸化、または酸化させるＰ４
５０酵素をコードする遺伝子、β−グルクロニドを加水
分解してＤ−グルクロンを遊離させるβーグルクロニダ
ーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、本発明で用い
たβーグルクロニダーゼが好ましい。プロモーター配列
は、植物の根で発現するアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子、ヒドロキシプロリン、リッチグライコプロテイン
遺伝子、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルス遺伝子、
ヘモグロビン遺伝子、レクチン遺伝子およびタバコＴｏ
ｂＲＢ７遺伝子を用いることができるが、下記の塩基配
列で表されるｐａｒ遺伝子のプロモーター配列（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 8013-8016 (1990))を用いる
のが好ましい。
解説する。本発明に使用する外来遺伝子は、植物根で発
現するプロモーター配列と、所望の物質への変換能を有
する構造遺伝子配列とを融合させた遺伝子を意味する。
その構造遺伝子として、ヒヨシアミンをスコポラミンに
変換するヒヨシアミン水酸化酵素をコードする遺伝子、
デチオビオチンをビオチンに変換するビオチン合成酵素
をコードする遺伝子、ステロール、テルペン、ジベレリ
ン、イソフラボノイドを水酸化、または酸化させるＰ４
５０酵素をコードする遺伝子、β−グルクロニドを加水
分解してＤ−グルクロンを遊離させるβーグルクロニダ
ーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、本発明で用い
たβーグルクロニダーゼが好ましい。プロモーター配列
は、植物の根で発現するアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子、ヒドロキシプロリン、リッチグライコプロテイン
遺伝子、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルス遺伝子、
ヘモグロビン遺伝子、レクチン遺伝子およびタバコＴｏ
ｂＲＢ７遺伝子を用いることができるが、下記の塩基配
列で表されるｐａｒ遺伝子のプロモーター配列（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 8013-8016 (1990))を用いる
のが好ましい。
【０００７】
【化３】 配列番号１ 遺伝子が導入される植物は、特に限定されるものではな
く、タバコ、ベラドンナ、ヒヨス、ズボイシア、ハシリ
ドコロ、シロイヌナズナ、ニンジン、ダイズ、イネ、コ
ムギなどが挙げられるが、本発明で用いたナス科植物が
好ましい。上記外来遺伝子を植物に導入する方法として
は、Ｔｉなどのベクターを用いる方法、パーティクルガ
ンにより直接導入する方法、植物細胞をプロトプラスト
にした後、電気刺激を与えて導入する方法、などが例示
できる。外来遺伝子を導入した植物細胞をオーキシン、
サイトカイニンなどの植物ホルモンを含む培地で培養
し、外来遺伝子が導入された形質転換植物体を得る。外
来遺伝子を導入したプロトプラストは、常法によりカル
ス化させた後、オーキシン、サイトカイニンなどの植物
ホルモンを含む培地で培養し、外来遺伝子が導入された
形質転換植物体を得る。外来遺伝子を導入した植物体か
ら植物根を得る方法としては、植物体の根を切り出す方
法、植物体、あるいは、植物体の一部にオーキシンなど
の植物ホルモンを処理して不定根を誘発させる方法、植
物体、あるいは、植物体の一部に土壌細菌アグロバクテ
リウム・リゾゲネスを感染させ、毛状根を誘発させる方
法、などが例示できる。不定根を誘発させる方法とし
て、さらに、Ｒｉバイナリーベクター法（PlantMol.Bio
l.9,973-984 (1987))がある。この方法は、まず、上記
外来遺伝子をアグロバクテリウム・リゾゲネスに導入し
て、上記外来遺伝子及びRiプラスミドを持った、アグロ
バクテリウム・リゾゲネスを作出する。この細菌を植物
組織に感染させると上記外来遺伝子が植物体の取り込ま
れるとともに、菌の持つRiプラスミド上の遺伝子の作用
によって、毛状根が誘発される。これにより、外来遺伝
子を導入した毛状根を直接得ることもできる。
く、タバコ、ベラドンナ、ヒヨス、ズボイシア、ハシリ
ドコロ、シロイヌナズナ、ニンジン、ダイズ、イネ、コ
ムギなどが挙げられるが、本発明で用いたナス科植物が
好ましい。上記外来遺伝子を植物に導入する方法として
は、Ｔｉなどのベクターを用いる方法、パーティクルガ
ンにより直接導入する方法、植物細胞をプロトプラスト
にした後、電気刺激を与えて導入する方法、などが例示
できる。外来遺伝子を導入した植物細胞をオーキシン、
サイトカイニンなどの植物ホルモンを含む培地で培養
し、外来遺伝子が導入された形質転換植物体を得る。外
来遺伝子を導入したプロトプラストは、常法によりカル
ス化させた後、オーキシン、サイトカイニンなどの植物
ホルモンを含む培地で培養し、外来遺伝子が導入された
形質転換植物体を得る。外来遺伝子を導入した植物体か
ら植物根を得る方法としては、植物体の根を切り出す方
法、植物体、あるいは、植物体の一部にオーキシンなど
の植物ホルモンを処理して不定根を誘発させる方法、植
物体、あるいは、植物体の一部に土壌細菌アグロバクテ
リウム・リゾゲネスを感染させ、毛状根を誘発させる方
法、などが例示できる。不定根を誘発させる方法とし
て、さらに、Ｒｉバイナリーベクター法（PlantMol.Bio
l.9,973-984 (1987))がある。この方法は、まず、上記
外来遺伝子をアグロバクテリウム・リゾゲネスに導入し
て、上記外来遺伝子及びRiプラスミドを持った、アグロ
バクテリウム・リゾゲネスを作出する。この細菌を植物
組織に感染させると上記外来遺伝子が植物体の取り込ま
れるとともに、菌の持つRiプラスミド上の遺伝子の作用
によって、毛状根が誘発される。これにより、外来遺伝
子を導入した毛状根を直接得ることもできる。
【０００８】本発明では、上記の方法で得られた外来遺
伝子導入植物根を、物質の変換を目的として液体培地で
培養する。培地は、既知の無機塩合成培地に炭素源を加
えたものを基本とし、これに、ビタミン類、アミノ酸
類、有機物、植物ホルモンなどを加えたものを用いる。
例えば、ＨＦ培地（Agric. Biol. Chem. 50, 2715- (19
86))、ヘラー培地、ホワイト培地、リンスマイヤーアン
ドスクーグ培地、ガンボルクのＢ５培地などが用いられ
る。物質を変換させることを目的として、遺伝子導入植
物根を培養している培地に、変換するための基質となる
物質を添加する。基質となる物質は、導入した外来遺伝
子が植物根で発現することによって変換されるものであ
る。すなわち、導入される遺伝子がヒヨシアミン水酸化
酵素遺伝子であればヒヨシアミンを、ビオチン合成酵素
遺伝子であればデチオビオチンを、Ｐ４５０遺伝子であ
れば、ステロール、テルペン、ジベレリン、イソフラボ
ノイドを、βーグルクロニダーゼ遺伝子であればメチル
ウンベリフェリルグルクロニドなどを用いることができ
る。基質となる物質を植物根培養開始時から培養後３カ
月、好ましくは植物根培養開始時から１カ月の範囲内に
おいて、１ppm から１０％の範囲の濃度で添加する。添
加方法は、限定されるものでなく、１回、数回に分け
る、あるいは、連続して添加することも可能である。基
質となる物質を添加して、さらに１時間から３カ月の範
囲、好ましくは１カ月の範囲内において、培養を続ける
ことにより、培地に添加した物質は、導入した外来遺伝
子が植物根、好ましくは、植物根の表皮組織、および、
根毛で発現することにより、外来遺伝子の基質との組み
合わせが順にヒヨシアミン水酸化酵素遺伝子に対してヒ
ヨシアミン、ビオチン合成酵素遺伝子に対してデチオビ
オチン、Ｐ４５０遺伝子に対してステロール、テルペ
ン、ジベレリン、イソフラボノイド、βーグルクロニダ
ーゼ遺伝子に対してメチルウンベリフェリルグルクロニ
ドであれば、それぞれスコポラミン、ビオチン、ステロ
ール、テルペン、ジベレリン、イソフラボノイドの水酸
化または酸化物およびメチルウンベリフェロンに変換さ
れ製造される。
伝子導入植物根を、物質の変換を目的として液体培地で
培養する。培地は、既知の無機塩合成培地に炭素源を加
えたものを基本とし、これに、ビタミン類、アミノ酸
類、有機物、植物ホルモンなどを加えたものを用いる。
例えば、ＨＦ培地（Agric. Biol. Chem. 50, 2715- (19
86))、ヘラー培地、ホワイト培地、リンスマイヤーアン
ドスクーグ培地、ガンボルクのＢ５培地などが用いられ
る。物質を変換させることを目的として、遺伝子導入植
物根を培養している培地に、変換するための基質となる
物質を添加する。基質となる物質は、導入した外来遺伝
子が植物根で発現することによって変換されるものであ
る。すなわち、導入される遺伝子がヒヨシアミン水酸化
酵素遺伝子であればヒヨシアミンを、ビオチン合成酵素
遺伝子であればデチオビオチンを、Ｐ４５０遺伝子であ
れば、ステロール、テルペン、ジベレリン、イソフラボ
ノイドを、βーグルクロニダーゼ遺伝子であればメチル
ウンベリフェリルグルクロニドなどを用いることができ
る。基質となる物質を植物根培養開始時から培養後３カ
月、好ましくは植物根培養開始時から１カ月の範囲内に
おいて、１ppm から１０％の範囲の濃度で添加する。添
加方法は、限定されるものでなく、１回、数回に分け
る、あるいは、連続して添加することも可能である。基
質となる物質を添加して、さらに１時間から３カ月の範
囲、好ましくは１カ月の範囲内において、培養を続ける
ことにより、培地に添加した物質は、導入した外来遺伝
子が植物根、好ましくは、植物根の表皮組織、および、
根毛で発現することにより、外来遺伝子の基質との組み
合わせが順にヒヨシアミン水酸化酵素遺伝子に対してヒ
ヨシアミン、ビオチン合成酵素遺伝子に対してデチオビ
オチン、Ｐ４５０遺伝子に対してステロール、テルペ
ン、ジベレリン、イソフラボノイド、βーグルクロニダ
ーゼ遺伝子に対してメチルウンベリフェリルグルクロニ
ドであれば、それぞれスコポラミン、ビオチン、ステロ
ール、テルペン、ジベレリン、イソフラボノイドの水酸
化または酸化物およびメチルウンベリフェロンに変換さ
れ製造される。
【０００９】植物根内で変換された変換物は、その植物
根を公知の方法に従い破砕することにより、回収するこ
とができる。さらに、培地等の濃度を検討することによ
り、培地中に培地中に漏出することが可能となった変換
物質は、培養液を濃縮する方法、吸着樹脂に吸着させる
方法などによって回収することができる。
根を公知の方法に従い破砕することにより、回収するこ
とができる。さらに、培地等の濃度を検討することによ
り、培地中に培地中に漏出することが可能となった変換
物質は、培養液を濃縮する方法、吸着樹脂に吸着させる
方法などによって回収することができる。
【００１０】
【実施例】次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説
明する。以下の実施例は、本発明を例示的に示すもので
あり、本発明は以下に挙げる実施例のみに限定されるも
のではない。 実施例１ ｐａｒ遺伝子の５’上流域１６７９とβ−グルクロニダ
ーゼ（以下ＧＵＳと略）遺伝子をトランスレーショナル
に結合した融合遺伝子（以下ｐ１Ｅ−ＧＵＳ遺伝子と
略）を、Ｔｉバイナリーベクター法によってタバコ植物
に導入した。遺伝子を導入したタバコ植物の自殖第一世
代の幼植物の葉に、ＹＥＢ培地で２夜培養したアグロバ
クテリウム・リゾゲネス ATCC 15834 株を接種し、ＬＳ
寒天培地に置床して人工気象（１６時間明所２５度、８
時間暗所２１度）で９日間培養し、不定根を誘発した。
その後、1mg/mlカルベニシニンを含むＬＳ寒天培地に移
植し、２８度、明所で培養した。培養１１日後、誘発し
た不定根を１本ずつ切取り、1mg/mlカルベニシニンを含
むＨＦ寒天培地で１週間ごとに３代培養し、増殖のよい
クローンを選抜し、形質転換毛状根（以下ｐ１Ｅ−ＧＵ
Ｓ毛状根と略）を得た。誘発した根端を含む約１cmの毛
状根に、２００μｌのＸ−グルクロニド( 以下Ｘ−ｇｌ
ｕｃと略）反応液（5.8mM X-gluc,0.5mM K3 Fe(CN)6 ,
0.5mM K4 Fe(CN) 6 ,0.3% Triton X-100) を加え３０度
暗所で４時間インキュベートする方法で組織化学染色に
よりｐａｒ遺伝子プロモーターの発現部位を調べた。そ
の結果、根毛及び根の表皮で高いＧＵＳ活性を示した。
さらに、毛状根を抽出緩衝液（30.5mM Na2 HPO 4 ,19.
5mM NaHPO 4 ,10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% so
diumN-lauroyl sarcosinate, 10mM mercaptoethanol)で
抽出し、タンパク量100 μgに調製した抽出液375 μl
を125 μl のメチルウンベリフェリルグルクロニド(以
下ＭＵＧと略）反応液（4mM MUG/抽出緩衝液) で３７
度、０から８０分間反応させた後、0.3M Na 2 CO3 で反
応を停止し、励起波長365nm 、蛍光波長455nm で測定す
る方法で、ＧＵＳ活性を測定したところ、根抽出物のＧ
ＵＳ活性は１３２nmol MU/mg protein/minであった。
明する。以下の実施例は、本発明を例示的に示すもので
あり、本発明は以下に挙げる実施例のみに限定されるも
のではない。 実施例１ ｐａｒ遺伝子の５’上流域１６７９とβ−グルクロニダ
ーゼ（以下ＧＵＳと略）遺伝子をトランスレーショナル
に結合した融合遺伝子（以下ｐ１Ｅ−ＧＵＳ遺伝子と
略）を、Ｔｉバイナリーベクター法によってタバコ植物
に導入した。遺伝子を導入したタバコ植物の自殖第一世
代の幼植物の葉に、ＹＥＢ培地で２夜培養したアグロバ
クテリウム・リゾゲネス ATCC 15834 株を接種し、ＬＳ
寒天培地に置床して人工気象（１６時間明所２５度、８
時間暗所２１度）で９日間培養し、不定根を誘発した。
その後、1mg/mlカルベニシニンを含むＬＳ寒天培地に移
植し、２８度、明所で培養した。培養１１日後、誘発し
た不定根を１本ずつ切取り、1mg/mlカルベニシニンを含
むＨＦ寒天培地で１週間ごとに３代培養し、増殖のよい
クローンを選抜し、形質転換毛状根（以下ｐ１Ｅ−ＧＵ
Ｓ毛状根と略）を得た。誘発した根端を含む約１cmの毛
状根に、２００μｌのＸ−グルクロニド( 以下Ｘ−ｇｌ
ｕｃと略）反応液（5.8mM X-gluc,0.5mM K3 Fe(CN)6 ,
0.5mM K4 Fe(CN) 6 ,0.3% Triton X-100) を加え３０度
暗所で４時間インキュベートする方法で組織化学染色に
よりｐａｒ遺伝子プロモーターの発現部位を調べた。そ
の結果、根毛及び根の表皮で高いＧＵＳ活性を示した。
さらに、毛状根を抽出緩衝液（30.5mM Na2 HPO 4 ,19.
5mM NaHPO 4 ,10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% so
diumN-lauroyl sarcosinate, 10mM mercaptoethanol)で
抽出し、タンパク量100 μgに調製した抽出液375 μl
を125 μl のメチルウンベリフェリルグルクロニド(以
下ＭＵＧと略）反応液（4mM MUG/抽出緩衝液) で３７
度、０から８０分間反応させた後、0.3M Na 2 CO3 で反
応を停止し、励起波長365nm 、蛍光波長455nm で測定す
る方法で、ＧＵＳ活性を測定したところ、根抽出物のＧ
ＵＳ活性は１３２nmol MU/mg protein/minであった。
【００１１】実施例２ Ｔｉバイナリーベクター法によってタバコ植物にカリフ
ラワーモザイクウイルスの３５ＳプロモーターとＧＵＳ
遺伝子を結合した融合遺伝子（以下３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝
子と略）を導入した。遺伝子を導入したタバコ植物に土
壌細菌アグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させ形質
転換毛状根（以下３５Ｓ−ＧＵＳ毛状根と略）を得た。
誘発した毛状根を実施例1 と同じＸ−グルクロニドを用
いた組織化学染色によりｐａｒ遺伝子プロモーターの発
現部位を調べたところ、維管束でＧＵＳ活性が見られ
た。さらに、実施例1 と同じ方法で測定した根抽出物の
ＧＵＳ活性は７nmol MU/mg protein/minであった。
ラワーモザイクウイルスの３５ＳプロモーターとＧＵＳ
遺伝子を結合した融合遺伝子（以下３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝
子と略）を導入した。遺伝子を導入したタバコ植物に土
壌細菌アグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させ形質
転換毛状根（以下３５Ｓ−ＧＵＳ毛状根と略）を得た。
誘発した毛状根を実施例1 と同じＸ−グルクロニドを用
いた組織化学染色によりｐａｒ遺伝子プロモーターの発
現部位を調べたところ、維管束でＧＵＳ活性が見られ
た。さらに、実施例1 と同じ方法で測定した根抽出物の
ＧＵＳ活性は７nmol MU/mg protein/minであった。
【００１２】実施例３ 形質転換タバコの毛状根培養の培地にＭＵＧを加えるこ
とによる、ＭＵＧからメチルウンベリフェロン（以下Ｍ
Ｕと略）への変換を調べた。形質転換毛状根のＧＵＳ
は、培養の過程で根の組織から培養液中に漏出する可能
性もあった。そこで、根の内部のＧＵＳと培地に漏出し
たＧＵＳとを区別するために次のような実験を行った。
すなわち、湿重２００mgの毛状根を、根の生育に適した
30mlのＨＦ液体培地で２５度、暗所、85rpm で１０日間
旋回培養した後、培地から取り出し滅菌水で洗い、湿重
２００mgを３０mlの新鮮なＨＦ液体培地に植込んだ。ま
ず実験Ａでは、培地の1/10量の20mM MUG/30.5mM Na2 HP
O 4 ,19.5mM NaHPO 4 を添加し、２５度、暗所、85rpm
でインキュベートした。0 から16時間に培養液550 μl
を取り、450 μl の0.3M Na2 CO3 で反応と停止した
後、実施例１の方法で蛍光を測定することによりＭＵの
生成量を測定し、ＭＵＧからＭＵへの変換量を求めた。
これにより、根の組織内部のＧＵＳと培地に漏出したＧ
ＵＳの両方によるトータルなＭＵＧの変換が求められ
る。一方、実験Ｂでは、湿重２００mgの毛状根を３０ml
の新鮮なＨＦ液体培地に植え込み０から１６時間インキ
ュベートした後、培養液だけを取り出しフィルター濾過
後、実験Ａと同じ濃度のＭＵＧを添加し、同一時間イン
キュベートした後にＭＵＧへの変換量を求めた。これに
より、培地に漏出したＧＵＳによるＭＵＧの変換が求め
られる。実験は、２５度、暗所で行なった。ｐ１Ｅ−Ｇ
ＵＳ毛状根では、時間に比例して変換量が増し、約８時
間後に平衡に達し。変換効率は、８０pM MU/mg FW/min
であった。培地に漏出したと考えられるＧＵＳによるＭ
ＵＧの変換は、インキュベーション初期から変換が起こ
っているものの、４０分で、トータル 0.6に対して0.0
5、８０分で、 1.3に対して0.12（それぞれ相対値）
と、全体の変換の１割以下の寄与であった。
とによる、ＭＵＧからメチルウンベリフェロン（以下Ｍ
Ｕと略）への変換を調べた。形質転換毛状根のＧＵＳ
は、培養の過程で根の組織から培養液中に漏出する可能
性もあった。そこで、根の内部のＧＵＳと培地に漏出し
たＧＵＳとを区別するために次のような実験を行った。
すなわち、湿重２００mgの毛状根を、根の生育に適した
30mlのＨＦ液体培地で２５度、暗所、85rpm で１０日間
旋回培養した後、培地から取り出し滅菌水で洗い、湿重
２００mgを３０mlの新鮮なＨＦ液体培地に植込んだ。ま
ず実験Ａでは、培地の1/10量の20mM MUG/30.5mM Na2 HP
O 4 ,19.5mM NaHPO 4 を添加し、２５度、暗所、85rpm
でインキュベートした。0 から16時間に培養液550 μl
を取り、450 μl の0.3M Na2 CO3 で反応と停止した
後、実施例１の方法で蛍光を測定することによりＭＵの
生成量を測定し、ＭＵＧからＭＵへの変換量を求めた。
これにより、根の組織内部のＧＵＳと培地に漏出したＧ
ＵＳの両方によるトータルなＭＵＧの変換が求められ
る。一方、実験Ｂでは、湿重２００mgの毛状根を３０ml
の新鮮なＨＦ液体培地に植え込み０から１６時間インキ
ュベートした後、培養液だけを取り出しフィルター濾過
後、実験Ａと同じ濃度のＭＵＧを添加し、同一時間イン
キュベートした後にＭＵＧへの変換量を求めた。これに
より、培地に漏出したＧＵＳによるＭＵＧの変換が求め
られる。実験は、２５度、暗所で行なった。ｐ１Ｅ−Ｇ
ＵＳ毛状根では、時間に比例して変換量が増し、約８時
間後に平衡に達し。変換効率は、８０pM MU/mg FW/min
であった。培地に漏出したと考えられるＧＵＳによるＭ
ＵＧの変換は、インキュベーション初期から変換が起こ
っているものの、４０分で、トータル 0.6に対して0.0
5、８０分で、 1.3に対して0.12（それぞれ相対値）
と、全体の変換の１割以下の寄与であった。
【００１３】実験例４ 実験例３と同じ条件で、３５Ｓ−ＧＵＳ毛状根によるＭ
ＵＧからＭＵの変換を調べた。３５Ｓ−ＧＵＳ毛状根で
は、時間に比例して変換量が増し、約８時間後に平衡に
達した。変換効率は、７pM MU/mg FW/min であった。培
地に漏出したと考えられるＧＵＳによるＭＵＧの変換
は、インキュベート約８０分目にわずかに検出された。
ＵＧからＭＵの変換を調べた。３５Ｓ−ＧＵＳ毛状根で
は、時間に比例して変換量が増し、約８時間後に平衡に
達した。変換効率は、７pM MU/mg FW/min であった。培
地に漏出したと考えられるＧＵＳによるＭＵＧの変換
は、インキュベート約８０分目にわずかに検出された。
【００１４】実験例５ ｐ１Ｅ−ＧＵＳ遺伝子をエレクトロポレーション法によ
りアグロバクテリウム・リゾゲネスに導入し、Ｒｉプラ
スミドとｐａｒ−ＧＵＳ遺伝子を持つアグロバクテリウ
ム・リゾゲネスを得た。このＲｉバイナリーベクターを
持つアグロバクテリウム・リゾゲネスをタバコ植物に接
種し、誘発した毛状根をカナマシンでスクリーニングす
ることにより、２つのプラスミド由来のＴ−ＤＮＡが取
り込まれた形質転換タバコ毛状根クローンを単離した。
形質転換タバコ毛状根では、毛状根の表皮全体および、
根毛で強いＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。それぞれ独
立な５つの毛状根クローンについて、毛状根抽出物のＧ
ＵＳ活性、および、毛状根培養におけるトータルなＧＵ
ＳによるＭＵＧの変換能を実験例３と同様に求めたとこ
ろ、各クローンのＧＵＳ活性は順に、２０，２２，１１
０，５１，２３nmolMU/mg protein/min、ＭＵＧ変換能
は順に、４８，４３，１１０，７５，５５pMMU/mg FW/m
in であった。
りアグロバクテリウム・リゾゲネスに導入し、Ｒｉプラ
スミドとｐａｒ−ＧＵＳ遺伝子を持つアグロバクテリウ
ム・リゾゲネスを得た。このＲｉバイナリーベクターを
持つアグロバクテリウム・リゾゲネスをタバコ植物に接
種し、誘発した毛状根をカナマシンでスクリーニングす
ることにより、２つのプラスミド由来のＴ−ＤＮＡが取
り込まれた形質転換タバコ毛状根クローンを単離した。
形質転換タバコ毛状根では、毛状根の表皮全体および、
根毛で強いＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。それぞれ独
立な５つの毛状根クローンについて、毛状根抽出物のＧ
ＵＳ活性、および、毛状根培養におけるトータルなＧＵ
ＳによるＭＵＧの変換能を実験例３と同様に求めたとこ
ろ、各クローンのＧＵＳ活性は順に、２０，２２，１１
０，５１，２３nmolMU/mg protein/min、ＭＵＧ変換能
は順に、４８，４３，１１０，７５，５５pMMU/mg FW/m
in であった。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１６７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴：promoter 配列 GAATTCTTTA GCCTTTAAAT TGCTAGTTTT CGTTAAATGG TCATAACTTG AGCTATGGAC 60 CTCCAAATTA AATTTCGGGC ATACGCTCAA ATCCCAAATT ACGATACGGA GCTACCGGAA 120 CTGTCAAAAT ACTGATCCGG GTCCGTTTGC TAAAAACGTT GACCAAAGTC CACTAAGTTG 180 AGTTTTAAAA CTTTATTTCA CATTTTAATC CATTTTTTAC ATGAAAACTT TCCGGAAAAT 240 ACGGAGTATG CACGCAAGTC GAGGAATGAT AAATGGTACT TTTCGAAGTT TTAGAACTCA 300 AAATTACTTA TTAAATTTAA AGATGACATT TTGGGTCATC ACATTGATGA AAATTTTGAC 360 ATTAATATCT GAGAACTTTC TTTGACCTTT TTCGATTCTA ATCCAATCAA TTCAACAGTG 420 TAAGGTGAAG CAGTCAATTT AAAGGAAGGC CTTTAAATTC TAAAATATTG TACTTTTCCT 480 GCGCTTCTAA AAGTGAACGA CAAAGAAAAA ATAGTTATTC TTGAACTTAA TATTGTACAA 540 TAGGATAAAT TTTAACTATC TATAAAAAGA GAACAAAACC TTAATCTCTT CAAAATAATA 600 TTATAAGAAG TAACATAATT GTCAAATGAA ATACACATAA GAAGCACATA AATTTAAATG 660 CCGTATTAAA CTTACAGTAT ACTATAGCGG AAGTTGGCTT GATAAAGGAA CGCTGAGGAG 720 AGTAGCCGAT GGTGAAACAC TAACATCAAG TGCAAAAGAA AGAAAAACTG AAAACAGAAG 780 ATGAATGTTT GAAGTGGGTA AAAGATTACT TAAAAGATAG GTTTGGTTAA CAAATGATTG 840 TGACTGTTAC GAAGCAGTGT GAACCGTTGG GACTTTTAAT ATTCTTCGGC AGAAGAACAT 900 TGCTCTTTCC ACGTATGTAG TCTTTGTCTA CTTGTAGTTT TTTTTAATTT AAATTAAATA 960 AGTTAATTAG AGAAATAATA AGAAGGATAT TTTAGTAATT CAACTTTTAA CTTTTAGGTT 1020 TCCCACTTAT AATATAATAT AGATATAGTT TTTTTTAATT TAAATTAAAT AAGTTAATTA 1080 GAGAAATAAT AAGAAGGATA TTTTAGTAAT TCAACTTTTA ACTTTTAGGG TTTCCACTTA 1140 TAATATAATA TAGATATAGA TATAGATATA GATATAGATA AAGATATATA GATATAGATA 1200 GATAATATAG ATGGATGAGT CATTGGCGAT AAAGTGAGGA TGTTTCATTT TTGTTATTAA 1260 AAACTTACTA CTCCTTAAAT ATAAAATATG ATTCCTTTTA AAAAAGAAAT AGAATAAAAA 1320 TAAAGATAAA ACACTAAAAA TAAATTAATT GTCTAGACAA AATCTACCGT TCACCTCAAT 1380 TAATACACAT CCCCGTCCAC ATCATGAAGT AGCTAGCACA AGCGTACAGA TCAGTTGAAA 1440 GAAGAAAAGG GTCCAGTCCT AAATATCCAA ATGTTCATGA AAGGAGGACA ACTTAGTTTT 1500 TTCTACTAGA AAGAATATTT TGACGAATTT CGTTCACATT GGCATGCTTT AATTATATTA 1560 AGTAGTCTTT CTTGGAAAAG AAGTATTTGC AATATCAAAC CAAATCTTCC CATTACGCAA 1620 GCAATGACAT CTAAGCAAAT ATATATCACT ATAAATAGTA CTACTAATGT TCAATGACT 1679
Claims (14)
- 【請求項１】物質を他の物質に変換する酵素をコードす
る外来遺伝子を発現する植物根を用いて、培地に添加し
た物質を他の物質に変換させることを特徴とする物質の
製造方法 - 【請求項２】培地に添加した物質を他の物質に変換さ
せ、その変換物を培地に漏出させることを特徴とする請
求項１記載の物質製造方法 - 【請求項３】培養植物根が毛状根であることを特徴とす
る請求項１記載の物質製造方法 - 【請求項４】培養植物根が毛状根であることを特徴とす
る請求項２記載の物質製造方法 - 【請求項５】培養植物根が、根の表皮組織および根毛で
ある請求項１記載の物質製造方法 - 【請求項６】培養植物根が、根の表皮組織および根毛で
ある請求項２記載の物質製造方法 - 【請求項７】培養植物根がナス科植物に属するものであ
ることを特徴とする請求項１記載の物質製造方法 - 【請求項８】培養植物根がナス科植物に属するものであ
ることを特徴とする請求項２記載の物質製造方法 - 【請求項９】導入する外来遺伝子のプロモーターが下記
に塩基配列で表されるｐａｒ遺伝子の５’上流域１６７
９塩基までの配列であることを特徴とする請求項１記載
の物質製造方法 【化１】 配列番号１ - 【請求項１０】導入する外来遺伝子のプロモーターが下
記に塩基配列で表されるｐａｒ遺伝子の５’上流域１６
７９塩基までの配列であることを特徴とする請求項２記
載の物質製造方法 【化２】 配列番号１ - 【請求項１１】導入する外来遺伝子のプロモーターが３
５Ｓカリフラワーモザイクウィルスであることを特徴と
する請求項１記載の物質製造方法 - 【請求項１２】導入する外来遺伝子のプロモーターが３
５Ｓカリフラワーモザイクウィルスであることを特徴と
する請求項２記載の物質製造方法 - 【請求項１３】導入する外来遺伝子がβ−グルクロニダ
ーゼであることを特徴とする請求項１記載の物質製造方
法 - 【請求項１４】導入する外来遺伝子がβ−グルクロニダ
ーゼであることを特徴とする請求項２記載の物質製造方
法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP826692A JPH05192172A (ja) | 1992-01-21 | 1992-01-21 | 外来遺伝子を導入した植物根培養による物質製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP826692A JPH05192172A (ja) | 1992-01-21 | 1992-01-21 | 外来遺伝子を導入した植物根培養による物質製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192172A true JPH05192172A (ja) | 1993-08-03 |
Family
ID=11688359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP826692A Pending JPH05192172A (ja) | 1992-01-21 | 1992-01-21 | 外来遺伝子を導入した植物根培養による物質製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05192172A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000053763A1 (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize metallothionein gene and promoter |
| EP3379253A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-26 | Biogemma | Method for determining the level of zygosity of a seed |
-
1992
- 1992-01-21 JP JP826692A patent/JPH05192172A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000053763A1 (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize metallothionein gene and promoter |
| US6774282B1 (en) | 1999-03-08 | 2004-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize metallothionein gene and promoter |
| EP3379253A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-26 | Biogemma | Method for determining the level of zygosity of a seed |
| WO2018172522A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-27 | Biogemma | Method for determining the level of zygosity of a seed |
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