JPH05192199A - 細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法 - Google Patents
細胞中の特異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡの検出法Info
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- JPH05192199A JPH05192199A JP4251156A JP25115692A JPH05192199A JP H05192199 A JPH05192199 A JP H05192199A JP 4251156 A JP4251156 A JP 4251156A JP 25115692 A JP25115692 A JP 25115692A JP H05192199 A JPH05192199 A JP H05192199A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 インビボ細胞またはインビトロで保存された
細胞中に存在する特異的ｍＲＮＡの存在を検出し、また
はその量を測定する方法を提供する。 【構成】 本発明方法は、原核生物および真核生物のス
クリーニングに利用することができ、これにはヒトを疾
病状態の存在につきスクリーニングすることが含まれ
る。本発明方法は、化学物質が１種類または数種類の遺
伝子産物に及ぼす作用であって、それらの遺伝子の転写
により生じるｍＲＮＡの存在および量によって示される
ものをインビトロスクリーニングするためにも利用しう
る。本発明方法は特に、多数の化合物をそれらの化合物
が遺伝子産物に及ぼす作用につきスクリーニングするの
に好適である。さらに本発明は、細胞中の特異的ｍＲＮ
Ａの存在に作用を及ぼしうる化合物に関するものであ
る。本発明方法はウイルス、微生物、植物および動物に
おける新規な遺伝子構造体の同定にも利用しうる。ま
た、本発明は細胞からＲＮＡおよびＤＮＡを単離するた
めの新規な方法に関するものである。
細胞中に存在する特異的ｍＲＮＡの存在を検出し、また
はその量を測定する方法を提供する。 【構成】 本発明方法は、原核生物および真核生物のス
クリーニングに利用することができ、これにはヒトを疾
病状態の存在につきスクリーニングすることが含まれ
る。本発明方法は、化学物質が１種類または数種類の遺
伝子産物に及ぼす作用であって、それらの遺伝子の転写
により生じるｍＲＮＡの存在および量によって示される
ものをインビトロスクリーニングするためにも利用しう
る。本発明方法は特に、多数の化合物をそれらの化合物
が遺伝子産物に及ぼす作用につきスクリーニングするの
に好適である。さらに本発明は、細胞中の特異的ｍＲＮ
Ａの存在に作用を及ぼしうる化合物に関するものであ
る。本発明方法はウイルス、微生物、植物および動物に
おける新規な遺伝子構造体の同定にも利用しうる。ま
た、本発明は細胞からＲＮＡおよびＤＮＡを単離するた
めの新規な方法に関するものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インビボ細胞またはイ
ンビトロで保存された細胞中に存在する特異的ｍＲＮＡ
の存在を検出し、またはその量を測定する方法に関する
ものである。本発明方法は、原核生物および真核生物の
スクリーニングに利用することができ、これにはヒトを
疾病状態の存在につきスクリーニングすることが含まれ
る。本発明方法は、化学物質が１種類または数種類の遺
伝子産物に及ぼす作用であって、それらの遺伝子の転写
により生じるｍＲＮＡの存在および量によって示される
ものをインビトロスクリーニングするためにも利用しう
る。本発明方法は特に、多数の化合物をそれらの化合物
が遺伝子産物に及ぼす作用につきスクリーニングするの
に好適である。さらに本発明は、細胞中の特異的ｍＲＮ
Ａの存在に作用を及ぼしうる化合物に関するものであ
る。
ンビトロで保存された細胞中に存在する特異的ｍＲＮＡ
の存在を検出し、またはその量を測定する方法に関する
ものである。本発明方法は、原核生物および真核生物の
スクリーニングに利用することができ、これにはヒトを
疾病状態の存在につきスクリーニングすることが含まれ
る。本発明方法は、化学物質が１種類または数種類の遺
伝子産物に及ぼす作用であって、それらの遺伝子の転写
により生じるｍＲＮＡの存在および量によって示される
ものをインビトロスクリーニングするためにも利用しう
る。本発明方法は特に、多数の化合物をそれらの化合物
が遺伝子産物に及ぼす作用につきスクリーニングするの
に好適である。さらに本発明は、細胞中の特異的ｍＲＮ
Ａの存在に作用を及ぼしうる化合物に関するものであ
る。
【０００２】さらにまた、本発明方法はウイルス、微生
物、植物および動物における新規な遺伝子構造体の同定
にも利用しうる。また、本発明は細胞からＲＮＡおよび
ＤＮＡを単離するための新規な方法に関するものであ
る。
物、植物および動物における新規な遺伝子構造体の同定
にも利用しうる。また、本発明は細胞からＲＮＡおよび
ＤＮＡを単離するための新規な方法に関するものであ
る。
【０００３】
【従来の技術】９６ウェル−ミクロタイターディッシュ
形式で遺伝子産物である蛋白質の発現を特異的に監視す
るために、酵素増幅による抗体アッセイ法が効果的に用
いられている。Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ
ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙｓ（ＥＬＩＳ
Ａ），ボラー，ビドウェルおよびバートレット（Ｖｏｌ
ｌｅｒ，Ａ．，Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｂａｒｔｌ
ｅｔｔ，Ａ．）（１９７９）ＩＳＢＮ ０−９０６０３
６．０１．１．を参照されたい。しかし同様にｍＲＮＡ
遺伝子産物を９６ウェル−ミクロタイターディッシュ形
式で監視する試みは、採用した方法の感度の欠如、およ
び簡便なｍＲＮＡ単離法が無いことにより失敗した。Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，アウスベル，ブレント，キン
グストン，ムーア，セイドマン，スミスおよびストルー
ル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．
Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒ，Ｊ．Ｇ．Ｓ
ｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈ
ｌ），ＥＤＳ．，グリーン・パブリシング・アソシエー
ツ・アンド・ワイリイ−インターサイエンス（１９８
７）。さらに特定の遺伝子の増加および／または減少調
節は、後続検出可能な遺伝子産物の異種発現に依存する
レポーター遺伝子構造体により間接的に測定しうる。Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，前掲。後者の方法は有用で
はあるが、それには幾つかの制限がある。それらの制限
には下記のものが含まれる：適宜な構造体を調製し、同
定し、そして解明する必要がある；その構造体は異種プ
ロモーターおよびレポーター遺伝子からなり、このため
プロモーターを入手し、解明することが必要になる；プ
ロモーター活性のみが測定される；活性の測定に酵素を
用いることは、翻訳および／または酵素の阻害剤がアッ
セイの統合性を損なう可能性があることを意味する；な
らびにレポーター遺伝子の挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ）が天然染色体部位を標的とせず、しばしば細胞当た
り多重コピーが生じ、これは遺伝子調節に作用を及ぼす
可能性がある。
形式で遺伝子産物である蛋白質の発現を特異的に監視す
るために、酵素増幅による抗体アッセイ法が効果的に用
いられている。Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ
ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙｓ（ＥＬＩＳ
Ａ），ボラー，ビドウェルおよびバートレット（Ｖｏｌ
ｌｅｒ，Ａ．，Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｂａｒｔｌ
ｅｔｔ，Ａ．）（１９７９）ＩＳＢＮ ０−９０６０３
６．０１．１．を参照されたい。しかし同様にｍＲＮＡ
遺伝子産物を９６ウェル−ミクロタイターディッシュ形
式で監視する試みは、採用した方法の感度の欠如、およ
び簡便なｍＲＮＡ単離法が無いことにより失敗した。Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，アウスベル，ブレント，キン
グストン，ムーア，セイドマン，スミスおよびストルー
ル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．
Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒ，Ｊ．Ｇ．Ｓ
ｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈ
ｌ），ＥＤＳ．，グリーン・パブリシング・アソシエー
ツ・アンド・ワイリイ−インターサイエンス（１９８
７）。さらに特定の遺伝子の増加および／または減少調
節は、後続検出可能な遺伝子産物の異種発現に依存する
レポーター遺伝子構造体により間接的に測定しうる。Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，前掲。後者の方法は有用で
はあるが、それには幾つかの制限がある。それらの制限
には下記のものが含まれる：適宜な構造体を調製し、同
定し、そして解明する必要がある；その構造体は異種プ
ロモーターおよびレポーター遺伝子からなり、このため
プロモーターを入手し、解明することが必要になる；プ
ロモーター活性のみが測定される；活性の測定に酵素を
用いることは、翻訳および／または酵素の阻害剤がアッ
セイの統合性を損なう可能性があることを意味する；な
らびにレポーター遺伝子の挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏ
ｎ）が天然染色体部位を標的とせず、しばしば細胞当た
り多重コピーが生じ、これは遺伝子調節に作用を及ぼす
可能性がある。
【０００４】特定の遺伝子に対する特異性を付与するた
めの遺伝子特異性オリゴマー、および特異的遺伝子配列
を検出可能な水準にまで増幅するための特定のＤＮＡポ
リメラーゼを用いる方法、即ち一般にポリメラーゼ連鎖
反応またはＰＣＲとして知られている方法が、サイキ
（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１
３５０（１９８５）およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．
Ｋ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８）
に記載されている。
めの遺伝子特異性オリゴマー、および特異的遺伝子配列
を検出可能な水準にまで増幅するための特定のＤＮＡポ
リメラーゼを用いる方法、即ち一般にポリメラーゼ連鎖
反応またはＰＣＲとして知られている方法が、サイキ
（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１
３５０（１９８５）およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．
Ｋ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８）
に記載されている。
【０００５】９６ウェル−ミクロタイターディッシュの
ウェル中においてインビトロで培養された細胞からｍＲ
ＮＡを検出しうることが報告されている。ルセル・ヒグ
チ（Ｒｕｓｓｅｌ Ｈｉｇｕｃｈｉ），ＰＣＲのための
簡単かつ迅速な試料調製法，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，ヘンリーＡ．エルリッヒ（Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｌ
ｒｉｃｈ）編，Ｍ．ストックトン・プレス（１９８
９）。しかしそこで用いられているｍＲＮＡ単離法は、
特にスクリーニングが複数の試料を伴うものである場
合、スクリーニング法にＰＣＲを利用するのに役立たな
い。
ウェル中においてインビトロで培養された細胞からｍＲ
ＮＡを検出しうることが報告されている。ルセル・ヒグ
チ（Ｒｕｓｓｅｌ Ｈｉｇｕｃｈｉ），ＰＣＲのための
簡単かつ迅速な試料調製法，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，ヘンリーＡ．エルリッヒ（Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｌ
ｒｉｃｈ）編，Ｍ．ストックトン・プレス（１９８
９）。しかしそこで用いられているｍＲＮＡ単離法は、
特にスクリーニングが複数の試料を伴うものである場
合、スクリーニング法にＰＣＲを利用するのに役立たな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞中の特
異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡ配列を検出および測定するた
めの新規な方法に関するものである。さらに本発明は、
細胞からＲＮＡおよびＤＮＡ配列を調製するための新規
な方法に関するものである。本発明方法に用いられる細
胞は、インビボ源から直接採取されたものであってもよ
く、またはインビトロで保存されたものであってもよ
い。本発明方法により検出される特異的ｍＲＮＡ配列は
いずれかのクラスまたはタイプに限定されない。ここに
記載される方法は、それからｃＤＮＡを産生しうる限り
いかなるｍＲＮＡ種にも利用しうる。
異的ｍＲＮＡおよびＤＮＡ配列を検出および測定するた
めの新規な方法に関するものである。さらに本発明は、
細胞からＲＮＡおよびＤＮＡ配列を調製するための新規
な方法に関するものである。本発明方法に用いられる細
胞は、インビボ源から直接採取されたものであってもよ
く、またはインビトロで保存されたものであってもよ
い。本発明方法により検出される特異的ｍＲＮＡ配列は
いずれかのクラスまたはタイプに限定されない。ここに
記載される方法は、それからｃＤＮＡを産生しうる限り
いかなるｍＲＮＡ種にも利用しうる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】細胞中の特異的ｍＲＮＡ
配列を検出および測定するための新規な本発明方法は、
場合に応じて細胞から生物学的流体または培地を除去
し；容器内で細胞に水を添加し、そして容器を約９０−
約１１５℃の温度の液体中に約２−約１２分間保持して
細胞を溶解することにより、細胞溶解質を調製し；細胞
溶解質を放冷し；細胞溶解質中に存在するｍＲＮＡ配列
１または２以上からｃＤＮＡ配列を調製し；これら１ま
たは２以上のｃＤＮＡ配列のコピー数を増幅し；そして
これら１または２以上のｃＤＮＡ配列の存在を検出し、
かつ所望によりその量を測定する工程を含む。所望によ
り、かつ好ましくは、細胞溶解の前に細胞を等張液で洗
浄し、次いで細胞から等張液を除去する。さらに所望に
より、かつ好ましくは、ｃＤＮＡ配列を含有する細胞溶
解質を増幅の前にプロテイナーゼで処理する。好ましい
プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。さらに、細
胞を入れた容器を約９９℃の温度の液体中に約４−約８
分間保持することにより細胞を溶解することが好まし
く、約６分の期間が特に好ましい。
配列を検出および測定するための新規な本発明方法は、
場合に応じて細胞から生物学的流体または培地を除去
し；容器内で細胞に水を添加し、そして容器を約９０−
約１１５℃の温度の液体中に約２−約１２分間保持して
細胞を溶解することにより、細胞溶解質を調製し；細胞
溶解質を放冷し；細胞溶解質中に存在するｍＲＮＡ配列
１または２以上からｃＤＮＡ配列を調製し；これら１ま
たは２以上のｃＤＮＡ配列のコピー数を増幅し；そして
これら１または２以上のｃＤＮＡ配列の存在を検出し、
かつ所望によりその量を測定する工程を含む。所望によ
り、かつ好ましくは、細胞溶解の前に細胞を等張液で洗
浄し、次いで細胞から等張液を除去する。さらに所望に
より、かつ好ましくは、ｃＤＮＡ配列を含有する細胞溶
解質を増幅の前にプロテイナーゼで処理する。好ましい
プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。さらに、細
胞を入れた容器を約９９℃の温度の液体中に約４−約８
分間保持することにより細胞を溶解することが好まし
く、約６分の期間が特に好ましい。
【０００８】細胞中の特異的ＤＮＡを検出するための新
規な本発明方法は、場合に応じて細胞から生物学的流体
または培地を除去し；容器内で細胞に水を添加し、そし
て容器を約９０−約１１５℃の温度の液体中に約２−約
１２分間保持して細胞を溶解することにより、細胞溶解
質を調製し；細胞溶解質を放冷し；目的とするＤＮＡ配
列のコピー数を増幅し；そしてこれらＤＮＡ配列の存在
を検出する工程を含む。上記のように所望により、かつ
好ましくは、細胞溶解の前に細胞を等張液で洗浄し、そ
して等張液を除去する。同様に、細胞を入れた容器を約
９９℃の温度の液体中に約４−約８分間保持することに
より細胞を溶解することが好ましく、約６分の期間が特
に好ましい。
規な本発明方法は、場合に応じて細胞から生物学的流体
または培地を除去し；容器内で細胞に水を添加し、そし
て容器を約９０−約１１５℃の温度の液体中に約２−約
１２分間保持して細胞を溶解することにより、細胞溶解
質を調製し；細胞溶解質を放冷し；目的とするＤＮＡ配
列のコピー数を増幅し；そしてこれらＤＮＡ配列の存在
を検出する工程を含む。上記のように所望により、かつ
好ましくは、細胞溶解の前に細胞を等張液で洗浄し、そ
して等張液を除去する。同様に、細胞を入れた容器を約
９９℃の温度の液体中に約４−約８分間保持することに
より細胞を溶解することが好ましく、約６分の期間が特
に好ましい。
【０００９】上記方法に用いられるＲＮＡおよびＤＮＡ
を単離するための新規な方法は、それからＲＮＡおよび
ＤＮＡを得ることを目的とする細胞に容器内で水を添加
し、そして容器を約９０−約１１５℃の温度の液体中に
約２−約１２分間保持して細胞を溶解することよりな
り、約９９℃の温度および約４−約８分の期間が好まし
い。約６分の期間が特に好ましい。調製された細胞溶解
質は細胞残屑を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む細胞質
内容物はその中に存在する。
を単離するための新規な方法は、それからＲＮＡおよび
ＤＮＡを得ることを目的とする細胞に容器内で水を添加
し、そして容器を約９０−約１１５℃の温度の液体中に
約２−約１２分間保持して細胞を溶解することよりな
り、約９９℃の温度および約４−約８分の期間が好まし
い。約６分の期間が特に好ましい。調製された細胞溶解
質は細胞残屑を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む細胞質
内容物はその中に存在する。
【００１０】新規な本発明方法は簡便な核酸調製法を提
供し、これを当業者に周知の各種方法で増幅することが
できる。その１方法は、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰ
ＣＲとして知られるものである。
供し、これを当業者に周知の各種方法で増幅することが
できる。その１方法は、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰ
ＣＲとして知られるものである。
【００１１】ここに記載する方法は極めて簡便であるの
で、異なる細胞または異なる処理が施された細胞の多数
の試料を、それらの細胞内の特異的ｍＲＮＡ配列を検出
し、かつ所望により定量するために、本発明方法により
アッセイすることができる。本発明方法は、化合物が細
胞の特異的ｍＲＮＡ配列の存在に及ぼす作用をスクリー
ニングするのに特に有用である。従って本発明方法は薬
物探索法として好適であり、多数の化合物をスクリーニ
ングする高い処理量が得られる。従って本発明は、本発
明方法により同定された、細胞内の特異的ｍＲＮＡ配列
の存在に作用する化合物に関するものでもある。
で、異なる細胞または異なる処理が施された細胞の多数
の試料を、それらの細胞内の特異的ｍＲＮＡ配列を検出
し、かつ所望により定量するために、本発明方法により
アッセイすることができる。本発明方法は、化合物が細
胞の特異的ｍＲＮＡ配列の存在に及ぼす作用をスクリー
ニングするのに特に有用である。従って本発明方法は薬
物探索法として好適であり、多数の化合物をスクリーニ
ングする高い処理量が得られる。従って本発明は、本発
明方法により同定された、細胞内の特異的ｍＲＮＡ配列
の存在に作用する化合物に関するものでもある。
【００１２】本発明方法を用いることにより、２以上の
ｍＲＮＡ配列を同時にアッセイすることができる。たと
えばＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ配列に関するハイブ
リダイゼーションをキナーゼ処理プローブ（ｋｉｎａｓ
ｅｄ ｐｒｏｂｅ）により同時に行うことができる。双
方の場合ともＧ−またはＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ水準の
増加が目的だからである。所望により、検出法の異なる
オリゴマープローブを用いて個々の産物を別個に測定す
ることもできる（たとえば放射性同位体−対−蛍光、お
よび／または異なる比活性をもつ放射性同位体）。さら
に、洗浄およびリプローブ（ｒｅｐｒｏｂｅ）が可能で
ある。測定される多様な産物の数を高める方法として、
または特異的産物の検出を高める方法として、増幅され
た物質を２または３枚以上のナイロン膜間で分割するこ
とも可能である。
ｍＲＮＡ配列を同時にアッセイすることができる。たと
えばＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ配列に関するハイブ
リダイゼーションをキナーゼ処理プローブ（ｋｉｎａｓ
ｅｄ ｐｒｏｂｅ）により同時に行うことができる。双
方の場合ともＧ−またはＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ水準の
増加が目的だからである。所望により、検出法の異なる
オリゴマープローブを用いて個々の産物を別個に測定す
ることもできる（たとえば放射性同位体−対−蛍光、お
よび／または異なる比活性をもつ放射性同位体）。さら
に、洗浄およびリプローブ（ｒｅｐｒｏｂｅ）が可能で
ある。測定される多様な産物の数を高める方法として、
または特異的産物の検出を高める方法として、増幅され
た物質を２または３枚以上のナイロン膜間で分割するこ
とも可能である。
【００１３】しかし新規な本発明方法はこのような高処
理量のスクリーニングにおける利用に限定されない。本
発明方法は、１または２以上の外来遺伝子が導入された
ウイルス、微生物、動物および植物を含めたキメラ生物
の同定にも有用である。たとえば、それらのキメラ生物
の同一性および安定性を本発明方法の利用によりアッセ
イすることができる。さらに本発明方法により、同時増
幅された（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）遺伝子またはそ
の一部を研究することによって遺伝子構造および遺伝子
の挿入を判定することができる。
理量のスクリーニングにおける利用に限定されない。本
発明方法は、１または２以上の外来遺伝子が導入された
ウイルス、微生物、動物および植物を含めたキメラ生物
の同定にも有用である。たとえば、それらのキメラ生物
の同一性および安定性を本発明方法の利用によりアッセ
イすることができる。さらに本発明方法により、同時増
幅された（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）遺伝子またはそ
の一部を研究することによって遺伝子構造および遺伝子
の挿入を判定することができる。
【００１４】本発明方法は臨床法および診断法としても
有用である。本方法によれば、特定の疾病状態に伴う特
異的ｍＲＮＡの存在を検出しうる。たとえば本発明によ
り提供される高感度の方法によって、転移前の潜伏期の
癌に伴うある種のｍＲＮＡの存在を検出することができ
る。従って本方法をこのような様式で利用することによ
り、癌進行の初期段階で処置を開始することができる。
他の例としては、エイズ感染者において活性感染（ａｃ
ｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に伴うｍＲＮＡの存在
を本発明方法により検出することができる。従って活性
エイズ患者の診断が可能である。
有用である。本方法によれば、特定の疾病状態に伴う特
異的ｍＲＮＡの存在を検出しうる。たとえば本発明によ
り提供される高感度の方法によって、転移前の潜伏期の
癌に伴うある種のｍＲＮＡの存在を検出することができ
る。従って本方法をこのような様式で利用することによ
り、癌進行の初期段階で処置を開始することができる。
他の例としては、エイズ感染者において活性感染（ａｃ
ｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に伴うｍＲＮＡの存在
を本発明方法により検出することができる。従って活性
エイズ患者の診断が可能である。
【００１５】本発明の実施に際して用いるのに適した緩
衝液および試薬は下記のものである：２０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液 １Ｍ トリス−Ｃｌ，ｐＨ８．３ １Ｍ ＫＣｌ ８０ｍＭ ＭｇＣｌ2 アニーリング／ＲＴ緩衝液（ウェル当たり） ８．１３μｌ 無菌蒸留水 １．００μｌ １０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ
緩衝液 ０．６４μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，２５ｍＭ ｄＴＴＰ，２５ｍＭ ｄＧＴＰ，２５ｍ
Ｍ ｄＣＴＰ） ０．０９μｌ １Ｍジチオトレイトール ０．０４−０．０８μｌ Ｘプライマー（１μｇ／μ
ｌ） ０．０１μｌ ＲＮａｓｉｎ（５０Ｕ／μｌ） ０．０１μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（３２Ｕ／μｌ）ＰＣＲ試薬（１０μｌ当たりの添加量） ８．６８μｌ 無菌蒸留水 １．０μｌ １０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ緩
衝液 ０．０４−０．０８μｌ Ｘプライマー（１μｇ／μ
ｌ） ０．２０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）ドットブロットＤＮＡ変性用溶液 ４４４ｍＭ ＮａＯＨ（１６０ｍｌ ５００ｍＭ Ｎａ
ＯＨ） １１ｍＭ ＥＤＴＡ（８ｍｌ ２５０ｍＭ ＥＤＴＡ） ０．０００７４％インク（１６μｌ １０％インディア
インク） ２２ｍｌ 蒸留水１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．２（Ｎａ+において１
Ｍ） １３４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ４ｍｌ ８５％ Ｈ3ＰＯ4 Ｈ2Ｏにより１リットルとなすハイブリダイゼーション緩衝液 ７％ ＳＤＳ ５× ＳＳＣ ２０ｍＭ ＮａＰＯ4 １０× デンハルト溶液ハイブリダイゼーション洗浄液 １％ ＳＤＳ １× ＳＳＣ２０× ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ（１７５ｇ／Ｌ） ０．３Ｍ クエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ（８８ｇ／
Ｌ） １Ｍ ＨＣｌによりｐＨ７．０に調整１００× デンハルト溶液 ２％ ファイコル４００ ２％ ポリビニルピロリドン ２％ウシ血清アルブミン（ペンタックス フラクション
Ｖ）１０×キナーゼ緩衝液 ５００ｍＭ トリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４ １００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ ＤＴＴ 上記試薬の酵素は市販されている。たとえばＲＮａｓｉ
ｎはベーリンガー・マンハイムから得られ、ＡＭＶ逆転
写酵素はモレキュラー・ジェネティックス社から得ら
れ、Ｔａｑポリメラーゼはパーキン・エルマーから得ら
れる。上記緩衝液および試薬の他の成分もすべて市販さ
れている。さらに原液を滅菌することが好ましい。
衝液および試薬は下記のものである：２０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液 １Ｍ トリス−Ｃｌ，ｐＨ８．３ １Ｍ ＫＣｌ ８０ｍＭ ＭｇＣｌ2 アニーリング／ＲＴ緩衝液（ウェル当たり） ８．１３μｌ 無菌蒸留水 １．００μｌ １０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ
緩衝液 ０．６４μｌ ２５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，２５ｍＭ ｄＴＴＰ，２５ｍＭ ｄＧＴＰ，２５ｍ
Ｍ ｄＣＴＰ） ０．０９μｌ １Ｍジチオトレイトール ０．０４−０．０８μｌ Ｘプライマー（１μｇ／μ
ｌ） ０．０１μｌ ＲＮａｓｉｎ（５０Ｕ／μｌ） ０．０１μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（３２Ｕ／μｌ）ＰＣＲ試薬（１０μｌ当たりの添加量） ８．６８μｌ 無菌蒸留水 １．０μｌ １０×逆転写酵素／Ｔａｑポリメラーゼ緩
衝液 ０．０４−０．０８μｌ Ｘプライマー（１μｇ／μ
ｌ） ０．２０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）ドットブロットＤＮＡ変性用溶液 ４４４ｍＭ ＮａＯＨ（１６０ｍｌ ５００ｍＭ Ｎａ
ＯＨ） １１ｍＭ ＥＤＴＡ（８ｍｌ ２５０ｍＭ ＥＤＴＡ） ０．０００７４％インク（１６μｌ １０％インディア
インク） ２２ｍｌ 蒸留水１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．２（Ｎａ+において１
Ｍ） １３４ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ４ｍｌ ８５％ Ｈ3ＰＯ4 Ｈ2Ｏにより１リットルとなすハイブリダイゼーション緩衝液 ７％ ＳＤＳ ５× ＳＳＣ ２０ｍＭ ＮａＰＯ4 １０× デンハルト溶液ハイブリダイゼーション洗浄液 １％ ＳＤＳ １× ＳＳＣ２０× ＳＳＣ ３Ｍ ＮａＣｌ（１７５ｇ／Ｌ） ０．３Ｍ クエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ（８８ｇ／
Ｌ） １Ｍ ＨＣｌによりｐＨ７．０に調整１００× デンハルト溶液 ２％ ファイコル４００ ２％ ポリビニルピロリドン ２％ウシ血清アルブミン（ペンタックス フラクション
Ｖ）１０×キナーゼ緩衝液 ５００ｍＭ トリス−Ｃｌ，ｐＨ７．４ １００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ ＤＴＴ 上記試薬の酵素は市販されている。たとえばＲＮａｓｉ
ｎはベーリンガー・マンハイムから得られ、ＡＭＶ逆転
写酵素はモレキュラー・ジェネティックス社から得ら
れ、Ｔａｑポリメラーゼはパーキン・エルマーから得ら
れる。上記緩衝液および試薬の他の成分もすべて市販さ
れている。さらに原液を滅菌することが好ましい。
【００１６】本発明方法に用いられる細胞は動物または
植物から単離し、ここに記載する方法に直接用いること
ができる。あるいは、かつ好ましくは、高処理量のスク
リーニングを実施する際、細胞を本発明方法に用いる前
に適宜な条件下で培養する。本明細書およぴ特許請求の
範囲全体を通して、動物という語は哺乳動物、たとえば
ヒトを含むが、これらに限定されない。本発明において
細胞は真核細胞に限定されず、原核細胞をも包含する。
植物から単離し、ここに記載する方法に直接用いること
ができる。あるいは、かつ好ましくは、高処理量のスク
リーニングを実施する際、細胞を本発明方法に用いる前
に適宜な条件下で培養する。本明細書およぴ特許請求の
範囲全体を通して、動物という語は哺乳動物、たとえば
ヒトを含むが、これらに限定されない。本発明において
細胞は真核細胞に限定されず、原核細胞をも包含する。
【００１７】細胞は周知の方法に従って各種容器、たと
えばミクロタイターディッシュまたはミクロタイターチ
ューブ内で培養することができる。ミクロタイターディ
ッシュは６、２４、４８、９６または１４４ウェルのも
のが市販されている。ミクロタイターディッシュの使用
は本発明方法を高処理量のスクリーニングに利用するた
めに好ましい。細胞は他の適宜な容器、たとえばローラ
ーボトルまたはペトリ皿内でも培養しうるが、それらの
容器はその大きさおよぴ付随する取扱いの問題のためさ
ほど適切ではない。しかし本発明方法は細胞を培養する
方法および／または装置に限定されない。ミクロタイタ
ーディッシュの業者にはコスター、ファルコン、ナンク
およびコーニングが含まれる。
えばミクロタイターディッシュまたはミクロタイターチ
ューブ内で培養することができる。ミクロタイターディ
ッシュは６、２４、４８、９６または１４４ウェルのも
のが市販されている。ミクロタイターディッシュの使用
は本発明方法を高処理量のスクリーニングに利用するた
めに好ましい。細胞は他の適宜な容器、たとえばローラ
ーボトルまたはペトリ皿内でも培養しうるが、それらの
容器はその大きさおよぴ付随する取扱いの問題のためさ
ほど適切ではない。しかし本発明方法は細胞を培養する
方法および／または装置に限定されない。ミクロタイタ
ーディッシュの業者にはコスター、ファルコン、ナンク
およびコーニングが含まれる。
【００１８】本発明方法に用いる真核細胞を培養するた
めの１方法は、目的数のウェルを備えたミクロタイター
ディッシュまたはミクロタイターチューブに適宜な数の
細胞を接種することよりなる。接種に最適な細胞数は当
業者により決定され、細胞の種類およびアッセイのター
ゲットに応じて異なるであろう。この決定には、漸増す
る数の細胞を接種された一連のアッセイすべき細胞タイ
プの培養物に後記の操作を施す必要があるにすぎない。
従ってこの決定は本明細書の記載から十分に当業者がな
しうる範囲内にある。たとえば、ネズミまたはヒト線維
芽細胞を用い、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ
−ＣＳＦ）、および／またはアルドラーゼのｍＲＮＡを
後記の本発明方法に従ってアッセイする場合、９６ウェ
ル−ミクロタイターディッシュのウェル当たり１×１０
4個のトリプシン処理細胞が適切な接種細胞数であるこ
とが認められた。
めの１方法は、目的数のウェルを備えたミクロタイター
ディッシュまたはミクロタイターチューブに適宜な数の
細胞を接種することよりなる。接種に最適な細胞数は当
業者により決定され、細胞の種類およびアッセイのター
ゲットに応じて異なるであろう。この決定には、漸増す
る数の細胞を接種された一連のアッセイすべき細胞タイ
プの培養物に後記の操作を施す必要があるにすぎない。
従ってこの決定は本明細書の記載から十分に当業者がな
しうる範囲内にある。たとえば、ネズミまたはヒト線維
芽細胞を用い、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ
−ＣＳＦ）、および／またはアルドラーゼのｍＲＮＡを
後記の本発明方法に従ってアッセイする場合、９６ウェ
ル−ミクロタイターディッシュのウェル当たり１×１０
4個のトリプシン処理細胞が適切な接種細胞数であるこ
とが認められた。
【００１９】接種された細胞を次いで適切な期間増殖さ
せる。この増殖期間は接種された細胞のタイプ、および
細胞を増殖させる条件に応じて異なる。当業者は、この
増殖の目的とする結果は適切な生理学的状態で後記の本
発明方法の後続工程を実施するのに十分な細胞数を得る
ことである点を留意して、この増殖に適した期間を容易
に決定することができる。適切な生理学的状態とは、細
胞がターゲットｍＲＮＡ種のモジュレーションを受けや
すい状態にあることを意味する。たとえばネズミまたは
ヒト線維芽細胞の増殖に適切な期間は２日であることが
認められた。これらの細胞は３７℃で約６−７％のＣＯ
2の存在下でインキュベートされる。
せる。この増殖期間は接種された細胞のタイプ、および
細胞を増殖させる条件に応じて異なる。当業者は、この
増殖の目的とする結果は適切な生理学的状態で後記の本
発明方法の後続工程を実施するのに十分な細胞数を得る
ことである点を留意して、この増殖に適した期間を容易
に決定することができる。適切な生理学的状態とは、細
胞がターゲットｍＲＮＡ種のモジュレーションを受けや
すい状態にあることを意味する。たとえばネズミまたは
ヒト線維芽細胞の増殖に適切な期間は２日であることが
認められた。これらの細胞は３７℃で約６−７％のＣＯ
2の存在下でインキュベートされる。
【００２０】適切な増殖ののち、細胞を特異的ｍＲＮＡ
の存在につきアッセイするか、またはこのアッセイの前
に１または２以上の被験化合物でさらに処理することが
できる。１または２以上の化合物をそれらが細胞中の１
または２以上のｍＲＮＡの水準に及ぼす作用につき試験
することを目的とする場合、次いで被験化合物を細胞に
添加する。最終濃度約５μｇ／ｍｌが達成されるように
被験化合物を添加するのが好ましいことが認められた。
これは約５０μｇ／ｍｌの化合物を含有する溶液を最終
容量の１０％添加することにより達成しうる。複数のミ
クロタイターデッシュを用いる場合、細胞に対する温度
衝撃を緩和するためにディッシュ４個の１グループでデ
ィッシュに化合物を添加することが好ましい。各ディッ
シュに適宜な対照を含める。たとえば表示したウェルに
最終容量の１０％（たとえば２０μｌ）の１ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．３、を添加する。ある種の試験については
陽性対照を含めることもでき、その場合は表示したウェ
ルに被験ｍＲＮＡの既知のインデューサーを添加する。
の存在につきアッセイするか、またはこのアッセイの前
に１または２以上の被験化合物でさらに処理することが
できる。１または２以上の化合物をそれらが細胞中の１
または２以上のｍＲＮＡの水準に及ぼす作用につき試験
することを目的とする場合、次いで被験化合物を細胞に
添加する。最終濃度約５μｇ／ｍｌが達成されるように
被験化合物を添加するのが好ましいことが認められた。
これは約５０μｇ／ｍｌの化合物を含有する溶液を最終
容量の１０％添加することにより達成しうる。複数のミ
クロタイターデッシュを用いる場合、細胞に対する温度
衝撃を緩和するためにディッシュ４個の１グループでデ
ィッシュに化合物を添加することが好ましい。各ディッ
シュに適宜な対照を含める。たとえば表示したウェルに
最終容量の１０％（たとえば２０μｌ）の１ｍＭトリ
ス、ｐＨ７．３、を添加する。ある種の試験については
陽性対照を含めることもでき、その場合は表示したウェ
ルに被験ｍＲＮＡの既知のインデューサーを添加する。
【００２１】上記のようにウェルへの添加を行ったの
ち、ディッシュをさらに一定期間インキュベートする。
この追加インキュベーションの期間は、用いる細胞およ
びアッセイすべきｍＲＮＡ種に応じて多少異なる。追加
インキュベーションの最適期間は本明細書の記載に基づ
いて当業者が容易に決定しうる。たとえばヒト線維芽細
胞を用い、化合物がこれらの細胞の顆粒球−マクロファ
ージ−コロニー刺激因子、顆粒球−コロニー刺激因子お
よび／またはアルドラーゼに関するｍＲＮＡを発現する
効力に及ぼす作用を判定する場合、ディッシュをさらに
９０−１８０分間、ＣＯ2インキュベーター（３７℃、
６−７％ＣＯ2）中でインキュベートすることが好まし
い。ディッシュを４個の同一グループで処理することも
好ましく、これによりすべてのディッシュがほぼ同じ期
間インキュベートされる。
ち、ディッシュをさらに一定期間インキュベートする。
この追加インキュベーションの期間は、用いる細胞およ
びアッセイすべきｍＲＮＡ種に応じて多少異なる。追加
インキュベーションの最適期間は本明細書の記載に基づ
いて当業者が容易に決定しうる。たとえばヒト線維芽細
胞を用い、化合物がこれらの細胞の顆粒球−マクロファ
ージ−コロニー刺激因子、顆粒球−コロニー刺激因子お
よび／またはアルドラーゼに関するｍＲＮＡを発現する
効力に及ぼす作用を判定する場合、ディッシュをさらに
９０−１８０分間、ＣＯ2インキュベーター（３７℃、
６−７％ＣＯ2）中でインキュベートすることが好まし
い。ディッシュを４個の同一グループで処理することも
好ましく、これによりすべてのディッシュがほぼ同じ期
間インキュベートされる。
【００２２】上記の追加インキュベーションののち、デ
ィッシュをインキュベーターから取り出し、速やかに裏
返して培地を除去する。次いでディッシュをミクロプレ
ート洗浄装置、たとえばバイオーラド・ミクロプレート
・ウォッシャー（バイオーラド、カタログＮｏ．１７０
−６５４０）に装入し、３７℃に予熱したリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）、たとえばヘイゼルトン・ダルベッコの
リン酸緩衝食塩液（カタログＮｏ．３１０−４１９０Ａ
Ｋ）を用いて、３回のすすぎ／吸引サイクルで約２００
μｌ／サイクルにおいてすすぐ。吸引高さは、各洗浄サ
イクルの終了時にディッシュの各ウェルに約１００μｌ
のＰＢＳが残るように調節する。次いでディッシュを急
激に裏返すことにより残りのＰＢＳを除去する。次いで
平らな吸収材料、たとえばペーパータオルを用いて、ウ
ェルの内側を吸取らないように注意してディッシュを吸
取る。
ィッシュをインキュベーターから取り出し、速やかに裏
返して培地を除去する。次いでディッシュをミクロプレ
ート洗浄装置、たとえばバイオーラド・ミクロプレート
・ウォッシャー（バイオーラド、カタログＮｏ．１７０
−６５４０）に装入し、３７℃に予熱したリン酸緩衝食
塩液（ＰＢＳ）、たとえばヘイゼルトン・ダルベッコの
リン酸緩衝食塩液（カタログＮｏ．３１０−４１９０Ａ
Ｋ）を用いて、３回のすすぎ／吸引サイクルで約２００
μｌ／サイクルにおいてすすぐ。吸引高さは、各洗浄サ
イクルの終了時にディッシュの各ウェルに約１００μｌ
のＰＢＳが残るように調節する。次いでディッシュを急
激に裏返すことにより残りのＰＢＳを除去する。次いで
平らな吸収材料、たとえばペーパータオルを用いて、ウ
ェルの内側を吸取らないように注意してディッシュを吸
取る。
【００２３】上記に従ってディッシュを吸取ったのち、
室温の蒸留水５０μｌをディッシュの各ウェルに添加す
る。上記のように複数のディッシュにつき作業する場
合、ディッシュを４個の１グループで処理することが好
ましい。５０μｌの水をディッシュに添加するために
は、マルチプルティップ−ピペッター、たとえばソーク
ン・シグマ・ペット９６ピペッター（ソークン東京、日
本）を使用し、ディッシュ４個の各グループを１分間隔
で処理することが好ましい。水を添加した直後にディッ
シュを鉱油浴に浮かせ、細胞を溶解させる。鉱油の温度
は約９０−約１１５℃であり、約９９℃が好ましい。デ
ィッシュは鉱油浴中に約２−約１２分間保持され、約４
−約８分間が好ましく、約６分間が特に好ましい。次い
で、好ましくは第２のマルチプルティップ−ピペッタ
ー、たとえば上記の種類のものを用いて１０−１２μｌ
の細胞溶解質を各ウェルから吸引する。好ましくは細胞
溶解質（１０−１２μｌ）をソークン先端で約５−約１
５秒間、特に好ましくは約７秒間冷却させ、次いで直ち
に、同じ数および形状のウェルを備え、低温のアニーリ
ング／ＲＴ緩衝液１０μｌ／ウェルを入れたビニル製デ
ィッシュに移す。あるいは細胞溶解質を容器内で約１−
約２分間冷却してもよい。アニーリング／ＲＴ緩衝液は
不安定である点を留意すべきである。従って逆転写酵素
およびプライマーを含有しないアニーリング／ＲＴ緩衝
液をアッセイの実施直前に調製し、この緩衝液を約３０
個のディッシュに用いるのに十分なアリコートに分割す
ることが好ましい。次いでアニーリング／ＲＴ緩衝液を
ディッシュに添加する直前に、緩衝液を低温に維持しな
がらアリコートの緩衝液の１つに逆転写酵素および１ま
たは２以上のプライマーを添加する。より多くのアニー
リング／ＲＴ緩衝液が必要となるのに伴って、他のアリ
コートの緩衝液に逆転写酵素および１または２以上のプ
ライマーを添加する。第２のマルチプルティップ−ピペ
ッターは細胞溶解質を次のディッシュから移す前に無菌
水ですすぐ。
室温の蒸留水５０μｌをディッシュの各ウェルに添加す
る。上記のように複数のディッシュにつき作業する場
合、ディッシュを４個の１グループで処理することが好
ましい。５０μｌの水をディッシュに添加するために
は、マルチプルティップ−ピペッター、たとえばソーク
ン・シグマ・ペット９６ピペッター（ソークン東京、日
本）を使用し、ディッシュ４個の各グループを１分間隔
で処理することが好ましい。水を添加した直後にディッ
シュを鉱油浴に浮かせ、細胞を溶解させる。鉱油の温度
は約９０−約１１５℃であり、約９９℃が好ましい。デ
ィッシュは鉱油浴中に約２−約１２分間保持され、約４
−約８分間が好ましく、約６分間が特に好ましい。次い
で、好ましくは第２のマルチプルティップ−ピペッタ
ー、たとえば上記の種類のものを用いて１０−１２μｌ
の細胞溶解質を各ウェルから吸引する。好ましくは細胞
溶解質（１０−１２μｌ）をソークン先端で約５−約１
５秒間、特に好ましくは約７秒間冷却させ、次いで直ち
に、同じ数および形状のウェルを備え、低温のアニーリ
ング／ＲＴ緩衝液１０μｌ／ウェルを入れたビニル製デ
ィッシュに移す。あるいは細胞溶解質を容器内で約１−
約２分間冷却してもよい。アニーリング／ＲＴ緩衝液は
不安定である点を留意すべきである。従って逆転写酵素
およびプライマーを含有しないアニーリング／ＲＴ緩衝
液をアッセイの実施直前に調製し、この緩衝液を約３０
個のディッシュに用いるのに十分なアリコートに分割す
ることが好ましい。次いでアニーリング／ＲＴ緩衝液を
ディッシュに添加する直前に、緩衝液を低温に維持しな
がらアリコートの緩衝液の１つに逆転写酵素および１ま
たは２以上のプライマーを添加する。より多くのアニー
リング／ＲＴ緩衝液が必要となるのに伴って、他のアリ
コートの緩衝液に逆転写酵素および１または２以上のプ
ライマーを添加する。第２のマルチプルティップ−ピペ
ッターは細胞溶解質を次のディッシュから移す前に無菌
水ですすぐ。
【００２４】ディッシュを水／氷スラリーに浮かせるこ
とによりディッシュを予冷し、ディッシュを低温に維持
することが好ましい。アニーリング／ＲＴ緩衝液を添加
した直後にビニル製ディッシュをプログラム可能な温度
制御装置（″ＰＴＣ″）、たとえばＭ−Ｊリサーチ・プ
ログラマブル・サーマル・コントローラー（９６ウェル
型、Ｍ−Ｊリサーチ、マサチュセッツ州ウォータータウ
ン）−−そのウェルにそれらの容積の約１／３まで鉱油
を充填したもの−−に移す。ＰＴＣはディッシュを４２
℃で１５分間インキュベートしたのち９５℃に５分間昇
温させるように予めプログラムされる。加熱サイクル終
了後にビニル製ディッシュを４℃に冷却する。多数の小
容量試料につき本発明方法を実施する場合は特に、加熱
サイクルに際してウェルに鉱油を積層しないことが好ま
しい。
とによりディッシュを予冷し、ディッシュを低温に維持
することが好ましい。アニーリング／ＲＴ緩衝液を添加
した直後にビニル製ディッシュをプログラム可能な温度
制御装置（″ＰＴＣ″）、たとえばＭ−Ｊリサーチ・プ
ログラマブル・サーマル・コントローラー（９６ウェル
型、Ｍ−Ｊリサーチ、マサチュセッツ州ウォータータウ
ン）−−そのウェルにそれらの容積の約１／３まで鉱油
を充填したもの−−に移す。ＰＴＣはディッシュを４２
℃で１５分間インキュベートしたのち９５℃に５分間昇
温させるように予めプログラムされる。加熱サイクル終
了後にビニル製ディッシュを４℃に冷却する。多数の小
容量試料につき本発明方法を実施する場合は特に、加熱
サイクルに際してウェルに鉱油を積層しないことが好ま
しい。
【００２５】ディッシュの各ウェルに１０μｌのプロテ
イナーゼＫ（５００μｇ／ｍｌ）を添加し、次いで各ウ
ェルに５０μｌの鉱油を積層する。この場合も、たとえ
ば前記のいずれかの種類のマルチプルティップ−ピペッ
ターを用いることが好ましい。次いで、６０℃に１０分
間、続いて９５℃に１０分間加熱するようにプログラム
されたＰＴＣにディッシュを装入する。加熱サイクル終
了後、次の工程に進むまでプレートを４℃に冷却する。
イナーゼＫ（５００μｇ／ｍｌ）を添加し、次いで各ウ
ェルに５０μｌの鉱油を積層する。この場合も、たとえ
ば前記のいずれかの種類のマルチプルティップ−ピペッ
ターを用いることが好ましい。次いで、６０℃に１０分
間、続いて９５℃に１０分間加熱するようにプログラム
されたＰＴＣにディッシュを装入する。加熱サイクル終
了後、次の工程に進むまでプレートを４℃に冷却する。
【００２６】ディッシュの各ウェルに１０μｌのＰＣＲ
試薬溶液を、好ましくは前記のいずれかの種類のマルチ
プルティップ−ピペッターにより添加する。次いで、９
２℃に９０秒間、続いて６０℃に１２０秒間、続いて７
２℃に１８０秒間の３１サイクルにプログラムされたＰ
ＴＣにディッシュを移す。サイクル終了後、４℃に冷却
するようにＰＴＣをプログラムする。本明細書の記載か
ら当業者に周知のように、他の時間、温度およびサイク
ル数が可能であり、それらも本発明の範囲に含まれる。
試薬溶液を、好ましくは前記のいずれかの種類のマルチ
プルティップ−ピペッターにより添加する。次いで、９
２℃に９０秒間、続いて６０℃に１２０秒間、続いて７
２℃に１８０秒間の３１サイクルにプログラムされたＰ
ＴＣにディッシュを移す。サイクル終了後、４℃に冷却
するようにＰＴＣをプログラムする。本明細書の記載か
ら当業者に周知のように、他の時間、温度およびサイク
ル数が可能であり、それらも本発明の範囲に含まれる。
【００２７】本方法は多数組のオリゴマーにつき利用す
ることができ、これにより２以上のターゲット配列を同
時に増幅することができる。しばしば、それら多数のう
ち１員子が対照として用いられ、唯一の前提条件はプラ
イマーの相容性、および誘導、リプレッションまたはｍ
ＲＮＡ半減期の速度論的相容性である。増幅産物が後続
のプロービング／定量のためのユニークＤＮＡ配列を提
供するのに十分な長さである限りいかなる組のオリゴマ
ー対も使用しうるが、ＰＣＲ反応の効率を最大限にする
ためには増幅産物のサイズを約３００ｂｐ以下に維持す
ることが好ましい。２方法が用いられ、それらの方法
は、人為的なゲノムＤＮＡ定量を最小限に抑え、または
防止するために、エキソン−イントロンの関係を利用す
るものである。第１法は、その範囲または範囲の和が約
５００ｂｐを越える単数または複数のイントロンによっ
て分離されたオリゴマー対を選択することよりなる。増
幅産物の長さが増大すると、ＰＣＲ増幅の効率が低下
し、ゲノムＤＮＡの増幅は低下または排除されるが、ｍ
ＲＮＡ依存性ＰＣＲは影響を受けることなく増幅する。
第２法は、各オリゴマーの最後の数個（２または３個）
の塩基が隣接エキソンに相同であるオリゴマーを選択す
ることよりなる。これによりｍＲＮＡは増幅されるが、
イントロンは増幅されない。このオリゴマーはその３プ
ライム末端において相同性を欠如し、イントロンが複製
されるのを阻害するからである。
ることができ、これにより２以上のターゲット配列を同
時に増幅することができる。しばしば、それら多数のう
ち１員子が対照として用いられ、唯一の前提条件はプラ
イマーの相容性、および誘導、リプレッションまたはｍ
ＲＮＡ半減期の速度論的相容性である。増幅産物が後続
のプロービング／定量のためのユニークＤＮＡ配列を提
供するのに十分な長さである限りいかなる組のオリゴマ
ー対も使用しうるが、ＰＣＲ反応の効率を最大限にする
ためには増幅産物のサイズを約３００ｂｐ以下に維持す
ることが好ましい。２方法が用いられ、それらの方法
は、人為的なゲノムＤＮＡ定量を最小限に抑え、または
防止するために、エキソン−イントロンの関係を利用す
るものである。第１法は、その範囲または範囲の和が約
５００ｂｐを越える単数または複数のイントロンによっ
て分離されたオリゴマー対を選択することよりなる。増
幅産物の長さが増大すると、ＰＣＲ増幅の効率が低下
し、ゲノムＤＮＡの増幅は低下または排除されるが、ｍ
ＲＮＡ依存性ＰＣＲは影響を受けることなく増幅する。
第２法は、各オリゴマーの最後の数個（２または３個）
の塩基が隣接エキソンに相同であるオリゴマーを選択す
ることよりなる。これによりｍＲＮＡは増幅されるが、
イントロンは増幅されない。このオリゴマーはその３プ
ライム末端において相同性を欠如し、イントロンが複製
されるのを阻害するからである。
【００２８】ＰＣＲ試薬溶液には非標識またはノンディ
スティンクト（ｎｏｎｄｉｓｔｉｎｃｔ）ヌクレオチド
を用いることが好ましいが、適宜標識された、または他
の形で検出可能なヌクレオチドをＰＣＲ試薬溶液に用い
ることができる。もちろんこれらのヌクレオチドはいず
れも目的配列の増幅に影響を及ぼしてはならない。配列
の増幅に際して、標識された、または他の検出可能なヌ
クレオチドを用いる場合、その配列の存在はその標識さ
れた、または検出可能なヌクレオチドに適した方法で測
定される。これらの方法は当業者に周知であり、ドット
ブロットオートラジオグラフィーおよび酵素結合抗−ア
ビジン／ビオチン検出法がこれに含まれる。標識され
た、または他の形で検出可能なヌクレオチドの存在下で
配列の増幅を行わないことが好ましいが、その場合、１
または２以上の増幅配列の存在を後記のように適宜なプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより検出すること
が好ましい。後記のプローブは標識されているが、化学
ルミネセンス、蛍光、アクリジニウムエステル、または
酵素結合抗−アビジン／ビオチン検出法などの方法で検
出および測定しうる他の適切なプローブを使用しうる。
これらのプローブを調製する方法は本明細書の記載から
当業者に周知である。
スティンクト（ｎｏｎｄｉｓｔｉｎｃｔ）ヌクレオチド
を用いることが好ましいが、適宜標識された、または他
の形で検出可能なヌクレオチドをＰＣＲ試薬溶液に用い
ることができる。もちろんこれらのヌクレオチドはいず
れも目的配列の増幅に影響を及ぼしてはならない。配列
の増幅に際して、標識された、または他の検出可能なヌ
クレオチドを用いる場合、その配列の存在はその標識さ
れた、または検出可能なヌクレオチドに適した方法で測
定される。これらの方法は当業者に周知であり、ドット
ブロットオートラジオグラフィーおよび酵素結合抗−ア
ビジン／ビオチン検出法がこれに含まれる。標識され
た、または他の形で検出可能なヌクレオチドの存在下で
配列の増幅を行わないことが好ましいが、その場合、１
または２以上の増幅配列の存在を後記のように適宜なプ
ローブとのハイブリダイゼーションにより検出すること
が好ましい。後記のプローブは標識されているが、化学
ルミネセンス、蛍光、アクリジニウムエステル、または
酵素結合抗−アビジン／ビオチン検出法などの方法で検
出および測定しうる他の適切なプローブを使用しうる。
これらのプローブを調製する方法は本明細書の記載から
当業者に周知である。
【００２９】ディッシュの各ウェルに１０μｌの蒸留水
を、この場合も好ましくは前記のいずれかの種類のマル
チプルティップ−ピペッターにより添加する。次いで、
増幅ＰＣＲ産物１または２以上を含有する溶液５０μｌ
を各ウェルから取り出し、それぞれ２５０μｌのドット
ブロット変性用緩衝液を入れたミクロ試験管、たとえば
１．２ｍｌミクロ試験管に装入する。試験管の後続加熱
に影響を及ぼす可能性のある底を備えていないラックに
ミクロ試験管を挿入することが好ましい。試験管を９５
℃以上の水に５分間挿入する。得られた変性ＤＮＡ溶液
は室温またはそれ以上に一定期間保存してから、次の工
程へ進めることもできる。
を、この場合も好ましくは前記のいずれかの種類のマル
チプルティップ−ピペッターにより添加する。次いで、
増幅ＰＣＲ産物１または２以上を含有する溶液５０μｌ
を各ウェルから取り出し、それぞれ２５０μｌのドット
ブロット変性用緩衝液を入れたミクロ試験管、たとえば
１．２ｍｌミクロ試験管に装入する。試験管の後続加熱
に影響を及ぼす可能性のある底を備えていないラックに
ミクロ試験管を挿入することが好ましい。試験管を９５
℃以上の水に５分間挿入する。得られた変性ＤＮＡ溶液
は室温またはそれ以上に一定期間保存してから、次の工
程へ進めることもできる。
【００３０】水に少なくとも１分間浸漬した適宜なナイ
ロン膜に、上記により調製した変性ＤＮＡを入れたミク
ロ試験管それぞれから２５０μｌを添加する。ナイロン
膜はゼータ−プローブナイロン膜（バイオ−プローブ、
カタログＮｏ．１６２−０１５３）であって、その膜が
保護されていない手で触れられないことが好ましい。さ
らに、膜をドットブロット装置（バイオ−ラド、カタロ
グＮｏ．１７０−６５４５）に装入し、変性ＤＮＡ溶液
の添加前に真空を付与して過剰の水を除去すること、お
よび変性ＤＮＡ溶液を膜に添加するためにソークンピペ
ッターを用いることが好ましい。さらにまた、膜と由来
するディッシュとを関係付けることができるように、膜
に番号およびインデックスを付けるべきである。変性Ｄ
ＮＡ溶液を膜に添加した時点で真空を付与し、乾燥する
まで継続することが好ましい。次いで膜を装置から取り
出し、２×ＳＳＣで短時間すすいだのち濾紙上で風乾す
る。
ロン膜に、上記により調製した変性ＤＮＡを入れたミク
ロ試験管それぞれから２５０μｌを添加する。ナイロン
膜はゼータ−プローブナイロン膜（バイオ−プローブ、
カタログＮｏ．１６２−０１５３）であって、その膜が
保護されていない手で触れられないことが好ましい。さ
らに、膜をドットブロット装置（バイオ−ラド、カタロ
グＮｏ．１７０−６５４５）に装入し、変性ＤＮＡ溶液
の添加前に真空を付与して過剰の水を除去すること、お
よび変性ＤＮＡ溶液を膜に添加するためにソークンピペ
ッターを用いることが好ましい。さらにまた、膜と由来
するディッシュとを関係付けることができるように、膜
に番号およびインデックスを付けるべきである。変性Ｄ
ＮＡ溶液を膜に添加した時点で真空を付与し、乾燥する
まで継続することが好ましい。次いで膜を装置から取り
出し、２×ＳＳＣで短時間すすいだのち濾紙上で風乾す
る。
【００３１】膜をスクリーニングするためのプローブは
下記により調製される。適宜な容器、たとえば０．５ｍ
ｌエッペンドルフ管中で、下記の成分を列記した順に添
加することにより反応混合物を調製する： １．１０×キナーゼ緩衝液 ５μｌ ２．無菌蒸留水 ３２μｌ ３．オリゴマー（１μｇ／μｌ）１μｌ ４．ガンマ32Ｐ−ＡＴＰ（１０μＣｉ／μｌ）１０μ
ｌ。
下記により調製される。適宜な容器、たとえば０．５ｍ
ｌエッペンドルフ管中で、下記の成分を列記した順に添
加することにより反応混合物を調製する： １．１０×キナーゼ緩衝液 ５μｌ ２．無菌蒸留水 ３２μｌ ３．オリゴマー（１μｇ／μｌ）１μｌ ４．ガンマ32Ｐ−ＡＴＰ（１０μＣｉ／μｌ）１０μ
ｌ。
【００３２】この混合物を６５℃に１０分間加熱し、次
いで氷中で急冷し、この時点でキナーゼ（８Ｕ／μｌ、
１μｌ）を添加する。好ましいキナーゼはＴ４キナーゼ
であり、これは市販されている。キナーゼ添加後に反応
物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで約９
５℃に５分間加熱することにより反応を停止する。３７
℃でのインキュベーションの前および後にサンプリング
し、全カウントおよびＴＣＡ沈殿性カウント／分を計数
することにより、標識取込み率を監視することができ
る。もちろん放射性同位体の使用を伴う操作はすべて、
手袋および適宜なシールドを用いて慎重に実施する。使
用するオリゴマープローブは被験ｍＲＮＡに応じて異な
るであろう。使用するオリゴマーは種々の長さおよび／
またはコード配列のオリゴマーの組み合わせであっても
よい。オリゴマーは本発明が関係する分野の専門家に周
知の標準的ＤＮＡ合成法により調製されるか、または市
販されている（たとえばゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）、
テキサス）。プローブがゲノムＤＮＡではなくｍＲＮＡ
を定量すべく保証するために、隣接する１または２以上
のエクソンに相同な配列をそれらの配列の約５０％含む
オリゴマーを選ぶことが好ましい。
いで氷中で急冷し、この時点でキナーゼ（８Ｕ／μｌ、
１μｌ）を添加する。好ましいキナーゼはＴ４キナーゼ
であり、これは市販されている。キナーゼ添加後に反応
物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで約９
５℃に５分間加熱することにより反応を停止する。３７
℃でのインキュベーションの前および後にサンプリング
し、全カウントおよびＴＣＡ沈殿性カウント／分を計数
することにより、標識取込み率を監視することができ
る。もちろん放射性同位体の使用を伴う操作はすべて、
手袋および適宜なシールドを用いて慎重に実施する。使
用するオリゴマープローブは被験ｍＲＮＡに応じて異な
るであろう。使用するオリゴマーは種々の長さおよび／
またはコード配列のオリゴマーの組み合わせであっても
よい。オリゴマーは本発明が関係する分野の専門家に周
知の標準的ＤＮＡ合成法により調製されるか、または市
販されている（たとえばゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）、
テキサス）。プローブがゲノムＤＮＡではなくｍＲＮＡ
を定量すべく保証するために、隣接する１または２以上
のエクソンに相同な配列をそれらの配列の約５０％含む
オリゴマーを選ぶことが好ましい。
【００３３】上記により調製された膜を、約７５ｍｌの
ハイブリダイゼーション緩衝液を入れたシール可能なパ
ウチまたはバッグに装入する。食品用プラスチックバッ
グ、たとえばデイジーＵＳＡを用いることが好ましい。
バッグをシールし、３７℃の振盪式水浴に少なくとも２
０分間浸漬する。次いでバッグをわずかに開き、各バッ
グに１μｌの９５℃処理プローブ（約１×１０7ｃｐｍ
／μｇオリゴマー）を添加する。余分な空気をもみ出し
たのち、バッグを再シールし、ハイブリダイゼーション
のために振盪式水浴に浸漬する。ハイブリダイゼーショ
ン用水浴の温度はプローブおよび被験ｍＲＮＡ種の関数
として変化するであろう。このハイブリダイゼーション
の温度は本明細書の記載から当業者が容易に決定しう
る。ハイブリダイゼーションは少なくとも４時間実施さ
れる。しかしハイブリダイゼーションを一夜継続するこ
とが好ましい。
ハイブリダイゼーション緩衝液を入れたシール可能なパ
ウチまたはバッグに装入する。食品用プラスチックバッ
グ、たとえばデイジーＵＳＡを用いることが好ましい。
バッグをシールし、３７℃の振盪式水浴に少なくとも２
０分間浸漬する。次いでバッグをわずかに開き、各バッ
グに１μｌの９５℃処理プローブ（約１×１０7ｃｐｍ
／μｇオリゴマー）を添加する。余分な空気をもみ出し
たのち、バッグを再シールし、ハイブリダイゼーション
のために振盪式水浴に浸漬する。ハイブリダイゼーショ
ン用水浴の温度はプローブおよび被験ｍＲＮＡ種の関数
として変化するであろう。このハイブリダイゼーション
の温度は本明細書の記載から当業者が容易に決定しう
る。ハイブリダイゼーションは少なくとも４時間実施さ
れる。しかしハイブリダイゼーションを一夜継続するこ
とが好ましい。
【００３４】ハイブリダイゼーションののち、バッグを
開き、ハイブリダイゼーション溶液を適切に貯蔵および
廃棄するために１または２以上の適宜な容器、たとえば
５０ｍｌ試験管に慎重に注入する。バッグまたは蓋付き
プラスチック容器内にまだ残されている膜を約２００ｍ
ｌのハイブリダイゼーション用洗浄液ですすぎ、洗液を
注ぎ出し、それぞれに約２００ｍｌの新たなハイブリダ
イゼーション用洗浄液を添加する。バッグまたはプラス
チック容器を再シールし、振盪式水浴に約３０分間装入
する。この時点での水浴の温度もプローブおよびｍＲＮ
Ａ種の関数であり、同様に本明細書の記載から当業者が
容易に決定しうる。次いでバッグまたはプラスチック容
器をを開き、ハイブリダイゼーション洗浄用緩衝液を注
ぎ出す。次いで各バッグに少量のハイブリダイゼーショ
ン洗浄用緩衝液を添加し、これで膜をすすぎ、そしてハ
イブリダイゼーション洗浄用緩衝液を廃棄する。バッグ
またはプラスチック容器それぞれに２００ｍｌの新たな
ハイブリダイゼーション洗浄用緩衝液を添加し、バッグ
を再シールし、上記の洗浄に用いたと同じ温度の振盪式
水浴に約３０分間装入する。すすぎおよび洗浄処理をさ
らに１回または２回反復する。次いでバッグまたはプラ
スチック容器から膜を取り出し、濾紙に乗せて風乾す
る。
開き、ハイブリダイゼーション溶液を適切に貯蔵および
廃棄するために１または２以上の適宜な容器、たとえば
５０ｍｌ試験管に慎重に注入する。バッグまたは蓋付き
プラスチック容器内にまだ残されている膜を約２００ｍ
ｌのハイブリダイゼーション用洗浄液ですすぎ、洗液を
注ぎ出し、それぞれに約２００ｍｌの新たなハイブリダ
イゼーション用洗浄液を添加する。バッグまたはプラス
チック容器を再シールし、振盪式水浴に約３０分間装入
する。この時点での水浴の温度もプローブおよびｍＲＮ
Ａ種の関数であり、同様に本明細書の記載から当業者が
容易に決定しうる。次いでバッグまたはプラスチック容
器をを開き、ハイブリダイゼーション洗浄用緩衝液を注
ぎ出す。次いで各バッグに少量のハイブリダイゼーショ
ン洗浄用緩衝液を添加し、これで膜をすすぎ、そしてハ
イブリダイゼーション洗浄用緩衝液を廃棄する。バッグ
またはプラスチック容器それぞれに２００ｍｌの新たな
ハイブリダイゼーション洗浄用緩衝液を添加し、バッグ
を再シールし、上記の洗浄に用いたと同じ温度の振盪式
水浴に約３０分間装入する。すすぎおよび洗浄処理をさ
らに１回または２回反復する。次いでバッグまたはプラ
スチック容器から膜を取り出し、濾紙に乗せて風乾す
る。
【００３５】次いで、乾燥した膜を適宜な装置により計
数する。たとえば本発明方法において９６ウェルディッ
シュ形式を採用した場合、マトリックス９６カウンター
（パッカード，Ａ キャンベラ社、コネチカット州）を
用いることが好ましい。
数する。たとえば本発明方法において９６ウェルディッ
シュ形式を採用した場合、マトリックス９６カウンター
（パッカード，Ａ キャンベラ社、コネチカット州）を
用いることが好ましい。
【００３６】データは下記の様式で集計および分析され
る： １）試験試薬を入れなかった特定のウェルを対照として
用いるか、または対照と異なる数値がわずかである試験
の場合はすべての位置からのデータを集計して中央値を
対照として用いる； ２）各実験値を対照値で割る； ３）数値は、本発明方法を実施する者により設定された
基準により対照の数値から差があるとみなされる。
る： １）試験試薬を入れなかった特定のウェルを対照として
用いるか、または対照と異なる数値がわずかである試験
の場合はすべての位置からのデータを集計して中央値を
対照として用いる； ２）各実験値を対照値で割る； ３）数値は、本発明方法を実施する者により設定された
基準により対照の数値から差があるとみなされる。
【００３７】この方法により、対照より大きい数値およ
び小さい数値を識別することができる。
び小さい数値を識別することができる。
【００３８】本発明を高処理量スクリーニングにおいて
実施する場合、適宜なコンピータープログラムを用いて
上記操作によるデータを分析することが好ましい。この
ようなプログラムはメインフレームまたはパーソナルコ
ンピーターを操作する技術分野の専門家は容易に書くこ
とができる。さらに市販のソフトウェア、たとえばロー
タスまたはエクセル・スプレッドシートを利用してそれ
らのデータを分析および提示することができる。
実施する場合、適宜なコンピータープログラムを用いて
上記操作によるデータを分析することが好ましい。この
ようなプログラムはメインフレームまたはパーソナルコ
ンピーターを操作する技術分野の専門家は容易に書くこ
とができる。さらに市販のソフトウェア、たとえばロー
タスまたはエクセル・スプレッドシートを利用してそれ
らのデータを分析および提示することができる。
【００３９】上記方法は、インビボ源から直接得られた
細胞にも適用しうる。たとえば腫瘍または組織細胞をイ
ンビボ源から無菌的な切採または他の適宜な方法（たと
えば頬擦過）により得ることができる。ネズミ腫瘍細胞
につき本発明を実施した例を以下に記載する。
細胞にも適用しうる。たとえば腫瘍または組織細胞をイ
ンビボ源から無菌的な切採または他の適宜な方法（たと
えば頬擦過）により得ることができる。ネズミ腫瘍細胞
につき本発明を実施した例を以下に記載する。
【００４０】無菌的切採により得たネズミ腫瘍細胞を１
０ｃｍのディッシュに装入し、蓋をし、秤量し、２ｍｇ
／ｍｌコラゲナーゼ、２％ウシ血清アルブミンおよび４
ｍＭＬ−グルタミンを含有するｐＨ７．４のコラゲナー
ゼ溶液１ｍｌ中で細断する。次いで上記コラゲナーゼ溶
液１部、ならびに１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、０．
６％Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレ
プトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌフンギゾン、１７μ
Ｍパントテン酸カルシウム、３３μｌ ｄ−ビオチン、
１００μＭアスコルビン酸および０．８２ｍＭ Ｎａ2
ＣＯ3を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）２部を入れたフラスコ内で、細胞をトリプシン処
理する。フラスコにアルミニウム箔で蓋をし、回転式振
盪機により１４０ｒｐｍで３７℃において６０分間イン
キュベートする。インキュベーションに際して細胞懸濁
液を１５分毎に慎重にピペット操作して組織断片をディ
スペンスし、クランプ形成した細胞を分断し、１５分間
のインキュベーション後に細胞懸濁液ｍｌ当たり１０μ
ｌのＤＮａｓｅ（２４５０Ｕ／ｍｌ）を添加する。次い
で細胞懸濁液を上記の補充ＤＭＥＭにより容量を４倍に
増加させて、１００ミクロンメッシュのナイロンスクリ
ーンに導通する。細胞を８００×ｇで４℃において１０
分間遠心分離し、上澄液をデカントし、そして細胞を０
℃の補充ＤＭＥＭに再懸濁する。遠心分離を合計１０回
反復し、最後に細胞を０℃の補充ＤＭＥＭ（細胞のｇ当
たり４ｍｌ）に懸濁する。次いで細胞懸濁液を４０ミク
ロンメッシュのナイロンスクリーンに導通する。
０ｃｍのディッシュに装入し、蓋をし、秤量し、２ｍｇ
／ｍｌコラゲナーゼ、２％ウシ血清アルブミンおよび４
ｍＭＬ−グルタミンを含有するｐＨ７．４のコラゲナー
ゼ溶液１ｍｌ中で細断する。次いで上記コラゲナーゼ溶
液１部、ならびに１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、０．
６％Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレ
プトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌフンギゾン、１７μ
Ｍパントテン酸カルシウム、３３μｌ ｄ−ビオチン、
１００μＭアスコルビン酸および０．８２ｍＭ Ｎａ2
ＣＯ3を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）２部を入れたフラスコ内で、細胞をトリプシン処
理する。フラスコにアルミニウム箔で蓋をし、回転式振
盪機により１４０ｒｐｍで３７℃において６０分間イン
キュベートする。インキュベーションに際して細胞懸濁
液を１５分毎に慎重にピペット操作して組織断片をディ
スペンスし、クランプ形成した細胞を分断し、１５分間
のインキュベーション後に細胞懸濁液ｍｌ当たり１０μ
ｌのＤＮａｓｅ（２４５０Ｕ／ｍｌ）を添加する。次い
で細胞懸濁液を上記の補充ＤＭＥＭにより容量を４倍に
増加させて、１００ミクロンメッシュのナイロンスクリ
ーンに導通する。細胞を８００×ｇで４℃において１０
分間遠心分離し、上澄液をデカントし、そして細胞を０
℃の補充ＤＭＥＭに再懸濁する。遠心分離を合計１０回
反復し、最後に細胞を０℃の補充ＤＭＥＭ（細胞のｇ当
たり４ｍｌ）に懸濁する。次いで細胞懸濁液を４０ミク
ロンメッシュのナイロンスクリーンに導通する。
【００４１】この時点で細胞をリン酸緩衝食塩液で洗浄
し、次いで前記に従って細胞溶解し、目的の配列を増幅
し、分析することができる。あるいは細胞をマルチプル
ウェル−ディッシュに直接装入し、前記方法に従って使
用することもできる。あるいはまた、当業者に周知の方
法、たとえばトリパンブルー色素排斥法により細胞の生
存性を判定することができる。次いで１０ｃｍの組織培
養プレート当たり１×１０7細胞の密度で細胞を接種す
る。細胞をコンフルエンシーに達するまで増殖させ、組
織培養皿から掻き取り、１０ｍｌの補充ＤＭＥＭに再懸
濁する。１ｍｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのエッペンド
ルフ試験管中でペレット化し、ペレットをリン酸緩衝食
塩液で洗浄し、再度ペレット化する。次いで前記に従っ
て細胞を２５０μｌの水中で細胞溶解する。次いで細胞
溶解質５０μｌを目的の逆転写酵素反応混合物５０μｌ
と共に使用したのち、目的配列の増幅および検出を行
う。これらはすべて前記に従う。
し、次いで前記に従って細胞溶解し、目的の配列を増幅
し、分析することができる。あるいは細胞をマルチプル
ウェル−ディッシュに直接装入し、前記方法に従って使
用することもできる。あるいはまた、当業者に周知の方
法、たとえばトリパンブルー色素排斥法により細胞の生
存性を判定することができる。次いで１０ｃｍの組織培
養プレート当たり１×１０7細胞の密度で細胞を接種す
る。細胞をコンフルエンシーに達するまで増殖させ、組
織培養皿から掻き取り、１０ｍｌの補充ＤＭＥＭに再懸
濁する。１ｍｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌのエッペンド
ルフ試験管中でペレット化し、ペレットをリン酸緩衝食
塩液で洗浄し、再度ペレット化する。次いで前記に従っ
て細胞を２５０μｌの水中で細胞溶解する。次いで細胞
溶解質５０μｌを目的の逆転写酵素反応混合物５０μｌ
と共に使用したのち、目的配列の増幅および検出を行
う。これらはすべて前記に従う。
【００４２】本明細書および特許請求の範囲全体におい
て用いられる単数形は複数形をも包含し、逆も同様であ
る。以上の記載は複数のミクロタイターディッシュを利
用した本発明方法を開示するが、本発明方法は他の型の
容器および他の数の試料にも同様に利用しうる。たとえ
ば本方法を１個のミクロタイターディッシュ、複数の試
験管、または１本の試験管にすら採用することができ、
これらに限定されない。本発明方法に関して以上に記載
した操作は、必要な修正を加えてこのような他の容器に
適用することができる。さらにここに記載した容量はお
おまかなものであり、本発明を限定するものではない。
容量および量の適切な比率が維持される限り、用いる全
容量および全量は本発明の範囲から逸脱することなく増
減させることができる。本明細書および特許請求の範囲
全体においてＨ2Ｏまたは水に関する記載はすべて、特
に指示しない限り脱イオンされたＨ2Ｏまたは水に関す
るものである。
て用いられる単数形は複数形をも包含し、逆も同様であ
る。以上の記載は複数のミクロタイターディッシュを利
用した本発明方法を開示するが、本発明方法は他の型の
容器および他の数の試料にも同様に利用しうる。たとえ
ば本方法を１個のミクロタイターディッシュ、複数の試
験管、または１本の試験管にすら採用することができ、
これらに限定されない。本発明方法に関して以上に記載
した操作は、必要な修正を加えてこのような他の容器に
適用することができる。さらにここに記載した容量はお
おまかなものであり、本発明を限定するものではない。
容量および量の適切な比率が維持される限り、用いる全
容量および全量は本発明の範囲から逸脱することなく増
減させることができる。本明細書および特許請求の範囲
全体においてＨ2Ｏまたは水に関する記載はすべて、特
に指示しない限り脱イオンされたＨ2Ｏまたは水に関す
るものである。
【００４３】
実施例１ ヒト線維芽細胞における顆粒球−マクロファージ−コロ
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡ水準、アルドラ
ーゼｍＲＮＡ水準、および顆粒球−コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡ水準に対する化合物の作用のス
クリーニング １ａ．初代線維芽細胞系の株化（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍ
ｅｎｔ） 近在由来のヒト包皮組織を細断し、コラゲナーゼ（１ｍ
ｇ／ｍｌ，３７℃，１０−２０％熱不活化（５６℃，１
／２時間）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中）で処理した。細
胞は３７℃、７％ＣＯ2において、１０％ＦＣＳ、なら
びに１０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したダルベッコの
改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ヘイゼルトンＤＭＥ培
地，カタログ＃５１−４３３７８）中での組織培養で維
持された。細胞を組織培養フラスコ内でほぼコンフルエ
ンシーにまで増殖させた。次いで細胞をトリプシン処理
（０．２５％トリプシン，０．０２％ ＥＤＴＡ）し、
ＤＭＥＭプラス１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓ中に１対４に
希釈した。次いで細胞をＣＯ2インキュベーター（７％
ＣＯ2）に戻した。十分な細胞数が得られるまでトリプ
シン処理および細胞増殖の操作を反復した。通常は３−
５回の反復で十分な細胞数が得られることが認められ
た。次いで細胞を２５％ウシ胎仔血清および１０％ジメ
チルスルホキシドを補充したＤＭＥＭ中に、約５×１０
6細胞／ｍｌで懸濁した。ジメチルスルホキシド添加後
に、細胞を直ちに１ｍｌアリコートに分割し、液体窒素
中に貯蔵した。
ニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡ水準、アルドラ
ーゼｍＲＮＡ水準、および顆粒球−コロニー刺激因子
（Ｇ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡ水準に対する化合物の作用のス
クリーニング １ａ．初代線維芽細胞系の株化（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍ
ｅｎｔ） 近在由来のヒト包皮組織を細断し、コラゲナーゼ（１ｍ
ｇ／ｍｌ，３７℃，１０−２０％熱不活化（５６℃，１
／２時間）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中）で処理した。細
胞は３７℃、７％ＣＯ2において、１０％ＦＣＳ、なら
びに１０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したダルベッコの
改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ヘイゼルトンＤＭＥ培
地，カタログ＃５１−４３３７８）中での組織培養で維
持された。細胞を組織培養フラスコ内でほぼコンフルエ
ンシーにまで増殖させた。次いで細胞をトリプシン処理
（０．２５％トリプシン，０．０２％ ＥＤＴＡ）し、
ＤＭＥＭプラス１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓ中に１対４に
希釈した。次いで細胞をＣＯ2インキュベーター（７％
ＣＯ2）に戻した。十分な細胞数が得られるまでトリプ
シン処理および細胞増殖の操作を反復した。通常は３−
５回の反復で十分な細胞数が得られることが認められ
た。次いで細胞を２５％ウシ胎仔血清および１０％ジメ
チルスルホキシドを補充したＤＭＥＭ中に、約５×１０
6細胞／ｍｌで懸濁した。ジメチルスルホキシド添加後
に、細胞を直ちに１ｍｌアリコートに分割し、液体窒素
中に貯蔵した。
【００４４】１ｂ．線維芽細胞の増殖 上記１ａの記載に従って調製した凍結線維芽細胞のアリ
コートを３７℃の水浴に浸漬することによって急速解凍
した。１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ
５０ｍｌを入れた１７５ｃｍ2 のフラスコに、解凍細胞
を移した。細胞が定着した時点で３−４日毎に、または
細胞がコンフルエンシーに達した際に、上記１ａの記載
に従って細胞をトリプシン処理した。細胞はこうして最
高１２代まで維持された。
コートを３７℃の水浴に浸漬することによって急速解凍
した。１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ
５０ｍｌを入れた１７５ｃｍ2 のフラスコに、解凍細胞
を移した。細胞が定着した時点で３−４日毎に、または
細胞がコンフルエンシーに達した際に、上記１ａの記載
に従って細胞をトリプシン処理した。細胞はこうして最
高１２代まで維持された。
【００４５】１ｃ．ミクロタイターディッシュの接種 アッセイの２日前に、上記１ｂに従って調製した線維芽
細胞を上記１ａに記載した方法に従ってトリプシン処理
することにより、フラスコから取出した。１０％ＦＣＳ
およびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ中に細胞を約５×１０
4細胞／ｍｌの密度に希釈した。次いで２００μｌの希
釈細胞を９６ウェルの平底ミクロタイターディッシュの
各ウェルに添加した。ディッシュは３７℃、７％ＣＯ2
において約４８時間インキュベートされた。
細胞を上記１ａに記載した方法に従ってトリプシン処理
することにより、フラスコから取出した。１０％ＦＣＳ
およびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ中に細胞を約５×１０
4細胞／ｍｌの密度に希釈した。次いで２００μｌの希
釈細胞を９６ウェルの平底ミクロタイターディッシュの
各ウェルに添加した。ディッシュは３７℃、７％ＣＯ2
において約４８時間インキュベートされた。
【００４６】１ｄ．被験化合物の添加およびインキュベ
ーション 被験化合物を１ｍＭトリス（ｐＨ７．３）および０．９
％ＤＭＳＯ中に約５０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、２０
μｌ（最終容量の１０％）を２または３ウェル／化合物
で添加した。化合物を添加するために一度に約４個を越
えるディッシュをインキュベーターから取出すことはな
かった。これにより細胞に対する温度衝撃が最小限に抑
えられた。対照として、表示された第１ウェルに１０ｎ
ｇ（２０μｌ）のネズミＩＬ−１アルファ（ｍＩＬ−
１，ファイザー社において既知の組換えＤＮＡ法により
調製され、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において発現され
た）、表示された第２ウェルに１ｎｇ（２０μｌ）のｍ
ＩＬ−１、表示された第３ウェルに０．１ｎｇ（２０μ
ｌ）のｍＩＬ−１を添加し、他の３個の表示されたウェ
ルに２０μｌ／ウェルの１ｍＭトリス（ｐＨ７．３）を
添加した。これらのディッシュを３７℃でＣＯ2インキ
ュベーター（７％ＣＯ2）中において約１８０分間イン
キュベートした。一連のウェルにつき約１８０分間のイ
ンキュベーションを維持するために、１グループのウェ
ルを約５分間隔で処理した。
ーション 被験化合物を１ｍＭトリス（ｐＨ７．３）および０．９
％ＤＭＳＯ中に約５０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、２０
μｌ（最終容量の１０％）を２または３ウェル／化合物
で添加した。化合物を添加するために一度に約４個を越
えるディッシュをインキュベーターから取出すことはな
かった。これにより細胞に対する温度衝撃が最小限に抑
えられた。対照として、表示された第１ウェルに１０ｎ
ｇ（２０μｌ）のネズミＩＬ−１アルファ（ｍＩＬ−
１，ファイザー社において既知の組換えＤＮＡ法により
調製され、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において発現され
た）、表示された第２ウェルに１ｎｇ（２０μｌ）のｍ
ＩＬ−１、表示された第３ウェルに０．１ｎｇ（２０μ
ｌ）のｍＩＬ−１を添加し、他の３個の表示されたウェ
ルに２０μｌ／ウェルの１ｍＭトリス（ｐＨ７．３）を
添加した。これらのディッシュを３７℃でＣＯ2インキ
ュベーター（７％ＣＯ2）中において約１８０分間イン
キュベートした。一連のウェルにつき約１８０分間のイ
ンキュベーションを維持するために、１グループのウェ
ルを約５分間隔で処理した。
【００４７】１ｅ．細胞の回収 ディッシュを３−６個のグループでインキュベーターか
ら取出した。可能な限り速やかにプレートを裏返して培
地を除去し、バイオ−ラドミクロプレート洗浄機（バイ
オ−ラド，カタログ＃１７０−６５４０）に装入し、予
熱した（３７℃）ＰＢＳ（ヘイゼルトン・ダルベッコの
リン酸緩衝食塩液，カタログ＃３１０−４１９０ＡＫ）
を用いて、３回のすすぎ／吸引サイクルで各サイクルに
つき２００μｌにおいてミクロプレート洗浄機によりす
すいだ。吸引高さは、各サイクルの終了時に約１００μ
ｌのＰＢＳが各ウェルに残留するように調整された。洗
浄後にディッシュを急激に裏返し、裏返したディッシュ
を平らなペーパータオル上で、ウェルの内側を吸取らな
いように注意して吸取ることにより、残留ＰＢＳをウェ
ルから除去した。
ら取出した。可能な限り速やかにプレートを裏返して培
地を除去し、バイオ−ラドミクロプレート洗浄機（バイ
オ−ラド，カタログ＃１７０−６５４０）に装入し、予
熱した（３７℃）ＰＢＳ（ヘイゼルトン・ダルベッコの
リン酸緩衝食塩液，カタログ＃３１０−４１９０ＡＫ）
を用いて、３回のすすぎ／吸引サイクルで各サイクルに
つき２００μｌにおいてミクロプレート洗浄機によりす
すいだ。吸引高さは、各サイクルの終了時に約１００μ
ｌのＰＢＳが各ウェルに残留するように調整された。洗
浄後にディッシュを急激に裏返し、裏返したディッシュ
を平らなペーパータオル上で、ウェルの内側を吸取らな
いように注意して吸取ることにより、残留ＰＢＳをウェ
ルから除去した。
【００４８】１ｆ．細胞溶解およびＤＮＡ配列の増幅 ４個のディッシュのグループにおいて１分間隔で作業し
て、室温の蒸留水５０μｌをソークン・シグマ・ペット
９６ピペッターにより各ウェルに添加した。水を添加し
た直後にディッシュを９９℃の鉱油浴に６分間浮かせ
た。次いで他のソークン・シグマ・ペット９６ピペッタ
ーにより１０−１２μｌの細胞溶解質を各ウェルから取
出し、先端で７秒間冷却した。次いで１０μｌ／ウェル
の低温のアニーリング／ＲＴ緩衝液を入れた９６ウェル
のビニル製ディッシュ（コスター・セロクラスター″
Ｕ″ビニルプレート，カタログ＃２７９７）に細胞溶解
質を移した（それらのディッシュは氷スラリーに乗せて
ある）。アニーリング／ＲＴ緩衝液は下記を含有してい
た：０．０８μｌのプライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
（５′ＣＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧ
ＧＴＣＡＡ，１μｇ／μｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ
にアニール；０．０４μｌのプライマーＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：２（５′ＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＣ
ＴＣＣ，１μｇ／μｌ）、アルドラーゼｍＲＮＡにアニ
ール；および０．０８μｌのプライマーＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３（５′ＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣ
ＣＧＧＣＡＴ，１μｇ／μｌ）、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ
にアニール。ＡＭＶ逆転写酵素はモレキュラー・ジェネ
ティック社から入手され（カタログ＃３１０−４１９０
ＡＫ）、ＲＮａｓｉｎはベーリンガー・マンハイムから
入手された（カタログ＃７９９−０２５）。ディッシュ
を直ちにＭ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・
コントローラー（９６ウェル型）に移した。この装置は
各ウェルに約１／３まで鉱油を満たしておき、そしてデ
ィッシュを４２℃で１５分間インキュベートしたのち９
５℃で５分間すすぐようにプログラムしておいた。次い
でディッシュを４℃に冷却した。各ウェルに１０μｌの
プロテイナーゼＫ（５００μｇ／ｍｌ）（ベーリンガー
・マンハイム，カタログ＃１０９２−７６６）を添加
し、次いで５０μｌの軽鉱油（フィッシャー・ケミカ
ル，カタログ＃０−１２１−１）をソークン・ピペッタ
ーにより積層した。次いで、６０℃に１０分間加熱した
のち９５℃に１０分間と指示するようにプログラムされ
たＭ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・コント
ローラーにディッシュを装入した。次いでプレートを４
℃に冷却した。
て、室温の蒸留水５０μｌをソークン・シグマ・ペット
９６ピペッターにより各ウェルに添加した。水を添加し
た直後にディッシュを９９℃の鉱油浴に６分間浮かせ
た。次いで他のソークン・シグマ・ペット９６ピペッタ
ーにより１０−１２μｌの細胞溶解質を各ウェルから取
出し、先端で７秒間冷却した。次いで１０μｌ／ウェル
の低温のアニーリング／ＲＴ緩衝液を入れた９６ウェル
のビニル製ディッシュ（コスター・セロクラスター″
Ｕ″ビニルプレート，カタログ＃２７９７）に細胞溶解
質を移した（それらのディッシュは氷スラリーに乗せて
ある）。アニーリング／ＲＴ緩衝液は下記を含有してい
た：０．０８μｌのプライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
（５′ＣＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧ
ＧＴＣＡＡ，１μｇ／μｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ
にアニール；０．０４μｌのプライマーＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：２（５′ＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＣ
ＴＣＣ，１μｇ／μｌ）、アルドラーゼｍＲＮＡにアニ
ール；および０．０８μｌのプライマーＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３（５′ＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣ
ＣＧＧＣＡＴ，１μｇ／μｌ）、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ
にアニール。ＡＭＶ逆転写酵素はモレキュラー・ジェネ
ティック社から入手され（カタログ＃３１０−４１９０
ＡＫ）、ＲＮａｓｉｎはベーリンガー・マンハイムから
入手された（カタログ＃７９９−０２５）。ディッシュ
を直ちにＭ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・
コントローラー（９６ウェル型）に移した。この装置は
各ウェルに約１／３まで鉱油を満たしておき、そしてデ
ィッシュを４２℃で１５分間インキュベートしたのち９
５℃で５分間すすぐようにプログラムしておいた。次い
でディッシュを４℃に冷却した。各ウェルに１０μｌの
プロテイナーゼＫ（５００μｇ／ｍｌ）（ベーリンガー
・マンハイム，カタログ＃１０９２−７６６）を添加
し、次いで５０μｌの軽鉱油（フィッシャー・ケミカ
ル，カタログ＃０−１２１−１）をソークン・ピペッタ
ーにより積層した。次いで、６０℃に１０分間加熱した
のち９５℃に１０分間と指示するようにプログラムされ
たＭ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・コント
ローラーにディッシュを装入した。次いでプレートを４
℃に冷却した。
【００４９】ディッシュの各ウェルに１０μｌのＰＣＲ
試薬溶液をソークン・ピペッターにより添加した。ＰＣ
Ｒ試薬溶液は下記を含有していた：０．０８μｌのプラ
イマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（５′ＧＧＣＡＣＴＧＴ
ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴ，１μｇ／μｌ）、
ＧＭ−ＣＳＦ配列を増幅；０．０４μｌのＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５（５′ＣＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧ
ＴＧＡ，１μｇ／μｌ）、アルドラーゼ配列を増幅；
０．０４μｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（５′ＴＴＴＧ
ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ，１μｇ／
μｌ）、Ｇ−ＣＳＦ配列を増幅。Ｔａｑ・ポリメラーゼ
はパーキン・エルマーから入手された（アンプリ−Ｔａ
ｑ・ポリメラーゼ，カタログ＃Ｎ８０１−００６０）。
９２℃に９０秒間、続いて６０℃に１２０秒間、続いて
７２℃に１８０秒間の３１サイクルにプログラムされた
Ｍ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・コントロ
ーラーにディッシュを移した。また、このコントローラ
ーは３１回目のサイクルののちディッシュを４℃に冷却
するようにプログラムされた。
試薬溶液をソークン・ピペッターにより添加した。ＰＣ
Ｒ試薬溶液は下記を含有していた：０．０８μｌのプラ
イマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（５′ＧＧＣＡＣＴＧＴ
ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴ，１μｇ／μｌ）、
ＧＭ−ＣＳＦ配列を増幅；０．０４μｌのＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５（５′ＣＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧ
ＴＧＡ，１μｇ／μｌ）、アルドラーゼ配列を増幅；
０．０４μｌのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（５′ＴＴＴＧ
ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ，１μｇ／
μｌ）、Ｇ−ＣＳＦ配列を増幅。Ｔａｑ・ポリメラーゼ
はパーキン・エルマーから入手された（アンプリ−Ｔａ
ｑ・ポリメラーゼ，カタログ＃Ｎ８０１−００６０）。
９２℃に９０秒間、続いて６０℃に１２０秒間、続いて
７２℃に１８０秒間の３１サイクルにプログラムされた
Ｍ−Ｊリサーチ・プログラマブル・サーマル・コントロ
ーラーにディッシュを移した。また、このコントローラ
ーは３１回目のサイクルののちディッシュを４℃に冷却
するようにプログラムされた。
【００５０】１ｇ．増幅ＤＮＡ配列の検出 上記１ｆの記載に従って処理したディッシュの各ウェル
に、無菌蒸留水５０μｌをソークン・ピペッターにより
添加した。次いでソークン・ピペッターを用いて各ウェ
ルから５０μｌを取出し、２５０μｌのドット・ブロッ
ト変性用緩衝液を入れた１．２ｍｌのミクロ試験管に装
入した。底を取除いたラック内に試験管を配置した。ラ
ックを９５℃以上の水浴に５分間挿入した。次いでソー
クン・ピペッターを用いて２５０μｌを取出し、バイオ
・ラド・ゼータ−プローブナイロンフィルター（カタロ
グ＃１６２−０１５３）（水に１分間以上浸漬し、それ
に真空を付与して過剰の水を除去したもの）を入れたバ
イオ・ラド・ドット・ブロット装置（カタログ＃１７０
−６５４５）に装入した。バイオ・ラド・ゼータ−プロ
ーブナイロンフィルターは手袋で保護した手で取扱い、
フィルターにペンで番号およびインデックスを付けた。
ブロットしたのち、真空を付与し、すべてのウェルが乾
燥するまで続けた。
に、無菌蒸留水５０μｌをソークン・ピペッターにより
添加した。次いでソークン・ピペッターを用いて各ウェ
ルから５０μｌを取出し、２５０μｌのドット・ブロッ
ト変性用緩衝液を入れた１．２ｍｌのミクロ試験管に装
入した。底を取除いたラック内に試験管を配置した。ラ
ックを９５℃以上の水浴に５分間挿入した。次いでソー
クン・ピペッターを用いて２５０μｌを取出し、バイオ
・ラド・ゼータ−プローブナイロンフィルター（カタロ
グ＃１６２−０１５３）（水に１分間以上浸漬し、それ
に真空を付与して過剰の水を除去したもの）を入れたバ
イオ・ラド・ドット・ブロット装置（カタログ＃１７０
−６５４５）に装入した。バイオ・ラド・ゼータ−プロ
ーブナイロンフィルターは手袋で保護した手で取扱い、
フィルターにペンで番号およびインデックスを付けた。
ブロットしたのち、真空を付与し、すべてのウェルが乾
燥するまで続けた。
【００５１】フィルターを装置から取出し、２×ＳＳＣ
で短期間すすいだのち、濾紙上で風乾した。次いでフィ
ルターをシール可能なプラスチックバッグに装入し、こ
れに約７５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加
した。バッグをシールし、３７℃の振盪式水浴に少なく
とも２０分間浸漬した。次いでバッグをわずかに開き、
１μｇの９５℃処理プローブ（それぞれ約１×１０7ｃ
ｐｍ／μｇのオリゴマープローブＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７（５′ＧＣＡＧＧＴＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣ
ＡＡＡＣＡＴ）、ＧＭ−ＣＳＦ配列を検出；ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：８（５′ＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧ
ＧＣＧＧＧＴＧ）、アルドラーゼ配列を検出；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：９（５′ＴＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡ
ＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧ）、Ｇ−ＣＳＦ配列を
検出）をそれぞれに添加した。余分な空気をバッグから
もみ出したのち、バッグを再シールした。バッグを３７
℃の振盪式水浴に少なくとも４時間浸漬した。次いでハ
イブリダイゼーション溶液を貯蔵および廃棄のために５
０ｍｌの試験管に慎重に注入した。
で短期間すすいだのち、濾紙上で風乾した。次いでフィ
ルターをシール可能なプラスチックバッグに装入し、こ
れに約７５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加
した。バッグをシールし、３７℃の振盪式水浴に少なく
とも２０分間浸漬した。次いでバッグをわずかに開き、
１μｇの９５℃処理プローブ（それぞれ約１×１０7ｃ
ｐｍ／μｇのオリゴマープローブＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７（５′ＧＣＡＧＧＴＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣ
ＡＡＡＣＡＴ）、ＧＭ−ＣＳＦ配列を検出；ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：８（５′ＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧ
ＧＣＧＧＧＴＧ）、アルドラーゼ配列を検出；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：９（５′ＴＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡ
ＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧ）、Ｇ−ＣＳＦ配列を
検出）をそれぞれに添加した。余分な空気をバッグから
もみ出したのち、バッグを再シールした。バッグを３７
℃の振盪式水浴に少なくとも４時間浸漬した。次いでハ
イブリダイゼーション溶液を貯蔵および廃棄のために５
０ｍｌの試験管に慎重に注入した。
【００５２】フィルターをそれぞれ約２００ｍｌのハイ
ブリダイゼーション洗浄液ですすぎ、次いで洗液を除去
し、約２００ｍｌの新たなハイブリダイゼーション洗浄
液を添加した。バッグを再シールし、５２℃の振盪式水
浴に少なくとも３０分間装入した。
ブリダイゼーション洗浄液ですすぎ、次いで洗液を除去
し、約２００ｍｌの新たなハイブリダイゼーション洗浄
液を添加した。バッグを再シールし、５２℃の振盪式水
浴に少なくとも３０分間装入した。
【００５３】このすすぎおよび洗浄処理を各フィルター
につき１回または２回反復した。
につき１回または２回反復した。
【００５４】最後のすすぎおよび洗浄ののち、フィルタ
ーをバッグから取出して濾紙上に移し、風乾した。乾燥
した時点でフィルターをマトリックス９６カウンターに
より計数した。
ーをバッグから取出して濾紙上に移し、風乾した。乾燥
した時点でフィルターをマトリックス９６カウンターに
より計数した。
【００５５】マトリックス９６カウンターから得たデー
タをパーソナルコンピューターにより、ＶＡＸメインフ
レームコンピューターへの移行用に集計およびフォーマ
ット化した。このデータをＶＡＸメインフレームコンピ
ューターによる操作のために書かれたソフトウェアプロ
グラムを用いて前記に従って分析した。
タをパーソナルコンピューターにより、ＶＡＸメインフ
レームコンピューターへの移行用に集計およびフォーマ
ット化した。このデータをＶＡＸメインフレームコンピ
ューターによる操作のために書かれたソフトウェアプロ
グラムを用いて前記に従って分析した。
【００５６】この実施例１に記載した方法により、多数
の化合物をそれらがＧＭ−ＣＳＦ、アルドラーゼおよび
／またはＧ−ＣＳＦをコードするｍＲＮＡの水準に作用
する効力につき、１週間でスクリーニングすることがで
きた。
の化合物をそれらがＧＭ−ＣＳＦ、アルドラーゼおよび
／またはＧ−ＣＳＦをコードするｍＲＮＡの水準に作用
する効力につき、１週間でスクリーニングすることがで
きた。
【００５７】実施例２ヒトＬＤＬｒの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）判定 楊枝で個々の頬の内側を擦過することにより頬細胞を採
取した。細胞を０．５ｍｌエッペンドルフ試験管中の９
５℃Ｈ2Ｏ ２００μｌに懸濁し、４分間煮沸した。試
験管を氷上で急冷したのち、８μｌの１０ｍｇ／ｍｌプ
ロテイナーゼＫを添加し、試料を６０℃で２０分間イン
キュベートした。次いで細胞溶解質を９０℃で１０分
間、加熱不活化した。次いで５０μｌの細胞溶解質を下
記よりなるＰＣＲ試薬溶液５０μｌに添加した：４１．
５μｌのＨ2Ｏ、５．５μｌの２０×ＰＣＲ緩衝液、２
μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのＴａｑポリメ
ラーゼ（パーキン−エルマー）、０．２５μｌのプライ
マーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１１（５′ＡＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＡＣＡ
ＧＧおよび５′ＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣ
ＴＣ，それぞれ１μｇ／μｌ）。次いでＬＤＬｒ遺伝子
フラグメントを９５℃で１．５分間、６０℃で２分間、
および７２℃で３分間からなるＰＣＲサイクル３０回に
より増幅した。次いでこの増幅ＤＮＡを実施例１の記載
に従ってドットブロットし、対立遺伝子特異性の放射性
オリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２またはＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１３（５′ＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＣＴ
ＴＣＣＡまたは５′ＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＡＴ
ＣＣＴ）でプローブした。次いで結合プローブをベータ
・スコープ・ブロット・アナライザー（ベータジェン）
により定量した。
取した。細胞を０．５ｍｌエッペンドルフ試験管中の９
５℃Ｈ2Ｏ ２００μｌに懸濁し、４分間煮沸した。試
験管を氷上で急冷したのち、８μｌの１０ｍｇ／ｍｌプ
ロテイナーゼＫを添加し、試料を６０℃で２０分間イン
キュベートした。次いで細胞溶解質を９０℃で１０分
間、加熱不活化した。次いで５０μｌの細胞溶解質を下
記よりなるＰＣＲ試薬溶液５０μｌに添加した：４１．
５μｌのＨ2Ｏ、５．５μｌの２０×ＰＣＲ緩衝液、２
μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのＴａｑポリメ
ラーゼ（パーキン−エルマー）、０．２５μｌのプライ
マーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１１（５′ＡＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＴＣＡＣＡ
ＧＧおよび５′ＣＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＡＣ
ＴＣ，それぞれ１μｇ／μｌ）。次いでＬＤＬｒ遺伝子
フラグメントを９５℃で１．５分間、６０℃で２分間、
および７２℃で３分間からなるＰＣＲサイクル３０回に
より増幅した。次いでこの増幅ＤＮＡを実施例１の記載
に従ってドットブロットし、対立遺伝子特異性の放射性
オリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２またはＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１３（５′ＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＣＴ
ＴＣＣＡまたは５′ＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＡＴ
ＣＣＴ）でプローブした。次いで結合プローブをベータ
・スコープ・ブロット・アナライザー（ベータジェン）
により定量した。
【００５８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 CTTGTAGTGG CTGGCCATCA TGGTCAA 27 配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 GTGAGCGATG TCAGACAGCT CC 22 配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状配列 GAAAGCAGAG GCGAAGGCCG GCAT 24 配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 GGCACTGTGG CCTGCAGCAT CTCT 24 配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 CGCAGAAGGG GTCCTGGTGA 20 配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 TTTGCCACCA CCATCTGGCA GCAG 24 配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 GCAGGTCGGC TCCTGGAGGT CAAACAT 27 配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 CTGGCACAGG AGAGGGGCGG GTG 23 配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 TTCCCAGTTC TTCCATCTGC TGCCAGATGG 30 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 AGTGCCAACC GCCTCACAGG 20 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 CCTCTCACAC CAGTTCACTC 20 配列番号：１２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 AGGATATGGT CCTCTTCCA 19 配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列 TGGAAGAGAA CCATATCCT 19
フロントページの続き (72)発明者 ラルフ・イー・デヴィッドソン アメリカ合衆国コネチカット州06359，ノ ース・ストニントン，パトリシア・アベニ ュー 62−ディー (72)発明者 デニス・エイ・ペレイラ アメリカ合衆国コネチカット州06378，ス トニントン，ペコット・トレイル 1027
Claims (22)
- 【請求項１】 細胞中の特異的ｍＲＮＡの存在を検出す
るための、下記工程を含む方法： （ａ）その中で細胞が培養された、またはその中に細胞
が存在する培地または生物学的流体を除去し； （ｂ）容器内で細胞に水を添加し、そして容器を約９０
−約１１５℃の温度の液体中に約２−約１２分間保持し
て細胞を溶解することにより、細胞溶解質を調製し； （ｃ）細胞溶解質を放冷し； （ｄ）細胞溶解質中に存在する特異的配列１または２以
上を含むｍＲＮＡから１または２以上のｃＤＮＡ配列を
調製し； （ｅ）これら１または２以上のｃＤＮＡ配列のコピー数
を増幅し；そして （ｆ）これら１または２以上のｃＤＮＡ配列の存在を検
出する。 - 【請求項２】 細胞中の１または２以上の特異的ＤＮＡ
配列の存在を検出するための、下記工程を含む方法： （ａ）その中で細胞が培養された、またはその中に細胞
が存在する培地または生物学的流体を除去し； （ｂ）容器内で細胞に水を添加し、そして容器を約９０
−約１１５℃の温度の液体中に約２−約１２分間保持し
て細胞を溶解することにより、細胞溶解質を調製し； （ｃ）細胞溶解質を放冷し； （ｄ）これら１または２以上のＤＮＡ配列のコピー数を
増幅し；そして （ｅ）増幅された１または２以上のＤＮＡ配列の存在を
検出する。 - 【請求項３】 工程（ｂ）の前に、細胞を等張液で洗浄
し、そして細胞から等張液を除去する追加工程を含む、
請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 工程（ｆ）において１または２以上のｃ
ＤＮＡ配列の存在を検出することが、それら１または２
以上のｃＤＮＡの量を定量することを含む、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項５】 工程（ｂ）において、容器が約９９℃の
温度の液体中に約４−約８分間保持される、請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項６】 工程（ｅ）の前に、ｃＤＮＡ配列を加熱
し、次いで該ｃＤＮＡ配列をプロテイナーゼで処理する
追加工程を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 工程（ｅ）の前に、ｃＤＮＡ配列を加熱
し、次いで該ｃＤＮＡ配列をプロテイナーゼで処理する
追加工程を含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 工程（ｂ）の前に、細胞を等張液で洗浄
し、そして細胞から等張液を除去し；工程（ｅ）の前
に、ｃＤＮＡ配列を加熱し、次いで該ｃＤＮＡ配列をプ
ロテイナーゼで処理する追加工程を含む、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項９】 工程（ｂ）において、容器が約９９℃の
温度の液体中に約６分間保持される、請求項３または８
に記載の方法。 - 【請求項１０】 工程（ｂ）において容器が約９９℃の
温度の液体中に約６分間保持され、工程（ｄ）が、１ま
たは２以上の特異的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列のＤＮ
Ａオリゴマーをアニールし、これから逆転写酵素により
１または２以上のｃＤＮＡ配列を調製することを含む、
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 工程（ｅ）がポリメラーゼ連鎖反応に
より１または２以上のｃＤＮＡ配列を増幅することより
なり、工程（ｆ）において１または２以上のｃＤＮＡ配
列の存在を検出することがそれら１または２以上のｃＤ
ＮＡの量を定量することを含む、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１２】 工程（ｅ）において、ｃＤＮＡのコピ
ー数が１または２以上の放射性標識ヌクレオチドまたは
検出可能なヌクレオチド同族体の存在下で増幅される、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 工程（ｂ）の前に、細胞を等張液で洗
浄し、そして細胞から等張液を除去する追加工程を含
み、工程（ｂ）において容器が約９９℃の温度の液体中
に約６分間保持され、工程（ｄ）がポリメラーゼ連鎖反
応により１または２以上の特異的ｃＤＮＡ配列を増幅す
ることよりなる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１４】 工程（ｅ）において、ポリメラーゼ連
鎖反応が１または２以上の放射性標識ヌクレオチドまた
は検出可能なヌクレオチド同族体の存在下で実施され
る、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 工程（ｂ）の前に、細胞を等張液で洗
浄し、そして細胞から等張液を除去する追加工程を含
み、工程（ｂ）において容器が約９９℃の温度の液体中
に約６分間保持され、工程（ｄ）において１または２以
上の特異的ｃＤＮＡのコピー数が１または２以上の放射
性標識ヌクレオチドまたは検出可能なヌクレオチド同族
体の存在下で増幅される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１６】 工程（ｄ）において、１または２以上
の特異的ｃＤＮＡのコピー数が１または２以上の放射性
標識ヌクレオチドまたは検出可能なヌクレオチド同族体
の存在下で増幅される、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１７】 放射性標識ヌクレオチドを用いる場
合、増幅された１または２以上のｃＤＮＡまたはＤＮＡ
配列の存在が、存在する放射能の直接または間接測定に
より検出される、請求項１２、１４、１５または１６に
記載の方法。 - 【請求項１８】 工程（ｆ）において、１または２以上
のｃＤＮＡ配列の存在が、それら１または２以上のｃＤ
ＮＡ配列を１または２以上の放射性標識ＤＮＡプローブ
とハイブリダイズさせ、そしてそれら１または２以上の
ｃＤＮＡ配列にハイブリダイズした放射能を測定するこ
とにより検出される、請求項１または１１に記載の方
法。 - 【請求項１９】 工程（ｅ）において、１または２以上
の増幅ＤＮＡ配列の存在が、それら１または２以上の増
幅ＤＮＡ配列を放射性標識ＤＮＡプローブとハイブリダ
イズさせ、そしてそれら１または２以上の増幅ＤＮＡ配
列にハイブリダイズした放射能を測定することにより検
出される、請求項２または１３に記載の方法。 - 【請求項２０】 インビトロで異なる条件下に培養され
た細胞中の１または２以上の特異的ｍＲＮＡ配列の存在
の変化を判定するための、下記工程を含む方法： （ａ）第１群の細胞を培養し； （ｂ）第２群の上記細胞を第１群の細胞の場合と異なる
培養条件下で培養し；そして （ｃ）第１群および第２群の細胞中の１または２以上の
特異的ｍＲＮＡ配列の存在を、請求項１または１８に記
載の方法により別個に判定する。 - 【請求項２１】 インビトロで培養された細胞中の１ま
たは２以上の特異的ｍＲＮＡ配列の存在に対する１化合
物の作用を判定する方法において、第２群の細胞を該化
合物の存在下で培養することを含む、請求項２０に記載
の方法。 - 【請求項２２】 インビトロで培養された細胞中の１ま
たは２以上の特異的ｍＲＮＡ配列の存在に対する複数の
化合物の作用を判定する方法において、それらの化合物
それぞれに関する作用を請求項２１に記載の方法により
同時に、または実質的に同時に判定することよりなる方
法。
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