JPH01503598A - 真核細胞のミクロ培養における生物学的調節遺伝子の表現を検出する方法およびそのキット - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 真核細胞のミクロ培養における生物学的調節遺伝子の表現を検出する方法および そのキット光里坐公団 本発明は真核細胞のミクロ培養における生物学的調節遺伝子の表現（ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ）を検出する方法に関する。特に本発明はウィルス、細菌、菌類、発 がん性または免疫調節疫愚の形態発生および動力学の診断および根本的な理解を 得るのに利用することができる。また、本発明は治療の有効性を警告するの有利 である。また、本発明は本発明を実施する診断用キットを包含する。

サイトカイン、すなわち、他の細胞の成長および挙動を調節する局所ホルモンと して作用する可溶性細胞生成物は適当な生理学的機能に含んでいる。サイトカイ ンはインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子および類似物質、およ び成長因子を含んでいる。

サイトカインについての研究は生物学的療法の重要な医療の開発を導くものであ る。

サイトカイン生物学的治療法はがん、ウィルス、菌類、細菌および免疫調節疾患 の現存する治療に改良を与える。

リンパ球、繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞、アストログリア、内皮細胞、神経膠 細胞（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）および血小板のような真核細胞は種々の生物学 的必要性および機能に応答してサイトカインを生成する。

真核細胞において、形質発現は蛋白質合成のプロセス中のメツセンジャーＲＮＡ の形成を含んでいる。このために、種々のサイトカインに対して特異的な！ｌＲ ＮＡの存在の程度を定量的に測定することによって遺伝子形質発現を調べること ができる。

この情報はがん、自己免疫疾患および免疫不全症候群を含む多くの疾患における 診断および治療指導に臨床上極めて重要であるけれども、最近では、まだ与えら れた患者における免疫応答の動力学を検定する直接方法は存在していない、単ク ローン性抗体はＴ細胞のサブセットを数えるのに用いることができるが、しかし 免疫系の作用および動的応答性について報告されていない、三者遺伝子（ｔｈｒ ｅｅ　ｈｕｍａｎｇｅｎｅｓ）は免疫応答の強さを調べるのに極めて重要である 。

これらはインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはＴ−細胞成長因子、ＩＬ−２ （ＩＬ−２Ｒ）に対する受容体、および免疫インターフェロンまたはＴ−インタ ーフェロン（ｒＦＮ−ｙ）を暗号化する。免疫刺激によって生ずる、これらの遺 伝子の表現は、通常、免疫系における細胞のサブセント間の相互作用〔カムファ ーＲ１およびエフラード３氏ｒＬｅｕｋｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｏ５ｔ　Ｄｅ ｆｅｎｓｅ　Ｊ　（Ｊ、Ｊ、オッペンハイムおよびり、Ｍ、ヤコブス共著）アラ ンＲ，リス　インコーポレーション、ニューヨーク、５７〜６８（１９８６）　 、レベンジカーＭ、Ａ、、タルＣ６，サヤー〇、、ピロＳ、、エイロンＡ、、バ ナイＹ１．およびカム７　ｙ　−Ｒ、氏ｒＥＭＢＯＪ、　Ｊ　６．５８５〜５８ ９　（１９８７）　；カムファーＲ１，サヤー〇、、エフラードＳルベンジカー Ｍ１ケツィネルＭ、、およびタルＣ０氏’Ｌｙｍ−ｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃＪ　６　＋　ｖｏｌ、　１　（５ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｙ ＋＋−ｐｈｏｋｉｎｅ　Ｗｏｒｋｓｈｏｎ　Ａｋｓｔｒ、　１６４０（１９８７ ））により１部、導き出された新しい分子機構〔エフラードＳ、およびカムファ ーＲ，氏ｒＰｒｏｃ、　ＮＡＴＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　８１． ２６０１〜２６０５（１９８４）　；エフラードＳ、、ゼリッグＳ、、ヤゲンＢ 、およびカムファーＲ，氏ｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　 Ｃｏｍｍｕｎ、」１２３８４２〜８４８（１９８４）　ｉカムファーＲ０および エフラードＳ。

氏ｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 Ｌｙｏ＋ｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｊ（Ｃ，ソルダおよびＡ、シンプル氏共著）アカデ ミ−出版社」６０５〜６１８　（１９８５）　；カムファーＲ０，エフラードＳ 、およびマーシュＳ１氏ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ　ｏｆＬｙａ＋ｐｈｏｋｉｎｅｓ）　（Ｄ、Ｒ，ウェ７プおよびり 、ゲーデル氏共著）アカデミ−出版社、５９〜？２（１９８７）　ｉレベンジカ −Ｍ、Ａ、、タルＣ６，サヤーＤ、、ピロＳ、、エイロンＡ、、バナイＹ、およ びカムファー８１氏ｒＢＭｓｏ　Ｊ、　Ｊ旦、５８５〜５８９　（１９８７）） によって厳格にダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）され る（９９％まで）、更に、これら３つの遺伝子の表現は機能的に結合し、異なる リンパ球において表現される遺伝子が相互作用する回路網を生ずる。

一般に、細胞からＲＮＡを回収する普通の方法は、細胞の崩壊（ｌｙｐｉｓ）お よび塩化セシウム勾配を介する超遠心分離を含んでおり、時間がかかり、取扱い にくく、かつ多数の細胞および重い装置を必要とする。抹消血球に適用する場合 、少数の細胞に適用することが知られている処理では、特定の遺伝子により暗号 化されたＲＮＡの定量的測定を形質発現するのに正確に測定するためには十分に 正確でない。

ｒａ　ＲＮ　Ａを抽出する普通のＳＤＳおよびＮ　Ｐ−４０法〔ホワイトＢ、Ａ 、およびＳ、バンクロフトＦ、Ｃ，氏’Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　」２５７ 　：　８５６９（１９８２）　）はサイトカインの検出に適当でない。

なぜならば、汚染蛋白質の存在がＲＮＡの存在をおおい、ＲＮＡの若干の分解が これらの処理に含まれている多くの段階中に生じるためである。

グアニジニウム　チオシアネート（ＧＣＮ）直接プロット（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｂｌ ｏｔ）　（マツヤマＭ、、スガムラに、、カワデＹ。

およびヒムラＹ、）氏（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」１２９　：　４５０（１９８２ ）　）は、ＤＡＮの粘度がＲＮＡフラクションの進行を妨げるために不適当であ る。この処理は１０’個以下の細胞を分析できるが、しかし多くの他の遺伝子の レベルより低いレベル゛のサイトカイン形質発現の検出にはあまり少なすぎる制 限を有している。

ＧＣＮ−ＬｉＣｆのようなグアニジニウムに基づいてＲＮＡを回収する他の方法 〔カサラＧ、、サボレットＪ、Ｆ、、メンデズＢ、、ウェストＢ、Ｌ、、カリン Ｍ１．マルチアルＪ、Ａ、およびバックスターＪ、Ｄ、氏ｒＤＮＡＪ　２　：２ ３９　（１９８３））は純粋なＭＲＮＡを生成するが、しかしあまりに多くの段 階を含んでおり、多く試料を都合よく処理するのに若干のＲＮＡを失う。

グアニジニウム塩酸塩による方法〔チェレーイＳ、およびアンダー７２２０氏「 ＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　１３７　：　１５（１９８４）　）は慢性 ウィルス感染の状態を表現するウィルスＲＮＡを検出するのに用いている０本発 明は、この方法を、適当な段階が生物学的調節遺伝子の表現を誘導するという条 件で真核細胞における生物学的調節遺伝子の表現を検出するのに適用できること を見出した０本発明の方法は、与えられた患者から採血した数ミリリットルの抹 消血液における生物学的調節遺伝子の表現を信頼的に、かつ別々に同定および定 量化するために用いることができる。更に、本発明は真核細胞の個々の試料に複 数の誘導プロセスを用いることによって、細胞試料中の遺伝子の動的機能を任意 の既知技術により可能とされるより一層理解できることを見出した。

本発明は、サイトカイン生成細胞における形質発現を測定する従来技術の欠点を 除去するために、サイトカイン細胞の表現を含み、およびサイトカイン遺伝子の 実際上の表現のみならず、病的状態におけるこれらの遺伝子およびその障害の表 現を制御する調節機構を機能的に完全に測定できる規定培養条件で従来可能とさ れるより少ない数量の細胞において上記表現を検出する方法を選定および提供す ることである０本発明の目的は、サイトカイン遺伝子およびその調節の正常また は異常の表現を評価するために、サイトカイン形質発現を検出する怒度を高め、 および標準ノザン分析（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎ ａｌｙｓｉｓ）を用いて生ずるプール　アーチファクトを回避する適当な培養人 抹消血液単核細胞集団からｍＲＮＡ抽出を効果的に実施する方法を提供すること である。

光」Ｌ血」し！ 本発明は、一時的表現が通常極めて低く、大体、検出できない程度で、かつ小さ い細胞試料だけを利用できる常態の生物学的調節遺伝子の一時的表現を正確に、 かつ敏感に検出する方法を達成した。

本発明の技術は、好適な例では、１００万の半分のような少ない細胞で、または 遺伝子の表現を検査するのに従来用いられていた標準方法において必要とされて いたより５００倍までより少ない細胞で形質発現の存在を正確に警告することが できる。この事は、患者から得られ、かつ生物学的調節に重要な多くの抹消血液 の数ミリリットル程度で種々の生物学的調節遺伝子の表現を研究できることを可 能にする。

本発明は、重要な診断および治療値を有する真核細胞のミクロ培養において生物 学的調節遺伝子の表現を検出する一般的な方法において、 ａ）前記細胞を少なくとも１個の前記遺伝子表現を含む条件下で単離し； ｂ）　前記培養細胞をグアニジニウム塩酸塩で崩壊し；Ｃ）均質化細胞調製に酢 酸ナトリウムまたはカリウム溶液を添加し、次いで無水エタノールを添加してリ ボ核酸を選択的に沈殿させ； ｄ）　ＲＮＡを支持マトリックス上に回収およびプロッティング（ｂｌｏｔｔｉ ｎｇ）　Ｌ　； ｅ）　回収およびプロッテッド（ｂｌｏｔｔｅｄ）　ＲＮ　Ａを、少なくとも１ 個の前記遺伝子に特定の標識リポプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）でハイブリッ ト形成し；およびｆ）　前記標識リポプローブを前記プロッテッドＲＮＡに結合 する程度を定量的に測定する各段階からなることを特徴とする特 他の好適な例では、前記崩壊段階（ｂ）をグアニジニウムチオシアネートを添加 して行い、および段階（ｃ）における前記選択的沈殿を塩化リチウム、次いで酢 酸ナトリウムまたはカリウム溶液および無水エタノールの添加により行うことが できる。

本発明の方法はインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および成 長因子からなる群から選択する生物学的調節遺伝子の表現の検査を行うのに用い るのが好ましく、この場合真核細胞はリンパ球、単球、表皮ケラチン細胞、繊維 芽細胞、アストログリア、内皮細胞、神経膠細胞および血小板からなる。生物学 的調節遺伝子の表現は、植物凝集素またはコンカバリンＡのような化合物を、シ クロへキシミドおよびγ−放射により、またはこれらによらずに、またはこれら の適当な組合せで行うのが好ましい。

γ−放射は、その１例としてサプレッサーＴ細胞の活性を抑制し〔グルベルブＭ 、およびラルソンＥ、Ｌ、氏ｒＪ、Ｉｍｍｕｎｏ１．　Ｊ１２８　：　１７６　 （１９８２））　、これはＩＦＮ−ｙ形質発現の影響を及ぼす〔レベンジカーＭ 、Ａ、、タルＣ９，サヤ−Ｄ、、ピロＳ、。

バナイＹ、、エイロンＡ、およびカムファーＲ，氏ｒＥＭＢＯ」６　：　６５８ 　（１９８７）　）　、シクロヘキシミドはＩＬ−２遺伝子〔エフラードＳ、お よびカムファーＲ，氏ｒＰｒｏｃ、　ＮｃａｄＳｃｉ、　ＵＳＡ　」８１　：　 ２６０１（１９８４）　）およびＩＦＮ−ｙ遺伝子〔レベンジカーＭ、Ａ、、タ ルＣ０，サヤ−Ｄ、、ピロＳ、、バナイＹ、。

エイロンＡ、およびカムファー２０氏ｒＥＭＢＯＪ　６　：５８５（１９８７） 　）の異常な表現を導く物質である。

本発明のプロセスは単一試料の２つの個々のアリコートについて実施するのが好 ましい、第１のアリコートは誘導物質を添加しないで調べて基礎表現レベルを示 す読み（ｒｅａｄｉｎｇ）を与え、同時に第２のアリコートは植物凝集素のよう な適当の誘導物質により誘引するようにする。誘導表現レベル対基礎レベルの比 は、遺伝子調節が正常であるか、またはそうでないかを示す。必要に応じて、誘 引（ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ）は細胞試料の個々のアリコートについて行い、誘導 プロセスにおいて動力学的情報を得るようにできる。

本発明の他の実施において、シクロへキシミドのような付加または他の誘導物質 を付加アリコートの細胞試料に添加して細胞を超誘導することができる。この超 誘導は形質発現についての最大の可能性を示すことができる。更に、この事は基 礎表現レベルを遺伝子の最大可能性の表現に近づける範囲としての指針を与える 。

サプレッサーＴ細胞が少なくともあるサイトカイン遺伝子をダウンレギュレーシ ョンすることを確かめた。このために、１つのアリコートの細胞試料を超誘導お よびＹ−照射するのに有利である。この試料はサプレッサーＴ細胞が興味ある遺 伝子の表現をダウンレギュレーションする範囲を示す。

本発明の方法は検出しうる同位体または非同位体化学基で標識付けする上記リボ プローブを必要とする。

本発明は、重い装置の使用および敵影式のデータの迅速定量化を必要としないで 多くの試料（４８個およびこれ以上）の便利な分析を提供する。

本発明の方法は超遠心機の使用を必要とすることなく有利に実施でき、多数の試 料を速やかに分析でき、更Ｇこ少なくとも２００倍の範囲にわたって形質発現を 反復検査することができる。装置は標準で、簡単なミクロ装置（ｍｉｃｒｏｆｕ ｇｅ）細胞遠心機、ＣＯｔインキュベーター、ドツト−プロット装置（ｄｏｔ− ｂｌｏｔ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）、水浴を必要とする。

１０ｍ１の血液試料では、通常、形質発現の多重分析（個々の遺伝子、誘導の条 件）することが１０’１１１胞が得られる。

単一血液試料において多くの測定をする能力は種々の誘導条件下で改良して疫愚 における遺伝子調節機構を測定するようにする。

応答はＲＮＡインプットの増加につれて直線になる。応答は細胞数およびＲＮＡ 数により線状に増加する。３倍以上の細胞は３倍以上のＲＮＡ、すなわち３倍の 強さに等しい信号を発生する。形質発現信号は少なくとも２００倍範囲（２００ −ｆｏｌｄ　ｒａｎｇｅ）にわたって直線になる。それ故、／Ｎイフ゛リット形 成およびフィルム黒色化（ｆｉｌｍ　ｂｌａｃｋｅｎｉｎｇ）を定量的に測定す ることができる。これらの特性は方法に著しい反復性および情報を与える。生成 物は５％以下の汚染ＤＮＡで無傷で、蛋白質を含まない全細胞ＲＮＡおよびｍＲ ＮＡである。

ハイブリット形成の信号は蛋白質によって遮蔽（ｍａｓｋｉｎｇ）されない、ハ イブリット形成信号は長くて、扱（１にくし１処理のグアニジニウム　イソシア ネート崩壊およびＣｓＣｌによる超遠心分離により生ずる純粋ＲＮＡの信号と等 しし）強さになる。

例えばインターロイキン（ＩＬ−２）またはＴ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｙ ）にたいする特定ｍＲＮＡの信号は２４時間内のフィルム暴露で５Ｘ１０’個の 細胞のような僅かで検査することができる。この事はこれらの遺伝子に対する標 準ノザン信号（ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｎｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｓｉｇｎａｌ） に必要とされるより２０〜１００倍の少数の細胞になる。

添付皿里■聚班 第１図は本発明による処理工程のアウトラインを線図で示している。

第２図はＩＦＮ−ｙ形質発現を測定する分析の使用を説明している。４Ｘ１０’ 個の大末梢血液単核細胞をＩＦＮ−ｙ形質発現のために誘導した。細胞から抽出 したＲＮＡをマニホールド　ドツト−プロット装置を用いて４つの一連の稀釈（ ０，１２５，０，２５，０，５およびｌ）で分析した。ニトロセルロース　フィ ルターをＩＦＮ−ｙリボプローブにノーイブリット形成した。

γ−照射（Ｙ−照射）を０．４％（ｖ／ｖ）植物凝集素（ＰＨＡ）の添加前に行 い、線量を１５００ラドにした。シクロへキシミド（ＣＨＸ）をＰＨＡの添加後 に個々の培養に添加した。フィルターをフィルムにノλイブリフト形成後暴露し 、オートラジオグラムを示した。

第３図は本発明による分析の直線性を示しているグラフである。ＩＬ−２ＲＮＡ またはＩＦＮ−Ｉ　ＲＮＡの異なるレベルを表現する試料をマニホールド　ドツ トニブロット装置を用いて４つの一連の稀釈（０，１２５，０，２５，０，５お よヒ０．１）で分析した。ニトロセルロース　フィルターの特定リボプローブお よびオートラジオグラムにハイブリッド形成した後、６３０■での個々の点の吸 光度をミクローエリサオートリーダー（ｏ＋１ｃｒｏ−ｅｌｉｓａ　ａｕｔｏｒ ｅａｄｅｒ）で測定した。

第４図は細胞数の増加またはＲＮＡインプットの増加に対する分析の直線性およ び当量応答を示しているグラフである。ＩＬ−２形質発現に対して誘導した４Ｘ １０’個の細胞を連続的に稀釈し、次いでＲＮＡを抽出した（ム）。あるいは、 またＲＮＡを４　ＸＩＯ’個の細胞から抽出し、次いで連続的に稀釈した。（Ｏ ）。

第５図は植物凝集素（ＰＨＡ）で誘導した人末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）におけ るＩＬ−２ｍＲＮＡの動力学を示すグラフである。細胞はＰＨＡ（０，４％ｖ　 ／　ｖ　）で０時間で誘導した。４Ｘ１０’個の細胞の試料を各時間においての 点で示し、ＲＮＡを抽出した。シクロへキシミド（ＣＨＸ　；　２０ｕｇ／　ｍ ｌ）を２１時間で添加し、２４時間で分析した（ム）。

第６図は９人の供血者のＰＢＬにおけるＩ　Ｌ−２およびＩＦＮ−ｙ形質発現の 定量化を示している図表である。各供血者からの細胞を　１）無添加（対照、Ｂ ＫＧ）で；２）０．４％（Ｖ／Ｖ）のＰＨＡを添加して；３）細胞の　Ｙ−照射 （１５００ラド）後、ＰＨＡを添加して；および４）ＰＨＡ添加、次いで１６時 間でＣＨＸ　（２０ｕｇ／　ｍ）を添加して温置した。ＲＮＡを、ＰＨＡ添加後 、２０時間のすべての試料から抽出し、ドツト−プロット　フィルターをＴＬ− ２およびＩＦＮ−３’リボプローブにそれぞれハイブリッド形成した。バーはミ クローエリサ　オートリーダーで測定した各分析におけるフィルム回度を示して いる。

第７図は、ハイブリット形成した（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）　ＲＮ　Ａの数を表 わす６３０口におけるフィルムの吸光度を示してし）る、第６図に示した９人の 供血者からの細胞におけるＩＬ−２およびＩＦＮｙ形質発現の分布を示している 図表である。

次に、本発明の好適な例を説明する。

拠−上　工Ｚべ球夙且１ １３患者から採血した１０ｍの末梢血液をヘパリン化管に入れた。

２、　りん酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２倍に稀釈した。

３、　２ｖｏｌ　フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　）上に層状にした。

４、細胞遠心機において室温、２００ｇで３０分間にわたり回転させた。

５、　血清を含まないＲＰＭ１１６４０媒質で２回洗浄した。

６、　細胞を１０−のプラスチック製のスクリューカップ丸底培養管において４ Ｘ１０’の密度で次の成分を含むＲＰＭｌ　１６４０媒質に再懸濁した： ２ＩＩＩＭ　グルタミン 、　１０ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸 １００　ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム １０　ｏ＋Ｍ　ヘペスｐＨ７，２ １００ｕ／ａｉｌ　ペニシリン １００　ｕｇ／　ｒｎＲストレプトマイシン４０　ｕｇ／　ｍｆｌ　ゲンタマイ シン５Ｘ１０−’？’ｌ　２−メルカプトエタノール２％　ウシ胎児血清 ５　ｕｇ／−ナイスクチン ７．５％ＣＯ□雰囲気中３７°Ｃで１夜温置した。

Ｍ−１１ｍＪＬゑ住 各供血者からの細胞を１）無添加（対照、ＢＫＧ）で；２）　０．４％（Ｖ／Ｖ ）のＰＨＡを添加して；３）細胞のＹ−照射（１５００ラド）後、ＰＨＡを添加 して；および４）ＰＨＡ添加、次いで１６時間でＣＨＸ　（２０ｐｇ／ｍｌ＞を 添加して温置した。ＲＮＡを、ＰＨＡ添加後、２０時間ですべての試料から抽出 した。

１−　川、ＲＮＡ 前段階を、標準テーブル・トップ　ミクロ遠心機（エフェンドルフ（Ｅｐｐｅｎ ｄｏｒｆ））を用いて１．５　ｔｄの単一ミクロ遠心機で行った。

１．１ｄの細胞懸濁物をエフエンドルフ遠心機で５００ｒｐｍ、５分間回転させ た。

２、　例４に記載するように用いることができる７、５門グアニジニウム　チオ シアネート（ＣＴＣ）０．４　ｄを添加した。

３、管を少なくとも３０秒、完全に溶解するまで渦巻運動を与えて均質化した。

４．２０ｕｊｌ：の２　Ｍ　ＫＯＡｃ　ｐＨ５，１を添加し、混合し、次いで２ ５０ｕ　ｌの無水エタノールを添加し、再び混合した。

５、−２０’Ｃで１夜放置した。

６、　エフェンドルフ遠心機において４°Ｃ１３０分間にわたり１５、０ＯＯｒ ｐ＋ｓで遠心処理した。

７、上澄み液を廃棄した。

８、　ペレットを５０ｕｊ！の３７％ホルムアルデヒドに溶解した。

この混合物に、溶解するまで、渦巻運動を与えた。次いで、５０ｕ２の３？ｌＮ ａＣｆおよび０．３Ｍ　＜えん酸ナトリウムを添加した。

９．６０°Ｃで１５分間にわたり放置した。

１０、ドツト−ブロック処理を行った。試料を９６−配置　微量滴定プレート（ Ｎｕｎｃ）の１つのくぼみ（ｗｅｌｌ）にピペットで移し、２段において１．５ Ｍ　ＮａＣ１および０．１５？ｌ　＜えん酸ナトリウム（１０Ｘ５ＳＣ）に連続 的に稀釈し、次のくぼみにピペットで移した。すべての試料を稀釈した後、９６ −配置マニホルド　ドツト−プロット装置（シレイヒーシュエル）の各くぼみの 内容物には９Ｘ１３ｃｍ　ニトロセルロース　シート（シレイヒーシュエルＧＢ 　００３吸取紙）を含有させた。ニトロセルロース　シートおよび吸取紙は蒸留 水に予め浸し、次いで１０　Ｘ　ＳＳＣに浸した。各くぼみを１００ｕ　ｌの１ ０　Ｘ　ＳＳＣで１回洗浄した。ニトロセルロースを真空下２時間にわたり８０ °Ｃで焼き、例５または６に記載する所望の遺伝子リボプローブで厳ぎに調べた 。

１１、ミクローエリサ　オートリーダーでフィルム　ドツトを定量した。この目 的のために、露光および現像Ｘ−線フイルムを微量滴定プレートの形状にカット し、ドツトがくぼみと一列に位置するようにプレート上に配置し、およびオート リーダー（例えばグイナテッチ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）に導入した。６３０ｎｓ 波長で走査した。

ｌエ　ＲＮＡ　の　の几 １、　１ｄの細胞培養物をエフエンドルフ遠心機において５００ｒｐｍで５分間 にわたって回転させた。

２．　上澄み液を廃棄し、ペレットを流出させた。

３、　５Ｍ　ＧＴＣ１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　トリス−Ｂｔｕ　ｐＨ７ ，５および８％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（新たに添加）を含有する 崩壊緩衝液（Ｉｙｓｉｓ　ｋｕｆｆｅｒ）　１００　ｕｎを添加した。

４、　渦巻運動を与え１０秒間にわたり３回かきまぜた。７００Ｕ！０４Ｍ　Ｌ ｉＣｊ！を加え、４°Ｃで２０時間（１夜）にわたり放置した。

５、　エフェンドルフ遠心機で９０分間、１２．ＯＯＯｒｐｍ　、４°Ｃで回転 した。

６、上澄み液を廃棄し、ペレットを乾燥し、５０ｕＩ！、のＲＮＡ可溶化緩衝液 二０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 　）リス−ＨＣｊｌ！　ｐ）！　７．５を添加した。

７．２０秒間渦巻運動を与えてかきまぜた。１０分間後、かきまぜを４０分間繰 り返した。この段階を室温で行った。

８、　溶液に渦巻運動を与え、溶液を等量のフェノール／クロロホルム（１：　 １）で抽出し、上相を回収した。

９、　１７１０容量の３Ｍ　ＮａＯ八ｃへｐＨ５，１を添加し、かきまぜ、２． ５容量の無水エタノールを添加し、−２０°Ｃで２０時間放置した。

ＩＱ、　ＲＮＡを、４°Ｃでエフェンドルフ遠心機において１５、０００ｒｐｍ で４５分間にわたる遠心処理により沈澱させた。

１１、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。

１２、上澄み液を廃棄し、ペレットを乾燥した。

１３、例３の８〜１１段階を行った。

±−５１Ｌ−２の１ボブローブの８゜１１リポプローブをプロメガ−ビオチクリ ポプローブ　キット（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃｒｉｂｏｐｒｏｂｅ　Ｋｉ ｔ）を用いて合成した。　ＩＬ−２ｃＤＮＡをＰ、ｔ　Ｉでプラスミドｐ３−１ ６から摘出し〔タニグチＴ１、マツイＨ９、フジタＴ１、タカ才力Ｃ１、カシマ Ｎ０、ヨシモトＲ０、およびハム０３１氏ｒＮａｔｕｒｅＪ３０２＋３０５　（ １９８３）　）、Ｐ、ｔ　１部位にｐＧＥＭ−３（プロメガ−ビオチク）に挿入 した。Ｔ７　プロモーターからの転写が所望のＲＮＡ鎖を与える配向を選定した 。

ａ）　転写産物を次のようにして作った：１）４ｕｊ！転写産物緩衝液。

２）２ｕｊ２ジチオトレイトール（ＤＤＴ）　（１００ｍＭ）　。

３）　０．６　ｕｊ２　ＲＮアシン（ＲＮ　ａｓｉｎ）３５０　ｕ／　ｖ＋ｌ。

４）それぞれ１ｕｊ２のヌクレオチドＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ（０，５ｍＭ）。

５）１　ｕｆ！Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（１５ｕ／ｍ）。

６）　１　ｕｊ２１Ｌ−２ｃＤＮＡ　含有プラスミド（ｌｕｇ／ｌ　ｕ　１　） 。

７）　１０ｕｊ２　（ｃ、ニー”Ｐ　）　ＡＴＰ　（１０ｍＣｉ／　ｍ）。

８）　１０ｕ！前段の（ｃ（−”Ｐ）　ＡＴＰの代わりに置換した〔＝ｃ−”） 　ＡＴＰ　（１０ｍＣｉ／　ｍｌ）（アメルサム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）　。

ｂ）　混合物を３７°Ｃ１１時間にわたって温間した。

ｃ）　１ｕｊ２　ＤＮアーゼ（ＲＮアーゼを含まない）１ｕＬ／ｍｊ！を添加し 、温間を３７°Ｃで１５分間継続した。

ｄ）　ＲＮＡを次のように抽出した： １）　２０ｕｊ！のフェノールクロロホルム（１：　１）を添加し、次いで渦巻 運動を与えてかきまぜ、エフェンドルフ遠心機で２分間遠心処理した。

２）上相（水相）を注意して回収した。

３）　フェノールクロロホルムの下相を２０ｕｊ２のＴ［３［液：１０ＩＩＩＭ トリスーＨ１ｐ）Ｉ　７．６および１ｍＭ　ＥＤＴ＾で洗浄した。

４）　エフェンドルフ遠心機で２分間かきまぜおよび遠心処理した後、上相を回 収し、前に回収した水相を添加した。

５）４０ｕｆのクロロホルムを上記混合水相に添加した。

６）　エフェンドルフ遠心機で２分間かきまぜ、遠心処理した後、上相を回収し た。

７）　下相を上記３）および４）段に記載するように４０ｕ！のＴＥ緩衝液で抽 出し、水相を上記６）段で回収した水相と混合した。

８）　この混合水相に８ｕｆの３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　ｐＨ５，１および２．５容量 の無水エタノールを添加した。

９）　溶液を一２０℃で２０時間（１夜）または−７０″Ｃで２時間貯蔵した。

１０）エフエンドルフ遠心機において１５．００Ｏｒｐｍで３０分間４°Ｃで遠 心処理した。

１１）ペレットを１＋ｆ！の７０％エタノールで洗浄した。

１２）ペレットを真空中で乾燥した。

１３）ペレットを１００ｕ　１２　ＴＥＮ　緩衝液（１０ｍＭ　）リス−Ｈ１ｐ Ｈ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１Ｍ　ＮａＣｊ２および２０ｕｇ／ｍｊ工 １失ＭＲＥ　６００（ボエリンガー）からのｔＲＮＡ）に再懸濁した。

１４）２−ｄの注射器に作った１ｄのセファデックスＧ−５０カラムに作用させ 、ＴＥＮ緩衝液で平衡させた。

１５）カラムを細胞遠心機において１．００Ｏｒｐｍで５分間にわたり遠心処理 し、管の流動物を回収した。

１６）ｌｕｊ！試料を１０％氷冷却トリクロロ酢酸に取り、沈澱しうる放射能を 測定した。

１７）３〜１０　Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｕ　１２の収量の良好な生産を達成した。

■−５１ＦＮ−についての１ボブローブの富、ＩＩＰＮ−ｙ形質発現についての りボブローブを例５に記載する処理により合成した。ＩＦＮ−ｙ　ｃＤＮＡをＢ ａ＋＋＋Ｈ１によるプラスミド　ｐＨ１１Ｆ−３Ｖ−ｙから摘出し〔デボソＲ０ ，チェロートレＨ８，タヤＹ、、デクラベＷ、、へヴエルスウィンＨ，Ｙ、およ びフィールスＷ０氏ｒＮｕｃ１．　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、Ｊ　１０．２４８７（１ ９８２））およびＢａｍＨ１部位にｐＧＥＭ−３を挿入した。Ｔ７プロモーター から転写が所望のＲＮＡ鎖を与える配向を選択した。

±−ユ　ニトロセルロース　フィル　−のバイブトド杉底 １）　フィルターをプラスチック製シールバッグで６０°Ｃ，４時間にわたって 前ハイブリット形成した。前ハイブリット形成緩衝液は次の成分を含んでいる： ２５％　ホルムアミド １０％　硫酸デキストラン（５，０００モル重量）１％　５ＤＳ ５０ｄ　）リス−）１１　ｐＨ７，５ １００ｕｇ／ｍ１１０分間沸騰させ、すみやかに冷却したサケの精液 １１００ｕ／Ｉｎ１ｔＲＮＡ　（ｌ。１去　ＭＲＥ６００）０．７Ｍ　ＮａＣ１ ２）　ハイブリット形成のために５　ＸＩＯ’　ｃｐ…／戚の上記リボプローブ ×１デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（０，０２％（ｗ ／ｖ）ピコール（ｐｉｃｏｌｌ）、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリビニル−ピロリド ンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）　ＳＳＡフラクションＶ　（シグマ）、および１ １００ｕ／ＩｄｔＲＮＡ　（エーエ史ＭＲＥ６００）を添加した。

３）　ハイブリット形成後、フィルターを次のようにして洗浄した： １）　２　ｘｓｓＣ（５００ｒｎｆｌ）で２回、室温、１５分間。

２）　２　Ｘ５ＳＣ，１％ＳＤＳ　（５００，ｄ）で２回、６８°Ｃ１３０分間 。

３）　０．２ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ　（５００成）で１回、６８°Ｃ５３０ 分間。

フィルターを乾燥し、Ｘ−線フイルムに一７０°Ｃで５〜２５時間にわたってさ らした。

拉」し二づＬ丘 結果を次のように分析することができる。

誘導物質なし　ＩＡ　ＩＢ ＰＨＡ（１６時間）　２Ａ　２Ｂ ＰＨＡ（２０時間）　３Ａ　３Ｂ ＰＨＡ＋シクロへキシミド　４Ａ　４ＢＰＨＡ＋Ｙ−照射　５Ａ　５Ｂ ａ）形質発現の基礎レベル：ＩＡ、ＩＢｂ）遺伝子の誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｉ ｌｉｔｙ）　：比２Ａ／ＩＡ、　２Ｂ／ＩＢ 比３Ａ／ＬＡ、　３Ｂ／ＩＢ 例２と例３との間の違いは動的であり、これらの遺伝子の一時表現（ｔｒａｎｓ ｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、供与者（ｄｏｎｏｒ）により影響される が、１６時間または２０時間でピークになる。

通常、これらの値は３〜１０にする；この値より小さい場合には、遺伝子が著し く活性であること、または誘導に対する応答が欠乏することを意味する。これら の可能性は次のＣ）段階において顕著である。

Ｃ）シクロへキシミドによる超誘導性：Ａ４／Ａ３．Ｂ４／Ｂ３ 比は形質発現についての可能性を示している。一般に、この比は１より著しく太 き（する必要がある（１．５〜５またはこれ以上）。もし、比がこれより小さい 場合には、基礎表現が極めて高くなり、この場合には比Ａ４／Ａｌ、Ｂ４／Ｂｌ は１に近づき、または誘導形質発現が極めて高く、制御できなくなり、この場合 には比Ａ３／ＡＩおよびＢ３／Ｂｌを高くする必要があることを意味する。

ｄ）　Ｙ−照射による超誘導性： Ａ５／Ａ３．Ｂ５／Ｂ３ 通常、この比は１より大きくする必要がある（１．５〜３）。

通常、比Ｂ５／Ｂ３は比Ａ５／Ａ３より大きくする。これらの値は、サプレッサ ーＴ細胞がＩ　Ｌ−２およびＩＦＮ−Ｙ形質発現をダウンレギュレーションする 範囲を評価し；後者の形質発現はこの手段で一層強く調節される。これらの比が 高いほど、ダウンレギュレーションは強くなる。

Ｆ／Ｇ、１ １　・・・・・・・■・・○・ Ｃ５・・・■・・・○・・○・　□ ０．２５　・・ＯＯＯ・・　・・　・ ｏｔ２ｒ　Ｑ　ＯＯＯ＠）　＠ｌ　＠　（ａ　Ｏ１・・・■・・・・○・Ｑ Ｏ５・・・　・・Ｏ・　・ Ｃ２ダ　・○■　・・００　０ ｏｔ２Ｅ　（ｅ　Ｏ○　・ＯＯＯ ２０１４１５１９７７１ｆ３　１９　２０　２１　２２　２Ｂ　２４ＣＨＸ（ｈ ｒａｄｄｅｄ）−１／２　−　−　１／Ｚ　１　−　−　１７２　１　Ｚ　−（ ２０，ｔｉｇ／ｍり １３　１４　１５　１６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　２３　２＋Ｈ Ａ Ｃ場外ｒｏｄｄｅｄ）−１／２１　Ｌ　−−１／２１　Ｚ　−−６２≠ｉ／Ｍθ ｉｆ−／！ＩＡＤ／Ａ７ｔＯＮ−−−−辱−−−−４−０、に！５　０．２５　 ０．５　ｔ、。

Ａ！ｒＬ　／？ＮＡ　ＩＮＰＬ／Ｔ Ｆ／θ、３ Ｆノ１１４　り＃ＮＳ／ｒＹ　どＡ６５クツ＝ＤｏＮｏｚｓ　＠り□ＮｏＲ５ 国際調査報告 ｌｅｕ＋＊ｓ＋ｎＩＩｅ＋＾＊＊ｂｔａｂ−−ｍ、ＰｃＴ／ＡＵＥ１１０００９ ９ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡｎＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡｎＯＮ　Ｎｏ、　Ｐ ＣＴ　ＡＵ　８８０００９９ＥＰ　１４０７６４　ＦＲ２５５２８７９ＪＰ　６ ０１０２２００

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．真核細胞のミクロ培養における生物学的調節遺伝子の表現を検出する方法に おいて、 ａ）前記細胞を少なくとも１個の前記遺伝子の表現を含む条件下で単離し； ｂ）前記培養細胞をグアニジニウム塩酸塩で崩壊し；ｃ）均質化細胞調製に酢酸 ナトリウムまたはカリウム溶液を添加し、次いで無水エタノールを添加してリボ 核酸を選択的に沈殿させ； ｄ）ＲＮＡを支持マトリックス上に回収およびプロティングし； ｅ）回収およびプロッテットＲＮＡを、少なくとも１個の前記遺伝子に特定の標 識リボプローブハイブリット形成し；および ｆ）前記標識リボプローブを前記プロテットＲＮＡに結合する程度を定量的に測 定する各段階からなることを特徴とする生物学的調節遺伝子の表現を検出する方 法。
2. ２．前記崩壊段階（ｂ）をグアニジニウムチオシアネートの添加により行い、お よび前記段階（ｃ）の前記選択沈殿を塩化リチウム、次いで酢酸ナトリウムまた はカリウムおよび無水エタノールの添加により行う請求の範囲１記載の方法。
3. ３．生物学的調節遺伝子をインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子 および成長因子について暗号化する遺伝子からなる群から選択する請求の範囲１ または２記載の方法。
4. ４．真核細胞をリンパ球、単球、繊維芽細胞、アストログリア、内皮細胞、神経 膠細胞、表皮ケラチン細胞、および血小板からなる群から選択する請求の範囲３ 記載の方法。
5. ５．前記表現の誘導物質を、植物凝集素、コンカバリンＡ、シクロヘキシミンか らなる群からなる化合物、またはこれらの組合せ、またはこれらとＹ−照射との 組合せとする請求の範囲４記載の方法。
6. ６．前記リボプローブを検出できる同位体または非同位体化学基で標識付けする 請求の範囲５記載の方法。
7. ７．少なくとも１種のサイトカインに翻訳しうるＲＮＡの存在を検出する方法に おいて、 ａ）少なくとも１０ミリリットルの抹消血液を採血し；ｂ）約１×１０６個のリ ンパ球細胞の少なくとも４つの培養物を分離および培養し； ｃ）前記細胞を誘導して少なくとも１種のサイトカインを生成し； ｄ）前記誘導細胞を７．５Ｍグアニジニウム塩酸塩で崩壊し； ｅ）塩を、最終濃度の酢酸ナトリウムまたはカリウムの０．１モル溶液に添加し 、次いで無水アルコールを添加して、ＲＮＡを均質化細胞リゼイトから−２０℃ で沈殿させ； ｆ）ＲＮＡを実質的に純粋状態で遠心分離および回収し； ｇ）ＲＮＡを支持マトリックス上にプロッティングし；ｈ）ＲＮＡを少なくとも １種のサイトカインに特定の標識リボプローブにハイブリット形成し；ｉ）ミク ロ−エリサオ−トリ−ダ−においてニトロセルロースフィルターの個々の点によ り黒色化したフィルムの吸光度を測定して前記ＲＮＡの存在およびその量を定量 することを特徴とするＲＮＡの存在を検出する方法。
8. ８．（ｄ）段階における前記誘導細胞の崩壊をＳＭグアニジニウムチオシアネー トで行い、および（ｅ）段階における前記ＲＮＡの沈殿を３．５Ｍの塩化リチウ ム、次いで０．３Ｍの酢酸ナトリウムまたはカリウム、次いで無水エタノールを 添加して行う請求の範囲７記載の方法。
9. ９．前記サイトカインをＩＬ−２およびＩＦＮ−ｙからなる群から選択するポリ ペプチドとする請求の範囲７または８記載の方法。
10. １０．（ｃ）段階において、前記細胞を０．４％（ｖ／ｖ）の植物凝集素を約１ ６時間にわたって温置し、この時に２０ｕｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加し 、および温置をさらに４時間継続する請求の範囲９記載の方法。
11. １１．（ｃ）段階において、前記細胞を０．４％（ｖ／ｖ）のＰＨＡのみで温置 し、または前記細胞の１５００ラドのＹ−照射により少なくとも１種のサイトカ インの生成を誘導する請求の範囲９記載の方法。
12. １２．前記リボプローブを検出しうる同位体または非同位体化学基で標識付けす る請求の範囲７または８記載の方法。
13. １３．前記サイトカイン検出をウィルス、細菌、菌類、発がん性または免疫調節 疫患の診断に用いる請求の範囲７または８記載の方法。
14. １４．請求の範囲１〜１３のいずれか一つの項に記載する方法を実施するのに用 いる診断用キット。
15. １５．請求の範囲１〜１３のいずれか一つの項に記載する方法を実施するのに用 いる疫患警告キット。