JPH05236982A - デキストランの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】医療あるいは生化学などの分野で利用されてい
るデキストランを、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉
分解物などの安価な原料から酵素化学的に効率的に製造
する方法を提供する。 【構成】澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物に、
枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼを作用
させる工程を包含するデキストランの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は医療あるいは生化学など
の分野で利用されているデキストラン（αー1,6-グルカ
ン）を、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物から
酵素化学的に効率的に製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】デキストランは、従来から蔗糖を原料と
して、ロイコノストック属菌であるLeuconostoc mesent
eroidesあるいはそれに由来するデキストランスクラー
ゼ（以下、DSaseという）を使用して産業的に生産さ
れ、医療あるいは生化学などの分野で利用されている。
DSaseは、蔗糖の構成糖であるグルコースのみを利用し
てデキストランを生産するが、この際、同じく構成糖で
あるフラクトースはデキストラン生産には全く利用され
ずに遊離する。このような作用機構ゆえに、DSaseを用
いて蔗糖からデキストランを生産する場合には、対糖収
率が決して５０％を越えることはない。実際には３７％
程度の収率しか得られていない。

【０００３】デキストリンデキストラナーゼ（以下、DD
aseという）は約４０年前に糸引きビールの原因菌であ
るグルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９４株
(Gluconobacter oxydans; American Type Culture Coll
ection Strain No.11894)より粗精製され、重合度３以
上のα-1,4結合を有するマルトオリゴ糖からデキストラ
ンを生成することがすでに報告されている(Journal of
Biological Chemistry、第192巻、第161〜174頁(195
1))。この報告によると、DDaseは重合度３以上のα-1,4
結合した直鎖のアミロース（マルトオリゴ糖を包含す
る）、および澱粉などの加水分解物の非還元末端側のグ
ルコース残基を転移することによってデキストランを生
成する。しかしながら、DDaseを各種糊化澱粉に作用さ
せてもデキストランの生成は認められない。可溶性澱粉
からのデキストランの収率も２０％程度にすぎない。こ
のことは、DDaseが可溶性澱粉などの構造中に存在する
分枝部分、すなわちα-1,6結合したグルコースを側鎖と
して有する構造の付近には作用できず、未反応部分が多
く残るためと考えられる。この事実はβ-アミラーゼ限
界デキストリンがDDaseの基質とならないことから確か
められる。

【０００４】上記のようにDSaseまたはDDaseによるデキ
ストランの生産収率は低いため、デキストランの安全性
が広く認められているにもかかわらず、高価なものとな
り、食品への利用がほとんど行われていない。もし安価
にデキストランを供給できるならば、安全性の高い優れ
た食品用多糖としての利用が期待できる。そのためには
安価な原料からより高収率で効率的にデキストランを生
産する必要がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来の問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、医療
あるいは生化学などの分野で利用されているデキストラ
ンを、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物などの
安価な原料から酵素化学的に効率的に製造する方法を提
供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明デキストランの製
造法は、澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物に、
枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼを作用
させる工程を包含し、そのことにより上記目的が達成さ
れる。

【０００７】好適な実施態様においては、上記枝切り酵
素は、イソアミラーゼまたはプルラナーゼである。

【０００８】本発明のデキストランの製造法に用いられ
るデキストリンデキストラナーゼ(DDase)は、グルコノ
バクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９４株(Gluconoba
cteroxydans; American Type Culture Collection stra
in No.11894)、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ
１１８９５株(Gluconobacter oxydans; American Type
Culture Collection strain No.11895)などの菌に存在
する酵素として従来から知られている。DDaseを有する
これら酢酸菌においては、病原性などは知られておら
ず、従ってこれらの菌由来のDDaseを食品原料加工に用
いても安全である。本発明においては好ましくは、上記
DDaseは、本発明者らによる精製法（特願平3-69590号に
おいて詳細に記載されている）により精製されたものが
用いられる。

【０００９】本発明に用いられるDDaseの製造および精
製法は、例えば、次のとおりである。

【００１０】まず、グルコノバクターオキシダンスＡＴ
ＣＣ１１８９４株(Gluconobacter oxydans; American T
ype Culture Collection strain No.11894)、グルコノ
バクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９５株(Gluconoba
cter oxydans; American Type Culture Collection str
ain No.11895)、またはグルコノバクターに属するその
他のDDase生産菌を、常法により培養する。培養後、採
取した菌体をそのままあるいは細胞破壊した後、緩衝液
に懸濁する。緩衝液としては、酢酸緩衝液などDDaseが
安定に存在できるｐＨの水溶液を用いることが望まし
い。必要に応じて菌体を除去することにより、粗酵素液
が得られる。

【００１１】この粗酵素液は、上記本発明者らの精製法
により、次のようにして精製される。まず、上記粗酵素
液（菌体を含んでいてもよい）を、極性の低い有機溶媒
で抽出し、これを除去する。水層を集め、透析した後、
疎水クロマトグラフィーに供する。次に、吸着したタン
パク質を、水と容易に混合し得るアルコール類（例え
ば、エチレングリコール）などを含有する緩衝液で溶出
した後、これを濃縮し、同じく緩衝液で平衡化したゲル
濾過カラムに供し回収する。上記低い極性の有機溶媒と
は、ヘキサンの極性を０、水の極性を９としたときに５
より低いものをさしていう。例えばn-ブタノール、クロ
ロホルムなどが好適に用いられる。上記疎水クロマトグ
ラフィーに吸着した酵素を溶出する際には、例えば、極
性が５以上の有機溶媒が好適に用いられる。このような
有機溶媒としては、アルコール類（例えば、n-ブタノー
ル、エチレングリコールなど）、アセトンなどが挙げら
れる。

【００１２】本発明に用いられ得る精製DDaseは以下の
特徴を有する。

【００１３】１）作用 本酵素はアミロースなどを含めて重合度３以上のマルト
オリゴ糖に作用し、それら基質の非還元末端側のグルコ
ース残基を転移することによってデキストランを生産す
る。この作用は、反応に用いた物質がマルトース（重合
度＝２）となるまで進行する。このDDaseの作用はマル
トオリゴ糖の還元末端に位置するグルコースが水素添加
などの修飾を受けていても同様である。

【００１４】２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ DDaseの最適作用ｐＨは4.0〜4.5であり、各種ｐＨ条件
下で30分置いた時にｐＨ2.5〜6.0で安定である。

【００１５】３）最適温度および安定温度 DDaseの最適作用温度は37〜45℃であり、各種温度条件
下で30分置いた時に45℃以下で安定である。本酵素は55
℃まで活性を有する。

【００１６】４）分子量 電気泳動によるDDaseの分子量は約30万である。

【００１７】５）力価測定法 酵素反応基質には還元低加水分解澱粉を用い、反応によ
って生成したデキストランをデキストラナーゼを用いて
分解後、この時生じる還元力を測定することによりデキ
ストラン生成量を求める。力価は、１分間に１μmolの
グルコース単位がデキストランとなる時の酵素量を１Ｕ
とする。

【００１８】本発明に用いられる枝切り酵素とは、澱粉
の構造中に存在するα-1,6グルコシル結合を切断する酵
素であり、例えば、イソアミラーゼまたはプルラナーゼ
が挙げられる。本発明に用いる澱粉とは、分解処理をし
ていない未分解の澱粉である。澱粉の分解物とは、ここ
では澱粉の酸加水分解物、またはα-アミラーゼなどの
酵素処理による分解物をさしていい、分子中にα-1,6結
合を有する。澱粉分解物の分解限度は特に限定されな
い。

【００１９】枝切り酵素およびDDaseを上記澱粉または
澱粉分解物に酵素化学的に作用させるには通常の酵素反
応の条件が採用され得る。例えば、本発明で用いる酵素
反応の条件は、好ましくはｐＨ3.5〜5.5、温度２０〜４
５℃、そして反応時間３〜７２時間である。このときに
用いる枝切り酵素およびDDaseは粗精製のものでも良い
が、好ましくは、精製酵素が用いられる。原料である澱
粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物の一部が未反応
で残る場合には、澱粉液化型α-アミラーゼなどをさら
に加えて、これを分解すれば良い。しかし、反応条件が
適切でかつ酵素量および反応時間が充分であれば、原料
である澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物は未反
応で残ることはなく、エタノール沈澱法などの通常の多
糖体分離取得法でのみで、効率的に純度の高いデキスト
ランを取得できる。

【００２０】

【作用】DDaseは澱粉分子中のα-1,4結合に作用する
が、α-1,6結合には作用しない。しかし、その分解物で
あってα-1,4結合のみを有する多糖類には作用し、デキ
ストランを生成する。DDaseを澱粉またはα-1,6結合を
有する澱粉分解物に作用させると、デキストラン分子を
形成するべく、そこに存在するα-1,4結合した非還元末
端グルコース残基をα-1,6結合様式で転移させるのであ
るが、澱粉分解物の構造中に存在する分枝部分の近辺で
その反応は停止する。それゆえ、α-1,6結合をもたない
直鎖のα-1,4オリゴ糖が、デキストラン製造における良
い原料となり、最も良い原料は澱粉を枝切り酵素で分解
したときに得られる短鎖アミロースであると考えられ
る。発明者はさらに研究をすすめ、澱粉またはα-1,6結
合とα-1,4結合とを有する分解物にDDaseと枝切り酵素
とを併用することにより、短時間で効果的にデキストラ
ンが生成することを見い出した。本発明においては、DD
aseと枝切り酵素が同時に澱粉またはα-1,6結合を有す
る澱粉分解物に作用し；もしくは、枝切り酵素が澱粉ま
たはα-1,6結合を有する澱粉分解物に作用してこれらの
α-1,6結合を分解し、次いで、これにDDaseが作用す
る。例えば、DDaseとイソアミラーゼとを用いると、イ
ソアミラーゼによって澱粉またはα-1,6結合を有する澱
粉分解物より短鎖アミロースを生成しながら、この生成
したアミロースに対してDDaseが作用してデキストラン
を生成する。この際、過剰のイソアミラーゼが反応に用
いられた場合には、反応途中において短鎖アミロースが
生成し、これが沈澱する場合があるが、この短鎖アミロ
ースは最終的にはデキストランへと変換されるので、特
に問題なく高収率でデキストランを製造することができ
る。一般に、イソアミラーゼを過剰に使用することが推
奨される。これに対してイソアミラーゼの使用量が少な
い場合には、デキストラン製造における所要時間が長く
なるがデキストランの収率が低下することはない。

【００２１】枝切り酵素のうちプルラナーゼも澱粉また
はα-1,6結合を有する澱粉分解物のα-1,6結合に作用す
るが、その作用部位は澱粉分子の外側に存在する分枝部
分に限られ、内部の分枝部分には作用しない。従って、
プルラナーゼは単独では澱粉に作用しないと言われてい
る。このプルラナーゼとDDaseとを併用すると、澱粉分
子の外側に存在するα-1,6結合に対してプルラナーゼが
作用し短鎖アミロースが生成する。生成した短鎖アミロ
ースおよび枝切りされた澱粉の外側の直鎖部分はDDase
の作用によりデキストランへと変換される。澱粉の外側
の直鎖部分がデキストランへと変換されて短くなるにつ
れて、澱粉の内部に存在する分枝部分が露出するため、
この部分のα-1,6結合がプルラナーゼの作用により切断
され、短鎖アミロースおよび直鎖部分が生じ、これにDD
aseが作用する。この繰り返しによって澱粉は完全に消
失し、デキストランが高収率で製造できる。このメカニ
ズムは、マルトースの製造において澱粉にβ-アミラー
ゼとプルラナーゼとを併用すると、プルラナーゼが効率
良く澱粉の枝切り酵素として作用するのに類似してい
る。

【００２２】本発明は、上記のように、澱粉からデキス
トランを高収率で取得するに際し、枝切り酵素とDDase
とを同時に作用させること、または枝切り酵素の作用中
にDDaseを作用させることを特徴としている。本発明方
法により、例えば、澱粉の分解物として可溶性澱粉を原
料に用い、枝切り酵素をDDaseと同時に作用させたとき
のデキストランの収率を、DDaseのみを作用させたとき
のデキストランの収率と比較すると、DDaseと枝切り酵
素とを併用した方がはるかに高い収率でデキストランを
製造できる。これまでDDaseの作用についてはほとんど
研究が行われたことがなく、澱粉中のα-1,6結合付近で
反応が停止すること、あるいは、この部分がイソアミラ
ーゼまたはプルラナーゼにより切断されることによりDD
aseが再び作用することについて明らかにされていなか
った。これらの事実は、本発明によって初めて明らかに
された。

【００２３】以下に実施例を挙げ、本発明を説明する。

【００２４】

【実施例】

（実施例１）４％とうもろこし澱粉0.75mlに特願平3-69
590号の方法で得られた1U/mlDDase0.75mlおよび12,500U
/mlイソアミラーゼ（天野製薬製、商品名「イソアミラ
ーゼ「アマノ」」、1,250,000U/ml）5μｌを加え、ｐＨ
4.8で３０℃にて３０時間反応させた。この反応液を１
５分間沸騰水中で加熱した後、4.5mlのエタノールを加
え、４℃で１時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集
めた。このとき得られた沈澱を乾固することにより、デ
キストランを19.5mg得た。収率は65.0％であった。本実
施例の結果を表１に示す。実施例２〜５、比較例１およ
び２、および参考例１の結果もあわせて表１に示す。

【００２５】（実施例２）４％とうもろこし澱粉0.75ml
に実施例１と同様の1U/mlDDase0.75mlおよび400U/mlプ
ルラナーゼ（林原生物化学研究所製、商品名「プルラナ
ーゼ」、40U/mgタンパク質）10μｌを加え、ｐＨ4.8で
３０℃にて３０時間反応させた。この反応液を１５分間
沸騰水中で加熱した後、4.5mlのエタノールを加え、４
℃で１時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。
このとき得られた沈澱を乾固することにより、デキスト
ランを10.2mg得た。収率は68.0％であった。

【００２６】（比較例１）２％とうもろこし澱粉2mlに
実施例１と同様の0.3U/mlDDase2mlを加え、ｐＨ4.8で３
０℃にて４８時間反応させた。この反応液を１５分間沸
騰水中で加熱した後、8mlのエタノールを加え、４℃で
１時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。この
とき得られた沈澱を蒸留水4mlに溶解し、これに200U/ml
液化型のα-アミラーゼ（上田化学工業製、商品名「フ
クタミラーゼ」、300,000U/g）を加え、４０℃で１時間
反応させた。この反応液を４℃で２時間放置し、これを
遠心分離したところ、デキストランの沈澱は得られなか
った。

【００２７】（実施例３）３０％可溶性澱粉1.8mlに実
施例１と同様の10U/mlDDase0.2mlおよび実施例１と同様
の5,900,000U/mlイソアミラーゼ5μｌを加え、ｐＨ4.8
で４０℃にて６６時間反応させた。この反応液を１５分
間沸騰水中で加熱した後、6mlのエタノールを加え、４
℃で１時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。
このとき得られた沈澱を乾固することにより、デキスト
ランを280mg得た。収率は51.9％であった。

【００２８】（実施例４）３０％可溶性澱粉1.8mlに実
施例１と同様の10U/mlDDase0.2mlおよび実施例２と同様
の400U/mlプルラナーゼ20μｌを加え、ｐＨ4.8で４０℃
にて６６時間反応させた。この反応液を１５分間沸騰水
中で加熱した後、6mlのエタノールを加え、４℃で１時
間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。このとき
得られた沈澱を乾固することによりデキストランを28.6
mg得た。収率は52.9％であった。

【００２９】（比較例２）２％可溶性澱粉1mlに実施例
１と同様の0.2U/mlDDase1mlを加え、ｐＨ4.8で３０℃に
て１６時間反応させた。この反応液を１５分間沸騰水中
で加熱した後、6mlのエタノールを加え、４℃で１時間
放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。この沈澱を
0.5mlの蒸留水に溶解し、これに比較例１と同様の100U/
ml液化型α-アミラーゼ50μｌを加え、３７℃で３０分
間反応させた。この反応液を１５分間沸騰水中にて加熱
後、1.7mlのエタノールを加え、４℃で１時間放置し、
これを遠心分離して沈澱を集めた。このとき得られた沈
澱を乾固することにより、デキストランを4.3mg得た。
収率は21.4％であった。

【００３０】（実施例５）４０％可溶性澱粉3.6mlに実
施例２と同様の400U/mlプルラナーゼ30μｌを加え、ｐ
Ｈ4.8で４０℃にて２時間反応させた後、これに実施例
１と同様の1U/mlDDase3.6mlを加え、さらに６０時間反
応させた。この反応液を１５分間沸騰水中で加熱した
後、20mlのエタノールを加え、４℃で１時間放置し、こ
れを遠心分離して沈澱を集めた。このとき得られた沈澱
を乾固することにより、デキストランを745mg得た。収
率は51.7％であった。

【００３１】（参考例１）４％短鎖アミロース1.5mlに
実施例１と同様の1U/mlDDase1.5mlを加え、ｐＨ4.8で３
０℃にて６時間反応させた。この反応液を１５分間沸騰
水中で加熱した後、9mlのエタノールを加え、４℃で１
時間放置し、これを遠心分離して沈澱を集めた。このと
き得られた沈澱を乾固することにより、デキストランを
42mg得た。収率は70.0％であった。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【発明の効果】本発明により、澱粉またはα-1,6結合を
有する澱粉分解物から、簡単な操作で短時間のうちにデ
キストランを製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解
   物に、枝切り酵素およびデキストリンデキストラナーゼ
   を作用させる工程を包含するデキストランの製造法。
2. 【請求項２】 前記枝切り酵素が、イソアミラーゼまた
   はプルラナーゼである、請求項１に記載のデキストラン
   の製造法。