JPH05244941A - Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 - Google Patents
Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法Info
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- JPH05244941A JPH05244941A JP8275792A JP8275792A JPH05244941A JP H05244941 A JPH05244941 A JP H05244941A JP 8275792 A JP8275792 A JP 8275792A JP 8275792 A JP8275792 A JP 8275792A JP H05244941 A JPH05244941 A JP H05244941A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明はＮＡＤＨの存在下において、パラヒド
ロキシ安息香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成さ
せる等の所定の酵素学的性質を有するＮＡＤＨ依存性パ
ラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、およびその製
造方法に関する。 【効果】本発明の酵素はプロトカテキュ酸の工業生産の
実用化に極めて有用である。
ロキシ安息香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成さ
せる等の所定の酵素学的性質を有するＮＡＤＨ依存性パ
ラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ、およびその製
造方法に関する。 【効果】本発明の酵素はプロトカテキュ酸の工業生産の
実用化に極めて有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤＨ依存性パラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼおよびロドコッカス
属に属する細菌を用いた該酵素の製造方法に関する。
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼおよびロドコッカス
属に属する細菌を用いた該酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】プロトカ
テキュ酸は防錆剤、食品用抗酸化剤の製造原料、香料な
どとして用いるバニリンの製造原料、各種医薬品の製造
原料などとして広く用いられている。このプロトカテキ
ュ酸の製造方法としては、有機合成反応によるものと、
高い基質特異性を有する微生物由来の酵素を用いての酵
素反応によるものとが知られている。後者の方法とし
て、パラヒドロキシ安息香酸に酵素としてパラヒドロキ
シ安息香酸ヒドロキシラーゼを作用させることにより、
プロトカテキュ酸を生成させる方法が知られている。
テキュ酸は防錆剤、食品用抗酸化剤の製造原料、香料な
どとして用いるバニリンの製造原料、各種医薬品の製造
原料などとして広く用いられている。このプロトカテキ
ュ酸の製造方法としては、有機合成反応によるものと、
高い基質特異性を有する微生物由来の酵素を用いての酵
素反応によるものとが知られている。後者の方法とし
て、パラヒドロキシ安息香酸に酵素としてパラヒドロキ
シ安息香酸ヒドロキシラーゼを作用させることにより、
プロトカテキュ酸を生成させる方法が知られている。
【０００３】このような従来より報告されているパラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、例えば、シュー
ドモナス属の微生物より産生されるもの（J.Biol.Che
m.,241,2453(1966) 、Biochem.Biophys.Res.Communs.,3
4, 1(1969)) 、またマイクロコッカス属の微生物により
産生されるもの（Current Science,54,419(1985)) であ
る。これらの酵素はいずれもＮＡＤＰＨ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とするもの
であり、微生物により産生されるパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼとしては、ＮＡＤＰＨの存在下で反
応が行なわれるＮＡＤＰＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼのみが一般に知られているのが現状
である。
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、例えば、シュー
ドモナス属の微生物より産生されるもの（J.Biol.Che
m.,241,2453(1966) 、Biochem.Biophys.Res.Communs.,3
4, 1(1969)) 、またマイクロコッカス属の微生物により
産生されるもの（Current Science,54,419(1985)) であ
る。これらの酵素はいずれもＮＡＤＰＨ（ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素とするもの
であり、微生物により産生されるパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼとしては、ＮＡＤＰＨの存在下で反
応が行なわれるＮＡＤＰＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼのみが一般に知られているのが現状
である。
【０００４】しかしながら、ＮＡＤＰＨ依存性パラヒド
ロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、その補酵素である
ＮＡＤＰＨが高価であるため、ＮＡＤＰＨ依存性の該酵
素を現実のプロトカテキュ酸の製造に用いることは工業
的には不利である。更に、ｐＨ７以上でＮＡＤＰＨはＮ
ＡＤＨより安定性が低いといった問題もあることから、
当業界ではより工業生産に好適なパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼの開発が望まれているのが実情であ
る。
ロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼは、その補酵素である
ＮＡＤＰＨが高価であるため、ＮＡＤＰＨ依存性の該酵
素を現実のプロトカテキュ酸の製造に用いることは工業
的には不利である。更に、ｐＨ７以上でＮＡＤＰＨはＮ
ＡＤＨより安定性が低いといった問題もあることから、
当業界ではより工業生産に好適なパラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼの開発が望まれているのが実情であ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる課題
を解決するためにパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラ
ーゼ生産能を有する微生物を広く自然界より検索した。
その結果、本発明者らは先にイソフタル酸を主炭素源と
する培地で Rhodococcus ｓｐ．Ｌ−１株( 微工研菌寄
第１０６１４号）を培養することにより、プロトカテキ
ュ酸を採取できることを見いだした（特願平１−５７３
６２号）が、さらに研究を進めたところ、この微生物が
意外にもＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド）を補酵素とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安
息香酸ヒドロキシラーゼを生産することを見い出し、本
発明を完成するに至った。
を解決するためにパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラ
ーゼ生産能を有する微生物を広く自然界より検索した。
その結果、本発明者らは先にイソフタル酸を主炭素源と
する培地で Rhodococcus ｓｐ．Ｌ−１株( 微工研菌寄
第１０６１４号）を培養することにより、プロトカテキ
ュ酸を採取できることを見いだした（特願平１−５７３
６２号）が、さらに研究を進めたところ、この微生物が
意外にもＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド）を補酵素とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安
息香酸ヒドロキシラーゼを生産することを見い出し、本
発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１）ＮＡＤＨ
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下に
おいて、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、プロトカ
テキュ酸を生成させる等の所定の酵素学的性質を有する
ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼ、並びに（２）ロドコッカス属に属し、ＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する
能力を有する微生物を培養し、培養物よりＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを採取する
ことを特徴とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼの製造方法に関する。
（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下に
おいて、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、プロトカ
テキュ酸を生成させる等の所定の酵素学的性質を有する
ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼ、並びに（２）ロドコッカス属に属し、ＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する
能力を有する微生物を培養し、培養物よりＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを採取する
ことを特徴とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香
酸ヒドロキシラーゼの製造方法に関する。
【０００７】以下に本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼについて詳細に説明す
る。 １）酵素の作用 ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の
存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、
プロトカテキュ酸を生成させる。
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼについて詳細に説明す
る。 １）酵素の作用 ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の
存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、
プロトカテキュ酸を生成させる。
【０００８】２）基質特異性 パラヒドロキシ安息香酸の類似化合物１４種類について
活性を調べた結果、パラヒドロキシ安息香酸に対する活
性を１００％とした場合、１０％以上の活性を示した化
合物は、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（１６％）のみ
であり、その他の化合物では５％以下の活性を示した物
は４種であった。従って、本酵素はパラヒドロキシ安息
香酸を特異的基質とする酵素である。
活性を調べた結果、パラヒドロキシ安息香酸に対する活
性を１００％とした場合、１０％以上の活性を示した化
合物は、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（１６％）のみ
であり、その他の化合物では５％以下の活性を示した物
は４種であった。従って、本酵素はパラヒドロキシ安息
香酸を特異的基質とする酵素である。
【０００９】３）力価の測定法 酵素活性の測定は、パラヒドロキシ安息香酸４０μＭお
よび還元型ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ）４０μＭを含有する５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）０．６ｍｌ中で３３℃で１分間反応させ、３
４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。
対照としてパラヒドロキシ安息香酸を含有させずに反応
させたときの吸光度を測定し、コントロールの値として
差し引いて求めた。また、酵素単位は１分間に１μＭの
還元型ピリジンヌクレオチドを減少させる酵素活性を１
単位とした。
よび還元型ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨ）４０μＭを含有する５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）０．６ｍｌ中で３３℃で１分間反応させ、３
４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。
対照としてパラヒドロキシ安息香酸を含有させずに反応
させたときの吸光度を測定し、コントロールの値として
差し引いて求めた。また、酵素単位は１分間に１μＭの
還元型ピリジンヌクレオチドを減少させる酵素活性を１
単位とした。
【００１０】４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは図１に示すとおり、ｐＨ７．５〜７．８であ
る。安定ｐＨ範囲は２５℃、１時間の保持条件の場合、
図２に示すとおりｐＨ７．４〜７．８であった。
る。安定ｐＨ範囲は２５℃、１時間の保持条件の場合、
図２に示すとおりｐＨ７．４〜７．８であった。
【００１１】５）至適温度および安定温度 反応の至適温度は３３℃であった（図３）。安定温度範
囲はｐＨ７．６、５０ｍＭヘペス緩衝液中に各温度で６
０分間保温して残存活性を測定した。その結果、本発明
の酵素は２５℃まで安定であり、４５℃で約５０％の残
存活性を示し６０℃以上で完全失活した（図４）。
囲はｐＨ７．６、５０ｍＭヘペス緩衝液中に各温度で６
０分間保温して残存活性を測定した。その結果、本発明
の酵素は２５℃まで安定であり、４５℃で約５０％の残
存活性を示し６０℃以上で完全失活した（図４）。
【００１２】６）ＮＡＤＨのＫｍ値 本酵素に対するＮＡＤＨのＫｍ値は、図５に示す通り５
５．３μＭであった。
５．３μＭであった。
【００１３】７）ＮＡＤＰＨのＫｍ値 本酵素に対するＮＡＤＰＨのＫｍ値は、図６に示す通り
３３３μＭであった。
３３３μＭであった。
【００１４】８）パラヒドロキシ安息香酸のＫｍ値 本酵素に対するパラヒドロキシ安息香酸のＫｍ値は、補
酵素ＮＡＤＨを用いた場合６．７μＭであり（図７）、
補酵素ＮＡＤＰＨを用いた場合１７．２μＭであった
（図８）。
酵素ＮＡＤＨを用いた場合６．７μＭであり（図７）、
補酵素ＮＡＤＰＨを用いた場合１７．２μＭであった
（図８）。
【００１５】９）抽出・精製方法 ＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラー
ゼは誘導酵素であり、後述するようにロドコッカス属に
属する微生物を、イソフタル酸を炭素源として含む培地
で培養を行うことにより産生させることができる。培養
終了後、培養物より遠心分離法等の方法にて菌体を分離
する。
ゼは誘導酵素であり、後述するようにロドコッカス属に
属する微生物を、イソフタル酸を炭素源として含む培地
で培養を行うことにより産生させることができる。培養
終了後、培養物より遠心分離法等の方法にて菌体を分離
する。
【００１６】分離した菌体をそのまま酵素源として用い
てもよいが、さらに酵素を抽出し精製することが好まし
い。酵素を菌体から分離する場合は、採取した菌体を懸
濁してから、例えば、超音波、圧力変化（Ｆｒｅｎｃｈ
プレス、Ｈｕｇｅｓプレス）、攪拌（ホモジナイザー、
ビーズミル、ブレンダー）、凍結融解等による物理的方
法、あるいは酵素、界面活性剤、カオトロピックイオ
ン、酸アルカリ、抗生物質、自己消化等による化学的方
法により菌体を破壊して無細胞抽出液を得ることができ
る。本酵素の抽出および精製は、酵素の一般的な抽出・
精製方法を適宜選択することにより行うことができ、特
に制限されるものではない。例えば、塩析法、限外濾過
法、カラムクロマトグラフィー（イオン交換、アフィニ
ティー、ゲル濾過等）、電気泳動法等が挙げられる。
てもよいが、さらに酵素を抽出し精製することが好まし
い。酵素を菌体から分離する場合は、採取した菌体を懸
濁してから、例えば、超音波、圧力変化（Ｆｒｅｎｃｈ
プレス、Ｈｕｇｅｓプレス）、攪拌（ホモジナイザー、
ビーズミル、ブレンダー）、凍結融解等による物理的方
法、あるいは酵素、界面活性剤、カオトロピックイオ
ン、酸アルカリ、抗生物質、自己消化等による化学的方
法により菌体を破壊して無細胞抽出液を得ることができ
る。本酵素の抽出および精製は、酵素の一般的な抽出・
精製方法を適宜選択することにより行うことができ、特
に制限されるものではない。例えば、塩析法、限外濾過
法、カラムクロマトグラフィー（イオン交換、アフィニ
ティー、ゲル濾過等）、電気泳動法等が挙げられる。
【００１７】１０）分子量 本酵素の分子量は、クリアパックＧＦＳ−３（８．０ｍ
ｍＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）とＴＳＫ ｇｅｌＧ３
０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：東ソー社製）
を連結して用いた高速ゲル濾過カラム法で約６．７×１
０4 と推定された。
ｍＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）とＴＳＫ ｇｅｌＧ３
０００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：東ソー社製）
を連結して用いた高速ゲル濾過カラム法で約６．７×１
０4 と推定された。
【００１８】１１）阻害剤等の影響 本酵素について種々の添加物質の影響について検討した
ところ、ハロゲンイオン、チオシアンイオンにより阻害
された。また、ナトリウムイオン、カリウムイオン等の
カチオンイオンにより阻害されなかった。
ところ、ハロゲンイオン、チオシアンイオンにより阻害
された。また、ナトリウムイオン、カリウムイオン等の
カチオンイオンにより阻害されなかった。
【００１９】このように本酵素は、パラヒドロキシ安息
香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成させることか
ら、パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。
さらに、前記のように本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値
は５５．３μＭ、ＮＡＤＰＨに対するＫｍ値は３３３μ
Ｍであることから、ＮＡＤＨに対するＫｍ値はＮＡＤＰ
Ｈに対するものよりも１／６倍も低いＫｍ値を示すもの
であり、このことから本酵素は、ＮＡＤＨ依存性パラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。
香酸に作用して、プロトカテキュ酸を生成させることか
ら、パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。
さらに、前記のように本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値
は５５．３μＭ、ＮＡＤＰＨに対するＫｍ値は３３３μ
Ｍであることから、ＮＡＤＨに対するＫｍ値はＮＡＤＰ
Ｈに対するものよりも１／６倍も低いＫｍ値を示すもの
であり、このことから本酵素は、ＮＡＤＨ依存性パラヒ
ドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼである。
【００２０】次に、本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロ
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する能力を有する
微生物について説明する。本発明に使用する微生物は、
ロドコッカス属に属し、前記の特性を有するＮＡＤＨ依
存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産す
る能力を持つものであればいかなるものでも良い。それ
らのうち好ましい菌株は、本発明者らにより東京都内の
土壌から分離したロドコッカスｓｐ．Ｌ−１株（Rhodoc
occus sp.Ｌ−１株，微工研菌寄第１０６１４号）を例
示できる。
キシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する能力を有する
微生物について説明する。本発明に使用する微生物は、
ロドコッカス属に属し、前記の特性を有するＮＡＤＨ依
存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産す
る能力を持つものであればいかなるものでも良い。それ
らのうち好ましい菌株は、本発明者らにより東京都内の
土壌から分離したロドコッカスｓｐ．Ｌ−１株（Rhodoc
occus sp.Ｌ−１株，微工研菌寄第１０６１４号）を例
示できる。
【００２１】本菌は次のような菌学的性質を有するもの
である。 (1) 形態学的性質 菌 形 ： 桿 菌 大 き さ ： ０．８×１．５〜２．０μｍ 多 形 性 ： ３０℃で培養すると、１〜２
日で菌糸を形成し、その後、フラグメンテーションを起
こし、桿菌となる。気菌糸は形成しない。 抗 酸 性 ： な し グラム染色性 ： 陽 性 鞭 毛 ： な し 胞 子 ： な し
である。 (1) 形態学的性質 菌 形 ： 桿 菌 大 き さ ： ０．８×１．５〜２．０μｍ 多 形 性 ： ３０℃で培養すると、１〜２
日で菌糸を形成し、その後、フラグメンテーションを起
こし、桿菌となる。気菌糸は形成しない。 抗 酸 性 ： な し グラム染色性 ： 陽 性 鞭 毛 ： な し 胞 子 ： な し
【００２２】(2) 培養的性質 肉汁寒天平板培養：生育良好。コロニー形状は円形、
周囲は平滑で、色は乳白色。 肉汁寒天斜面培養：糸状。コロニーの色は乳白色。 肉汁液体培養：均一に混濁。 イソフタル酸寒天平板培養：生育良好。コロニー形状
は円形で、周囲は平滑で、色は白色。
周囲は平滑で、色は乳白色。 肉汁寒天斜面培養：糸状。コロニーの色は乳白色。 肉汁液体培養：均一に混濁。 イソフタル酸寒天平板培養：生育良好。コロニー形状
は円形で、周囲は平滑で、色は白色。
【００２３】(3) 生理学的性質 （1) 最適生育温度 ： ２５〜３３℃ （2) 生 育 温 度 ： ２０〜３５℃ （3) 最 適 ｐＨ ： ６．０〜８．０ （4) 生 育 ｐＨ ： ５．０〜１０．
０ （5) 酸 素 要 求 性 ： 好気的 （6) 色 素 の 生 産 ： な し （7) ゼラチン液化性 ： 陽 性 （8) カタラーゼ活性 ： 陽 性 （9) オキシダーゼ活性 ： 陰 性 （10) ウレアーゼ活性 ： 陽 性 （11) インドールの生産 ： 陰 性 （12) デンプンの加水分解活性 ： 陰 性 （13) 硝酸塩の還元 ： 陰 性 （14) クエン酸培地における生育 ： 生育する （15) メチルレッド試験 ： 陰 性 （16) ＶＰ反応 ： 陰 性
０ （5) 酸 素 要 求 性 ： 好気的 （6) 色 素 の 生 産 ： な し （7) ゼラチン液化性 ： 陽 性 （8) カタラーゼ活性 ： 陽 性 （9) オキシダーゼ活性 ： 陰 性 （10) ウレアーゼ活性 ： 陽 性 （11) インドールの生産 ： 陰 性 （12) デンプンの加水分解活性 ： 陰 性 （13) 硝酸塩の還元 ： 陰 性 （14) クエン酸培地における生育 ： 生育する （15) メチルレッド試験 ： 陰 性 （16) ＶＰ反応 ： 陰 性
【００２４】 （17) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法，30℃，10日間，開放系，密閉系）： 〔糖〕 〔開放系〕 〔密閉系〕 グルコース 変化なし 変化なし サッカロース 変化なし 変化なし D-フラクトース 変化なし 変化なし D-マンニット 変化なし 変化なし L-ソルボース 変化なし 変化なし D-ラフィノース 変化なし 変化なし D-ラムノース 変化なし 変化なし D-ガラクトース 変化なし 変化なし meso- エリストール 変化なし 変化なし D-ラクトース 変化なし 変化なし myo-イノシット 変化なし 変化なし D-キシロース 変化なし 変化なし イノシトール 変化なし 変化なし トレハロース 変化なし 変化なし D-アラビノース 変化なし 変化なし L-アラビノース 変化なし 変化なし セロビオース 変化なし 変化なし
【００２５】 （18) 糖の分解（Barsiekow 培地，30℃，10日間）： 〔糖〕 〔酸産生〕 〔ガス産生〕 グルコース 産生しない 産生しない サッカロース 産生しない 産生しない D-ラクトース 産生しない 産生しない グリセロール 産生しない 産生しない D-アラビノース 産生しない 産生しない
【００２６】（19) 細胞壁のジアミノピメリン酸異性
体：meso−ＤＡＰ。 （20) 細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリル
基が存在。 （21) ミコール酸の存在：存在する。 （22) 分 離 源 ：東京都内土壌
体：meso−ＤＡＰ。 （20) 細胞壁アシル型（グリコリル試験）：グリコリル
基が存在。 （21) ミコール酸の存在：存在する。 （22) 分 離 源 ：東京都内土壌
【００２７】次に、このようなロドコッカス属に属する
微生物を用いてＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸
ヒドロキシラーゼを生産するには、次のような培地を用
いて培養する。すなわち、主炭素源としてのイソフタル
酸、ちっ素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養因子
を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地で
も使用できる。ちっ素源としては、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウムなどの無機ちっ素源、ペプト
ン、肉エキス、コンスティープリカー、酵母エキス、カ
ザミノ酸、大豆粉などを単独でまたは組み合わせて用い
ることができる。無機塩類として、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫
酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、塩
化カルシウム、塩化カリウムなどを加えてもよい。これ
らの他、生育に必要な栄養因子としては、ビタミン類、
アミノ酸、核酸およびその塩類などがある。また、ペプ
トン、肉エキス、コンスティープリカー、酵母エキス、
カザミノ酸などの上記栄養因子を含有する天然有機栄養
物を適宜添加することもできる。
微生物を用いてＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸
ヒドロキシラーゼを生産するには、次のような培地を用
いて培養する。すなわち、主炭素源としてのイソフタル
酸、ちっ素源、無機塩類、ビタミン、その他の栄養因子
を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地で
も使用できる。ちっ素源としては、硝酸アンモニウム、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウムなどの無機ちっ素源、ペプト
ン、肉エキス、コンスティープリカー、酵母エキス、カ
ザミノ酸、大豆粉などを単独でまたは組み合わせて用い
ることができる。無機塩類として、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫
酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、塩
化カルシウム、塩化カリウムなどを加えてもよい。これ
らの他、生育に必要な栄養因子としては、ビタミン類、
アミノ酸、核酸およびその塩類などがある。また、ペプ
トン、肉エキス、コンスティープリカー、酵母エキス、
カザミノ酸などの上記栄養因子を含有する天然有機栄養
物を適宜添加することもできる。
【００２８】培養は、好気的条件、例えば振盪培養法、
通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養法を
組み合わせることもできる。培養温度は２０〜３５℃、
特に２５〜３３℃が良好で、培養時のｐＨは７〜９であ
る。培地中のイソフタル酸の濃度は通常０．１〜１０
％、好ましくは０．５〜３．０％が好適である。イソフ
タル酸を主炭素源として、培地ｐＨ７．０付近、３０℃
で振盪培養あるいは通気攪拌培養する。培養時間は通常
６５〜７５時間程度である。培養終了後、培養液から本
発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキ
シラーゼを採取し、前記のような方法により精製する。
通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養法を
組み合わせることもできる。培養温度は２０〜３５℃、
特に２５〜３３℃が良好で、培養時のｐＨは７〜９であ
る。培地中のイソフタル酸の濃度は通常０．１〜１０
％、好ましくは０．５〜３．０％が好適である。イソフ
タル酸を主炭素源として、培地ｐＨ７．０付近、３０℃
で振盪培養あるいは通気攪拌培養する。培養時間は通常
６５〜７５時間程度である。培養終了後、培養液から本
発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキ
シラーゼを採取し、前記のような方法により精製する。
【００２９】
【実施例】以下、実施例および参考例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。 実施例１ イソフタル酸２％、硫安０．２％、リン酸一カリウム
０．１５％、リン酸二カリウム０．１５％、硫酸マグネ
シウム０．０５％、塩化ナトリウム０．０１％、塩化カ
ルシウム０．００２％、硫化鉄０．００１％、硫化マン
ガン０．０００２％、硫化亜鉛０．０００２％、モリブ
デン酸ナトリウム０．０００２％、ｐＨ７．２からなる
培地４０ｍｌを１００ｍｌ容の三角フラスコに１白金耳
ロドコッカスＬ１（微工研菌寄第１０６１４号）を接種
して３０℃で７０時間振盪培養したものを１００μｌ抽
出してから新たな培地４０ｍｌへ接種し、計４８本の三
角フラスコを３０℃で７０時間振盪培養した。
らに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。 実施例１ イソフタル酸２％、硫安０．２％、リン酸一カリウム
０．１５％、リン酸二カリウム０．１５％、硫酸マグネ
シウム０．０５％、塩化ナトリウム０．０１％、塩化カ
ルシウム０．００２％、硫化鉄０．００１％、硫化マン
ガン０．０００２％、硫化亜鉛０．０００２％、モリブ
デン酸ナトリウム０．０００２％、ｐＨ７．２からなる
培地４０ｍｌを１００ｍｌ容の三角フラスコに１白金耳
ロドコッカスＬ１（微工研菌寄第１０６１４号）を接種
して３０℃で７０時間振盪培養したものを１００μｌ抽
出してから新たな培地４０ｍｌへ接種し、計４８本の三
角フラスコを３０℃で７０時間振盪培養した。
【００３０】培養終了後、培養液２リットルを遠心分離
し、菌体２５．７ｇ（湿菌重量）を得た。このようにし
て得られた菌体を５ｍＭＭｇ2+を含む５０ｍＭヘペス緩
衝液（ｐＨ７．６）に２５．７ｇ／１００ｍｌ濃度にな
るように懸濁し、ソニーケーター２５０（ＢＲＡＮＳＯ
Ｎ社製）により菌体を破砕後、遠心分離（１０万×ｇ）
を行い無細胞抽出液を得た。この抽出液の比活性は１
１．６×１０-2Ｕ／ｍｇの酵素標品であった。
し、菌体２５．７ｇ（湿菌重量）を得た。このようにし
て得られた菌体を５ｍＭＭｇ2+を含む５０ｍＭヘペス緩
衝液（ｐＨ７．６）に２５．７ｇ／１００ｍｌ濃度にな
るように懸濁し、ソニーケーター２５０（ＢＲＡＮＳＯ
Ｎ社製）により菌体を破砕後、遠心分離（１０万×ｇ）
を行い無細胞抽出液を得た。この抽出液の比活性は１
１．６×１０-2Ｕ／ｍｇの酵素標品であった。
【００３１】次に、この抽出液を５ｍＭＭｇ2+を含む５
０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）流速１ｍｌ／ｍｉｎ
で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラム（２ｃｍＩ
Ｄ×４ｃｍ：ファルマシア社製）に吸着させ、同平衡化
緩衝液にて洗浄後、５０ｍＭ及び１５０ｍＭＫＣｌを含
む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）で段階的溶出を
行い、目的とする酵素の活性画分（フラクションＮｏ．
４６〜４９）を得た（図９）。この活性画分を遠心タイ
プの限外濾過器具であるウルトラセントー３０（東ソー
社製）を用いて脱塩し、５０ｍＭヘペス緩衝液で平衡化
したクリアパックＩＥＰ／ＤＥＡＥ（６０ｍｍＩＤ×１
０ｃｍ：アトー社製）に吸着させ、０．０から０．５Ｍ
ＫＣｌのイオン強度による直線勾配溶出法により、０．
８ｍｌ／ｍｉｎの流速で酵素活性画分を得た。この酵素
活性画分をウルトラセントー３０を用いて５００μｌま
で脱塩、濃縮し、クリアパックＧＦＳ−３（８．０ｍｍ
ＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）とＴＳＫ ｇｅｌＧ３０
００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：東ソー社製）を
連結させた高速ゲル濾過カラムで、０．５ＭＫＣｌを含
む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）にて分離溶出を
行い、電気泳動的に単一な活性画分を得た（図１０）。
電気泳動はＤａｖｉｓ法によるスラブゲル電気泳動法に
より１０％ポリアクリルアミドゲルで泳動後、銀染色法
により染色を行った。尚、この活性画分の分子量は約
６．７×１０4 と推定された。ここで得られた精製品の
比活性は１８．８×１０-2Ｕ／ｍｇであった。
０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）流速１ｍｌ／ｍｉｎ
で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラム（２ｃｍＩ
Ｄ×４ｃｍ：ファルマシア社製）に吸着させ、同平衡化
緩衝液にて洗浄後、５０ｍＭ及び１５０ｍＭＫＣｌを含
む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）で段階的溶出を
行い、目的とする酵素の活性画分（フラクションＮｏ．
４６〜４９）を得た（図９）。この活性画分を遠心タイ
プの限外濾過器具であるウルトラセントー３０（東ソー
社製）を用いて脱塩し、５０ｍＭヘペス緩衝液で平衡化
したクリアパックＩＥＰ／ＤＥＡＥ（６０ｍｍＩＤ×１
０ｃｍ：アトー社製）に吸着させ、０．０から０．５Ｍ
ＫＣｌのイオン強度による直線勾配溶出法により、０．
８ｍｌ／ｍｉｎの流速で酵素活性画分を得た。この酵素
活性画分をウルトラセントー３０を用いて５００μｌま
で脱塩、濃縮し、クリアパックＧＦＳ−３（８．０ｍｍ
ＩＤ×３０ｃｍ：アトー社製）とＴＳＫ ｇｅｌＧ３０
００ＳＷ（７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ：東ソー社製）を
連結させた高速ゲル濾過カラムで、０．５ＭＫＣｌを含
む５０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）にて分離溶出を
行い、電気泳動的に単一な活性画分を得た（図１０）。
電気泳動はＤａｖｉｓ法によるスラブゲル電気泳動法に
より１０％ポリアクリルアミドゲルで泳動後、銀染色法
により染色を行った。尚、この活性画分の分子量は約
６．７×１０4 と推定された。ここで得られた精製品の
比活性は１８．８×１０-2Ｕ／ｍｇであった。
【００３２】参考例１ パラヒドロキシ安息香酸（最終濃度４０nmol）１０μl
およびＮＡＤＨ（最終濃度４０nmol）８μl を５０mMヘ
ペス緩衝液（ｐＨ７．６）４３２μl に溶解した後、実
施例１で得られた酵素抽出液（10万×ｇの上清液、687.
9 μｇタンパク／ｍl ）２５０μl を加えて、０，１
０，２０分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１Ｍ過
塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Na溶液を各６００μl 加え
て反応を停止させた。次いで、反応液を１５００ｒｐ
ｍ、１０分間で遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、反応０時間において認められたパラヒド
ロキシ安息香酸のピークは、反応１０分後には大きく減
少し、反応２０分後には完全に消失した。
およびＮＡＤＨ（最終濃度４０nmol）８μl を５０mMヘ
ペス緩衝液（ｐＨ７．６）４３２μl に溶解した後、実
施例１で得られた酵素抽出液（10万×ｇの上清液、687.
9 μｇタンパク／ｍl ）２５０μl を加えて、０，１
０，２０分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１Ｍ過
塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Na溶液を各６００μl 加え
て反応を停止させた。次いで、反応液を１５００ｒｐ
ｍ、１０分間で遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、反応０時間において認められたパラヒド
ロキシ安息香酸のピークは、反応１０分後には大きく減
少し、反応２０分後には完全に消失した。
【００３３】参考例２ パラヒドロキシ安息香酸（最終濃度４０ｎｍｏｌ）１０
μｌ及びＮＡＤＨ（最終濃度４０ｎｍｏｌ）１０μｌ及
び定量用内部標準物質である３，４−ジヒドロキシフェ
ニル酢酸（最終濃度４００ｎｍｏｌ）１０μｌを５０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）４７０μｌに溶解した
後、実施例１で得られた粗酵素（ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕ
ｅカラム（２ｃｍＩＤ×４ｃｍ）の溶出液、１０５μｇ
／ｍｌ）１０μｌを加えて０，３，１０，２０，４０，
６０，１００分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１
Ｍ過塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Ｎａ溶液を各５００μ
ｌ加え、反応を停止させた。次いで反応液を１５００ｒ
ｐｍ、１０分間遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、経時的にプロトカテキュ酸のピークが増
加した。各経過時間のプロトカテキュ酸量を、内部標準
物質で定量し、図１１に示すようなプロトカテキュ酸生
成量の増加曲線を得た。
μｌ及びＮＡＤＨ（最終濃度４０ｎｍｏｌ）１０μｌ及
び定量用内部標準物質である３，４−ジヒドロキシフェ
ニル酢酸（最終濃度４００ｎｍｏｌ）１０μｌを５０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）４７０μｌに溶解した
後、実施例１で得られた粗酵素（ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕ
ｅカラム（２ｃｍＩＤ×４ｃｍ）の溶出液、１０５μｇ
／ｍｌ）１０μｌを加えて０，３，１０，２０，４０，
６０，１００分間、反応温度３３℃下で反応を行い、１
Ｍ過塩素酸＋０．２％ＥＤＴＡ−Ｎａ溶液を各５００μ
ｌ加え、反応を停止させた。次いで反応液を１５００ｒ
ｐｍ、１０分間遠心を行い、除タンパクし、得られた上
清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析を行っ
た。その結果、経時的にプロトカテキュ酸のピークが増
加した。各経過時間のプロトカテキュ酸量を、内部標準
物質で定量し、図１１に示すようなプロトカテキュ酸生
成量の増加曲線を得た。
【００３４】
【発明の効果】本発明のＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ
安息香酸ヒドロキシラーゼは、ＮＡＤＨの存在下におい
て、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、プロトカテキ
ュ酸を生成する性質を有しているので、プロトカテキュ
酸の工業生産の実用化に極めて有用である。
安息香酸ヒドロキシラーゼは、ＮＡＤＨの存在下におい
て、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、プロトカテキ
ュ酸を生成する性質を有しているので、プロトカテキュ
酸の工業生産の実用化に極めて有用である。
【図１】図１は本酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図２】図２は本酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図３】図３は本酵素の至適温度を示す図である。
【図４】図４は本酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】図５は本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値を示す
図である。
図である。
【図６】図６は本酵素のＨＡＤＰＨに対するＫｍ値を示
す図である。
す図である。
【図７】図７はＮＡＤＨを用いた場合の本酵素のパラヒ
ドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。
ドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。
【図８】図８はＮＡＤＰＨを用いた場合の本酵素のパラ
ヒドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。
ヒドロキシ安息香酸に対するＫｍ値を示す図である。
【図９】図９は実施例においてＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ
カラムを用いた本酵素の溶出パターンを示す図である。
カラムを用いた本酵素の溶出パターンを示す図である。
【図１０】図１０は実施例において１０％ポリアクリル
アミドゲルを用いた本酵素活性画分の電気泳動図を示
す。
アミドゲルを用いた本酵素活性画分の電気泳動図を示
す。
【図１１】図１１は参考例２において得られたプロトカ
テキュ酸生成量の増加曲線を示す。
テキュ酸生成量の増加曲線を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 次の酵素学的性質を有するＮＡＤＨ依存
性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ。 作用 ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の
存在下において、パラヒドロキシ安息香酸に作用して、
プロトカテキュ酸を生成させる。 基質特異性 パラヒドロキシ安息香酸を特異的基質とする。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．５〜７．８であり、安定ｐＨ範囲は
２５℃、１時間の保持条件においてｐＨ７．４〜７．８
である。 至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は３３℃であり、ｐＨ７．６で６０分間
保温した時、２５℃まで安定であり、６０℃以上で完全
失活する。 分子量 高速ゲル濾過カラム法により測定した分子量は約６．７
×１０4 である。 阻害剤等の影響 ハロゲンイオン、チオシアンイオンにより阻害される
が、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のカチオンイ
オンにより阻害されない。 - 【請求項２】 ロドコッカス属に属し、ＮＡＤＨ依存性
パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを生産する能
力を有する微生物を培養し、培養物よりＮＡＤＨ依存性
パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを採取するこ
とを特徴とするＮＡＤＨ依存性パラヒドロキシ安息香酸
ヒドロキシラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8275792A JPH05244941A (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8275792A JPH05244941A (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244941A true JPH05244941A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=13783320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8275792A Pending JPH05244941A (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05244941A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017073701A2 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing aldehyde |
| WO2018079687A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079685A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079686A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-methionine or metabolites requiring s-adenosylmethionine for synthesis |
| WO2018079684A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079683A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079705A1 (en) | 2016-10-27 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing aldehyde |
| EP3406727A1 (en) | 2017-05-22 | 2018-11-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| EP3502263A2 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2020027251A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2020226087A1 (ja) | 2019-05-08 | 2020-11-12 | 味の素株式会社 | バニリンの製造方法 |
-
1992
- 1992-03-03 JP JP8275792A patent/JPH05244941A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017073701A2 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing aldehyde |
| WO2018079687A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079685A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079686A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-methionine or metabolites requiring s-adenosylmethionine for synthesis |
| WO2018079684A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079683A1 (en) | 2016-10-26 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2018079705A1 (en) | 2016-10-27 | 2018-05-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing aldehyde |
| EP3406727A1 (en) | 2017-05-22 | 2018-11-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| EP3502263A2 (en) | 2017-11-29 | 2019-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2020027251A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing objective substance |
| WO2020226087A1 (ja) | 2019-05-08 | 2020-11-12 | 味の素株式会社 | バニリンの製造方法 |
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