JPH0440990B2 - - Google Patents
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- JPH0440990B2 JPH0440990B2 JP58142667A JP14266783A JPH0440990B2 JP H0440990 B2 JPH0440990 B2 JP H0440990B2 JP 58142667 A JP58142667 A JP 58142667A JP 14266783 A JP14266783 A JP 14266783A JP H0440990 B2 JPH0440990 B2 JP H0440990B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
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- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
発明の分野
本発明はグリセロールエステルの加水分解を触
媒する酵素に関する。このタイプの酵素は当業界
ではエステラーゼまたはさらに詳細には、グリセ
ロールエステルヒドロラーゼと称される。この酵
素はリパーゼの定量に有用である。 リパーゼの定量分析方法において、その第１工
程はグリセロールトリエステルのα位の長鎖エス
テルの、サンプル中リパーゼによる加水分解を触
媒することにある。基質は生成するジエステル上
のアルキル基が短鎖アルキル基であるようなもの
である。この方法の次の工程では、短鎖アルキル
基が加水分解されてグリセロールを生成する。グ
リセロールの形成速度が検知され、これはサンプ
ル中のリパーゼに相関する。 短鎖アルキル基の加水分解は短鎖アルキル基に
特異的なエステラーゼ酵素によつて触媒される。
これらのエステラーゼ酵素の多くは公知であり、
前記方法の実施に有用である。 従来技術 バチルス・サブチリス（Bacillus subtilia）由
来のエステラーゼ酵素は知られている。たとえ
ば、ハイガード（Higerd）及びスパイジゼン
（Spizizen）はこれらの酵素のうち２種について
述べている〔「バチルス・サブチリスの抽出物か
らの２種のアセチルエステラーゼの単離
（Isolation of Two Acetyl Esterases from
Extracts of Bacillus subtilis）」，J.of
Bacteriology，第114巻，1184〜1192ページ
（1973年）〕。この文献に記載されている菌株から
生産される酵素量は所望とされる量よりも少ない
（比較例７参照）。さらに、本発明の酵素と比較し
たこれらの酵素のゲル電気泳動は、本発明の酵素
が前記文献に開示された酵素のいずれとも異なる
ことを決定的に示している。電気泳動実験につい
ての詳細は本明細書の比較例８に記載した。 従つて、従来技術の酵素によれば触媒反応の速
度は遅い。さらに、多くの公知エステラーゼ酵素
には所望とされる特異性がない。たとえば、リパ
ーゼ基質と接触させて長期間貯蔵した場合、これ
らの従来技術の酵素の多くは基質のα位の長鎖ア
ルキル基の加水分解を触媒する。出発基質の多く
がこの機構によつて使い果たされてしまうため、
このことが方法の感度に重大な影響を与えること
は言うまでもない。特異性が高く、しかも活性が
高い新しい酵素が望まれている。さらに、大量の
酵素を生産する微生物を見い出すことが望まれて
いる。 発明の概要 本発明に従えば、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCCNo.31954から単離さ
れ、短鎖エステルに対する基質特異性を有し、至
適PHが7.0〜9.0であるグリセロールエステルの加
水分解用グリセロールエステルヒドロラーゼ酵素
が提供される。 本発明は従来の酵素工学の欠陥を考慮してなさ
れたものであり、その目的は短鎖アルキル基に対
して特異性が高く且つ反応を速かに触媒する酵素
を提供することにある。 グリセロールエステルの加水分解を触媒し、１
個または複数のアルキル基の炭素数が１〜４であ
るアルキルエステルに特異的な本発明の酵素は、
微生物バトルス・ズブチリスATCCNo.31954から
単離される。 アルキル基の炭素数が１〜４のグリセロールエ
ステルの加水分解を触媒する酵素の生産方法は次
の工程(a)及び(b)を含んでなる： (a) 微生物バチルス・ズブチリスATCCNo.31954
を生育培地中で生育せしめ、そして (b) この培養物から酵素を回収する。 この酵素は特にリパーゼ検出アツセイにおいて
ジエステラーゼとして有用である。 本発明の酵素を生産する微生物はバチルス・ズ
ブチリスの１菌株である。この菌株はニユーヨー
ク州、ロチエスターの近くで得た土壌試料から単
離された。単離された菌株のサンプルは、アメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託
し、受託番号ATCCNo.31954が与えられた。この
サンプルはブダペスト条約の規定に従つて寄託し
た。 ジエステラーゼを回収する微生物は好ましく
は、当業界においてMRS培地として知られた培
地上で生育させる。この培地はドマン
（DeMann）らにより述べられている〔「乳酸桿菌
培養用培地（Ａ Medium for the Cultivation
of Lactobacilli）」，J.App.Bact.，23(1)，130〜
135〕。 発酵後、公知酵素回収法を用いて生育培地から
ジエステラーゼを回収する。酵素は細胞内酵素で
ある。一般に、酵素は、細胞を破壊し、次いで、
好ましくはｎ−プロパノールのような有機溶媒で
の沈澱によつて酵素を回収することによつて回収
される。有用な方法は米国特許第3597323号、同
第4087329号、同第4134793号及び同第4275166号
に記載されている。 実施例においては、以下の材料及び手法を用い
た： Ａ 材料 卵白リゾチーム、牛膵臓からデオキシリボヌク
レアーゼ（DN−100）、牛膵臓からのリボヌクレ
アーゼＡ（Type1−Ａ）、トリオレイン及びアラビ
アゴムはミズリー州セントルイスのシグマ・ケミ
カル社（Sigma Chemical Co.）から購入した。
バクト （Bacto ）酵母エキスはミシガン州デ
トロイトのデイフコ・ラブス（Difco Labs）か
ら入手した。ドマン（Demann）、ラゴツサ
（Ragossa）及びシヤープ（Sharpe）（MRS）ブ
ロス（CM359）、酵母エキス、ラブ・レムコ
（Lab Lemco ）粉末（Ｌ−29）（肉エキス普通
ブロス）、ペプトン（Ｌ−34）及びオキソイド寒
天 （Oxoid agar ）はカナダ国、オンタ
リオ州、オタワのオキソイド・カナダ社（Oxoid
Canada Ltd.）から購入した。ポリグリコール
（Polyglycol）（Ｐ−2000） はミシガン州、ミツ
ドランドのダウ・ケミカル社（Dow Chemical
Co.）から入手した。ジアセチン、グルコース及
び他の化学薬品は特に断わりのない限り、ニユー
ヨーク州、ロチエスターのイーストマン・オーガ
ニツク・ケミカルズ（Eastman Organic
Chemicals）から入手した。 Ｂ 培地 MRS培地 ペプトン（Ｌ−34） 10.0ｇ／ ラブ・レムコ 粉末（Ｌ−29） 8.0ｇ／ 酵母エキス（オキソイド） 4.0ｇ／ グルコース 20.0ｇ／ トウイーン （Tween ）80界面活性剤
1.0ml／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 酢酸ナトリウム三水和物 5.0ｇ／ クエン酸三アンモニウム 2.0ｇ／ 硫酸マグネシウム七水和物 0.2ｇ／ 硫酸マンガン四水和物 0.05ｇ／ 寒天（オキソイド ） 20.0ｇ／ 稀硫酸でPHを6.2に調整した。 ジアセチン含有MRS培地 前記MRS培地 72.25ｇ／* ジアセチン（過滅菌） 2.0ml／* 塩溶液Ｃ（修正） 塩化ナトリウム（NaCl） 0.6ｇ／ 塩化カルシウム二水和物 0.1ｇ／ 硫酸第二鉄七水和物 2.8ｇ／ モリブデン酸ナトリウム二水和物 0.1ｇ／ 硫酸亜鉛七水和物 0.06ｇ／ 硫酸マンガン−水和物 1.7ｇ／ 硫酸マグネシウム七水和物 25.0ｇ／ ＊出発溶液は0.1N塩酸であつた。 酵母エキス培地 硫酸アンモニウム 2.0ｇ／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 酵母エキス（バクト） 5.0ｇ／ 塩溶液Ｃ（修正） 10.0ml／ 稀硫酸でPHを6.9に調整した。 ジアセチン含有酵母エキス培地 酵母エキス培地（前記） 9.0ｇ／ ジアセチン（過滅菌） 2.0ml／ ピリビン酸塩培地（PM） ピリビン酸ナトリウム 10.0ｇ／ 酵母エキス 5.0ｇ／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 塩溶液Ｃ（修正）（前記） 10.0ml／ 6N塩酸でPHを4.5に調整した。 Ｃ 手法 １ バチルス・ズブチリスの単離 前記ピルビン酸塩培地中で40℃で増菌すること
によつて、土壌サンプルから培養菌を単離した。
10個の凍結土壌サンプルを解凍した。ピルビン酸
塩培地25mlを含む容量125mlのフラスコに各約10
ｇの土壌サンプルを加えた。このフラスコを振盪
せずに40℃でインキユベートした。約３日の後
に、培地が濁つてきたら、各0.5mlをピルビン酸
塩培地10mlを含む試験管に移した。振盪せずに40
℃で数日間インキユベートした後、各試験管の培
養物を水で10：１に稀釈し、ピルビン酸塩培地及
びピルビン酸塩0.25％を加えたMRS培地上に板
状に広げ、次いで24〜48時間インキユーベートし
た。これらの培養物から、単離菌ATCCNo.31954
を選択した。 ２ 分類学上のデータ バチルス属の微生物の分類についての以下の文
献を、単離菌の同定のための指針として用いた：
R.E.ゴードン（Gordon）著、シーアールシー・
ハンドブツク・オブ・マイクロバイオロシー
（CRC Handbook of Microbiology），第巻，
71ページ，A.I.フアスキン（Faskin）及びH.A.
ライチエバリアー（Leichevalier）編，CRCプレ
ス（オハイ州，クリーブランド），1973年；及び
T.ギブスン（Gibson）及びR.E.ゴードン著，バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテ
イブ・バクテリオロジー（Bergy′s Manual of
Determinative Bacteriology），第８版，529ペ
ージ，R.E.ブチヤナン（Buchanan）及びN.E.ギ
ボンズ（Gibbons）編，ザ・ウイリアムス・アン
ド・ウイルキンス社（The Williams and
WilKins Co.）（メリーランド州，ボルチモア），
1974年。単離菌ATCCNo.1954の反応はバチルス・
ズブチリスの文献に記載された反応及び対照培養
菌バチルス・ズブチリス〔ワオーズ（Ward′s）
85WO228〕の反応に非常によく似ていた。 単離菌ATCCNo.31954は好気性、グラム陽性、
胞子形成性、運動性の桿菌で、大きさは２〜3μ
×0.5μであつた。この細胞の大部分は、MRS培
地で生育させた時に単個細胞であつた；ダブレツ
トと繊維細胞（長さ50μ）もわずかに存在した。
斜面培地上で生育した細胞は多くの胞子を生じ、
それらは中央に位置することが示された。これら
は形状が楕円状または円柱状であり、胞子嚢を膨
張させなかつた。コロニーの形態は多様であり、
円形、根状または不均整であつた。縁は全縁、波
状または裂片状であり、隆起は扁平であり、時に
は釦様であつた。表面は平滑であるかまたはしわ
があつた。コロニーの特徴は培地の組成によつて
変化した。 単離菌ATCCNo.31954は５℃では生育しなかつ
た。嫌気的条件下では、MRSプレート上で有意
な生育が見られなかつた。55℃ではピルビン酸塩
プレート及びMRSプレート上で生育したが、40
℃では生育しなかつた。単離菌と同様にして、バ
チルス・サブチリス〔ワーズ（Ward′s）
85WO228〕、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）（ワーズ85WO200）及びバチルス・メガ
テリウム（Bacillus megaterium）
（ATCC25300）の対照培養菌を評価した。単離菌
はバチルス・サブチリスの１菌株として同定され
た。 48時間ではアドニトール、ダルシトール、ガラ
クトース、ラクトース、レブロース、マルトー
ス、マンノース、ラフイノース、イノシトール、
トレハロース、ソルビトール、グルコース、セロ
ビオース、ラムノース、メリビオース及びスクロ
ースから酸は形成されなかつた。48時間後にキシ
ロースから除々に酸が形成された。 サリシン、アラビノース、マンニトール及びグ
リセロールからは酸は形成されたが、ガスは発生
しなかつた。この菌株をさらに次の試験によつて
特定した： オキシダーゼ 陽性 カタラーゼ 陽性 インドール 陰性 ｏ−ニトロフエノールガラクトシド 陽性 アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 リジンデカルボキシラーゼ 陰性 オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 クエン酸 陰性 H2S 陰性 尿素 陰性 フオーゲス−プロスカウエル （Voges−Proskauer）（VP） 陽性 フエニルアラニン 陰性 硝酸塩還元酵素 陽性 マロン酸塩 陰性 単離菌ATCCNo.31954はまた、ゼラチン及びエ
スクリンを加水分解した。この菌はジアセチン及
びチロシン上で生育し、澱粉を加水分解し、リト
マスミルクを還元せずにペプトン化した。また、
馬尿酸塩上では生育しなかつた。 ３ 培養菌の保存及び生長 培養菌はMRS培地上で保存した。MRS斜面培
地を回転式振盪機で40℃においてインキユーベー
トし、１週間毎に新しい培地に移した。 培養菌の生育は、前述の種々の培地50mlを容量
250mlのコニカルフラスコに入れ、前記MRS斜面
培地からの細胞を接種し、そしてサイクロサーム
（Psycrotherm）中で40℃において12時間、
200rpm（行程２インチ）でインキユーベートする
ことによつて行なつた。 ４ 微生物細胞の破壊及び細胞を含まない抽出物
の調製 微生物細胞を以下の手法に従つてリゾチーム処
理によつて破壊した：リゾチーム１mg／ml、デオ
キシリボヌクレアーゼ0.1mg／ml及びリボヌクレ
アーゼ0.1mg／mlをPH7.0の0.05M燐酸カリウム緩
衝液中に含む溶解試薬を調製した。培地6.6か
ら得た細胞の代表的なバツチは含水重量が50ｇで
あつた。この細胞ペーストを溶解試薬250mlに浮
遊せしめ（17％浮遊液）、37℃にし、そして
150rpmで回転する代謝振盪機中で同温度におい
て30分間インキユーベートした。冷却遠心機で
39000×ｇで10分間遠心分離することによつて、
細胞を含まない抽出物を調製した。 ５ 酵素の生産 酵母エキス培地７を前述のようにして調製し
た。各１の培地６フラクシヨンををフエルンバ
ツハフラスコに入れ、各々にポリグリコール消泡
剤を１滴加えた。各50.0mlの培地15フラクシヨン
を容量250mlのコニカルフラスコに入れた。たれ
ら全部を30分間、オートクレーブ処理した。フラ
スコを40℃に冷却し、滅菌したジアセチンをフエ
ルンバツハフラスコに各々2.0ml、コニカルフラ
スコに各々５滴加えた。 前記の２つのコニカルフラスコ各々にMRS斜
面培地（２〜３日経たもの）から１白金耳量のバ
チルス・サブチリスATCCNo.31954を接種した。
これらのフラスコを振盪機−インキユーベーター
中で40℃、200rpmで12時間インキユーベートし
た。 最も生育の良い、すなわち、最も濁つたフラス
コを残りのフラスコのうち12個の接種に用いた。
この12個のフラスコ各々に接種物2.0mlを接種し、
そして前述のようにしてインキユーベートした。
然る後に、前述の６個のフエルンバツハフラスコ
の各々に、残りのフラスコのうち２個で接種し、
次いでサイクロサーム中で40℃において12時間イ
ンキユベートした。 各フエルンバツハフラスコから１フラクシヨン
ずつを得て、１：10に稀釈した。各々の吸光度を
660nmで読み取つた。冷却遠心機で０〜４℃、
9000rpmで15分間遠心分離することによつて細胞
を回収し、次いで凍結保存した。 ６ 酵素の部分精製 微生物細胞の破壊を、前述のようにしてリゾチ
ーム処理によつて行なつた。溶解後、浮遊液の全
容量（初期容量）を測定した。浮遊液を10℃以下
になるまで氷浴中に撹拌した。次いで、15分間に
わたつて、細胞残屑を除去せずに、冷ｎ−プロパ
ノール（−20℃）を40％（Ｖ／Ｖ）の濃度まで加
える。最後の添加後、混合物を20分間撹拌し、次
いで５℃において10000rpmで10分間遠心分離し
た。（40％プロパノールフラクシヨンからの）ペ
レツトを除去し、そして透明な黄色上清を再び氷
浴中に置き、撹拌した。再び、15分間にわたつて
冷ｎ−プロパノールを濃度60％（Ｖ／Ｖ）まで加
えた。混合物を30分間撹拌し、次いで前述のよう
にして遠心分離した。（40〜60％プロパノールフ
ラクシヨンからの）小さな黄色ペレツトを回収
し、ビーカーに入れ、そして45分間撹拌しながら
PH7.0の冷（５℃）0.05M燐酸カリウム緩衝液中
に懸濁せしめた。濁つた懸濁液を５℃、39000×
ｇで10分間遠心分離して透明にした。この透明で
かすかに黄色い生成物を凍結保存した。 ７ 酵素の測定 酵素活性の測定をPH−スタツト （Stat ）計
測〔ラジオメーター（Radiometer），コペンハー
ゲン〕を用いて行なつた。標準反応混合物は全容
量5.0ml中に塩化カルシウム（1mM）５マイクロ
モル及び以下の実施例中に示した種々の濃度の基
質を含んでいた。PHを7.5に調整し、混合物を37
℃において平衡させた。酵素添加によつて反応を
開始させ、次いで10.4mM水酸化ナトリウムの添
加によつてPHを7.5に保存した。空試験速度を測
定し、水酸化ナトリウムの正味の直線的な添加速
度から各場合の加水分解活性を求めた。１単位
は、37℃、PH7.5において毎分１マイクロモルの
酸の生成（NaOH1マイクロモル添加）を触媒す
る酵素の量であるように決められた。 実施例 本発明をさらに説明するために以下の実施例を
示す。 例１：各種培地を用いた微生物の生長とエステラ
ーゼの生成 Ａ 酵母エキス培地 バチルス・ズブチリスATCCNo.31954を培地(a)
酵母エキス及び培地(b)ジアセチン含有酵母エキス
（両者とも前記）中で次の手法で生育させた： 培地(b)50mlにMRS斜面培地からの１白金耳量
のバチルス培養菌を接種し、40℃、200rpmで12
時間振盪機−インキユベーター中でインキユベー
トした。この12時間培養ブロス２mlを用いて、培
地(a)を50ml含むコニカルフラスコと培地(b)を50ml
含むコニカルフラスコに接種した。これららのフ
ラスコを前述と同様にしてインキユベートした。 微生物細胞を、ソルブオール （Sorvall ）
RC−2B冷却遠心機を用いて０−４℃、9000rpm
で20分間遠心分離することによつて単離した。 Ｂ MRS培地 前記Ａの手法を繰り返した。ただし、培養菌は
培地(c)MRS及び培地(d)ジアセチン含有MRS中で
生育させた。 酵素精製及びアツセイを前述のようにして行な
つた。第１表の結果は、培地(c)の場合に全生長及
び酵素生成が最良だつたことを示している。
媒する酵素に関する。このタイプの酵素は当業界
ではエステラーゼまたはさらに詳細には、グリセ
ロールエステルヒドロラーゼと称される。この酵
素はリパーゼの定量に有用である。 リパーゼの定量分析方法において、その第１工
程はグリセロールトリエステルのα位の長鎖エス
テルの、サンプル中リパーゼによる加水分解を触
媒することにある。基質は生成するジエステル上
のアルキル基が短鎖アルキル基であるようなもの
である。この方法の次の工程では、短鎖アルキル
基が加水分解されてグリセロールを生成する。グ
リセロールの形成速度が検知され、これはサンプ
ル中のリパーゼに相関する。 短鎖アルキル基の加水分解は短鎖アルキル基に
特異的なエステラーゼ酵素によつて触媒される。
これらのエステラーゼ酵素の多くは公知であり、
前記方法の実施に有用である。 従来技術 バチルス・サブチリス（Bacillus subtilia）由
来のエステラーゼ酵素は知られている。たとえ
ば、ハイガード（Higerd）及びスパイジゼン
（Spizizen）はこれらの酵素のうち２種について
述べている〔「バチルス・サブチリスの抽出物か
らの２種のアセチルエステラーゼの単離
（Isolation of Two Acetyl Esterases from
Extracts of Bacillus subtilis）」，J.of
Bacteriology，第114巻，1184〜1192ページ
（1973年）〕。この文献に記載されている菌株から
生産される酵素量は所望とされる量よりも少ない
（比較例７参照）。さらに、本発明の酵素と比較し
たこれらの酵素のゲル電気泳動は、本発明の酵素
が前記文献に開示された酵素のいずれとも異なる
ことを決定的に示している。電気泳動実験につい
ての詳細は本明細書の比較例８に記載した。 従つて、従来技術の酵素によれば触媒反応の速
度は遅い。さらに、多くの公知エステラーゼ酵素
には所望とされる特異性がない。たとえば、リパ
ーゼ基質と接触させて長期間貯蔵した場合、これ
らの従来技術の酵素の多くは基質のα位の長鎖ア
ルキル基の加水分解を触媒する。出発基質の多く
がこの機構によつて使い果たされてしまうため、
このことが方法の感度に重大な影響を与えること
は言うまでもない。特異性が高く、しかも活性が
高い新しい酵素が望まれている。さらに、大量の
酵素を生産する微生物を見い出すことが望まれて
いる。 発明の概要 本発明に従えば、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCCNo.31954から単離さ
れ、短鎖エステルに対する基質特異性を有し、至
適PHが7.0〜9.0であるグリセロールエステルの加
水分解用グリセロールエステルヒドロラーゼ酵素
が提供される。 本発明は従来の酵素工学の欠陥を考慮してなさ
れたものであり、その目的は短鎖アルキル基に対
して特異性が高く且つ反応を速かに触媒する酵素
を提供することにある。 グリセロールエステルの加水分解を触媒し、１
個または複数のアルキル基の炭素数が１〜４であ
るアルキルエステルに特異的な本発明の酵素は、
微生物バトルス・ズブチリスATCCNo.31954から
単離される。 アルキル基の炭素数が１〜４のグリセロールエ
ステルの加水分解を触媒する酵素の生産方法は次
の工程(a)及び(b)を含んでなる： (a) 微生物バチルス・ズブチリスATCCNo.31954
を生育培地中で生育せしめ、そして (b) この培養物から酵素を回収する。 この酵素は特にリパーゼ検出アツセイにおいて
ジエステラーゼとして有用である。 本発明の酵素を生産する微生物はバチルス・ズ
ブチリスの１菌株である。この菌株はニユーヨー
ク州、ロチエスターの近くで得た土壌試料から単
離された。単離された菌株のサンプルは、アメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託
し、受託番号ATCCNo.31954が与えられた。この
サンプルはブダペスト条約の規定に従つて寄託し
た。 ジエステラーゼを回収する微生物は好ましく
は、当業界においてMRS培地として知られた培
地上で生育させる。この培地はドマン
（DeMann）らにより述べられている〔「乳酸桿菌
培養用培地（Ａ Medium for the Cultivation
of Lactobacilli）」，J.App.Bact.，23(1)，130〜
135〕。 発酵後、公知酵素回収法を用いて生育培地から
ジエステラーゼを回収する。酵素は細胞内酵素で
ある。一般に、酵素は、細胞を破壊し、次いで、
好ましくはｎ−プロパノールのような有機溶媒で
の沈澱によつて酵素を回収することによつて回収
される。有用な方法は米国特許第3597323号、同
第4087329号、同第4134793号及び同第4275166号
に記載されている。 実施例においては、以下の材料及び手法を用い
た： Ａ 材料 卵白リゾチーム、牛膵臓からデオキシリボヌク
レアーゼ（DN−100）、牛膵臓からのリボヌクレ
アーゼＡ（Type1−Ａ）、トリオレイン及びアラビ
アゴムはミズリー州セントルイスのシグマ・ケミ
カル社（Sigma Chemical Co.）から購入した。
バクト （Bacto ）酵母エキスはミシガン州デ
トロイトのデイフコ・ラブス（Difco Labs）か
ら入手した。ドマン（Demann）、ラゴツサ
（Ragossa）及びシヤープ（Sharpe）（MRS）ブ
ロス（CM359）、酵母エキス、ラブ・レムコ
（Lab Lemco ）粉末（Ｌ−29）（肉エキス普通
ブロス）、ペプトン（Ｌ−34）及びオキソイド寒
天 （Oxoid agar ）はカナダ国、オンタ
リオ州、オタワのオキソイド・カナダ社（Oxoid
Canada Ltd.）から購入した。ポリグリコール
（Polyglycol）（Ｐ−2000） はミシガン州、ミツ
ドランドのダウ・ケミカル社（Dow Chemical
Co.）から入手した。ジアセチン、グルコース及
び他の化学薬品は特に断わりのない限り、ニユー
ヨーク州、ロチエスターのイーストマン・オーガ
ニツク・ケミカルズ（Eastman Organic
Chemicals）から入手した。 Ｂ 培地 MRS培地 ペプトン（Ｌ−34） 10.0ｇ／ ラブ・レムコ 粉末（Ｌ−29） 8.0ｇ／ 酵母エキス（オキソイド） 4.0ｇ／ グルコース 20.0ｇ／ トウイーン （Tween ）80界面活性剤
1.0ml／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 酢酸ナトリウム三水和物 5.0ｇ／ クエン酸三アンモニウム 2.0ｇ／ 硫酸マグネシウム七水和物 0.2ｇ／ 硫酸マンガン四水和物 0.05ｇ／ 寒天（オキソイド ） 20.0ｇ／ 稀硫酸でPHを6.2に調整した。 ジアセチン含有MRS培地 前記MRS培地 72.25ｇ／* ジアセチン（過滅菌） 2.0ml／* 塩溶液Ｃ（修正） 塩化ナトリウム（NaCl） 0.6ｇ／ 塩化カルシウム二水和物 0.1ｇ／ 硫酸第二鉄七水和物 2.8ｇ／ モリブデン酸ナトリウム二水和物 0.1ｇ／ 硫酸亜鉛七水和物 0.06ｇ／ 硫酸マンガン−水和物 1.7ｇ／ 硫酸マグネシウム七水和物 25.0ｇ／ ＊出発溶液は0.1N塩酸であつた。 酵母エキス培地 硫酸アンモニウム 2.0ｇ／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 酵母エキス（バクト） 5.0ｇ／ 塩溶液Ｃ（修正） 10.0ml／ 稀硫酸でPHを6.9に調整した。 ジアセチン含有酵母エキス培地 酵母エキス培地（前記） 9.0ｇ／ ジアセチン（過滅菌） 2.0ml／ ピリビン酸塩培地（PM） ピリビン酸ナトリウム 10.0ｇ／ 酵母エキス 5.0ｇ／ 燐酸水素二カリウム（K2HPO4） 2.0ｇ／ 塩溶液Ｃ（修正）（前記） 10.0ml／ 6N塩酸でPHを4.5に調整した。 Ｃ 手法 １ バチルス・ズブチリスの単離 前記ピルビン酸塩培地中で40℃で増菌すること
によつて、土壌サンプルから培養菌を単離した。
10個の凍結土壌サンプルを解凍した。ピルビン酸
塩培地25mlを含む容量125mlのフラスコに各約10
ｇの土壌サンプルを加えた。このフラスコを振盪
せずに40℃でインキユベートした。約３日の後
に、培地が濁つてきたら、各0.5mlをピルビン酸
塩培地10mlを含む試験管に移した。振盪せずに40
℃で数日間インキユベートした後、各試験管の培
養物を水で10：１に稀釈し、ピルビン酸塩培地及
びピルビン酸塩0.25％を加えたMRS培地上に板
状に広げ、次いで24〜48時間インキユーベートし
た。これらの培養物から、単離菌ATCCNo.31954
を選択した。 ２ 分類学上のデータ バチルス属の微生物の分類についての以下の文
献を、単離菌の同定のための指針として用いた：
R.E.ゴードン（Gordon）著、シーアールシー・
ハンドブツク・オブ・マイクロバイオロシー
（CRC Handbook of Microbiology），第巻，
71ページ，A.I.フアスキン（Faskin）及びH.A.
ライチエバリアー（Leichevalier）編，CRCプレ
ス（オハイ州，クリーブランド），1973年；及び
T.ギブスン（Gibson）及びR.E.ゴードン著，バ
ージーズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテ
イブ・バクテリオロジー（Bergy′s Manual of
Determinative Bacteriology），第８版，529ペ
ージ，R.E.ブチヤナン（Buchanan）及びN.E.ギ
ボンズ（Gibbons）編，ザ・ウイリアムス・アン
ド・ウイルキンス社（The Williams and
WilKins Co.）（メリーランド州，ボルチモア），
1974年。単離菌ATCCNo.1954の反応はバチルス・
ズブチリスの文献に記載された反応及び対照培養
菌バチルス・ズブチリス〔ワオーズ（Ward′s）
85WO228〕の反応に非常によく似ていた。 単離菌ATCCNo.31954は好気性、グラム陽性、
胞子形成性、運動性の桿菌で、大きさは２〜3μ
×0.5μであつた。この細胞の大部分は、MRS培
地で生育させた時に単個細胞であつた；ダブレツ
トと繊維細胞（長さ50μ）もわずかに存在した。
斜面培地上で生育した細胞は多くの胞子を生じ、
それらは中央に位置することが示された。これら
は形状が楕円状または円柱状であり、胞子嚢を膨
張させなかつた。コロニーの形態は多様であり、
円形、根状または不均整であつた。縁は全縁、波
状または裂片状であり、隆起は扁平であり、時に
は釦様であつた。表面は平滑であるかまたはしわ
があつた。コロニーの特徴は培地の組成によつて
変化した。 単離菌ATCCNo.31954は５℃では生育しなかつ
た。嫌気的条件下では、MRSプレート上で有意
な生育が見られなかつた。55℃ではピルビン酸塩
プレート及びMRSプレート上で生育したが、40
℃では生育しなかつた。単離菌と同様にして、バ
チルス・サブチリス〔ワーズ（Ward′s）
85WO228〕、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）（ワーズ85WO200）及びバチルス・メガ
テリウム（Bacillus megaterium）
（ATCC25300）の対照培養菌を評価した。単離菌
はバチルス・サブチリスの１菌株として同定され
た。 48時間ではアドニトール、ダルシトール、ガラ
クトース、ラクトース、レブロース、マルトー
ス、マンノース、ラフイノース、イノシトール、
トレハロース、ソルビトール、グルコース、セロ
ビオース、ラムノース、メリビオース及びスクロ
ースから酸は形成されなかつた。48時間後にキシ
ロースから除々に酸が形成された。 サリシン、アラビノース、マンニトール及びグ
リセロールからは酸は形成されたが、ガスは発生
しなかつた。この菌株をさらに次の試験によつて
特定した： オキシダーゼ 陽性 カタラーゼ 陽性 インドール 陰性 ｏ−ニトロフエノールガラクトシド 陽性 アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 リジンデカルボキシラーゼ 陰性 オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 クエン酸 陰性 H2S 陰性 尿素 陰性 フオーゲス−プロスカウエル （Voges−Proskauer）（VP） 陽性 フエニルアラニン 陰性 硝酸塩還元酵素 陽性 マロン酸塩 陰性 単離菌ATCCNo.31954はまた、ゼラチン及びエ
スクリンを加水分解した。この菌はジアセチン及
びチロシン上で生育し、澱粉を加水分解し、リト
マスミルクを還元せずにペプトン化した。また、
馬尿酸塩上では生育しなかつた。 ３ 培養菌の保存及び生長 培養菌はMRS培地上で保存した。MRS斜面培
地を回転式振盪機で40℃においてインキユーベー
トし、１週間毎に新しい培地に移した。 培養菌の生育は、前述の種々の培地50mlを容量
250mlのコニカルフラスコに入れ、前記MRS斜面
培地からの細胞を接種し、そしてサイクロサーム
（Psycrotherm）中で40℃において12時間、
200rpm（行程２インチ）でインキユーベートする
ことによつて行なつた。 ４ 微生物細胞の破壊及び細胞を含まない抽出物
の調製 微生物細胞を以下の手法に従つてリゾチーム処
理によつて破壊した：リゾチーム１mg／ml、デオ
キシリボヌクレアーゼ0.1mg／ml及びリボヌクレ
アーゼ0.1mg／mlをPH7.0の0.05M燐酸カリウム緩
衝液中に含む溶解試薬を調製した。培地6.6か
ら得た細胞の代表的なバツチは含水重量が50ｇで
あつた。この細胞ペーストを溶解試薬250mlに浮
遊せしめ（17％浮遊液）、37℃にし、そして
150rpmで回転する代謝振盪機中で同温度におい
て30分間インキユーベートした。冷却遠心機で
39000×ｇで10分間遠心分離することによつて、
細胞を含まない抽出物を調製した。 ５ 酵素の生産 酵母エキス培地７を前述のようにして調製し
た。各１の培地６フラクシヨンををフエルンバ
ツハフラスコに入れ、各々にポリグリコール消泡
剤を１滴加えた。各50.0mlの培地15フラクシヨン
を容量250mlのコニカルフラスコに入れた。たれ
ら全部を30分間、オートクレーブ処理した。フラ
スコを40℃に冷却し、滅菌したジアセチンをフエ
ルンバツハフラスコに各々2.0ml、コニカルフラ
スコに各々５滴加えた。 前記の２つのコニカルフラスコ各々にMRS斜
面培地（２〜３日経たもの）から１白金耳量のバ
チルス・サブチリスATCCNo.31954を接種した。
これらのフラスコを振盪機−インキユーベーター
中で40℃、200rpmで12時間インキユーベートし
た。 最も生育の良い、すなわち、最も濁つたフラス
コを残りのフラスコのうち12個の接種に用いた。
この12個のフラスコ各々に接種物2.0mlを接種し、
そして前述のようにしてインキユーベートした。
然る後に、前述の６個のフエルンバツハフラスコ
の各々に、残りのフラスコのうち２個で接種し、
次いでサイクロサーム中で40℃において12時間イ
ンキユベートした。 各フエルンバツハフラスコから１フラクシヨン
ずつを得て、１：10に稀釈した。各々の吸光度を
660nmで読み取つた。冷却遠心機で０〜４℃、
9000rpmで15分間遠心分離することによつて細胞
を回収し、次いで凍結保存した。 ６ 酵素の部分精製 微生物細胞の破壊を、前述のようにしてリゾチ
ーム処理によつて行なつた。溶解後、浮遊液の全
容量（初期容量）を測定した。浮遊液を10℃以下
になるまで氷浴中に撹拌した。次いで、15分間に
わたつて、細胞残屑を除去せずに、冷ｎ−プロパ
ノール（−20℃）を40％（Ｖ／Ｖ）の濃度まで加
える。最後の添加後、混合物を20分間撹拌し、次
いで５℃において10000rpmで10分間遠心分離し
た。（40％プロパノールフラクシヨンからの）ペ
レツトを除去し、そして透明な黄色上清を再び氷
浴中に置き、撹拌した。再び、15分間にわたつて
冷ｎ−プロパノールを濃度60％（Ｖ／Ｖ）まで加
えた。混合物を30分間撹拌し、次いで前述のよう
にして遠心分離した。（40〜60％プロパノールフ
ラクシヨンからの）小さな黄色ペレツトを回収
し、ビーカーに入れ、そして45分間撹拌しながら
PH7.0の冷（５℃）0.05M燐酸カリウム緩衝液中
に懸濁せしめた。濁つた懸濁液を５℃、39000×
ｇで10分間遠心分離して透明にした。この透明で
かすかに黄色い生成物を凍結保存した。 ７ 酵素の測定 酵素活性の測定をPH−スタツト （Stat ）計
測〔ラジオメーター（Radiometer），コペンハー
ゲン〕を用いて行なつた。標準反応混合物は全容
量5.0ml中に塩化カルシウム（1mM）５マイクロ
モル及び以下の実施例中に示した種々の濃度の基
質を含んでいた。PHを7.5に調整し、混合物を37
℃において平衡させた。酵素添加によつて反応を
開始させ、次いで10.4mM水酸化ナトリウムの添
加によつてPHを7.5に保存した。空試験速度を測
定し、水酸化ナトリウムの正味の直線的な添加速
度から各場合の加水分解活性を求めた。１単位
は、37℃、PH7.5において毎分１マイクロモルの
酸の生成（NaOH1マイクロモル添加）を触媒す
る酵素の量であるように決められた。 実施例 本発明をさらに説明するために以下の実施例を
示す。 例１：各種培地を用いた微生物の生長とエステラ
ーゼの生成 Ａ 酵母エキス培地 バチルス・ズブチリスATCCNo.31954を培地(a)
酵母エキス及び培地(b)ジアセチン含有酵母エキス
（両者とも前記）中で次の手法で生育させた： 培地(b)50mlにMRS斜面培地からの１白金耳量
のバチルス培養菌を接種し、40℃、200rpmで12
時間振盪機−インキユベーター中でインキユベー
トした。この12時間培養ブロス２mlを用いて、培
地(a)を50ml含むコニカルフラスコと培地(b)を50ml
含むコニカルフラスコに接種した。これららのフ
ラスコを前述と同様にしてインキユベートした。 微生物細胞を、ソルブオール （Sorvall ）
RC−2B冷却遠心機を用いて０−４℃、9000rpm
で20分間遠心分離することによつて単離した。 Ｂ MRS培地 前記Ａの手法を繰り返した。ただし、培養菌は
培地(c)MRS及び培地(d)ジアセチン含有MRS中で
生育させた。 酵素精製及びアツセイを前述のようにして行な
つた。第１表の結果は、培地(c)の場合に全生長及
び酵素生成が最良だつたことを示している。
【表】
セチン
(c)MRS 8.4 657 78.0
(d)MRS＋ジアセチン 5.6 371 68.0
例２：良好なMRS培地を用いた細胞生育及びエ
ステラーゼ生成の速度論研究 MRS培地上における最大細胞生育及びエステ
ラーゼ生産のためのインキユベーシヨン時間を以
下の手法で求めた：培地50mlを容量250mlのコニ
カルフラスコに入れ、１白金耳量のバチルス・ズ
ブチリスATCCNo.31954を接種した。培養菌を振
盪機−インキユベーター中、40℃、200rpmで12
時間、インキユベートした。この培養物２mlを用
いて、培地50mlを含む容量250mlの別の８個のコ
ニカルフラスコ各々に接種し、次いで、前述と同
様にしてインキユベートした。培地１及びＰ−
2000 消泡剤１滴を含む４個のフエルンバツハフ
ラスコ各々に２個の250mlコニカルフラスコ中の
前記培養物を接種した。フエルンバツハフラスコ
を振盪機−インキユベーター中、40℃、150rpm
でインキユベートした。第２表に示した時間に、
遠心機中、０〜４℃、9000rpmで20分間遠心分離
することによつて培養菌を回収した。 前述と同様にして部分精製を行なつた。第２表
に示されるように、インキユベーシヨン時間が11
時間の場合にMRS培地中で最良の細胞生育及び
エステラーゼ生産が見られた。
(c)MRS 8.4 657 78.0
(d)MRS＋ジアセチン 5.6 371 68.0
例２：良好なMRS培地を用いた細胞生育及びエ
ステラーゼ生成の速度論研究 MRS培地上における最大細胞生育及びエステ
ラーゼ生産のためのインキユベーシヨン時間を以
下の手法で求めた：培地50mlを容量250mlのコニ
カルフラスコに入れ、１白金耳量のバチルス・ズ
ブチリスATCCNo.31954を接種した。培養菌を振
盪機−インキユベーター中、40℃、200rpmで12
時間、インキユベートした。この培養物２mlを用
いて、培地50mlを含む容量250mlの別の８個のコ
ニカルフラスコ各々に接種し、次いで、前述と同
様にしてインキユベートした。培地１及びＰ−
2000 消泡剤１滴を含む４個のフエルンバツハフ
ラスコ各々に２個の250mlコニカルフラスコ中の
前記培養物を接種した。フエルンバツハフラスコ
を振盪機−インキユベーター中、40℃、150rpm
でインキユベートした。第２表に示した時間に、
遠心機中、０〜４℃、9000rpmで20分間遠心分離
することによつて培養菌を回収した。 前述と同様にして部分精製を行なつた。第２表
に示されるように、インキユベーシヨン時間が11
時間の場合にMRS培地中で最良の細胞生育及び
エステラーゼ生産が見られた。
【表】
くなつた。
例３：ジアセチン含有培地からの微生物エステラ
ーゼの部分精製 微生物エステラーゼの部分精製を、前述のプロ
パノール分別法を用いて行なつた。ジアセチン含
有酵母エキス培地6.6中で細菌細胞（53.5ｇ）
を培養した。0.05M燐酸カリウム緩衝液50mlを用
いてエステラーゼペレツトを懸濁せしめ、この懸
濁液を遠心分離して精製酵素を単離した。 第３表の結果は、数種の異なる標品からの収率
が63〜72％であることを示している。
例３：ジアセチン含有培地からの微生物エステラ
ーゼの部分精製 微生物エステラーゼの部分精製を、前述のプロ
パノール分別法を用いて行なつた。ジアセチン含
有酵母エキス培地6.6中で細菌細胞（53.5ｇ）
を培養した。0.05M燐酸カリウム緩衝液50mlを用
いてエステラーゼペレツトを懸濁せしめ、この懸
濁液を遠心分離して精製酵素を単離した。 第３表の結果は、数種の異なる標品からの収率
が63〜72％であることを示している。
【表】
例４：酵素の最適PH
6.0〜9.0の範囲の種々のPH値において前述のよ
うにして酵素活性を測定した。基質乳液はトリア
セチン（25mM）及びトリブチリン（16.5mM）
を用いて調製した。PHプロフイルは同様であり、
最適PHは7.0〜9.0と広い範囲であつた。 例４： 微生物エステラーゼの基質特異性 エステラーゼの基質特異性を測定するために、
第４表に示した濃度の種々の鎖長のトリグリセリ
ド基質を調製して、評価した。 第４表の結果は、脂質鎖長が増加すると加水分
解速度が驚異的に減少する、すなわち、活性が減
少することを証明し、微生物酵素が短鎖エステル
に特異的であることを実証した。
うにして酵素活性を測定した。基質乳液はトリア
セチン（25mM）及びトリブチリン（16.5mM）
を用いて調製した。PHプロフイルは同様であり、
最適PHは7.0〜9.0と広い範囲であつた。 例４： 微生物エステラーゼの基質特異性 エステラーゼの基質特異性を測定するために、
第４表に示した濃度の種々の鎖長のトリグリセリ
ド基質を調製して、評価した。 第４表の結果は、脂質鎖長が増加すると加水分
解速度が驚異的に減少する、すなわち、活性が減
少することを証明し、微生物酵素が短鎖エステル
に特異的であることを実証した。
【表】
例６：ジアセチナーゼの基質親和性
グリセロールの短鎖脂肪酸エステルに対するジ
アセチナーゼの親和性を測定するために、以下の
アセチンを基質として用いて酵素活性を測定し
た：トリアセチン、ジアセチン及びモノアセチ
ン。 酵素活性を基質濃度に対してプロツトすると各
基質について標準双曲線が得られた。基質モル濃
度に基づき、トリアセチンで最も高い基質親和性
を観測した。しかしながら、各基質について加水
分解されたエステル結合の濃度に対してKm値を
規格化した後、第５表に示されるように、親和性
はより類似していた。
アセチナーゼの親和性を測定するために、以下の
アセチンを基質として用いて酵素活性を測定し
た：トリアセチン、ジアセチン及びモノアセチ
ン。 酵素活性を基質濃度に対してプロツトすると各
基質について標準双曲線が得られた。基質モル濃
度に基づき、トリアセチンで最も高い基質親和性
を観測した。しかしながら、各基質について加水
分解されたエステル結合の濃度に対してKm値を
規格化した後、第５表に示されるように、親和性
はより類似していた。
【表】
比較例７：MRS培地におけるバチルス・サブチ
リス168（ハイガード）の生長及びエステラ
ーゼの生産 Ａ T.B.ハイガード（Higerd）らによつて単離
された微生物バチルス・ズブチリス168〔T.B.
ハイガード及びJ.スパイジゼン（Spizizen）
著、「バチルス・ズブチリスの抽出物からの２
種のアセチルエステラーゼの単離（Isolation
of Two Acetyl Esterases from Extracts of
Bacillus subtilis）」、Journal of
Bacteriology、第114巻、1184〜1192ページ、
1972年〕を前述と同様にしてMRS培地上で生
育せしめ、エステラーゼの収量を、土壌バチル
ス・ズブチリス（ATCCNo.31954）を同培地上
で生育せしめた時に得られるエステラーゼの収
量と比較した。前記の生育法、酵素生産法及び
精製法に従つた。 下記第６表に示した結果は、168菌株に比較し
てバチルス・ズブチリス（ATCCNo.31954）から
のエステラーゼの収量は29倍増加することを証明
している。
リス168（ハイガード）の生長及びエステラ
ーゼの生産 Ａ T.B.ハイガード（Higerd）らによつて単離
された微生物バチルス・ズブチリス168〔T.B.
ハイガード及びJ.スパイジゼン（Spizizen）
著、「バチルス・ズブチリスの抽出物からの２
種のアセチルエステラーゼの単離（Isolation
of Two Acetyl Esterases from Extracts of
Bacillus subtilis）」、Journal of
Bacteriology、第114巻、1184〜1192ページ、
1972年〕を前述と同様にしてMRS培地上で生
育せしめ、エステラーゼの収量を、土壌バチル
ス・ズブチリス（ATCCNo.31954）を同培地上
で生育せしめた時に得られるエステラーゼの収
量と比較した。前記の生育法、酵素生産法及び
精製法に従つた。 下記第６表に示した結果は、168菌株に比較し
てバチルス・ズブチリス（ATCCNo.31954）から
のエステラーゼの収量は29倍増加することを証明
している。
【表】
Ｂ 前記Ａの手法を繰り返した。ただし、培養菌
はMRS培地中で25℃において生育させた。下
記第７表の結果は、バチルス・ズブチリス
（ATCCNo.31954）を用いると酵素の収量が14倍
増加することを示している。これらの結果はま
た、40℃に比較して25℃における酵素の全収量
が驚異的に増加することを証明している。
はMRS培地中で25℃において生育させた。下
記第７表の結果は、バチルス・ズブチリス
（ATCCNo.31954）を用いると酵素の収量が14倍
増加することを示している。これらの結果はま
た、40℃に比較して25℃における酵素の全収量
が驚異的に増加することを証明している。
【表】
比較例８：バチルス・ズブチリスの２菌株を区別
する電気泳動像 ヘンドリツク（Hendrick）及びスミス
（Smith）によつて開発された方法（Archives of
Biochemistry and Biophysics、126巻、155ペー
ジ、1968年）を用いて得られたバチルス・ズブチ
リス168及びバチルス・ズブチリス（ATCCNo.
31954）からのエステラーゼ酵素の電気泳動像を
比較した。７％のゼラチンを含んでなる電気泳動
プレートに酵素サンプルを塗布し、電気泳動完了
後に、例７に引用したハイガード及びスパイジゼ
ンの方法を用いてエステラーゼ活性に関して染色
した。 バチルス・ズブチリス（ATCCNo.31954）から
の部分精製抽出物においては２つのエステラーゼ
活性帯が見られた。しかしながら、バチルス・ズ
ブチリス168菌株からの抽出物の場合にはエステ
ラーゼ活性帯は１つしかなかつた。これら２菌株
からの抽出物を合わせてゼラチンに塗布すると３
種の異なる活性帯が得られ、これら２菌株からの
酵素ははつきりと区別された。 本発明によれば、前に説明したように、バチル
ス・ズブチリスATCCNo.31954から単離され、グ
リセロールエステルの加水分解を触媒し且つ１個
または複数個のアルキル基の炭素数が１〜４のア
ルキルエステルに特異的な酵素が、迅速で特異性
の高いリパーゼ定量に有用である。
する電気泳動像 ヘンドリツク（Hendrick）及びスミス
（Smith）によつて開発された方法（Archives of
Biochemistry and Biophysics、126巻、155ペー
ジ、1968年）を用いて得られたバチルス・ズブチ
リス168及びバチルス・ズブチリス（ATCCNo.
31954）からのエステラーゼ酵素の電気泳動像を
比較した。７％のゼラチンを含んでなる電気泳動
プレートに酵素サンプルを塗布し、電気泳動完了
後に、例７に引用したハイガード及びスパイジゼ
ンの方法を用いてエステラーゼ活性に関して染色
した。 バチルス・ズブチリス（ATCCNo.31954）から
の部分精製抽出物においては２つのエステラーゼ
活性帯が見られた。しかしながら、バチルス・ズ
ブチリス168菌株からの抽出物の場合にはエステ
ラーゼ活性帯は１つしかなかつた。これら２菌株
からの抽出物を合わせてゼラチンに塗布すると３
種の異なる活性帯が得られ、これら２菌株からの
酵素ははつきりと区別された。 本発明によれば、前に説明したように、バチル
ス・ズブチリスATCCNo.31954から単離され、グ
リセロールエステルの加水分解を触媒し且つ１個
または複数個のアルキル基の炭素数が１〜４のア
ルキルエステルに特異的な酵素が、迅速で特異性
の高いリパーゼ定量に有用である。
Claims (1)
- １ バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）
ATCCNo.31954から単離され、短鎖エステルに対
する基質特異性を有し、至適PHが7.0〜9.0である
グリセロールエステルの加水分解用グリセロール
エステルヒドロラーゼ酵素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/407,213 US4444886A (en) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | Diacetinase from Bacillus subtilis |
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