JPH05252980A - Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体 - Google Patents

Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体

Info

Publication number
JPH05252980A
JPH05252980A JP19214691A JP19214691A JPH05252980A JP H05252980 A JPH05252980 A JP H05252980A JP 19214691 A JP19214691 A JP 19214691A JP 19214691 A JP19214691 A JP 19214691A JP H05252980 A JPH05252980 A JP H05252980A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
monoclonal antibody
thy
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP19214691A
Other languages
English (en)
Inventor
Koji Nishimura
村 孝 司 西
Sonoko Kakio
生 園 子 垣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to JP19214691A priority Critical patent/JPH05252980A/ja
Publication of JPH05252980A publication Critical patent/JPH05252980A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞障害性Ｔリンパ球による細胞障害などの
Ｔ細胞の機能を阻害でき、Ｔ細胞上のＴｈｙ−１分子の
機能を研究するのに有用なモノクローナル抗体を提供す
ることを目的とする。 【構成】 本発明のモノクローナル抗体は、Ｔｈｙ−１
分子と細胞骨格タンパク質とを認識し、かつＴ細胞の機
能を阻害する作用を有するものであることを構成とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｔｈｙ−１分子と細胞
骨格タンパク質とを認識し、かつＴ細胞の機能を阻害す
る作用を有するモノクローナル抗体に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】細胞同士のインターラクションは、リン
パ球の分化や生育、エフェクター細胞の機能、リンパ球
のホーミング、炎症等の種々の免疫反応において必須で
ある。たとえば、Ｔ細胞の抗原特異的な反応性は、Ｔ細
胞レセプター−ＣＤ３複合体経由の標的細胞あるいは抗
原提示細胞とＴ細胞とのインターラクションが引金とな
っている。最近、ＣＤ４、ＣＤ８、ＬＦＡ−１、ＣＤ
２、ＬＦＡ−３等の補助分子の大部分が免疫グロブリン
かインテグリンのいずれかのスーパーファミリーに属
し、これらの補助分子が細胞のインターラクションにお
いて重要な役割を担っていることが明らかにされた。こ
れらの報告によれば、Ｔ細胞上の補助分子と他の細胞上
の対応するリガンド分子とが相互に作用し合って免疫的
インターラクションを促進して細胞同士の接着を強化し
ているのではないか、と考えられる。
【０００３】ところで、Ｔｈｙ−１分子は、主にマウス
のＴ細胞や脳組織で発現されるアロ抗原として同定され
たものであるが、現在ではこの分子も基本的には免疫グ
ロブリンのスーパーファミリーに属すると考えられてい
る。Williamsは、Ｔｈｙ−１の分子構造から、Ｔｈｙ−
１分子が細胞のインターラクションに直接的に関与して
いる可能性を示唆している（Nature, 314,579(1985)
）。また一方、Ｔｈｙ−１分子に対するモノクローナ
ル抗体がＴ細胞の増殖を引き起こすという事実から、Ｔ
ｈｙ−１分子が信号伝達分子として重要な役割を演じて
いるであろうことが従来既に支持されている。さらに、
Ｔｈｙ−１分子に対する抗体が、赤血球細胞とマウスの
Ｔ細胞とによるロゼット形成を阻害するという事実も、
Ｔｈｙ−１分子が細胞のインターラクションにおいて重
要な役割を果たしているであろうことを強く示唆してい
る。しかし、Ｔｈｙ−１分子がＴ細胞の免疫制御的なイ
ンターラクションに関与しているという直接的な証拠は
未だに報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のようなＴｈｙ−
１分子の機能を研究するための試薬として、Ｔｈｙ−１
分子に対するモノクローナル抗体（抗Ｔｈｙ−１．１抗
体および抗Ｔｈｙ−１．２抗体）が作製されて既に市販
されている。本発明者らの実験によれば、これらの市販
の抗体は、細胞障害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lympho
cyte：ＣＴＬ）による細胞障害などのＴ細胞の機能を阻
害できず、よって、これら市販の抗体はＴ細胞上のＴｈ
ｙ−１分子の機能を研究する試薬としては充分適当なも
のであるとは言い難い。また、Ｔｈｙ−１．１分子とビ
メンチン分子とに交差反応性を示す抗体、およびＴｈｙ
−１．２分子とアクチン分子とに交差反応性を示す抗体
も知られているが、このような抗体がＴ細胞の機能を阻
害できるか否かは全く検討されていない。
【０００５】よって、本発明の目的は、Ｔ細胞の機能を
阻害でき、Ｔ細胞上のＴｈｙ−１分子を研究するのに有
用なモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成すべく研
究を重ねた結果、本発明者らは、Ｔｈｙ−１分子と細胞
骨格タンパク質、特にアクチン分子、とを共に認識しう
る抗体が上記目的に適ったモノクローナル抗体であるこ
とを見い出し、さらに、そのような特徴を有する抗体を
効率よく取得する方法を確立し、本発明を完成するに至
った。すなわち、本発明は、Ｔｈｙ−１分子と細胞骨格
タンパク質とを認識し、かつＴ細胞の機能を阻害する作
用を有するモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体と
称することもある）を提供するものである。
【０００７】以下、本発明を詳しく説明する。 １．本発明の抗体の特性 本発明の抗体の典型的なものは、下記の特性を有するも
のである。 クラス：ＩｇＭに属する。 交差反応性：Ｔｈｙ−１分子および細胞骨格タンパク
質であるアクチンを認識する。したがって、Ｔｈｙ−１
分子とアクチン分子のそれぞれの分子中に存在する共通
または類似する抗原決定基を認識しているものと予想さ
れる。 Ｔ細胞の機能を阻害する作用：Ｔ細胞のＰＭＡによる
凝集の阻止作用および／または細胞障害性Ｔリンパ球に
よる細胞障害の阻止作用を有する。 本発明の抗体は、基本的には上記の〜の特性を充足
するものであるが、必ずしもすべての特性を充足する必
要はなく、少なくともおよびの特性を充足すれば充
分である。したがって、およびの特性を充足するモ
ノクローナル抗体も本発明の抗体の範畴に属する。
【０００８】２．本発明の抗体の製造法 本発明の抗体は公知の方法を適宜応用することにより容
易に製造することができる。使用する免疫源としては、
細胞骨格タンパク質、特にアクチンを含有するものであ
れば特に限定されない。具体的には、精製アクチン、ア
クチンを含有する細胞抽出物、アクチンを含有する生細
胞などを免疫源として使用することができる。なお、生
細胞を免疫源として使用する場合、細胞表面にＴｈｙ−
１分子が発現されていないものを使用するのが好まし
く、このような生細胞としてはフィブロザルコーマ（fi
brosarcoma）ＷＥＨＩ１６４（ATCC CRL1751）等のザル
コーマ細胞が例示できる。
【０００９】免疫源を投与する動物としては、特に制限
されず、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、
モルモット、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワト
リなどの動物を使用することができる。特にマウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ヤギなどが取り扱い上好都
合である。
【００１０】このような動物への免疫源の投与は常法に
従って行えばよい。すなわち、完全フロイントアジュバ
ンド、不完全フロイントアジュバンド、ミョウバンアジ
ュバンド、水酸化アルミニウムアジュバンド、百日咳菌
アジュバンドなどの各種アジュバンドと上述の免疫源と
の懸濁液または免疫源そのものを上記動物の静脈内、腹
腔内、皮下または皮内に投与すればよい。免疫源として
細胞を使用する場合の投与量は、１×１０6 〜１０8 細
胞／匹程度が適当である。初回投与後、１〜４週間おき
に１〜５回程度の上記と同様の追加免疫を行うことによ
り、動物体内で細胞骨格タンパク質に対する免疫を誘導
する。次に、免疫を獲得した動物からの脾細胞、リンパ
節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法によ
り取得する。
【００１１】抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞
としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由
来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。
使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の
状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合し
た状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
通常、８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株
はヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランス
フェラーゼ（Hypoxanthine guaninephosphoribosyl tra
nsferase）を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン
・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また細胞の
性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分
泌型の細胞株であることが好ましい。
【００１２】ミエローマ細胞株の具体例としては、P3x6
3Ag8（ATCC TIB-9）、P3x63Ag8U.1（P3U1）（ATCC CRL-
1597 ）、P3x63Ag8. 653 （ATCC CRL-1580 ）、P2/NSI/
1-Ag4-1（ATCC TIB-18 ）、Sp2/O-Ag14（ATCC CRL-15
8）などのマウスミエローマ細胞株、210. RCY.Ag1. 2.
3（Y3-Ag1. 2. 3）（ATCC CRL-1631 ）などのラットミ
エローマ細胞株、U-266-AR1 （Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 77,5429(1980)）、GM1500（Nature, 288, 488
(1980) ）、KR-4（Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A., 7
9, 6651 (1982) ）などのヒトミエローマ細胞株を例示
することができる。
【００１３】細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適
合したミエローマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグ
ルの最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル
培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地などの動物
細胞培養用培地中で１×１０6 〜１０8 細胞／ｍｌのミ
エローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：４〜１０に混
合し、３７℃で１〜１０分間細胞同士を接触させること
により効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促
進させるために、平均分子量１０００〜６０００のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニールアルコー
ル、センダイウイルスなどの融合促進剤を使用すること
ができる。また、電気パルスを利用した市販の細胞融合
装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合さ
せることもできる。
【００１４】細胞融合処理後の細胞から目的とするハイ
ブリドーマを選別する手段としては、選択的培地におけ
る細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができ
る。たとえば、細胞懸濁液を１５％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）含有ＲＰＭＩ １６４０培地などで適当に希釈後、
マイクロプレート上に１×１０3 〜１０6 細胞／ウエル
程度まき、各ウエルに選択培地（たとえば、ＨＡＴ培地
など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行
う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン耐性株、選
択培地としてＨＡＴ培地を用いた場合は、未融合のミエ
ローマ細胞は培養１０日目ぐらいまでに死滅し、正常細
胞である抗体産生細胞もイン・ビトロ（in vitro）では
長期間生育できないので、培養１０〜１４日目から生育
してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができ
る。
【００１５】Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別は、後
述実施例に詳述したごとくホルボールエステル（特に、
ホルボールミリステートアセテート：ＰＭＡ）が誘導す
るＴ細胞凝集反応の阻害を検討する方法により実施する
ことができる。すなわち、通常の胸腺Ｔ細胞またはコン
カナバリンＡなどにより幼若化させたＴ細胞を用いて、
ハイブリドーマの培養上清をＰＭＡによる幼若化Ｔ細胞
の凝集反応系に共存させてＰＭＡによるＴ細胞の凝集を
抑制したハイブリドーマをＴ細胞の機能を阻害する作用
を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
として選別する。次に、選別したハイブリドーマの培養
上清またはその培養上清から精製したモノクローナル抗
体を用いて、ハイブリドーマの産生するモノクローナル
抗体がＴｈｙ−１分子および細胞骨格タンパク質（特に
アクチン）を認識するものであることを後述の実施例に
記載したようなイムノブロッテング法や免疫沈降法によ
り確認する。イムノブロッテング法および免疫沈降法は
常法を適宜応用して行うことができる。ハイブリドーマ
のクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリン
ゲル法、蛍光励起セルソーター法などにより行うことが
できる。
【００１６】このようにして取得したハイブリドーマか
ら本発明の抗体を産生する方法としては、通常の細胞培
養法や腹水形成法などが採用されうる。細胞培養法にお
いては、ハイブリドーマを１０〜１５％ＦＣＳ含有ＲＰ
ＭＩ１６４０培地、無血清培地などの通常の動物細胞培
養用培地中で常法にしたがって培養し、その培養上清液
から抗体を取得することができる。腹水から回収する方
法では、ハイブリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動
物に、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、た
とえばマウスの場合にはハイブリドーマを約１０6細胞
／匹程度腹腔内投与する。ハイブリドーマは１０〜１８
日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度
に抗体を生産する。
【００１７】抗体の精製が必要とされる場合には、硫安
塩析法、ＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利
用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡー
セファロースなどを用いるアフィニティークロマトグラ
フィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方
法を適宜に選択または組み合わせることにより抗体を精
製することができる。
【００１８】３．本発明の抗体の有用性 本発明の抗体は前記１で示したような、従来の抗体には
認められない特性を有するために、ヒトを含む動物のＴ
ｈｙ−１分子またはＴｈｙ−１相等分子の分子免疫学的
研究用試薬、特にＴ細胞同士の接着や細胞障害の発現に
おけるＴｈｙ−１分子の役割などを研究するための試薬
として有用である。
【００１９】
【実施例】以下実施例を示し、本発明をより具体的に説
明する。 （１）本発明の抗体の調製 ＳＤラット（雌、５〜８週令）に２×１０7 個のマウス
フィブロザルコーマＷＥＨＩ１６４細胞（ATCC CRL175
1）を２回腹腔投与し、さらに４×１０7 個の上記細胞
を腹腔内投与して最終免疫した。それぞれの免疫は２週
間間隔で行った。ＷＥＨＩ１６４細胞で免疫したＳＤラ
ットから常法にしたがって脾臓細胞を調製し、この脾臓
細胞とラットミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞
（ATCC CRL-1580 ）とを公知の方法（Cell.Immunol., 9
4,122(1985) ）に従って融合した。細胞融合処理１０日
後、培養上清を採取し、幼若化Ｔ細胞凝集の阻害作用を
有する抗体を下記の方法でスクリーニングした。
【００２０】（Ｔ細胞凝集の阻害試験）ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの脾臓細胞を2.5 μg/mlのコンカナバリンＡ（Ｃｏ
ｎＡ）と二日間培養し、ＣｏｎＡを洗浄によって除去し
た後200 U/mlの組換えインターロイキン２の存在下でさ
らに二日間培養した。このようにして調製したＣｏｎＡ
幼若細胞はほとんど凝集しない。しかし、ウェル当り５
×１０4 個のＣｏｎＡ幼若細胞を 20ng/mlのＰＭＡ存在
下で培養するとＣｏｎＡ幼若細胞は凝集し始め、ＰＭＡ
刺激後１時間半から２時間で平衡に達する。この性質を
利用して、連続希釈したハイブリドーマの培養上清また
は連続希釈したモノクローナル抗体溶液をウエルに加え
てモノクローナル抗体のＴ細胞凝集の阻害活性を決定す
る。
【００２１】１５３６個のハイブリドーマの培養上清に
ついてＰＭＡ誘導Ｔ細胞凝集の阻害活性をスクリーニン
グした結果、それらのうちただひとつのモノクローナル
抗体ＴＮ１４（「ＴＮ１４ｍＡｂ」と略す）が顕著なＴ
細胞凝集に対する阻害効果を示した（図１Ｅ）。図１Ａ
に示されているように、ＣｏｎＡによって誘導された幼
若Ｔ細胞は弱い非特異的な凝集しか示さない。しかし、
ＣｏｎＡ幼若細胞を20ng/ml ＰＭＡで刺激してやると、
図１Ｂに示されているように刺激１時間後には強い凝集
反応を示す。ＰＭＡ誘導Ｔ細胞凝集は、ＬＦＡ−１−Ｉ
ＣＡＭ−１関与免疫反応であることがマウスおよびヒト
の系で報告されており、ＣｏｎＡ幼若細胞の凝集は抗Ｌ
ＦＡ−１モノクローナル抗体の添加によって完全に阻害
された（図１Ｃ）。こうした阻害は抗ＣＤ４モノクロー
ナル抗体では認められなかった（図１Ｄ）。しかし、Ｔ
Ｎ１４ｍＡｂを培養液に添加することにより、抗ＬＦＡ
−１モノクローナル抗体と同様にＴ細胞の凝集を阻害し
た（図１Ｅ）。また、５０％阻害を起こすために必要な
ＴＮ１４ｍＡｂの濃度は、1.5 μg/mlであった。
【００２２】このようにしてスクリーニングして得られ
たハイブリドーマを用いて腹水形成法によって、ＴＮ１
４ｍＡｂを調製し、これを５０％硫酸アンモニウムによ
る塩析およびセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグ
ラフィによって精製した。また、常法によりＴＮ１４ｍ
Ａｂのクラスを検索した結果、ＩｇＭであった。
【００２３】（２）ＴＮ１４ｍＡｂの認識する抗原の分
布 各種細胞（骨髄細胞（BM）、胸線細胞（THY ）、リンパ
節細胞（LN）、脾臓細胞（SP）、脾臓Ｔ細胞（T ）、脾
臓Ｂ細胞（B ）、マクロファージ（M φ）、ヌードマウ
ス脾臓細胞（Nu-SP ）、胎児胸線細胞（FT）、胎児肝細
胞（FL）、胸線上皮細胞株（C3HTE1）および繊維芽細胞
様細胞株（Fib-1 ））とＴＮ１４ｍＡｂとの反応性をフ
ローサイトメトリーを用いて分析した。図２に示すよう
に、ＴＮ１４ｍＡｂは、マウス胸線細胞、リンパ節細
胞、ナイロン透過性脾臓Ｔ細胞と反応したが、骨髄細
胞、脾臓Ｂ細胞、マクロファージ、ヌードマウス脾臓細
胞、胎児肝細胞はと反応しなかった。また、胸線上皮細
胞株（C3HTE1）や繊維芽細胞株（Fib-1 ）等の非リンパ
球細胞とも反応せず、これらの結果からＴＮ１４ｍＡｂ
は主としてＴ細胞と反応することが明らかになった。次
に、ＴＮ１４ｍＡｂに反応する抗原とＬＦＡ−１または
ＩＣＡＭ−１抗原との間の発現パターンの違いを調べ
た。図３に示すようにＬＦＡ−１抗原及びＩＣＡＭ−１
抗原はどちらも骨髄細胞に強く発現されているのに対
し、ＴＮ１４ｍＡｂと反応する抗原は発現されていなか
った。これらの結果から、ＴＮ１４ｍＡｂは、ＬＦＡ−
１−ＩＣＡＭ−１依存のＴ細胞の凝集を阻害するにもか
かわらず、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１とは異なる細
胞接着因子を認識していることが明らかになった。
【００２４】なお、実験に使用した細胞は、以下のよう
にして調製した。胸線細胞、リンパ節細胞、脾臓細胞、
骨髄細胞は成熟ＢＡＬＢ／ｃマウスから公知文献（Eur.
J.Immunol., 18,97(1988) ）に記載の方法に従って調製
した。胎児Ｔ細胞と肝臓細胞は１４日めのＢＡＬＢ／ｃ
胎児から常法により調製した。Ｔ細胞はナイロンウール
カラムを通過させることによりエンリッチした。また、
ナイロン吸着性で補体と抗Ｔｈｙ−１モノクローナル抗
体による処理に抵抗性の脾臓細胞をＢ細胞源として用い
た。マクロファージはＯＫ−４３２を注射したマウスの
腹膜腔から抗Ｔｈｙ−１および抗Ｂ２２０モノクローナ
ル抗体を結合した磁気ビーズを用いてエンリッチした
（Cell.Immunol., 94,122(1985) ）。繊維芽細胞様の細
胞株Ｆｉｂ−１はＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節から常
法により得た。胸線上皮細胞株 C3HTE1 はC3H/HeN マウ
スの胸線から調製した。
【００２５】（３）ＴＮ１４ｍＡｂの認識する抗原の同
定 ＴＮ１４ｍＡｂの認識する抗原の同定を以下に示すウェ
スタンブロッティング分析法及び免疫沈降法を用いて行
った。 （ウェスタンブロッティング分析法）胸線細胞または骨
髄細胞を可溶化バッファー（２％トライトン−Ｘ１０
０、０．５％デオキシコレート、０．０２％アザイド、
５ｍＭイオドアセトアミド、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、
０．２Ｕ／ｍｌアプロチニン）で可溶化して総細胞溶解
液を作製した。溶解した細胞から得た蛋白をラエムリの
方法（Nature, 227 ,680(1970)）を用いて５〜１５％グ
ラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
により分離し、ニトロセルロース膜に転写した。得られ
たニトロセルロース膜を０．０５％のツイン２０を含む
ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄し、３％ＢＳＡを
含むＰＢＳで３７℃１５分処理し、再度Ｔｗｅｅｎ−Ｐ
ＢＳで洗浄後、バッファー（２％正常ウサギ血清、０．
０１Ｍ ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％ゼラチン、
０．１％アザイド、１ｍＭ ＭｇＣｌ2 含有）中で２
３℃、３０分放置した。反応後、膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓで洗浄し、各種抗体溶液と２３℃、１時間反応させ、
Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで３〜５回洗浄し、ペルオキシダー
ゼを結合したウサギ抗ラット免疫グロブリン抗体溶液と
２３℃、１時間反応させた。反応後、膜をＴｗｅｅｎ−
ＰＢＳで５回洗浄し、抗体と反応したバンドをＤＡＢと
過酸化水素を加えて発色させた。
【００２６】（免疫沈降法）ミッチェルらの方法（Mol.
Immunol.,18,207(1981) ）を用いて細胞表面蛋白を125
Ｉ で標識した。ＰＢＳ、２０ｍＭ ＫＩ溶液そしてＰ
ＢＳ（０．０２％ヘモグロビン及び５ｍＭイオドアセト
アミド含有）で順次洗浄した後、ウェスタンブロッティ
ング分析法で使用した可溶化バッファーを用いて細胞を
可溶化した。１５０００回転で１５分間遠心分離した
後、非特異的な結合蛋白を除去するために上清をラット
免疫グロブリン結合セファロース４Ｂビーズと４℃で１
時間反応させた。その後、上清をＴＮ１４ｍＡｂ結合セ
ファロース４Ｂビーズと４℃で１時間反応させた。反応
後、セファロース４Ｂを２％ＳＤＳ単独あるいは２％Ｓ
ＤＳと５％２−ＭＥを含む検体用バッファーに懸濁し、
５〜１５％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動を行った。段階的な免疫沈降の場合、まず
細胞溶解液を抗Ｔｈｙ−１モノクローナル抗体（４Ａ
３）結合セファロース４Ｂビーズで２回吸着させた後、
ＴＮ１４ｍＡｂ結合セファロース４Ｂビーズを用いて免
疫沈降させ、以下上記と同様に処理して電気泳動を行っ
た。電気泳動終了後、ゲルを染色液（５０％メタノー
ル、１０％酢酸、０．２５％クーマシーブリリアントブ
ルーＧ−２５０含有）を用いて染色した。染色後、ゲル
を脱色乾燥し、コダック Ｘ−Ｏｍａｔ ＡＲ フィル
ムを用いて−８０℃でオートラジオグラフィーを行っ
た。
【００２７】ＴＮ１４ｍＡｂが認識する抗原の同定をウ
エスタンブロッティング分析法により分析した結果、図
４Ａ−３に示すように、ＴＮ１４ｍＡｂは胸線細胞溶解
液中の４３Ｋｄの一本のバンドと反応した。しかし予測
に反し、ＴＮ１４ｍＡｂはフローサイトメトリーを用い
た分析ではＴＮ１４ｍＡｂと反応しなかった骨髄細胞か
ら得られた細胞溶解液に対しても同様の反応を示した
（図４Ａ−４）。ＴＮ１４ｍＡｂと４３Ｋｄ蛋白の反応
パターンは還元状態でも非還元状態でも同様であった。
このようなＴＮ１４ｍＡｂの矛盾した反応パターンは調
べたすべての細胞で同様であった。同様の条件下でＧＫ
１．５モノクローナル抗体およびＨ０１３抗Ｔｈｙ−１
モノクローナル抗体（ＩｇＭ）などは４３Ｋｄ蛋白と反
応を示さなかった（図４Ａ−１およびＡ−２）。ＴＮ１
４ｍＡｂがＴ細胞表面分子と特異的な反応性を示すにも
かかわらず、様々な細胞の溶解液と反応するという事実
は、ＴＮ１４ｍＡｂがある種の細胞質蛋白を認識してい
ることを強く示唆している。ＴＮ１４ｍＡｂが反応する
細胞質蛋白の分子量から判断してＴＮ１４ｍＡｂが細胞
骨格蛋白であるアクチンと反応している可能性が考えら
れた。これを確認するため市販の精製アクチンを用いた
ウエスタンブロッティング分析を行った（図４Ｂ）。Ｔ
Ｎ１４ｍＡｂは精製アクチン（図４Ｂ−１）に対して胸
線細胞溶解液（図４Ｂ−２）と同様の特異的反応を示し
た。アクチンと結合する能力を有するＤＮａｓｅ結合セ
ファロース４Ｂビーズで胸線細胞溶解液を事前に吸着処
理した場合、ＴＮ１４ｍＡｂ反応性の４３Ｋｄのバンド
は消失した（図４Ｂ−３）。また、ＴＮ１４ｍＡｂの細
胞溶解液に対する反応性は、ＴＮ１４ｍＡｂを事前にア
クチン結合セファロース４Ｂビーズで処理した場合にも
消失した（図４Ｂ−４）。これらの結果からＴＮ１４ｍ
Ａｂは細胞骨格蛋白アクチンを認識していると結論し
た。
【００２８】次に、免疫沈降実験から、図５に示すよう
に、ＴＮ１４ｍＡｂは分子量２８−３０Ｋｄの蛋白質を
免疫沈降した（図５−Ｄ）。ＴＮ１４ｍＡｂの反応性分
布パターンと分子のサイズから判断して、ＴＮ１４ｍＡ
ｂの反応する蛋白はＴ細胞のマーカーであるＴｈｙ−１
分子であろうと考えられた。これを確認するため、抗Ｔ
ｈｙ−１モノクローナル抗体（４Ａ３）を用いて段階的
な免疫沈降を行った。その結果、抗Ｔｈｙ−１モノクロ
ーナル抗体（４Ａ３）は最初の沈降で分子量３０Ｋｄ程
度のＴｈｙ−１分子を沈降した（図５−Ａ）。二度目の
沈降では反応するバンドは著しく減少した（図５−
Ｂ）。Ｔｈｙ−１分子の減少に並行してＴＮ１４ｍＡｂ
と反応するバンドも完全に消失した（図５−Ｃ）。この
結果からＴＮ１４ｍＡｂが、アクチンに加えＴｈｙ−１
分子とも反応することが示された。さらに、図６に示す
ように、アクチンの添加はＴＮ１４ｍＡｂのＴｈｙ−１
分子に対する結合を大きく阻害した（図６−Ａ）。対照
的に、アクチンは他の抗Ｔｈｙ−１．２抗体、抗Ｔｈｙ
−１．１抗体、抗ＬＦＡ−１抗体、抗ＩＣＡＭ−１抗体
とは競合せず（図６−Ｂ〜Ｅ）、ＴＮ１４ｍＡｂがＴｈ
ｙ−１分子のユニークなアクチン関連エピトープを認識
している事が明かとなった。
【００２９】（４）ＴＮ１４ｍＡｂのＴ細胞細胞障害の
阻止作用 ＴＮ１４ｍＡｂのＴ細胞細胞障害の阻止作用を以下の方
法で検討した。 （細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導と細胞障害性試
験）ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞（５×１０6 /well
）を60μg/mlのマイトマイシンＣで処理した C3H/HeN
マウス脾臓細胞（２．５×１０6 /well ）と一緒にコー
スター６穴プレートを用いて４日間培養して初代培養Ｃ
ＴＬを取得した。細胞障害性は公知の方法（J.Immuno
l., 142 ,2155(1989) ）に従って４時間の51Cr遊離試験
により決定した。細胞障害性の割合は、以下の式によっ
て算出した。 モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣＴＬ活性に対する阻
害効果は細胞障害試験培養液にモノクローナル抗体を加
えることによって決定した。阻害率は、以下の式によっ
て算出した。
【００３０】その結果を図７に示す。従来の報告（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.,78,4535(1981)）と同様に抗ＬＦ
Ａ−１モノクローナル抗体の添加は原生のＲＤＭ−４リ
ンフォーマ細胞に対するＣＴＬ活性を強く阻害した。ま
た、ＴＮ１４ｍＡｂの添加もＣＴＬ活性を阻害した。し
かし、ＩｇＭ抗Ｔｈｙ−１．２モノクローナル抗体Ｈ０
１３の添加はＣＴＬ活性に対して弱い阻害活性しか示さ
なかったことからＴＮ１４ｍＡｂによる阻害が抗Ｔｈｙ
−１ｍＡｂの非特異的な効果によるものではないことが
裏付けられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＭＡ誘導ＣｏｎＡ幼若細胞の凝集の
各種抗体による阻害の様子を示したものである。 （Ａ）ＣｏｎＡ幼若細胞（５×１０4 cells/well ）の
み、無添加 （Ｂ）（Ａ）にＰＭＡ添加 （Ｃ）（Ａ）にＰＭＡおよび抗ＬＦＡ−１モノクローナ
ル抗体添加 （Ｄ）（Ａ）にＰＭＡおよび抗ＣＤ４モノクローナル抗
体添加 （Ｄ）（Ａ）にＰＭＡおよびＴＮ１４ｍＡｂ添加
【図２】図２は、ＴＮ１４ｍＡｂとＦＩＴＣ結合抗ラッ
ト免疫グロブリン抗体を用いて種々の正常細胞を染色
し、それをファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）を用い
て分析して得た正常リンパ球および非リンパ球細胞上の
ＴＮ１４ｍＡｂ反応抗原の分布パターンを示したもので
ある。点線は非染色コントロ−ルのパターンを示し、実
線は染色時のパターンを示す。 （Ａ）骨髄細胞、（Ｂ）胸線細胞、（Ｃ）リンパ節細
胞、（Ｄ）脾臓細胞 （Ｅ）脾臓Ｔ細胞、（Ｆ）脾臓Ｂ細胞、（Ｇ）マクロフ
ァージ （Ｈ）ヌードマウス脾臓細胞、（Ｉ）胎児胸線細胞、
（Ｊ）胎児肝細胞 （Ｋ）胸線上皮細胞株 C3HTE1、（Ｌ）繊維芽細胞様細
胞株 Fib-1
【図３】図３は、ＴＮ１４ｍＡｂ、抗ＬＦＡ−１モノク
ローナル抗体または抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体
のいずれかの抗体とＦＩＴＣ結合抗ラット免疫グロブリ
ン抗体とを用いて種々の正常細胞を染色し、それをファ
ックスキャンを用いて分析した時の結果を示したもので
ある。点線は非染色コントロ−ルのパターンを示し、実
線は染色時のパターンを示す。 （使用した細胞） （使用したモノクローナル抗体） （Ａ） 正常骨髄細胞 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｂ） 正常骨髄細胞 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体 （Ｃ） 正常骨髄細胞 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体 （Ｄ） ヌードマウス骨髄細胞 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｅ） ヌードマウス骨髄細胞 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体 （Ｆ） ヌードマウス骨髄細胞 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体
【図４】図４は、ウェスタンブロッティング分析の結果
を示したものである。 （試料） （使用したモノクローナル抗体） （Ａ−１） 胸腺細胞溶解液 ＧＫ１．５モノクローナル抗体 （Ａ−２） 骨髄細胞溶解液 ＧＫ１．５モノクローナル抗体 （Ａ−３） 胸腺細胞溶解液 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ａ−４） 骨髄細胞溶解液 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｂ−１） ウサギアクチン ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｂ−２） 胸腺細胞溶解液 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｂ−３） DNase 吸着処理 ＴＮ１４ｍＡｂ 胸腺細胞溶解液 （Ｂ−４） 胸腺細胞溶解液 アクチン−ビーズ吸着処理 ＴＮ１４ｍＡｂ
【図５】図５は免疫沈降試験の結果を示したものであ
る。 （Ａ）抗Ｔｈｙ−１抗体（４Ａ３）による一回目の免疫
沈降パターン （Ｂ）抗Ｔｈｙ−１抗体（４Ａ３）による二回目の免疫
沈降パターン （Ｃ）抗Ｔｈｙ−１抗体（４Ａ３）処理後、ＴＮ１４ｍ
Ａｂによる免疫沈降パターン （Ｄ）ＴＮ１４ｍＡｂによる免疫沈降パターン （Ｅ）ラット免疫グロブリン結合セファロース４Ｂビー
ズによる免疫沈降パターン
【図６】図６は、アクチン共存下でのＴＮ１４ｍＡｂの
Ｔｈｙ−１分子への反応性をファックスキャンを用いて
分析した時の結果を示したものである。図中、ａ線はコ
ントロ−ルのパターン、ｂ線はアクチン非共存条件下の
パターン、ｃ線はアクチン共存条件下のパターンを示
す。 （使用した細胞） （使用した抗体） （Ａ） Thy-1.2+ MBL-2 Ｔリンパ球 ＴＮ１４ｍＡｂ （Ｂ） Thy-1.2+ MBL-2 Ｔリンパ球 抗Ｔｈｙ−１．２モノクローナル抗体 （Ｃ） Thy-1.1+ RDM-4 Ｔリンパ球 抗Ｔｈｙ−１．１モノクローナル抗体 （Ｄ） Thy-1.2+ MBL-2 Ｔリンパ球 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体 （Ｅ） Thy-1.2+ MBL-2 Ｔリンパ球 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体
【図７】図７は各種抗体のＴ細胞細胞障害の阻止作用の
結果を示したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｔｈｙ−１分子と細胞骨格タンパク質とを
    認識し、かつＴ細胞の機能を阻害する作用を有するモノ
    クローナル抗体。
  2. 【請求項２】Ｔ細胞の機能を阻害する作用が、Ｔ細胞の
    凝集の阻止作用である、請求項１記載の抗体。
  3. 【請求項３】Ｔ細胞の機能を阻害する作用が、Ｔ細胞の
    細胞障害の阻止作用である、請求項１記載の抗体。
  4. 【請求項４】認識する細胞骨格タンパク質がアクチンで
    ある、請求項１記載の抗体。
JP19214691A 1991-07-31 1991-07-31 Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体 Pending JPH05252980A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19214691A JPH05252980A (ja) 1991-07-31 1991-07-31 Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19214691A JPH05252980A (ja) 1991-07-31 1991-07-31 Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05252980A true JPH05252980A (ja) 1993-10-05

Family

ID=16286465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP19214691A Pending JPH05252980A (ja) 1991-07-31 1991-07-31 Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH05252980A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559729A (zh) * 2018-02-05 2018-09-21 上海科技大学 Fam49基因及其编码蛋白的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559729A (zh) * 2018-02-05 2018-09-21 上海科技大学 Fam49基因及其编码蛋白的应用
CN108559729B (zh) * 2018-02-05 2022-01-14 上海科技大学 Fam49基因及其编码蛋白的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hansen et al. Monoclonal antibodies identifying a novel T-cell antigen and Ia antigens of human lymphocytes
Dörken et al. HD39 (B3), a B lineage-restricted antigen whose cell surface expression is limited to resting and activated human B lymphocytes.
Wong et al. Bi-specific monoclonal antibodies: selective binding and complement fixation to cells that express two different surface antigens.
Carrel et al. Subsets of human Ia-like molecules defined by monoclonal antibodies
Frankel et al. Tissue distribution of breast cancer-associated antigens defined by monoclonal antibodies
JP2998976B2 (ja) ヒトインタ―ロイキン―６レセプターに対する抗体
JP2769311B2 (ja) ヒト乳癌細胞に対するモノクローナル抗体
JPH0159870B2 (ja)
JPH0160231B2 (ja)
JPH0159871B2 (ja)
JPH0159869B2 (ja)
Kimura et al. A new mouse cell-surface antigen (Ly-m20) controlled by a gene linked to Mls locus and defined by monoclonal antibodies
JPH1084960A (ja) γ，δＴ細胞レセプターおよび検出方法
Loop et al. Two human tumor‐associated antigens, p155 and p210, detected by monoclonal antibodies
JPH03219894A (ja) ｇｐ１３０蛋白質に対する抗体
JPH0160230B2 (ja)
US5879911A (en) Cell surface protein expressed on human cortical thymocyte and their use
Wang et al. Stimulation and expansion of a human T-cell subpopulation by a monoclonal antibody to T-cell receptor molecule
JPH0683666B2 (ja) 腫瘍▲下−▼胎児に特異的なモノクロナ−ル抗体の調製方法および使用方法
JPH0662845A (ja) ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
JPH05252980A (ja) Ｔ細胞の機能を阻害する作用を有するモノクローナル抗体
AU636867B2 (en) Rat monoclonal antibodies directed against human antigens and processes for preparation thereof
Whitson et al. Cytotoxicity of antisera to a myelogenous leukemia cell line with the Philadelphia chromosome
Bicknell et al. Monoclonal antibodies specific for a tumor-associated membrane phosphoprotein in human cell hybrids
Billing et al. A monoclonal antibody against an epitope common to HLA-B locus antigens