JPH0662845A - ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞 - Google Patents
ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞Info
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- JPH0662845A JPH0662845A JP4323131A JP32313192A JPH0662845A JP H0662845 A JPH0662845 A JP H0662845A JP 4323131 A JP4323131 A JP 4323131A JP 32313192 A JP32313192 A JP 32313192A JP H0662845 A JPH0662845 A JP H0662845A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、モノクローナル抗体を産生するこ
とができるハイブリドーマ細胞を提供する。 【構成】 本発明のハイブリドーマ細胞は、補体の存在
下インビトロでヒトＮＫ細胞を溶解することができ、非
ＮＫヒト顆粒球、非ヒト単球、ヒト赤血球、ヒト胸腺細
胞および非ＮＫヒトＴ3リンパ球とは反応性でないモノ
クローナル抗体を産生することができる。
とができるハイブリドーマ細胞を提供する。 【構成】 本発明のハイブリドーマ細胞は、補体の存在
下インビトロでヒトＮＫ細胞を溶解することができ、非
ＮＫヒト顆粒球、非ヒト単球、ヒト赤血球、ヒト胸腺細
胞および非ＮＫヒトＴ3リンパ球とは反応性でないモノ
クローナル抗体を産生することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体を産
生することができるハイブリドーマ細胞に関する。
生することができるハイブリドーマ細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト末梢血液はナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞と称される単核球細胞の集団を含む。ＮＫ細胞
は抗体、すなわち抗体の不在下または予め免疫なしにイ
ンビトロで腫瘍細胞を溶解する能力を有するものと定義
されている。
Ｋ）細胞と称される単核球細胞の集団を含む。ＮＫ細胞
は抗体、すなわち抗体の不在下または予め免疫なしにイ
ンビトロで腫瘍細胞を溶解する能力を有するものと定義
されている。
【０００３】Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３０， ２９４７には、非ＮＫヒト単球、
顆粒球、Ｂ−リンパ球、Ｔ細胞、赤血球および血小板と
は反応性でない、ＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体
（“Ｎ９０１”と称される）が記載されている。この抗
体は補体の存在下にインビトロでＮＫ細胞およびＮＫ様
細胞を溶解することは不可能である。（ここで“ＮＫ様
細胞”とは正常な末梢血液以外に見られる細胞で、たと
えば培養ＮＫ細胞、あるいは他の器官または悪性腫瘍の
細胞であって、いずれもＮＫ細胞の溶解能力を有し、Ｎ
Ｋ細胞に特異的な表面抗原決定基を担持している。）Ｐ
ｅｒｕｓｓｉａら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３０， ２１３３にはＮＫ細胞と反応性の他のモノクロ
ーナル抗体が記載されている。
ｕｎｏｌ．１３０， ２９４７には、非ＮＫヒト単球、
顆粒球、Ｂ−リンパ球、Ｔ細胞、赤血球および血小板と
は反応性でない、ＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体
（“Ｎ９０１”と称される）が記載されている。この抗
体は補体の存在下にインビトロでＮＫ細胞およびＮＫ様
細胞を溶解することは不可能である。（ここで“ＮＫ様
細胞”とは正常な末梢血液以外に見られる細胞で、たと
えば培養ＮＫ細胞、あるいは他の器官または悪性腫瘍の
細胞であって、いずれもＮＫ細胞の溶解能力を有し、Ｎ
Ｋ細胞に特異的な表面抗原決定基を担持している。）Ｐ
ｅｒｕｓｓｉａら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３０， ２１３３にはＮＫ細胞と反応性の他のモノクロ
ーナル抗体が記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般に、本発明は一態
様として、補体の存在下にインビトロでヒトＮＫ細胞を
溶解することができるモノクローナル抗体を産生するこ
とができるハイブリドーマ細胞である。
様として、補体の存在下にインビトロでヒトＮＫ細胞を
溶解することができるモノクローナル抗体を産生するこ
とができるハイブリドーマ細胞である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】好適具体例として該抗体
は非ＮＫヒト顆粒球、非ＮＫヒト単球、ヒト赤血球、ヒ
ト血小板、ヒト胸腺細胞および非ＮＫヒトＴ3 リンパ
球と反応性ではなく；該抗体はＩｇＭまたはＩｇＧ2
アイソタイプであって；該抗体は実質的にすべてのＮＫ
細胞の表面上の、ＮＫ細胞に特異的な約２００，０００
〜２２０，０００ダルトンの抗原決定基を認識する（特
定の抗原決定基はここでは“ＮＫＨ１Ａ”と称す
る。）。
は非ＮＫヒト顆粒球、非ＮＫヒト単球、ヒト赤血球、ヒ
ト血小板、ヒト胸腺細胞および非ＮＫヒトＴ3 リンパ
球と反応性ではなく；該抗体はＩｇＭまたはＩｇＧ2
アイソタイプであって；該抗体は実質的にすべてのＮＫ
細胞の表面上の、ＮＫ細胞に特異的な約２００，０００
〜２２０，０００ダルトンの抗原決定基を認識する（特
定の抗原決定基はここでは“ＮＫＨ１Ａ”と称す
る。）。
【０００６】本発明の抗体（“抗−ＮＫＨ１Ａ”）はた
とえば放射性同位元素または蛍光染料で標識して使用す
ることによりＮＫ細胞を固定でき、これらの細胞を非Ｎ
Ｋ細胞から区別できる。この抗体は組織、たとえば患者
に埋め込まれる骨髄中のＮＫ細胞を殺して移植組織対宿
主病を阻止するのにも使用できる。
とえば放射性同位元素または蛍光染料で標識して使用す
ることによりＮＫ細胞を固定でき、これらの細胞を非Ｎ
Ｋ細胞から区別できる。この抗体は組織、たとえば患者
に埋め込まれる骨髄中のＮＫ細胞を殺して移植組織対宿
主病を阻止するのにも使用できる。
【０００７】上記特異性と特性を有するすべてのモノク
ローナル抗体は本発明に包含される。これらのモノクロ
ーナル抗体は従来のハイブリダイゼーションとスクリー
ニング技術（Ｒｅｉｎｈｅｒｚら（１９７９）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１２３， １３１２およびＲｉｔｚらＮａ
ｔｕｒｅ（１９８０）２８３， ５８３に記載されてい
るような技術）を使用してつくったハイブリッド細胞に
よって産生される。モノクローナル抗体の分野で周知の
ように、同一の特定の抗原決定基に対して特異的なモノ
クローナル抗体を産生する各々の独立して産生されたハ
イブリッド細胞株は他のすべてのものからあまり異なら
ず、それにより産生されたモノクローナル抗体も各々あ
まり異ならない。このようにして、下記の方法を繰り返
すと、ＮＫ細胞に対して特異的でＮＫ細胞を溶解するこ
とができる有用なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リッド細胞株を産生できるが、化学的に下記モノクロー
ナル抗体の正確なコピーであるモノクローナル抗体を産
生する細胞株を産生するであろうことはほとんどあり得
ない。
ローナル抗体は本発明に包含される。これらのモノクロ
ーナル抗体は従来のハイブリダイゼーションとスクリー
ニング技術（Ｒｅｉｎｈｅｒｚら（１９７９）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１２３， １３１２およびＲｉｔｚらＮａ
ｔｕｒｅ（１９８０）２８３， ５８３に記載されてい
るような技術）を使用してつくったハイブリッド細胞に
よって産生される。モノクローナル抗体の分野で周知の
ように、同一の特定の抗原決定基に対して特異的なモノ
クローナル抗体を産生する各々の独立して産生されたハ
イブリッド細胞株は他のすべてのものからあまり異なら
ず、それにより産生されたモノクローナル抗体も各々あ
まり異ならない。このようにして、下記の方法を繰り返
すと、ＮＫ細胞に対して特異的でＮＫ細胞を溶解するこ
とができる有用なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リッド細胞株を産生できるが、化学的に下記モノクロー
ナル抗体の正確なコピーであるモノクローナル抗体を産
生する細胞株を産生するであろうことはほとんどあり得
ない。
【０００８】本発明の好適具体例は下記のとおりであ
る。
る。
【０００９】
【実施例】ハイブリドーマ産生およびスクリーニング ６週令の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスをヒトクローン化ＮＫ細
胞株ＪＴ３の細胞で免疫化した。該細胞株はＨｅｒｃｅ
ｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０１， １５８に記
載されている。ＪＴ３クローンは、精製された大きな顆
粒リンパ球（ＬＧＬ）をまずＰＨＡで刺激したものとイ
ンターロイキン−２を含む培地から誘導される。１８ケ
月を越える間、ＪＴ３細胞は培養を維持され、安定な表
現型（Ｔ３−Ｔ４−Ｔ８−Ｔ１１＋Ｎ９０１＋）および
細胞毒性を、インビトロで確立した細胞株の大きなパネ
ルに対して試験したとき示すことがわかった。
胞株ＪＴ３の細胞で免疫化した。該細胞株はＨｅｒｃｅ
ｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０１， １５８に記
載されている。ＪＴ３クローンは、精製された大きな顆
粒リンパ球（ＬＧＬ）をまずＰＨＡで刺激したものとイ
ンターロイキン−２を含む培地から誘導される。１８ケ
月を越える間、ＪＴ３細胞は培養を維持され、安定な表
現型（Ｔ３−Ｔ４−Ｔ８−Ｔ１１＋Ｎ９０１＋）および
細胞毒性を、インビトロで確立した細胞株の大きなパネ
ルに対して試験したとき示すことがわかった。
【００１０】ＪＴ３クローンはＨｅｒｃｅｎｄら（１９
８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９， １２９９とＨｅ
ｒｃｅｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０１， １５
８に記載された限定希釈法によって発生させた。この方
法は、自己由来の照射（５０００ラド）ヒト末梢血液単
核球（ＰＢＭＣ）プラスＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ）または
同種異系間によるか若しくは自己由来の照射（５０００
ラド）ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の供給層上で１個の細胞を
１つの穴の割合でＬＧＬをクローニングすることからな
る。選択されたコロニーは３日毎にＬＣＭ（最終希釈率
１０〜１５％）を含有する培地を添加することによって
増殖された。培地はペニシリン−ストレプトマイシン１
％、ピルビン酸ナトリウム１％、ヒトＡＢ血清２０％の
ＲＰＭＩ１６４０であった。ＪＴ３株は次いで、オート
ローガス照射ＰＢＭＣプラス照射されたＥＢＶ形質転換
Ｂ細胞の供給層上で１００細胞／穴で２回サブクローン
化された。サブクローニング後、表現型と細胞毒性機能
は両方とも安定であった。
８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９， １２９９とＨｅ
ｒｃｅｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０１， １５
８に記載された限定希釈法によって発生させた。この方
法は、自己由来の照射（５０００ラド）ヒト末梢血液単
核球（ＰＢＭＣ）プラスＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ）または
同種異系間によるか若しくは自己由来の照射（５０００
ラド）ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の供給層上で１個の細胞を
１つの穴の割合でＬＧＬをクローニングすることからな
る。選択されたコロニーは３日毎にＬＣＭ（最終希釈率
１０〜１５％）を含有する培地を添加することによって
増殖された。培地はペニシリン−ストレプトマイシン１
％、ピルビン酸ナトリウム１％、ヒトＡＢ血清２０％の
ＲＰＭＩ１６４０であった。ＪＴ３株は次いで、オート
ローガス照射ＰＢＭＣプラス照射されたＥＢＶ形質転換
Ｂ細胞の供給層上で１００細胞／穴で２回サブクローン
化された。サブクローニング後、表現型と細胞毒性機能
は両方とも安定であった。
【００１１】免疫化は、まず完全フロインドアジュバン
ト（ミシガン州デトロイトのディフコ）中で乳化された
４×１０6ＪＴ３細胞の腹腔内注射に始まり、次いで２
週間リン酸塩で緩衝化された生理塩水（ＰＢＳ）中４×
１０6生細胞を腹腔内注射することからなる。２週間
後、２×１０6細胞を静脈内注射し、３日後脾臓除去し
た。体細胞ハイブリダイゼーションはＫｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６，
４９５の方法で行った。
ト（ミシガン州デトロイトのディフコ）中で乳化された
４×１０6ＪＴ３細胞の腹腔内注射に始まり、次いで２
週間リン酸塩で緩衝化された生理塩水（ＰＢＳ）中４×
１０6生細胞を腹腔内注射することからなる。２週間
後、２×１０6細胞を静脈内注射し、３日後脾臓除去し
た。体細胞ハイブリダイゼーションはＫｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６，
４９５の方法で行った。
【００１２】ハイブリドーマ上清のスクリーニングをま
ず次のように行った：１０，０００51Ｃｒ標識ＪＴ３細
胞をＶ底滴板で室温で３０分間各ハイブリドーマ上清の
アリコットとインキュベートした。適当な非毒性希釈
（通常１：１０）でウサギ補体を次いで１時間３７℃で
添加した。次いで、滴板をスピンダウンさせ、抗体反応
性をガンマシンチレーションカウンターを使用して上記
上清への51Ｃｒの放出として測定した。陽性上清を次い
で同一の実験条件下に自己由来のＭＨＣ制限細胞毒性Ｔ
細胞クローンならびに自然界ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株に
対して試験した。補体の存在下にＪＴ３細胞を溶解する
がＭＨＣ制限細胞毒性Ｔ細胞クローンまたはＥＢＶ形質
転換Ｂ細胞株を溶解しない抗体を産生した細胞を選択し
た。抗体産生ハイブリドーマを制限希釈法によって２回
再クローンし、免疫腹水症をつくり出した。
ず次のように行った：１０，０００51Ｃｒ標識ＪＴ３細
胞をＶ底滴板で室温で３０分間各ハイブリドーマ上清の
アリコットとインキュベートした。適当な非毒性希釈
（通常１：１０）でウサギ補体を次いで１時間３７℃で
添加した。次いで、滴板をスピンダウンさせ、抗体反応
性をガンマシンチレーションカウンターを使用して上記
上清への51Ｃｒの放出として測定した。陽性上清を次い
で同一の実験条件下に自己由来のＭＨＣ制限細胞毒性Ｔ
細胞クローンならびに自然界ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株に
対して試験した。補体の存在下にＪＴ３細胞を溶解する
がＭＨＣ制限細胞毒性Ｔ細胞クローンまたはＥＢＶ形質
転換Ｂ細胞株を溶解しない抗体を産生した細胞を選択し
た。抗体産生ハイブリドーマを制限希釈法によって２回
再クローンし、免疫腹水症をつくり出した。
【００１３】抗体特性 抗体の反応性パターンを、リンパ球と非リンパ球を間接
イムノフルオレセンスアッセイ、続いてＦＡＣＳＩフロ
ーサイトメーターまたはＥｐｉｃｓＶフローサイトメー
ターのいずれかを使用して分析して純粋培養することに
より試験して決定した。試験のために適当な細胞を得る
ために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｆ／Ｈ）密度
勾配遠心分離により健康なボランティアー提供者からＰ
ＢＭＣを単離した。単球に富んだ接着細胞がプラスチッ
ク培養皿上で２段階接着によってＰＢＭＣから得られ
た。高分子デキストランを使用してＦ／Ｈ勾配ペレット
から顆粒球が単離された。活性化Ｔ細胞は、Ｅ＋細胞を
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（２μｇ／ｍｌ）で刺
激することによって発生し、刺激後７日目に試験され
た。
イムノフルオレセンスアッセイ、続いてＦＡＣＳＩフロ
ーサイトメーターまたはＥｐｉｃｓＶフローサイトメー
ターのいずれかを使用して分析して純粋培養することに
より試験して決定した。試験のために適当な細胞を得る
ために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｆ／Ｈ）密度
勾配遠心分離により健康なボランティアー提供者からＰ
ＢＭＣを単離した。単球に富んだ接着細胞がプラスチッ
ク培養皿上で２段階接着によってＰＢＭＣから得られ
た。高分子デキストランを使用してＦ／Ｈ勾配ペレット
から顆粒球が単離された。活性化Ｔ細胞は、Ｅ＋細胞を
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（２μｇ／ｍｌ）で刺
激することによって発生し、刺激後７日目に試験され
た。
【００１４】この抗体はＪＴ３免疫細胞と強く反応性で
あることがわかった。さらに、表１に示されるように、
末梢血液に存在する少量（１２％）のリンパ球と反応す
ることがわかった。ヒト単球、顆粒球、血小板、赤血
球、胸腺細胞、Ｔ3リンパ球、およびＰＨＡ活性化Ｅ＋
細胞は陰性であった。
あることがわかった。さらに、表１に示されるように、
末梢血液に存在する少量（１２％）のリンパ球と反応す
ることがわかった。ヒト単球、顆粒球、血小板、赤血
球、胸腺細胞、Ｔ3リンパ球、およびＰＨＡ活性化Ｅ＋
細胞は陰性であった。
【００１５】
【表１】 表 １ 末梢血液リンパ球 提供者 抗−ＮＫＨ１Ａと反応性細胞（％） １ ９ ２ １７ ３ ８ ４ １３ ５ １２ ６ １５ ７ １０ ８ ２０ ９ １７ １０ １５ １１ ９ １２ １１ 平均±標準偏差 １２．３±４ さらに実験した結果、抗−ＮＫＨ１Ａはウイルスで形質
転換した細胞または腫瘍細胞から得られた一連の１４リ
ンパ造血細胞株のすべての細胞とは反応性ではなかっ
た。
転換した細胞または腫瘍細胞から得られた一連の１４リ
ンパ造血細胞株のすべての細胞とは反応性ではなかっ
た。
【００１６】未刺激末梢血液中のＮＫＨ１Ａ＋細胞の形
態学的特徴はイムノフルオレセンス細胞分類によってこ
れらの細胞を精製することによって決定した。この目的
のために、２人の個々の提供者からの末梢血リンパ球を
抗ＮＫＨ１Ａ＋ＧＭ−ＦＩＴＣとともにインキュベート
した。少数（約５０，０００）のＮＫＨ１Ａ＋細胞をＥ
ｐｉｃｓＶセルソーターを使用して精製し、細胞遠心分
離物を調製し分析した。ＮＫＨ１Ａ＋精製フラクション
はほとんど全部（９０％以上）大きな顆粒リンパ球から
なっていた。この発見は、末梢血液中に存在する全ＮＫ
活性が、大きなサイズおよび細胞質中のアズール好性顆
粒の存在から形態学的に同定できるわずかなフラクショ
ンのリンパ球によって媒介された、という以前の研究結
果と一致する。
態学的特徴はイムノフルオレセンス細胞分類によってこ
れらの細胞を精製することによって決定した。この目的
のために、２人の個々の提供者からの末梢血リンパ球を
抗ＮＫＨ１Ａ＋ＧＭ−ＦＩＴＣとともにインキュベート
した。少数（約５０，０００）のＮＫＨ１Ａ＋細胞をＥ
ｐｉｃｓＶセルソーターを使用して精製し、細胞遠心分
離物を調製し分析した。ＮＫＨ１Ａ＋精製フラクション
はほとんど全部（９０％以上）大きな顆粒リンパ球から
なっていた。この発見は、末梢血液中に存在する全ＮＫ
活性が、大きなサイズおよび細胞質中のアズール好性顆
粒の存在から形態学的に同定できるわずかなフラクショ
ンのリンパ球によって媒介された、という以前の研究結
果と一致する。
【００１７】細胞溶解 抗ＮＫＨ１ＡはＩｇＭ抗体であるので、補体の存在下に
ヒト末梢血液中のＮＫ細胞を溶解する能力を研究するこ
とが可能であった。この目的のために、末梢血単核細胞
を培地あるいは抗ＮＫＨ１Ａと３０分間室温でインキュ
ベートした。抗Ｎ９０１（上述の）、すなわちＮＫ細胞
において指令される非溶解性ＩｇＧｉ抗体は、これらの
実験で対照として使用された。過剰の抗体を洗い、補体
を４５分間３７℃で添加した。この方法を２回繰り返し
た。次いで、残っている生細胞をカウントし、51Ｃｒ標
識標的細胞を添加した。
ヒト末梢血液中のＮＫ細胞を溶解する能力を研究するこ
とが可能であった。この目的のために、末梢血単核細胞
を培地あるいは抗ＮＫＨ１Ａと３０分間室温でインキュ
ベートした。抗Ｎ９０１（上述の）、すなわちＮＫ細胞
において指令される非溶解性ＩｇＧｉ抗体は、これらの
実験で対照として使用された。過剰の抗体を洗い、補体
を４５分間３７℃で添加した。この方法を２回繰り返し
た。次いで、残っている生細胞をカウントし、51Ｃｒ標
識標的細胞を添加した。
【００１８】この方法は、白血病Ｔ細胞株に対する自己
細胞毒性が非常に高いレベルであるために多くのＮＫ細
胞の存在を示す提供者からのＰＢＬ標的細胞に使用され
た。これらのＰＢＬを抗ＮＫＨ１Ａ＋補体で処理すると
事実上完全にＮＫ活性を失い、抗ＮＫＨ１Ａは末梢血中
のすべてのＮＫ細胞と反応することを示した。対照の処
理ＰＢＬは継続して高いレベルの細胞毒性を示した。
細胞毒性が非常に高いレベルであるために多くのＮＫ細
胞の存在を示す提供者からのＰＢＬ標的細胞に使用され
た。これらのＰＢＬを抗ＮＫＨ１Ａ＋補体で処理すると
事実上完全にＮＫ活性を失い、抗ＮＫＨ１Ａは末梢血中
のすべてのＮＫ細胞と反応することを示した。対照の処
理ＰＢＬは継続して高いレベルの細胞毒性を示した。
【００１９】ＮＫＨ１Ａ抗原の特性 免疫沈澱実験を行って抗ＮＫＨ１Ａによって明確になっ
た抗原の分子量を測定した。
た抗原の分子量を測定した。
【００２０】ウサギ抗マウスＩｇと抗ＮＫＨ１Ａとであ
らかじめ形成された複合体を使用して免疫沈澱を行っ
た。これらのあらかじめ形成された複合体を125Ｉ表面
標識ＪＴ３細胞溶解物（これらは３回、４℃で１時間ホ
ルマリン固定スタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａ細菌および／また
はウサギ抗マウスＩｇ非特異性モノクローナル抗体のあ
らかじめ形成された複合体とインキュベートしてあらか
じめ澄明にしておいた）と反応させた。あらかじめ澄明
にしておいた溶解物のアリコットを次いで特異的なあら
かじめ形成しておいた複合体と２時間４℃でインキュベ
ートした。免疫沈澱物を次いで４回ＲＩＰＡ緩衝液で洗
い、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）試料緩衝液に溶解し、１０
％ポリアクリルアミド平板ゲル上の別々の溝にのせた。
免疫沈澱の同一のアリコットは、非還元条件下および２
−メルカプトエタノールをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液
に添加した還元条件下に泳動した。ゲルを乾燥し、放射
性同位元素で標識された沈澱物を標準的方法で可視化し
た。抗ＮＫＨ１Ａは約２００−２２０ｋＤの巾広バンド
として沈澱した。さらに実験することにより、該沈澱物
を５−１５％ポリアクリルアミド勾配により分析した
が、他の特異的バンドは同定されなかった。勾配ゲルを
使用すると、１０％ポリアクリルアミドゲルに比較して
わずかに低分子量（１８０−２００ｋＤ）の特異的バン
ドが見られた。
らかじめ形成された複合体を使用して免疫沈澱を行っ
た。これらのあらかじめ形成された複合体を125Ｉ表面
標識ＪＴ３細胞溶解物（これらは３回、４℃で１時間ホ
ルマリン固定スタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａ細菌および／また
はウサギ抗マウスＩｇ非特異性モノクローナル抗体のあ
らかじめ形成された複合体とインキュベートしてあらか
じめ澄明にしておいた）と反応させた。あらかじめ澄明
にしておいた溶解物のアリコットを次いで特異的なあら
かじめ形成しておいた複合体と２時間４℃でインキュベ
ートした。免疫沈澱物を次いで４回ＲＩＰＡ緩衝液で洗
い、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）試料緩衝液に溶解し、１０
％ポリアクリルアミド平板ゲル上の別々の溝にのせた。
免疫沈澱の同一のアリコットは、非還元条件下および２
−メルカプトエタノールをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液
に添加した還元条件下に泳動した。ゲルを乾燥し、放射
性同位元素で標識された沈澱物を標準的方法で可視化し
た。抗ＮＫＨ１Ａは約２００−２２０ｋＤの巾広バンド
として沈澱した。さらに実験することにより、該沈澱物
を５−１５％ポリアクリルアミド勾配により分析した
が、他の特異的バンドは同定されなかった。勾配ゲルを
使用すると、１０％ポリアクリルアミドゲルに比較して
わずかに低分子量（１８０−２００ｋＤ）の特異的バン
ドが見られた。
【００２１】抗ＮＫＨ１Ａおよび抗Ｎ９０１は、一連の
競合的結合実験により、おそらく同一のＮＫ表面抗原分
子に対するものであることが示された。これら２つの抗
体の異なるアイソタイプ（抗ＮＫＨ１ＡはＩｇＭ、抗Ｎ
９０１はＩｇＧ1）は利点を有する。アイソタイプ特異
的ＦＩＴＣを間接イムノフルオレセンスアッセイで使用
すると、抗Ｎ９０１は効率よくＮＫＨ１Ａの結合をブロ
ックするのに対し、抗ＮＫＨ１Ａは抗Ｎ９０１の結合に
何ら有意の影響を与えない。これらの結果は、両者の抗
体が同一の細胞表面抗原に対して特異的であって、Ｉｇ
Ｇ1抗体（抗Ｎ９０１）はＩｇＭ（抗ＮＫＨ１Ａ）より
親和性が高いことを示している。
競合的結合実験により、おそらく同一のＮＫ表面抗原分
子に対するものであることが示された。これら２つの抗
体の異なるアイソタイプ（抗ＮＫＨ１ＡはＩｇＭ、抗Ｎ
９０１はＩｇＧ1）は利点を有する。アイソタイプ特異
的ＦＩＴＣを間接イムノフルオレセンスアッセイで使用
すると、抗Ｎ９０１は効率よくＮＫＨ１Ａの結合をブロ
ックするのに対し、抗ＮＫＨ１Ａは抗Ｎ９０１の結合に
何ら有意の影響を与えない。これらの結果は、両者の抗
体が同一の細胞表面抗原に対して特異的であって、Ｉｇ
Ｇ1抗体（抗Ｎ９０１）はＩｇＭ（抗ＮＫＨ１Ａ）より
親和性が高いことを示している。
【００２２】寄託 抗ＮＫＨ１を産生する細胞はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）に
寄託されており、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８５６４であ
る。
チャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）に
寄託されており、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ８５６４であ
る。
【００２３】
【効果】ＮＫ細胞およびＮＫ様細胞の確認 本発明のモノクローナル抗体を使用して末梢血液試料中
および他の組織、たとえば骨髄中のＮＫおよびＮＫ様細
胞を固定できる。
および他の組織、たとえば骨髄中のＮＫおよびＮＫ様細
胞を固定できる。
【００２４】上記抗体を使用して、臨床試料中のそのよ
うな細胞を、従来のイムノアッセイ技術、たとえば間接
イムノフルオレセンスまたは標識抗体、たとえば放射性
標識によるものを使用した直接アッセイを使用して検出
することができる。
うな細胞を、従来のイムノアッセイ技術、たとえば間接
イムノフルオレセンスまたは標識抗体、たとえば放射性
標識によるものを使用した直接アッセイを使用して検出
することができる。
【００２５】上記抗体も血漿や他の体液中のＮＫまたは
ＮＫ様細胞、あるいは細胞を含まない抗原をインビトロ
で検出するのにも使用できる。
ＮＫ様細胞、あるいは細胞を含まない抗原をインビトロ
で検出するのにも使用できる。
【００２６】循環するＮＫ細胞を検出し定量することに
よって、種々の症状とＮＫ細胞数との相関関係を明確に
でき、そのような情報により健康な人と病人のＮＫ細胞
の役割、すなわち、悪性腫瘍の破壊を含む役割を明確に
することができる。
よって、種々の症状とＮＫ細胞数との相関関係を明確に
でき、そのような情報により健康な人と病人のＮＫ細胞
の役割、すなわち、悪性腫瘍の破壊を含む役割を明確に
することができる。
【００２７】治療 ＮＫ細胞は、器官または組織移植後の移植物対宿主の病
気（ＧＶＨＤ）において有害であるかもしれないので、
本発明の上記抗体は関連のＮＫ細胞を殺すことによって
ＧＶＨＤを撲滅するのに有用であり得る。たとえば、骨
髄についていえば、抗体＋補体を使用して移植前に骨髄
を処理して、骨髄に対する宿主の拒絶反応の原因となり
うるＮＫ細胞を殺すのに使用できる。補体の存在下にＮ
Ｋ細胞を溶解する抗体の能力はＩｇＭアイソタイプの特
性であり、一般的にＩｇＭおよびＩｇＧ2抗体のみがこ
の特性を有している。組織のＮＫ細胞の撲滅速度はすで
に結合されている抗体を使用して、従来技術を使用し
て、リシンまたはアジアマイシンのような細胞毒性剤を
使用することによって増大できる。
気（ＧＶＨＤ）において有害であるかもしれないので、
本発明の上記抗体は関連のＮＫ細胞を殺すことによって
ＧＶＨＤを撲滅するのに有用であり得る。たとえば、骨
髄についていえば、抗体＋補体を使用して移植前に骨髄
を処理して、骨髄に対する宿主の拒絶反応の原因となり
うるＮＫ細胞を殺すのに使用できる。補体の存在下にＮ
Ｋ細胞を溶解する抗体の能力はＩｇＭアイソタイプの特
性であり、一般的にＩｇＭおよびＩｇＧ2抗体のみがこ
の特性を有している。組織のＮＫ細胞の撲滅速度はすで
に結合されている抗体を使用して、従来技術を使用し
て、リシンまたはアジアマイシンのような細胞毒性剤を
使用することによって増大できる。
【００２８】ＮＫ細胞をインビボで選択的にとり出すこ
とにより、一部はＮＫ細胞によって媒介されているＳＬ
Ｅのような自己免疫患者の治療に有用であることも証明
できる。
とにより、一部はＮＫ細胞によって媒介されているＳＬ
Ｅのような自己免疫患者の治療に有用であることも証明
できる。
【００２９】この抗体は、抗ＮＫＨ１Ａを使用すること
により、骨髄および腎臓のような移植物の拒絶を阻止し
て、移植物を攻撃する宿主ＮＫ細胞を不活性化するのに
有用であることも証明できる。
により、骨髄および腎臓のような移植物の拒絶を阻止し
て、移植物を攻撃する宿主ＮＫ細胞を不活性化するのに
有用であることも証明できる。
【００３０】抗体のもう１つの用途は、末梢血液または
造血組織、たとえば骨髄の細胞懸濁液、またはリンパ組
織、たとえば胸腺、脾臓、またはリンパ節組織の細胞懸
濁液からのＮＫ細胞の精製である。本発明の抗体は、従
来からの細胞分離技術、たとえば細胞分類、免疫ロゼッ
ト化、パニング、あるいはイムノアフィニティカラムク
ロマトグラフィーと組合せてそのような精製に使用でき
る。
造血組織、たとえば骨髄の細胞懸濁液、またはリンパ組
織、たとえば胸腺、脾臓、またはリンパ節組織の細胞懸
濁液からのＮＫ細胞の精製である。本発明の抗体は、従
来からの細胞分離技術、たとえば細胞分類、免疫ロゼッ
ト化、パニング、あるいはイムノアフィニティカラムク
ロマトグラフィーと組合せてそのような精製に使用でき
る。
【００３１】ＮＫ細胞のそのような精製は、特定の医学
上の疾患がＮＫ細胞の患者への注入を要する場合（患者
自身から、あるいは提供者から）有用であり得る。その
ようなＮＫ細胞の注入はたとえばＮＫ細胞による攻撃に
感受性の悪性腫瘍を処理するのに使用できる。
上の疾患がＮＫ細胞の患者への注入を要する場合（患者
自身から、あるいは提供者から）有用であり得る。その
ようなＮＫ細胞の注入はたとえばＮＫ細胞による攻撃に
感受性の悪性腫瘍を処理するのに使用できる。
【００３２】そのような治療のために患者自身のＮＫ細
胞を使用することが特に有用であることが明らかであ
る。抗ＮＫを使用して患者の血液または他の組織からＮ
Ｋ細胞を精製後、選択されたＮＫ細胞を培養して増殖さ
せ、患者に再注入できる。適当な培養方法はＨｅｒｃｅ
ｎｄら（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９， １
２９９およびＨｅｒｃｅｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒ
ｅ３０１， １５８に記載されている。
胞を使用することが特に有用であることが明らかであ
る。抗ＮＫを使用して患者の血液または他の組織からＮ
Ｋ細胞を精製後、選択されたＮＫ細胞を培養して増殖さ
せ、患者に再注入できる。適当な培養方法はＨｅｒｃｅ
ｎｄら（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９， １
２９９およびＨｅｒｃｅｎｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒ
ｅ３０１， １５８に記載されている。
【００３３】他の具体例も本発明の範囲にある。たとえ
ば、本発明の抗体は、種々の方法、たとえばフルオレセ
インを有するルガンド、重金属、または13Ｃを有する化
合物で標識できる。
ば、本発明の抗体は、種々の方法、たとえばフルオレセ
インを有するルガンド、重金属、または13Ｃを有する化
合物で標識できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 15/28 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7804−4Ｂ (72)発明者 ジェローム・リッツ アメリカ合衆国マサチューセッツ州リンカ ーン，コナント・ロード（番地なし) (72)発明者 スチアート・エフ・シュロスマン アメリカ合衆国マサチューセッツ州ニュー トン・センター，ワン・フォックス・プレ イス（番地なし)
Claims (2)
- 【請求項１】 補体の存在下インビトロでヒトＮＫ細胞
を溶解することができ、非ＮＫヒト顆粒球、非ヒト単
球、ヒト赤血球、ヒト胸腺細胞および非ＮＫヒトＴ3リ
ンパ球とは反応性でないモノクローナル抗体を産生する
ことができる、ハイブリドーマ細胞。 - 【請求項２】 ＡＴＣＣ番号がＨＢ８５６４である、特
許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US603181 | 1984-04-23 | ||
| US06/603,181 US4772552A (en) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | Monoclonal antibody which recognizes a 200-220 KD antigen on natural killer cells |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8735485A Division JPS6128000A (ja) | 1984-04-23 | 1985-04-23 | ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662845A true JPH0662845A (ja) | 1994-03-08 |
| JPH0734742B2 JPH0734742B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=24414404
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8735485A Granted JPS6128000A (ja) | 1984-04-23 | 1985-04-23 | ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクロ−ナル抗体 |
| JP4323131A Expired - Fee Related JPH0734742B2 (ja) | 1984-04-23 | 1992-12-02 | ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8735485A Granted JPS6128000A (ja) | 1984-04-23 | 1985-04-23 | ヒトｎｋ細胞溶解可能なモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4772552A (ja) |
| EP (1) | EP0160486B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6128000A (ja) |
| AT (1) | ATE71149T1 (ja) |
| CA (1) | CA1271715A (ja) |
| DE (1) | DE3585049D1 (ja) |
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| US4895796A (en) * | 1988-01-06 | 1990-01-23 | Becton Dickinson And Company | Identification of NK cells and cytotoxic T lymphocytes |
| DK172110B1 (da) | 1988-04-15 | 1997-10-27 | Gen Hospital Corp | Fremgangsmåde til isolation af mutanter af DNA-sekvenser og anvendelsen heraf til identifikation af celleoverfladeproteiner |
| US5089384A (en) * | 1988-11-04 | 1992-02-18 | Amoco Corporation | Method and apparatus for selective cell destruction using amplified immunofluorescence |
| DE69331778T2 (de) | 1992-01-08 | 2002-11-14 | The General Hospital Corp., Boston | Induzierte toleranz gegen transplantate |
| US5658564A (en) * | 1992-02-19 | 1997-08-19 | The General Hospital Corporation | Xenograft thymus |
| US5663481A (en) * | 1993-08-06 | 1997-09-02 | Mount Sinai Hospital Corporation | Animal model of the human immune system |
| EP0714510B1 (en) * | 1993-08-27 | 2002-06-19 | Dana Farber Cancer Institute | Natural killer cell-specific antigen and antibodies that identify the same |
| JP4294286B2 (ja) | 2002-09-24 | 2009-07-08 | 富士重工業株式会社 | 車両の差動制限制御装置 |
| CA2564246A1 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Innate Pharma | Compositions and methods for treating immunoproliferatifs disorders such as nk-type ldgl |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4607007A (en) * | 1983-04-07 | 1986-08-19 | Becton, Dickinson And Company | Differentiation of natural killer cell subpopulations of cells |
| US4599307A (en) * | 1983-07-18 | 1986-07-08 | Becton, Dickinson And Company | Method for elimination of selected cell populations in analytic cytology |
| US4599304A (en) * | 1983-10-07 | 1986-07-08 | Becton, Dickinson And Company | Method for monitoring activated cell subpopulations |
| US4572834A (en) * | 1984-04-10 | 1986-02-25 | Clinical Reference Laboratory, Inc. | Biologic and method of preparing same |
-
1984
- 1984-04-23 US US06/603,181 patent/US4772552A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-22 DE DE8585302806T patent/DE3585049D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-22 CA CA000479685A patent/CA1271715A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-22 AT AT85302806T patent/ATE71149T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-22 EP EP85302806A patent/EP0160486B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-23 JP JP8735485A patent/JPS6128000A/ja active Granted
-
1992
- 1992-12-02 JP JP4323131A patent/JPH0734742B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0160486A2 (en) | 1985-11-06 |
| CA1271715A (en) | 1990-07-17 |
| EP0160486B1 (en) | 1992-01-02 |
| JPH0734742B2 (ja) | 1995-04-19 |
| EP0160486A3 (en) | 1987-06-16 |
| ATE71149T1 (de) | 1992-01-15 |
| DE3585049D1 (de) | 1992-02-13 |
| JPS6128000A (ja) | 1986-02-07 |
| JPH0588115B2 (ja) | 1993-12-21 |
| US4772552A (en) | 1988-09-20 |
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Legal Events
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