JPH0819106B2 - 化学ルミノゲン標識としてのアクリジニウム化合物 - Google Patents

化学ルミノゲン標識としてのアクリジニウム化合物

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JPH0819106B2 JP63318327A JP31832788A JPH0819106B2 JP H0819106 B2 JPH0819106 B2 JP H0819106B2 JP 63318327 A JP63318327 A JP 63318327A JP 31832788 A JP31832788 A JP 31832788A JP H0819106 B2 JPH0819106 B2 JP H0819106B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は化学ルミネセンス標識として使用することが
できるアクリジニウム化合物に関する。
式２を有し、式中に存在する置換基R4が生物学的に重
要な物質と反応できる官能性基を含む化学ルミノゲンア
クリジニウム化合物はヨーロツパ特許出願第82,636号お
よび同第216,553号から知られている。このようなアク
リジニウム化合物によるヌクレオチドの標識付けはヨー
ロッパ特許出願第212,951から知られている。
化学ルミネセンスは電磁放射線（光）が化学反応の結
果として発射される現象である。通常、この反応の性質
から、電子的に励起された状態で生成される反応生成物
が含まれる。この励起状態の生成物はその過剰のエネル
ギーを電磁放射線の形で失なうことによつて、正常な基
底状態に戻ることができる。ヨーロツパ特許出願第82,6
36号に記載されているようなアクリジニウム化合物の場
合に〔Clin.Chem.29（８）、1474〜1479頁（1983年）を
また参照できる〕、化学ルミネセンスは下記の反応経
路： に化合物２について図示されているような経路で塩基性
過酸化水素との反応により生起する。
放射性同位元素を含む化合物とまさに同様に、化学ル
ミノゲン化合物はこれらの化合物で標識された物質を検
出するために、標識として使用することができる。放射
能を有する標識に優る化学ルミノゲン標識の利点は健康
に対する害が少なく、感度が高くそして貯蔵寿命が長い
ことにある。
この種の標識は特に生物学的系に対して使用されてい
る。この方法により、タンパク質、炭水化物、核酸およ
びその他の生物学的関連化合物を検出できるばかりでな
く、またこれらの化合物と適当な反応相手との生物学的
反応を追跡することもできる。このような例には、薬物
とその受容体との相互反応毒素とのその受容体または解
毒剤との相互反応、およびさらに特に免疫学的抗原−抗
体反応が含まれる。
化学ルミネセンス反応を使用する特別の検定系には励
起状態の生成物（ドナー）のエネルギーが光として直接
に発射されず、この発射線を持たないエネルギーが適当
な受容体、たとえば螢光化合物に転移される系がある。
この受容体はドナーの化学ルミネセンスの波長とは異な
る波長によつて、このエネルギーを電磁放射線として失
なうことができる。この現象は、たとえばT.Trsterに
より〔Ann.Phys.（Leipzig）2、55〜75頁（1948年）〕
およびZ.Naturforschにより〔4a、321〜334頁（1949
年）〕記載されている。発射される光の波長は受容体ま
たはドナー‐受容体複合体について特異的であるので螢
光化合物またはドナー‐複合基質（たとえば抗原）で標
識された抗体であることができる受容体は結合した複合
体を分離する必要なく、測定することができる。このい
わゆるホモジニアス化学ルミネセンスエネルギー転移検
定法（homogeneouschemiluminescence energy transfer
assay）は標識としてイソルミノール誘導体を使用して
開示されている〔A.PatelおよびA.K.CampbellによるCli
n.Chem.29（９）、1604〜1608頁（1983年）参照〕。し
かしながら、ルミノールおよびイソルミノールならびに
その誘導体の欠点はそれらの比較的低い量子収率にあ
る。さらにまた、これらの化合物の化学ルミネセンス反
応の開始には触媒が必要である。
ヨーロツパ特許出願第82,836号および同第216,553号
に記載されているアクリジニウム化合物の欠点は、これ
らの化合物がエネルギー転移化学ルミネセンスにもとず
くホモジニアス免疫検定法を行なうのに有用でないこと
にある。これらの従来技術の化合物のもう一つの欠点は
生物学的流体中におけるそれらの制限された安定性にあ
る。
ここに、或る群の化学ルミノゲン化合物がヘテロジニ
アスおよびホモジニアスの両方の免疫検定法のような生
物学的検定法において、標識として有用であることが見
い出された。しかも、これらの化合物はきわ立つた安定
性を有することが見い出された。
本発明によるアクリジニウム化合物は次式１で示され
る特徴を有する： 〔式中Ａは二価の有機介在基であり、 Ｘは過酸化水素との反応により、アクリジンC9位にジ
オキセタンを生じさせ得る基であり、有機基質とカップ
リングできる官能基を含まず、 Ｙは対イオンであり、 Ｚは有機基質とカップリングできる官能基であり、 そして式中ベンゼン環は１個または２個以上の置換基を
有することができる〕で示されることを特徴とする、化
学ルミノゲン標識として使用できるアクリジニウム化合
物。ただし、Ｘがアリールスルホニルカルバモイル基で
ある場合にＺがスルホ基である化合物を除く。
一方で、本発明による化合物は化学ルミノゲン官能性
を有する、すなわち、これらの化合物は化学反応によつ
て、その過剰のエネルギーを光の形態で失なう電子励起
状態の生成物に転移させることができる。この官能性は
アクリジンのC9位に存在する。他方で、これらの化合物
はカプリング性を有する、すなわちこれらの化合物は、
たとえばタンパク質のような生物学的活性物質およびま
たたとえば毒物学的に関連する化合物と結合できる官能
基を有機スペーサーを経て有している。このカプリング
性はアクリジンの窒素原子に存在する。この二重の機能
によつて、本発明による化合物は、たとえば免疫検定の
目的に、標識として有用である。被検定物質（analyt
e）との、あるいは被検定物質を分析するための試薬と
の特異的カップリングによって生成する結合物（カップ
リング生成物）の存在または試薬との相互反応の存在を
化学ルミネセンスを用いて検出することができる。
本発明によるアクリジニウム化合物の利点は、化学ル
ミネセンス反応、すなわち過酸化水素と反応してジオキ
セタンを介して励起アクリドンを生成する反応の期間に
わたり、発光体と被検定物質とのカプリングが維持され
ることにある。その結果として、励起状態の生成物のエ
ネルギーはカプリング生成物または複合体のどこかに存
在するフルオレセインおよびルシフアーイエロー（Luci
fer Yellow）のような受容体に転移させることができ
る。この場合に、エネルギー転移はイソルミノール形の
化学ルミネセンスドナーに比較してより効率が良く、さ
らにまた、化学ルミネセンスの開始に触媒を必要としな
い。
本発明による化合物のもう一つの利点は、カプリング
生成物（たとえば、本発明のアクリジニウム化合物で標
識されたステロイドのような生物学的活性化合物）の化
学ルミネセンス反応がたとえば抗体または解毒体のよう
な標識付けされた化合物と反応する物質の存在に依存し
て生起することにある。この種の免疫反応の場合に、免
疫複合体の化学ルミネセンスのキネティクスは非複合の
標識付けされた化合物の化学ルミネセンスのキネティク
スとは異なつている（この関係についてはヨーロツパ特
許出願第103,469号を参照できる）。これは化学ルミネ
センスの最高発光時点における変化として測定すること
ができる。このメカニズムに従いホモジニアス免疫検定
においてまた生成する免疫複合体は分離する必要はな
い。
二価の有機介在基は、アクリジニウム部分と基質の官
能基との間を架橋する、いわゆるスペーサーとして機能
する。この基質は基Ｚにより結合される。Ａの長さは官
能基Ｚと基質の官能基との反応が可能であるような長さ
である。従つて、この最小長さは式１で示される化合物
と結合させる基質に依存する。基Ａの種類はこの基が官
能基Ｚの反応性または基Ｘと過酸化水素との所望の反応
を干渉しないかぎり、重要ではない。基Ａはアルキレン
基、アリーレン基、カルボニル基、たとえばエステル
基、チオエステル基、アミド基のような形で組合されて
いる窒素、酸素およびイオウのようなヘテロ原子などを
含むことができる。基Ａはまた、たとえばジカルボン
酸、ジチオール、ヒドロキシ酸、アミノ酸、チオ酸など
のような二官能性単位から構成されていてもよい。
基Ａはいずれかの非干渉性二価有機基であることがで
きるが、本発明の好適態様では、複雑な合成工程を回避
するために、好ましくは単純な有機残基、たとえば１個
または２個以上のヘテロ原子および（または）カルボニ
ル基を含有していてもよい、二価の炭化水素基から選択
する。さらに特に、Ａは炭素原子１〜４個を有するアル
キレン基である。
Ｘは過酸化水素との反応の後に、1,2−ジオキセタン
を生成できるいづれかの基であることができる。このジ
オキセタンは過酸化水素から生じる２個の酸素原子に加
えて、アクリジンのC9位原子を含む。従つて、基Ｘは、
たとえば過酸化水素との反応によつて負に帯電したイオ
ンとして分離されうる基で置換されている炭素原子でな
ければならない。このような置換基の例には、ハロゲン
原子、アルコキシ、アリールオキシ、スルホンアミドま
たはアルキルチオ基、あるいはアンモニウムまたはスル
ホニウム基が含まれる。基Ｘの例には、１−ハロアルキ
ル、１−アルコキシアルキル、シアノなどが含まれる。
好ましくは、基Ｘはアルコキシカルボニルまたは活性化
されたカルバモイル基であり、あるいはさらに特に、ア
リールオキシカルボニル基またはアリールスルホニルカ
ルバモイル基である。
アニオンＹは対イオンであり、ハロゲン、スルフエー
ト、アレンスルホネートなどのようないずれかのアニオ
ンであることができる。一例として、Ｙはアクリジン窒
素原子における四級化反応中に脱離基として働くイオン
であることができる。
基Ｚは有機基質とカプリングできる官能基である。Ｚ
の選択は基質に存在する官能基に依存する。基質が、た
とえばアミノ基、ヒドロキシ基またはメルカプト基を有
する場合には、Ｚはカルボキシル基、またはその反応性
誘導体、たとえばエステル、酸クロライドなどであるこ
とができる。この場合に、カツプリングは（チオ）−エ
ステルまたは（チオ）−アミド結合の形成により達成さ
れる。ヨーロツパ特許出願第82,636号でも使用されてい
る適当な基にはＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル
基がある。Ｚはまた、イソシアネートまたはイソチオシ
アネートであることもでき、この場合のカツプリングは
尿素またはウレタンの形成、あるいはそのモノ−または
ジ−チオ同族体の形成により達成される。アミノ、ヒド
ロキシおよび（または）メルカプト基と反応できるその
他の使用できるＺ基には、場合によりそのβ位置がカル
ボニルまたはアルケン官能基により活性化されているハ
ライド、スルホン酸およびリン酸の誘導体、アジド、場
合によりプロトン付与されているカルボキシイミデート
が含まれる。
基質がカルボキシル基またはその誘導体、たとえばエ
ステルを含む場合には、Ｚは、たとえばアミノ官能基で
あることができる。
最も好ましい化合物は式１において、Ｚがカルボキシ
ル基またはその反応性誘導体である相当するアクリジニ
ウム化合物である。
本発明による化合物はそれ自体既知の方法により製造
することができる。原料物質はアクリジンまたは９位置
で適当に置換されているアクリジン、たとえばアクリジ
ン−９−カルボン酸またはその誘導体、９−ハロメチル
−、９−アルコキシメチル−または９−アリールオキシ
メチル−アクリジンであることができる。アクリジン−
９−カルボン酸は適当なエステルまたはアシル化スルホ
ンアミドに、あるいは過酸化水素との反応後にジオキセ
タンを生成できるその他の誘導体に変換することができ
る。この９−置換アクリジン化合物はアクリジン窒素原
子の位置で次いで四級化させることができ、その後で、
スペーサーＡを形成させ、次いで基Ｚを有する単位を結
合させることができる。さらに特に、アクリジン窒素原
子は基Ａ−Ｚにより四級化させることができ、この場合
には、アクリジンを化合物Ｙ′−Ａ−Ｚ（式中Ｙ′は反
応性基、たとえばハロゲン原子または他の脱離性基であ
る）と反応させる。望ましくない反応を避けるために、
官能基Ｚはその合成中、保護すると好ましいこともあ
る。基Ｚの保護は既知の方法で行なうことができる。す
なわち、Ｚがカルボキシル基である場合に、この基は、
たとえば第三ブチル、ベンジル、スクシンイミジルエス
テルなどのようなエステルの形で保護することができ
る。
本発明によるアクリジニウム化合物は下記の反応経路
で示される過酸化水素との反応の後に、化学ルミネセン
スを示す： この反応経路図において、各式中基Ｘは基CR2L（式中
基Ｒはそれぞれ、たとえば水素またはアルキルである
か、またはＲは一緒になつてオキソ基を形成しており、
そしてＬは脱離性基、たとえばハロゲン原子、アリール
オキシ基、スルホンアミド基またはアンモニウム基など
を表わす）として示されている。過酸化水素および塩基
と反応すると、アクリジニウム化合物１′は基Ｌの脱離
を付随して、スピロジオキセタン４に変換される。この
ジオキセタンまたはジオキセタノンはCR2＝Ｏ分子を失
ない、式５で示される励起状態アクリドンを生成し、こ
の励起状態アクリドン５は発光を伴い、基底状態に戻
る。この化学ルミネセンスは既知の装置、たとえばLUMA
C Biocounter 2010を用いて測定することができる。
式１で示される化合物は過酸化水素との反応の後に、
一般に420nmの波長を有する化学ルミネセンスを示す。
基Ｘ（＝CR2L）がフエノキシカルボニル基であり、そし
て基Ａ−Ｚがカルボキシメチル基である化合物は過酸化
水素との反応の後に、420nmの波長を有する化学ルミネ
センスを示す。この化合物の検出限界は約16attomol
（＝16×10-18モル）に相当する8fg（＝８×10-15ｇ）
より低い。周知のように、化学ルミネセンスは分析用途
を有することができる。化合物１を基質に標識として付
与し、このカツプリング生成物を非カプリングアクリジ
ニウム化合物から分離すると、過酸化水素との反応によ
る化学ルミネセンスの強度がこのカツプリング生成物の
濃度の尺度になり、この濃度は基質の量に関連すること
ができる。
本発明はまた、化学ルミネセンスを用いる免疫検定法
における式１で示されるアクリジニウム化合物の使用に
関する。
この場合に、化学ルミノゲン化合物１を免疫反応に含
まれる物質、たとえば抗原に結合させる。この標識され
た抗原は免疫反応にまた含まれる物質、たとえば抗体と
複合体を形成するか、または他の相互反応の後に、標識
された複合体を生成する。この標識された複合体は（非
複合体形成抗原の分離後に）、化学ルミネセンス定量ま
たは定性分析法で検定することができる。
本発明はまた、化学ルミネセンスおよびエネルギー転
移による免疫検定法における式１で示されるアクリジニ
ウム化合物の使用に関する。
この場合に、抗体をエネルギー受容体、たとえば螢光
性化合物に結合させ、その後、抗原−抗体複合体を、非
複合体形成抗原の分離を必要とすることなく、化学ルミ
ネセンスおよひエネルギー転移により測定することがで
きる。本発明による化合物はアクリジニウム部分から受
容体へのエネルギー転移の効率が非常に良好であり、し
かも化学ルミネセンス反応中にドナー（アクリジン化合
物）−受容体解離が生じないことから、この種の検定法
に極めて適している。
本発明はさらにまた、免疫学的反応に含まれる物質に
結合された式１で示される化合物に関する。
本発明はまた、エネルギー転移と組合せたまたは組合
されていない、化学ルミネセンスにおる免疫反応および
免疫物質の検定に、式１で示されるアクリジニウム化合
物と免疫学的反応に含まれる物質との前記カツプリング
生成物を使用することに関する。
実施例 例１ フエニルアクリジン−９−カルボキシレートの製造 アクリジン−９−カルボン酸（5g）を塩化チオニル
（75ml）に懸濁する。混合物を４時間、還流下に攪拌す
る。過剰の塩化チオニルを留去する。残留物をピリジン
（75ml）に懸濁し、混合物を室温で10分間攪拌する。フ
エノール（4.5g）を懸濁液に加える。生成する反応混合
物を室温で16時間攪拌する。生成する溶液を１規定塩酸
（200ml）中に注ぎ入れる。生成された沈殿（6.5g）を
濾別し、ベンゼン／シクロヘキサンから再結晶させる。
融点:192℃;IR（KBr）:1750、1177cm-1;MS:299、206、1
78、152、151;1H−NMR:δ7.5〜8.5。
例２ ４−メトキシフエニルアクリジン−９−カルボキシレー
トの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに４−メ
トキシフエノールを用いて製造する。融点:202.4〜203
℃；1H−NMR:δ3.86、6.9〜8.3;MS:329、206、178。
例３ ４−クロロフエニルアクリジン−９−カルボキシレート
の製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、４−
クロロフエノールを用いて製造する。融点:169.6〜170.
2℃；1H−NMR:δ7.3〜8.4;MS:333、206、178。
例４ ４−アセチルフエニルアクリジン−９−カルボキシレー
トの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、４−
ヒドロシアセトフエノンを用いて製造する。融点:214.2
〜214.8℃；1H−NMR:82.69、7.5〜8.3;MS:341、206、17
8。
例５ 2,5−ジメチルフエニルアクリジン−９−カルボキシレ
ートの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、2,5
−ジメチルフエノールを用いて製造する。融点:187〜19
0℃；1H−NMR:δ2.3、2.4、7.0〜8.4;MS:327、206、17
8。
例６ 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロピルアクリジ
ン−９−カルボキシレートの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、1,1,
1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを用いて
製造する。融点:143.2〜145℃；1H−NMR:δ6.0〜6.5、
7.4〜8.3;IR:2988、1782、1200〜1000cm-1;MS:373、20
6、178。
例７ 2,7−ジメトキシアクリジン−９−カルボン酸の製造 ジクロロメタン（75ml）中の4,4′−ジメトキシジフ
エニルアミン（7.45g）の溶液をジクロロメタン（50m
l）中のオキサリルクロライド（4.68g）の攪拌溶液に滴
下して加える。反応混合物を20分間還流させ、次いで蒸
発させる。残留物（10.06g）をジクロロメタン（100m
l）に溶解する。この攪拌溶液に、三塩化アルミニウム
（18.16g）を少しづつ加える。添加が終了した後に、混
合物を50分間、還流させる。溶媒を除去し、残留物を氷
/1モル塩酸の混合物（1/1、300ml）中の注ぎ入れる。赤
褐色生成物を濾取する。この生成物を10％水酸化カリウ
ム水溶液（100ml）に溶解し、一夜にわたり還流させ、
室温まで冷却させた後に、氷/5モル塩酸（3/1、500ml）
中に注ぎ入れる。2,7−ジメトキシアクリジン−９−カ
ルボン酸の黄色結晶を濾取する。この粗生成物は塩基
（KOH）溶液（メタノール）を酸性にすることにより精
製する。収量:8.03g（86％）。融点：＞290℃；1H−NM
R:δ10.5、7.2〜8.6、3.95;IR:3526、2835、1614cm-1;M
S:283、268、240、196、169。
例８ フエニル2,7−ジメトキシアクリジン−９−カルボキシ
レートの製造 この化合物は例１に従い、アクリジン−９−カルボン
酸の代りに、2,7−ジメトキシアクリジン−９−カルボ
ン酸を使用して製造する。1H−NMR:δ3.98、7.5〜8.2;I
R:2838、1738、1619、822cm-1;MS:359、266、238。
例９ Ｎ−フエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニルアクリジン
−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
フエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンアミドを使用して
製造する。NMR:δ6.98〜8.12、2.54;MS:452、298、20
6、178、151、91。
例10 Ｎ−２−クロロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル
アクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
２−クロロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンアミド
を使用して製造する。融点:244.5℃;NMR:δ6.5〜8.5、
2.38。
例11 Ｎ−４−メトキシフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニ
ルアクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
４−メトキシフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンアミ
ドを使用して製造する。融点192.8℃;NMR:δ6.25〜8.1
5、3.50、2.57;MS:482、328、206、178、151。
例12 Ｎ−2,5−ジクロロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホ
ニルアクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
2,5−ジクロロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンア
ミドを使用して製造する。NMR:δ7.0〜8.3、2.38。
例13 Ｎ−３−クロロ−５−メチルフエニル−Ｎ−ｐ−トルエ
ンスルホニルアクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
３−クロロ−５−メチルフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンス
ルホンアミドを使用して製造する。
例14 Ｎ−２−メトキシフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニ
ルアクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
２−メトキシフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンアミ
ドを使用して製造する。NMR:δ6.6〜8.4、3.63、2.34。
例15 Ｎ−４−メトキシフエニル−Ｎ−４−ニトロフエニルス
ルホニルアクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
４−メトキシフエニル−Ｎ−４−ニトロフエニルスルホ
ンアミドを使用して製造する。NMR:δ6.5〜8.3、3.71。
例16 Ｎ−４−ニトロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル
アクリジン−９−カルボキシアミドの製造 この化合物は例１に従い、フエノールの代りに、Ｎ−
４−ニトロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホンアミド
を使用して製造する。NMR:δ7.0〜8.5、2.6。
例17 ｔ−ブチルヨードアセテートの製造 ｔ−ブチルクロロアセテート（20g）とヨー化ナトリ
ウム（25g）との混合物をアセトン（200ml）中で20時間
攪拌する。アセトンを減圧で留去し、残留物をジエチル
エーテル（100ml）と水（50ml）とに分配させる。エー
テル層を水、５％チオ硫酸ナトリウム溶液、次いで水で
洗浄する。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次い
で減圧下に蒸発させる。ｔ−ブチルヨードアセテート25
gが得られる。NMR:δ3.5、1.38。
例18 ベンジルヨードアセテートの製造 この化合物は例17に従い、原料としてベンジルクロロ
アセテートを使用して製造する。
例19 ｔ−ブチル−３−ヨードプロピオネートの製造 ジクロロメタン（200ml）中の３−クロロプロピオニ
ルクロライド（20g）、ピリジン（20g）およびｔ−ブタ
ノール（20g）の混合物を室温で20時間攪拌する。反応
混合物を水（200ml）中に注ぎ入れる。有機相を水、0.1
モル塩酸、水、次いで５％炭酸水素ナトリウムで洗浄す
る。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後に、有機溶媒を減
圧下に留去する。残留物の一部分（5g）をアセトン（10
ml）に溶解し、アセトン中のヨー化ナトリウム（8g）の
溶液で処理する。反応混合物を20時間還流および攪拌す
る。例17に記載のとおりに仕上げ処理し、ｔ−ブチル３
−ヨードプロピオネート6.5gを得る。
例20 ９−フエノキシカルボニル−10−カルボキシメチルアク
リジニウムブロマイドの製造 フエニルアクリジン−９−カルボキシレート（100mg）
とｔ−ブチルヨードアセテートとの混合物を110℃で５
時間、攪拌加熱する。生成する溶液をジエチルエーテル
（25ml）中に注ぎ入れ、生成する沈殿を濾取する。この
沈殿の一部分（10mg）を酢酸（1ml）中の33％臭化水素
酸とともに攪拌し、次いで50℃で２時間加熱する。反応
混合物を水中に注ぎ入れ、生成する沈殿（約6mg）を単
離する。MS:358、314、300、237、220、206。
例21 ９−フエノキシカルボニル−10−カルボキシエチルアク
リジニウムブロマイドの製造 フエニルアクリジン−９−カルボキシレート（100m
g）とｔ−ブチル３−ヨードプロピオネート（5g）との
混合物を130℃で16時間、攪拌加熱する。生成する溶液
をベンゼン（25ml）中に注ぎ入れ、生成する沈殿を濾別
する。この沈殿の一部分（10mg）を酢酸（1ml）中の33
％臭化水素酸とともに攪拌し、次いで50℃で２時間加熱
する。反応混合物を水中に注ぎ入れ、生成する沈殿（約
6mg）を単離する。
例22 10−カルボキシメチル−９−Ｎ−フエニル−Ｎ−ｐ−ト
ルエンスルホニルカルバモイル−アクリジニウムブロマ
イドの製造 この化合物は例20に従い、フエニルアクリジン−９−
カルボキシレートの代りにＮ−フエニル−Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニルアクリジン−９−カルボキシアミドを使
用して製造する。NMR:δ6.8〜9.1、6.61、2.55;MS:51
1、357、237。
例23 10−カルボキシメチル−９−Ｎ−２−クロロフエニル−
Ｎ−ｐ−トルエンスルホニルカルバモイル−アクリジニ
ウムブロマイド（アクリジニウム化合物Ｂ）の製造 この化合物は例20に従い、フエニルアクリジン−９−
カルボキシレートの代りに、Ｎ−２−クロロフエニル−
Ｎ−ｐ−トルエンスルホニルアクリジン−９−カルボキ
シアミドを使用して製造する。NMR:δ6.9〜8.8、6.45、
2.5。
例24 10−カルボキシメチル−９−フエノキシカルボニル−2.
7−ジメトキシアクリジニウムブロマイドの製造 この化合物は例20に従い、フエニルアクリジン−９−
カルボキシレートの代りに、フエニル2.7−ジメトキシ
アクリジン−９−カルボキシレートを使用して製造す
る。
例25 ９−フエノキシカルボニル−10−カルボキシメチルアク
リジニウムブロマイド（アクリジニウムエステルＡ）の
化学ルミネセンス メタノール（1ml）中のアクリジニウムエステルA0.1m
gを含有する貯蔵溶液を作る。この貯蔵溶液を0.001モル
塩酸中でさらに稀釈する。この稀釈溶液を塩基性過酸化
水素（この試薬は５モル水酸化ナトリウム水溶液100マ
イクロリツターおよび30％過酸化水素20マイクロリツタ
ーを水20ml中で稀釈することにより新しく調製する）で
処理した場合に生じる化学ルミネセンスをLUMAC Biocou
nter 2010を用いて測定する。第１図に示されている使
用量−応答曲線が得られる。
例26 活性化された10−カルボキシメチル−９−Ｎ−２−クロ
ロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニルカルバモイル
−アクリジニウムブロマイドを使用する卵白アルブミン
の標識付け アクリジニウム化合物Ｂ（1mg）をジメチルホルムア
ミド（DMF、0.05ml）に溶解する。この溶液に、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド（0.5mg）およびDMF中のジシク
ロヘキシルカルボジイミド（DCC）の溶液（0.1g/ml、0.
015ml）を加える。混合物を６℃で20時間インキユベー
トすると、標識用溶液が得られる。卵白アルブミン（1m
g）を標識用緩衝液（0.1Mリン酸塩緩衝液、pH8.0、0.1m
l）に溶解し、上記標識用溶液（0.01ml）で処理する。
２時間後に、標識付けされたタンパク質をSephadex G 2
5上のゲル濾過により、遊離の標識から分離する。溶出
留分は化学ルミネセンス測定により分析する。
例27 活性化された10−カルボキシメチル−９−Ｎ−２−クロ
ロフエニル−Ｎ−ｐ−トルエンスルホニルカルバモイル
−アクリジニウムブロマイドを使用するヒトIgGの標識
付け この標識付け操作は例26における卵白アルブミンの標
識付けに係る記載と同様に行なう。PBS緩衝液（pH7.0）
中で調製された標識付けされたヒトIgGの稀釈曲線は室
温で24時間放置した後でも、いずれの変化も示さなかつ
た。
【図面の簡単な説明】
第１図は例25のアクリジニウムエステルＡの化学ルミネ
センスを示す使用量−応答曲線である。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式１ 〔式中Ａは二価の有機介在基であり、 Ｘは過酸化水素との反応により、アクリジンC9位にジオ
    キセタンを生じさせ得る基であり、有機基質とカップリ
    ングできる官能基を含まず、 Ｙは対イオンであり、 Ｚは有機基質とカップリングできる官能基であり、 そして式中ベンゼン環は１個または２個以上の置換基を
    有することができる〕で示されることを特徴とする、化
    学ルミノゲン標識として使用できるアクリジニウム化合
    物。ただし、Ｘがアリールスルホニルカルバモイル基で
    ある場合にＺがスルホ基である化合物を除く。
  2. 【請求項２】Ｘが置換されていてもよいアルコキシカル
    ボニル基、アリールオキシカルボニル基、およびアリー
    ルスルホニルカルバモイル基からなる群から選ばれる請
    求項１に記載のアクリジニウム化合物。
  3. 【請求項３】Ｚがカルボキシル基またはその反応性誘導
    体である請求項１または２に記載のアクリジニウム化合
    物。
  4. 【請求項４】Ｘが、置換されていてもよいアルコキシカ
    ルボニル基、アリールオキシカルボニル基またはアリー
    ルスルホニルカルバモイル基であり、Ｚがカルボキシル
    基またはその反応性誘導体である請求項１〜３のいずれ
    かに記載のアクリジニウム化合物。
  5. 【請求項５】Ａが二価の炭化水素基であり、この基は１
    個または２個以上のヘテロ原子および（または）カルボ
    ニルを含有していてもよい請求項１〜４のいずれか１項
    に記載のアクリジニウム化合物。
  6. 【請求項６】Ａが炭素原子１〜４個のいずれかを含有す
    るアルキレン基である請求項１〜５のいずれかに記載の
    アクリジニウム化合物。
  7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の化合物と
    免疫反応に含まれる物質とのカップリング生成物（標識
    物）。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のカップリング生成物を免
    疫反応に用い、化学ルミネセンス測定により定量または
    定性分析することを特徴とする免疫検定法。
  9. 【請求項９】請求項７に記載のカップリング生成物を免
    疫反応に用い、該カップリング生成物と該カップリング
    生成物に対する免疫反応に含まれる物質との複合体を形
    成させたのち、化学ルミネセンス測定により定量または
    定性分析することを特徴とする請求項８に記載の免疫検
    定方法。
  10. 【請求項１０】請求項７に記載のカップリング生成物
    と、エネルギー受容体を結合した該カップリング生成物
    に対する免疫反応に含まれる物質とを免疫反応に用い、
    反応系内で該カップリング生成物より形成された複合体
    と複合体を形成していない該カップリング生成物とを分
    離する工程を行うことなく、化学ルミネセンスおよびエ
    ネルギー転移を測定することを特徴とする免疫検定方
    法。
  11. 【請求項１１】請求項１〜６のいずれか１項に記載の化
    合物と抗原とのカップリング生成物と、エネルギー受容
    体を結合した抗体とを免疫反応に用い、反応系内で該カ
    ップリング生成物より形成された複合体と複合体を形成
    していない該カップリング生成物とを分離する工程を行
    うことなく、化学ルミネセンスおよびエネルギー転移を
    測定することを特徴とする免疫検定方法。
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