JPH05268982A - 骨形成作用を有する新規な蛋白質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織から得
られるＯＳＦ−２と名付けられた骨関連蛋白質。本蛋白
質は骨形成において、重要な役割を担っている新しい天
然型哺乳類蛋白質であり、骨誘導部位における骨形成の
過程において関与する細胞を導くガイディング（guidin
g)蛋白質もしくは接着分子または成長因子として作用す
る。ＯＳＦ−２は組換え遺伝子技術によっても得られ
る。 【効果】 ＯＳＦ−２は、骨疾患の治療剤として用いる
ことができ、また骨に対する臓器特異性が高く、骨疾患
の診断薬として用いることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な骨関連蛋白質を
提供する。本発明の蛋白質はＯＳＦ−２と名付けられ、
マウス、ヒトを含む哺乳動物の骨組織より得ることがで
きる。また、本発明は組換え遺伝子技術によるＯＳＦ−
２の産生方法も提供する。

【０００２】

【従来の技術】特異的細胞接合は、多くの生物学的現象
において、非常に重要な働きを示している。その例をあ
げると、細胞に分離された動物組織が自動的に元の組織
と同様な構造を再形成するという報告がある（Moscona
and Moscona （1952）, J. Anat., vol.86, p287-301;
Townes and Holtfreter（1955）, J. Exp. Zool., vol.
128, p53-120; Weiss and Tayler（1960） Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol.46, p1177-1185）。ある動物種
では、分散された胚細胞が完全な胚組織を再構成すると
いう報告もある（Guidice（1962）, Develop. Biol., v
ol.5, p402-411;Spiegel and Spiegel（1975）, Am. Zo
ol., vol.15,p583-606）。

【０００３】これらの生物組織の再構成は、少なくとも
一部は個々の細胞の内在的な形態形成能によっていると
考えられている。こうした形態形成能を有している細胞
の重要な性質は、同一の又は異なった細胞型を識別でき
る能力であり、種々の細胞と混合された時自分自身と同
じタイプの細胞とうまく接合する能力であることも示唆
されてきた。（Roth and Weston（1967），Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol.58, p974-980）。そうした細胞
間の接合の選択性が、複数の細胞から構成される組織の
組織化において、重要な働きをしている。これまでに
も、種々の細胞接着分子が同定されてきた（Damsky et
al.,(1984),“The Biology of Glycoproteins”(ed. R.
J.Ivatt)，p1-64, New York, Plenum Publishing C
o.）。ひとつの例では、特異的な細胞接着分子が、神経
の成長円錐の伸張および方向性の決定を制御していた
（Jessell(1988)，Neuron, vol.1, p3-13）。

【０００４】他にも、種々の神経性接着分子が同定され
てきており、成長期の脊椎動物の神経系において、軸索
の成長や方向性の決定、線維束形成を仲介することが明
らかになってきた。そうした蛋白質の多くは、その遺伝
子の塩基配列が決定され、これまでに確かめられたそれ
ぞれの神経性接着因子、例えば、神経性細胞接着因子の
Ｎ−ＣＡＭ、Ｌ１、コンタクチン（contactin）Ｆ１
１、Ｎ−カドヘリン（cadherin）が、細胞接着分子のい
くつかのファミリーの一つに属することが明らかになっ
てきた。しかしながら、現在まで知られている細胞特異
的細胞接着分子の数は多いのにもかかわらず、骨細胞生
物学の分野では、未だにそうした細胞特異的細胞接着分
子の報告はない。

【０００５】骨形成の過程は、二つの異なったステップ
で開始出来る。即ち、１）内軟骨性（endochondral）骨
化と、２）膜内（intra membranous）骨化である。内軟
骨性骨化過程では、軟骨が形成され、カルシウムが沈着
する。カルシウム沈着軟骨は、吸収され、最終的に新生
骨と置き換わる。膜内骨化過程では、原結合組織から直
接に骨が形成される。いずれのケースでも、骨芽細胞の
侵入と集合がカルシウム沈着した軟骨又は、結合組織で
みられる、骨形成時の最初の現象で有り、それ故骨化に
おいて重要なステップである。

【０００６】必要十分な量の骨芽細胞を呼び寄せ、集合
させることが、自己刺激性（autocrine）の成長因子、
例えば骨形成因子 Bone morphogenetic protein（BM
P）、Insulin-like growth factor（IGF）、Transformi
ng growth factor-beta（TGFb）を効率的に働かせるた
めに必須である。ＯＳＦ−２は、骨形成の初期に、軟骨
細胞、又は、骨芽細胞の集合に必須の分子である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明により提供される
蛋白質は、骨形成において重要な役割を担っている新し
い天然型哺乳類蛋白質ＯＳＦ−２と名付けたグループで
あり、より具体的には本発明中に記載されているヒト及
びマウスのＯＳＦ−２である。ＯＳＦ−２は、骨誘導部
位における骨形成の過程において関与する細胞を導くガ
イデイング（guiding）蛋白質または接着分子または成
長因子として作用する。これらヒト又はマウスのＯＳＦ
−２は、塩基配列やアミノ酸配列において類似した他の
哺乳類由来のＯＳＦ−２蛋白質を分離同定するために使
用できる。

【０００８】本発明は、さらに、ヒト及びマウスのアナ
ログを提供する。即ち、ミュータント、融合蛋白、及び
さらに本発明はヒト及びマウスのＯＳＦ−２及びそれら
のアナログの断片も提供する。

【０００９】本発明は又これらのＯＳＦ−２蛋白質をコ
ードする遺伝子に関する。マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３
Ｅ１から分離されたマウスＯＳＦ−２のｃＤＮＡは、２
３アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを含む８１１
個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしている。ヒト胎
盤ｃＤＮＡライブラリーより分離されたヒトＯＳＦ−２
のｃＤＮＡは２１アミノ酸残基からなるシグナルペプチ
ドを含む７７９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードし
ている。さらに骨腫瘍細胞（osteosarcoma）から分離さ
れたヒトＯＳＦ−２変異体のｃＤＮＡは２１アミノ酸残
基からなるシグナルペプチドを含む８３６個のアミノ酸
からなる蛋白質をコードしている。本発明はまた組換え
遺伝子技術によるＯＳＦ−２の製造方法を提供する。本
発明はまたＯＳＦ−２と他のＢＭＰのような骨誘導性蛋
白質との併用による治療用組成物を提供する。

【００１０】本発明は、配列表の配列番号１において、
１番から７８８番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳ
Ｆ−２、配列番号２において、１番から７５８番目まで
のアミノ酸配列を有するｈＯＳＦ−２ｐｌ、配列番号３
において、１番から８１５番目までのアミノ酸配列を有
するｈＯＳＦ−２ｏｓ、またはこれらのアナログ、また
はこれらの断片よりなる蛋白質に関する。

【００１１】配列１はマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３Ｅ１
から分離されたマウスＯＳＦ−２（ｍＯＳＦ−２）をコ
ードするｃＤＮＡとｍＯＳＦ−２のアミノ酸配列であ
る。アミノ酸残基の番号１は予想される成熟ｍＯＳＦ−
２のＮ端に相当する。ｍＯＳＦ−２は７８８個のアミノ
酸を有する成熟蛋白質である。

【００１２】配列２は、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
から分離されたヒト胎盤ＯＳＦ−２（ｈＯＳＦ−２ｐ
ｌ）をコードするｃＤＮＡとｈＯＳＦ−２ｐｌのアミノ
酸配列である。アミノ酸残基の番号２は予想される成熟
ｈＯＳＦ−２ｐｌのＮ端に相当する。ｈＯＳＦ−２ｐｌ
は７５８個のアミノ酸を有する成熟蛋白質である。

【００１３】配列３は、ヒト骨腫瘍細胞株から分離され
たヒトＯＳＦ−２変異体（ｈＯＳＦ−２ｏｓ）をコード
するｃＤＮＡとｈＯＳＦ−２ｏｓのアミノ酸配列であ
る。アミノ酸残基の番号１は予想される成熟ｈＯＳＦ−
２ｏｓのＮ端に相当する。ｈＯＳＦ−２ｏｓは８１５個
のアミノ酸を有する成熟蛋白質である。

【００１４】これら３つのＯＳＦ−２のアナログとは、
アミノ酸配列がアミノ酸の置換、削除、付加によって修
飾されたものをいう。したっがって、アナログは、これ
らのＯＳＦ−２のアミノ酸配列と均等な配列を持つ蛋白
質を含むことは当然である。更にアナログは、これらの
ＯＳＦ−２の主要な性質を保持する程度にこれらのアミ
ノ酸配列の主要な部を持った蛋白質とも定義される。こ
のような蛋白質としては、３つの蛋白質に共通のアミノ
酸配列のうち少なくとも８５％以上、好ましくは９０％
以上の配列を保持する蛋白質が例として示される。

【００１５】本発明のアナログには、アミノ酸配列の修
飾によってその性質が改良されたミュータントと称され
るものも含んでいる。本発明のＯＳＦ−２およびアナロ
グは、他の蛋白質と融合させて融合蛋白質とすることが
できる。したがって、本発明はこのような融合蛋白をも
カバーする。

【００１６】本発明は、さらにこれらのＯＳＦ−２およ
びそのアナログの断片に関する。本発明の断片は、少な
くとも１２個のアミノ酸の配列がＯＳＦ−２の部分的ア
ミノ酸配列に一致するペプチドの全てを包含する。これ
らの断片は、主として抗原として用いられる。またこれ
らの断片を他の蛋白と融合させて融合蛋白とすることも
できる。したがって、本発明はこのような融合蛋白をも
カバーする。

【００１７】ＯＳＦ−２は一般に分泌型蛋白質で知られ
ている典型的なシグナルペプチドを有しているが、典型
的な細胞膜貫通領域は欠いている。ＯＳＦ−２は４ヵ所
のそれぞれ約１３０アミノ酸残基よりなる繰り返し構造
を有している（図１）。

【００１８】図１はヒト胎盤ＯＳＦ−２の構造の模式図
である。ＯＳＦ−２は７つの分節（segment）に分ける
ことができ、それぞれＮ端より、シグナル領域（斜線で
示されている）、Ｃｙｓに富んだ領域、４回繰り返され
る領域（Ｒ１からＲ４）、及びＣ端領域である。矢印は
予想されるＮ結合型糖鎖付加部位であり、ＣはＣｙｓ残
基の位置を示す。それぞれの繰り返し領域のなかで２ヵ
所ずつ特に保存されている領域を、点模様のボックス及
び黒色のボックスで示す。

【００１９】ＯＳＦ−２と良く似た繰り返し構造が昆虫
ファシクリン（fasciclin）について報告されている（Z
inn et al.，（1988），Cell，vol.53，p577-587）。

【００２０】図２はヒトＯＳＦ−２（ｈＯＳＦ−２）と
ショウジョウバエ（drosophila）のファシクリン−Ｉ
（ｄＦａｓ−１）の繰り返し領域（Ｒ１からＲ４）のア
ミノ酸残基の配列比較表である。それぞれの領域の開始
と終結残基は、それぞれの配列の後に括弧で示してお
り、それぞれの成熟蛋白質のＮ端残基を１と定義し番号
を付けた。記号（−）は、ギャップを示し、配列の類似
性を最大にするために挿入した。少なくとも４本の配列
で同一であるアミノ酸残基は、コンセンサス配列に示し
た。特によく保存された領域を箱型に囲んで示した。

【００２１】ＯＳＦ−２とショウジョウバエ（drosophi
la melanogaster）由来のファシクリン−Ｉとの間で特
に良く保存されている領域は、約１０アミノ酸残基と非
常に短く、本発明で提案されているドメイン（domain）
構造の中に限定されている（図２）。それらのドメイン
の他にはアミノ酸配列の類似性は見られない。しかしな
がら、ＯＳＦ−２とファシクリン−Ｉとの間の当該領域
の中の類似性は顕著であり、これらの蛋白質の間の機能
的な関連性が強く示唆される。これらの事実から、ＯＳ
Ｆ−２は、ファシクリン−Ｉが神経の成長において果し
ている役割、即ち、特殊化された神経細胞を本来在るべ
き場所に導く作用と似た役割を骨の中で果していると考
えられる。しかし、ファシクリン−Ｉと違う点は、ＯＳ
Ｆ−２は細胞膜貫通領域を欠く細胞膜結合性蛋白質に時
にみられる、明らかなフォスファチジルイノシトール脂
質膜アンカー（anchor）を欠いている。他方、ＯＳＦ−
２は細胞膜アンカーの配列として機能するであろう両親
媒性（amphiphatic）のアルファヘリックスの領域を有
している。図３はマウスとヒトのＯＳＦ−２のアミノ酸
残基の配列比較表（alignment）である。記号（−）
は、ギャップを示し、配列の比較をしやすくするために
挿入したものである。マウスとヒトのＯＳＦ−２の間で
共通なアミノ酸残基はドット（・）で示している。

【００２２】ｍＯＳＦ−２のアミノ酸配列との比較で、
ｈＯＳＦ−２ｏｓは4回繰り返し領域の外でＣ端側に、
２７アミノ酸残基連続した挿入部分を有している。これ
に対して、ｍＯＳＦ−２のアミノ酸配列と比較した時、
ｈＯＳＦ−２ｐ１は４回繰り返し領域の外でｈＯＳＦ−
２ｏｓの挿入部位の近くに３０アミノ酸残基長の連続し
た欠損部分を有している（図３）。

【００２３】ＯＳＦ−２のアミノ酸配列は、マウスとヒ
トの間で非常に良く保存されている。ｍＯＳＦ−２とｈ
ＯＳＦ−２ｏｓとのアミノ酸配列の比較では、８９.２
％のホモロジーを示している（図３）。シグナル配列が
この比較から除かれれば、アミノ酸配列のホモロジーは
９０.１％に上昇する。この高いアミノ酸配列の種間の
保存性は、ＯＳＦ−２が脊椎動物の骨の細胞生物学の分
野で必須な働きを有することを示唆している。したがっ
て、同様なＯＳＦ−２蛋白質が他の動物種から分離しう
ることは確実であり、そのアミノ酸配列はｍＯＳＦ−
２、ｈＯＳＦ−２ｐｌ、ｈＯＳＦ−２ｏｓと極めて類似
していることも確実である。したがって、本発明はこの
ような他の動物種から分離されるＯＳＦ−２蛋白質をも
包含している。

【００２４】組換え遺伝子技術を用いて、他の動物種の
ＯＳＦ−２を、それぞれの骨や培養骨細胞、及び、他の
体組織から作成したｃＤＮＡライブラリーまたは遺伝子
（genomic）ＤＮＡライブラリーから、本発明のｃＤＮ
Ａ又はそのＤＮＡ断片をプローブとしてもちいてクロー
ニングすることができる。本発明のＯＳＦ−２は遺伝子
工学的方法によって製造することができる。したがっ
て、本発明は、ＯＳＦ−２の遺伝子工学的製造法及びそ
のために必要なＤＮＡ、それを含むベクター、そのベク
ターを含む形質転換細胞に関する。本発明は、ＯＳＦ−
２蛋白質をコードするＤＮＡに関する。

【００２５】マウスＯＳＦ−２（ｍＯＳＦ−２）のｃＤ
ＮＡは，マウス骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１由来の
ｃＤＮＡライブラリーから、サブトラクションハイブリ
ダイゼーション（subtraction hybridization）法によ
りクローン化された。つづいて、マウスＯＳＦ−２のｃ
ＤＮＡをプローブとして、ヒト胎盤及び骨腫瘍細胞株由
来の二種のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。それぞれのｃＤＮＡライブラリーから、二種のＯ
ＳＦ−２が得られ、それぞれｈＯＳＦ−２ｐ１及びｈＯ
ＳＦ−２ｏｓと名付けられ、その塩基配列を決定した。
これらは、それぞれ配列表の１、２および３に示されて
いる。これらのｃＤＮＡの配列は現在利用できる種々の
ＤＮＡデータベースによる検索で、新規であることが明
らかにされた。

【００２６】ＯＳＦ−２を製造するためには、成熟ＯＳ
Ｆ−２のＮ端にシグナルシークエンスを持つＤＮＡが用
いられる。配列表の配列番号１においてシグナルシーク
エンスは−23〜−1のアミノ酸配列をコードする部分で
ある。配列番号２および３のシグナルシークエンスは−
21〜−1のアミノ酸配列をコードする部分である。酵母
菌あるいは大腸菌を用いてＯＳＦ−２を生産するために
は、成熟ＯＳＦ−２をコードするＮ末端に、酵母菌ある
いは大腸菌に典型的な分泌型Ｎ末端シグナルシークエン
スを結合させる。ＯＳＦ−２およびそのアナログは以下
の手順を含む組換え技術により生産される。 （ａ）以下のＤＮＡ配列より成る異種ＤＮＡを含む細胞
集団を得ること （ｉ）当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
する配列 （ii）上記のコントロール配列の下に結合した哺乳動物
のＯＳＦ−２又そのはそのアナログより成るポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列 （ｂ）当該細胞集団を当該ポリペプチドが産生される条
件下で培養することここで細胞集団には、酵母または大
腸菌等の微生物、または哺乳動物細胞を用いることがで
きる。組換え遺伝子技術を用いて、他の動物種のＯＳＦ
−２を、それぞれの骨や培養骨細胞及び他の体組織から
作成したｃＤＮＡライブラリー、または遺伝子（genomi
c）ＤＮＡライブラリーから、本発明のｃＤＮＡ又はそ
のＤＮＡ断片をプローブとして用いてクローニングする
ことができる。

【００２７】ｍＯＳＦ−２の疎水性（hydrophobic）領
域に由来するペプチドを合成し、ウシアルブミンと架橋
し、ウサギの免疫に使用した。得られた抗ｍＯＳＦ−２
ペプチド抗血清を新生児ラット全身切片中のＯＳＦ−２
の免疫組織化学的検出に用いた。ＯＳＦ−２は骨芽細
胞、軟骨細胞、及び舌組織に検出された。

【００２８】一般に、ＯＳＦ−２は、ヒト、ウシ、マウ
ス又はその他の材料から、公知の生化学的技術によっ
て、直接に、骨組織、又は、軟骨組織から抽出して得る
こともできる。また代りに、ＯＳＦ−２をコードするＤ
ＮＡは、脊椎動物の骨組織から抽出したｍＲＮＡから作
成されたｃＤＮＡライブラリーから、本明細書中で開示
されたヒトまたはマウスのｃＤＮＡ配列の断片を標識し
てプローブとして用いることができる。全長クローンは
上記の及び他の標準的な分子生物学的な技術を組合せて
得ることができる。

【００２９】本発明のＯＳＦ−２は、骨の代謝異常等の
治療剤として応用することができる。

【００３０】

【実施例】

〔実施例１〕 サブトラクション cDNA ライブラリーの
作成 この実施例ではマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３Ｅ１に特異
的なｃＤＮＡライブラリーの構築について記述する。こ
のｃＤＮＡライブラリーはサブトラクションｃＤＮＡラ
イブラリーであり、線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３とＭＣ３
Ｔ３Ｅ１に共通した全てのｃＤＮＡ配列は除かれてい
る。全ての一般的な組換えDNA技術に関する手順（proto
col）は、特に他に断らなければ、Sambrookらによる「M
olecular Cloning Manual」（1989年、Cold Spring Har
bor Laboratory社、米国、Cold Spring Harbor）に準じ
ておこなった。総ＲＮＡは、グアニジン法により、マウ
ス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３Ｅ１及び線維芽細胞株ＮＩＨ３
Ｔ３（ATCC CRL 1658）の、それぞれ８×１０⁷個の細胞
を出発材料として抽出した。ｍＲＮＡは総ＲＮＡから市
販の「ｍＲＮＡ精製キット」（Pharmacia社）により精
製した。光ビオチン化（photobiotinylation）、ｃＤＮ
Ａ合成及びサブトラクションハイブリダイゼーションの
手順は、市販のサブトラクションキット「Subtractor I
I」（Invitron社）の添付のプロトコールに従った。

【００３１】まず、１００μｇのＮＩＨ３Ｔ３由来のｍ
ＲＮＡを光ビオチン化した。ついで、１.０μｇのＭＣ
３Ｔ３Ｅ１由来のｍＲＮＡから一次鎖（first strand）
ｃＤＮＡを合成した。これらの、光ビオチン化ＮＩＨ３
Ｔ３由来のｍＲＮＡとＭＣ３Ｔ３Ｅ１のｃＤＮＡを混合
しハイブリダイズさせ、さらに、ストレプトアビジン
（streptavidin）をこのハイブリダイゼーション反応液
のなかに加えた。両者の共通配列により生成された光ビ
オチン化ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリドは、遊離ストレ
プトアビジンと複合体を形成し、標準的なフェノール／
クロロフォルム抽出法によりハイブリダイゼーション反
応液より除去された。反応液中に残存したｃＤＮＡ分子
は二次鎖合成法（second strand synthesis）により二
本鎖ｃＤＮＡに変換され、次いで、この二本鎖ｃＤＮＡ
の両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター（adaptor）
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。

【００３２】これらアダプターと結合したｃＤＮＡはラ
ムダｇｔ１０クローニングベクター（lambda gt10 clon
ing vector）と連結し、さらに、市販のインビトロパッ
ケージングキット（in vitro packaging kit）「ギガパ
ック（Gigapack）」（STRATAGENE 社）によりラッダ粒
子にパッケージング（packaging）をおこなった。構築
された組換えファージはＳＭ緩衝液中に保存した。でき
あがったライブラリーの感染効率はこれらの組換えファ
ージを、大腸菌Ｃ６００（日本予防衛生研究所、日本癌
研究資源バンクにＨＴ００３として保存されている）に
感染させて測定し、１μｇのｃＤＮＡ当り２.８×１０⁷
ファージの値を得た。

【００３３】〔実施例２〕 マウスＯＳＦ−２クローン
の単離 この実施例では、サブトラクションハイブリダイゼーシ
ョン法により、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１に特異的なクローンの一
つとして、ＯＳＦ−２のｃＤＮＡを同定し、サブクロー
ニング（subcloning）する方法を記述している。

【００３４】実施例１に記載された方法により調製され
た、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞から得ら
れたｍＲＮＡを１μｇずつ用いて、［３２］Ｐ標識ｃＤ
ＮＡプローブを、ＡＭＶ逆転写酵素（reverse transcri
ptase）を用いて合成した。実施例１で作成された、約
１.１×１０⁴個のクローンをプレートに撒き、二枚のナ
イロンフイルター上にレプリカ（replica）を写し取
り、ハイブリダイゼーションに用いた。フィルターＡ
は、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１のｍＲＮＡから作成した放射性標識
ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行
い、フィルターＢは、ＮＩＨ３Ｔ３のｍＲＮＡから作成
した放射性標識ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイ
ゼーションを行った。

【００３５】この方法で、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１プローブとハ
イブリダイズさせた時、ポジテイブシグナルを示し、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３プローブとではネガテイブであるようなクロ
ーンが１５５個得られた。これらのポジテイブな組換え
ファージを釣り上げ増殖させた。ついで、フェノールで
それぞれのクローンのファージＤＮＡを抽出した。これ
らファージＤＮＡは７０％エタノールで沈殿させ、得ら
れたＤＮＡをＥｃｏＲＩで酵素分解し、アガロースゲル
電気泳動にて切り出されたｃＤＮＡの挿入断片を精製し
た。これらの個々のｃＤＮＡ断片の一部は市販のランダ
ムプライムＤＮＡ標識キット（random primed DNA labe
ling kit）により放射性標識プローブを作成するために
使用した。

【００３６】ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞
から得られたｍＲＮＡをそれぞれ０.３μｇずつフォル
ムアミド変性アガロースゲル電気泳動に流し、ナイロン
メンブレン（「BYODYNE」，Pall Bio Support 社、米
国）にキャピラリーブロッテング（capillary blottin
g）法により転写した。それぞれのナイロンフイルター
は、それぞれの細胞株のｍＲＮＡを含む泳動帯が並列に
なるようなフイルター片に等分され、個々のｃＤＮＡプ
ローブとハイブリダイズさせた。ＭＣ３Ｔ３Ｅ１のｍＲ
ＮＡと特異的にハイブリダイズするがＮＩＨ３Ｔ３のｍ
ＲＮＡとはハイブリダイズしない、一個のｃＤＮＡを選
び出し、ＭＣ１６３と名づけた。このｃＤＮＡを ｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造から購入）にクローンニングし、それ
ぞれ反対方向にこのｃＤＮＡが挿入されている二つのプ
ラスミド、ｐＭＣ１６３−１（図４）とｐＭＣ１６３−
２を得た。このｃＤＮＡプローブがハイブリダイズした
ｍＲＮＡのサイズは約３.２ｋｂだった。

【００３７】〔実施例３〕 マウスのＯＳＦ−２のＤＮ
Ａ配列 ｐＭＣ１６３−１とｐＭＣ１６３−２を、制限酵素のＳ
ｐｈＩとＢａｍＨＩで酵素消化し、宝酒造から購入した
「キロシークエンスデレーションキット」をもちいて、
１２個のデレーションミュータントを作成した。それぞ
れのデレーションミュータントの両方向のＮＡ鎖の配列
は、米国 Applied Biosystems 社製の自動ＤＮＡ配列読
取り装置モデル３７０Ａ（automatic DNA sequencer）
により決定した。それぞれのクローンの塩基配列のう
ち、約３００塩基対を決定し、全長のｃＤＮＡの配列
は、重複部分を連結させることにより決定した。この全
長ｃＤＮＡの塩基配列と、この塩基配列より翻訳したア
ミノ酸配列は図１に示した。このｃＤＮＡにコードされ
ている蛋白質はマウスＯＳＦ−２と名づけられた。

【００３８】〔実施例４〕 マウスＯＳＦ−２の組織特
異的発現 マウスＯＳＦ−２の組織特異的発現をみるためにＲＮＡ
ドットブロッテイング（dot blotting）をおこなった。
マウスの胸腺、脾臓、脳、腎臓、肝臓、肺、睾丸及び心
臓の総ＲＮＡをグアニジン法で調製した。マウスは、４
週令の動物を用いた。頭蓋冠由来の骨芽細胞濃縮化細胞
は、新生児ＩＣＲマウスの頭蓋冠より作成し、総ＲＮＡ
を調製した。上記の組織、プライマリー（primary）骨
芽細胞培養、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞
から調製したＲＮＡを１μｇづつＢＩＯＤＹＮＥナイロ
ンメンブレンに点状に吸着させ（dot）８０℃で加熱し
（baking）固定させた。ｐＭＣ１６３−１はＥｃｏＲＩ
で消化し、ｐＭＣ１６３−１は、ＥｃｏＲＩで消化さ
れ、ｃＤＮＡ断片は、常法に従いアガロースゲル電気泳
動で分離された。放射性標識したプローブは、市販のラ
ンダムプライムドＤＮＡ標識キットで、すでに述べた方
法で作成した。ＲＮＡドットブロット分析により、頭蓋
冠由来の骨芽細胞豊富な細胞集団と培養１２日目以降の
ＭＣ３Ｔ３Ｅ１で、ＯＳＦ−２の強いシグナルが見ら
れ、また肺でごく弱いシグナルが見られた（図５）。

【００３９】〔実施例５〕 ヒトＯＳＦ−２をコードす
るｃＤＮＡのクローニング ｐＭＣ１６３−１をＥｃｏＲＩで消化して、得られたマ
ウスＯＳＦ−２ｃＤＮＡをプローブして、１.５×１０⁶
個のクローンから成るヒト胎盤ｃＤＮＡファージライブ
ラリー（Clonthech社より購入）と１.３×１０⁵個のク
ローンから成るヒト原発性骨腫瘍ｃＤＮＡファージライ
ブラリーをスクリーニングした。その結果、胎盤ライブ
ラリーからは７２個、骨腫瘍 ライブラリーからは３１
個のポジティブクローンが得られた。そのうち、最も強
い反応を示した胎盤ライブラリー由来の７クローンと骨
腫瘍ライブラリーの５クローンをさらに増殖させ、それ
ぞれの挿入断片を分離した。それぞれのライブラリー由
来で最も長い挿入断片をついで、ｐＵＣ１１８に組め換
えた。この結果、得られたプラスミドは、胎盤由来はｐ
ＫＯＴ１３３、骨腫瘍由来はｐＫＯＴ１５８と名付けら
れた。

【００４０】〔実施例６〕 ヒトＯＳＦ−２のＤＮＡ配
列 下記の実施例５でクローン化された、ｐＫＯＴ１３３と
ｐＫＯＴ１５８についても、制限酵素のＳｐｈＩとＸｂ
ａＩで酵素消化し、「キロシークエンスデレーションキ
ット」をもちいて、デレーションミュータントを作成し
た。ｐＫＯＴ１３３とｐＫＯＴ１５８のデレーションミ
ュータントのＤＮＡ鎖の配列は、米国 Applied Biosyst
ems 社製の自動ＤＮＡ配列読取り装置３７３Ａ（automa
tic DNAsequencer）により決定した。それぞれのクロー
ンの塩基配列のうち、約３００塩基対を決定し、全長の
cDNA の配列は、重複部分を連結させることにより決定
した。この全長ｃＤＮＡの塩基配列と、この塩基配列よ
り翻訳したアミノ酸配列は配列表の配列番号２、３に示
した。

【００４１】〔実施例７〕 ＯＳＦ−２の大腸菌での発
現 マウスＯＳＦ−２を大腸菌で発現させるために、日本癌
研究資源バンク（日本予防衛生研究所、カタログ番号は
ＶＥＯ４０）からプラスミドベクターｐＨＳＧ７４１を
入手し、使用した。このベクターは大腸菌トリプトファ
ン（Trp）プロモーターシステムを用い、Ｔｒｐプロモ
ーターとｒｒｎＢ転写終止記号との間に、クローン化Ｄ
ＮＡを挿入するためのポリリンカー部分を有している。
ｐＭＣ１６３−１（図４）をＡｐａＩとＥｃｏＲＩで消
化した後、マウスＯＳＦ−２の成熟型をコードしている
ｃＤＮＡ断片を含む、小さい方のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ
断片をアガロースゲルによるサイズ分画によって精製し
た。下記表１のリンカーＤＮＡ（配列番号４及び配列番
号５）を自動ＤＮＡ合成機（モデル３８０、Applied Bi
osystems 社製）により合成し、アニーリング（anneali
ng）を行なった。

【００４２】

【表１】 ｐＨＳ７４１をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化した後、長
い方のベクター断片を分離し、上記のＯＳＦ−２ ｃＤ
ＮＡを含むＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片と、上記のアニー
リングした合成リンカーの共存の下に、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼで結合させた。出来上がった発現プラスミドをｐ
ＯＳＦ２Ｅ１と名付けた。

【００４３】大腸菌Ｗ３１１０をｐＯＳＦ２Ｅ１で形質
転換し、アンピシリン耐性獲得形質転換菌を、ＬＢ培地
で２４時間培養した。この菌の一部を最小必須培地（mi
nimal essential medium）に植菌し、菌濃度がＯＤ５５
０ｎｍで ０.９になるまで成育させた。Ｔｒｐプロモー
ターを誘発させるためにはインドールアクリル酸（indo
lacrylic acid：IAA）を、カザミノ酸とグルコースと同
時に、培地に添加した。さらに数時間培養を続けた後、
大腸菌を集菌し、ついで溶菌させた。ＯＳＦ−２蛋白質
は細胞内画分に存在していた。このように、ｐＨＳＧ７
４１は、大腸菌におけるＯＳＦ−２の発現には好ましい
ベクターであるが、他の多くのベクターも同じ目的に使
用することができる。

【００４４】〔実施例８〕 酵母でのＯＳＦ−２の発現 マウスＯＳＦ−２を、酵母中で発現させるために、ｐＥ
ＭＢＬｙｅｘ４プラスミド発現ベクターを使用した（Ce
sareni and Murray（1988），Genetic Engineering，vo
l.9，p135-154）。ｐＥＮＢＬｙｅｘ４は、誘導型のガ
ラクトースプロモーター、クローン化した遺伝子を挿入
するためのポリリンカー部分、酵母用転写終止信号を有
し、クローン化した遺伝子効率良く発現することができ
る。

【００４５】ＯＳＦ−２のｃＤＮＡは、ｐＥＭＢＫｙｅ
ｘ４のポリリンカー部分に以下の方法で挿入した。即
ち、ｐＥＭＢＫｙｅｘ４をＳａｃＩとＳｐｈＩで消化
し、大きいほうのベクター断片をアガロースゲル電気泳
動で精製した。ｐＭＣ１６３−２からは同様にＯＳＦ−
２をコードしている領域を全長で含むＳａｃＩ−Ｓｐｈ
Ｉ断片を分離した。これらの二つの断片をＴ４ ＤＮＡ
リガーゼで結合させ、結合混合物で、大腸菌を形質転換
した。予測していた構造を有するプラスミドが同定、分
離され、ｐＯＳＦ２Ｙ１と名付けられた。

【００４６】酵母をｐＯＳＦ２Ｙ１で形質転換し、プラ
スミドで転換された酵母をロイシンとウラシルの栄養要
求性の有無で選択した。得られた形質転換酵母は、ロイ
シンとウラシルを欠し、酵母用培地で培養した。ＯＳＦ
−２蛋白質は、酵母の細胞内に存在していた。酵母に特
異的な分泌シグナルを用いたプラスミドを作成すれば、
ＯＳＦ−２は酵母細胞から培地中に分泌させることがで
きる。

【００４７】〔実施例９〕 動物細胞でのＯＳＦ−２の
発現 ＯＳＦ−２の動物細胞を用いた発現は、Gene，vol.71，
p9-18（1988）に記載された方法に従っておこなった。
マウスＯＳＦ−２ ｃＤＮＡは、ｐＨＳＧ７５７のクロ
ーニングカセット（cloning cassette）のＳＶ４０Ｔ抗
原初期プロモーターとポリＡシグナルとの間にあるＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入した。ＯＳＦ−２の発現のための正し
い方向に挿入断片が組み込まれた、プラスミドクローン
をｐＯＳＦ２Ａ１と名付けた。

【００４８】ＯＳＦ−２の「発現単位断片」（表２）
は、重複したＯＳＦ−２ ｃＤＮＡ挿入断片を、発現効
率を上げるために含んでおり、ｐＯＳＦ２Ａ１をＢｓｔ
ＸＩで消化することにより得られる非対称粘着性末端を
有している。

【００４９】

【表２】 分離された上記の「ＯＳＦ−２発現単位断片」は、下記
のｐＨＳＧ２９３（日本癌研究資源バンク、日本予防衛
生研究所より入手、カタログ番号はＶＥＯ４６）（表
３）から調製された。

【００５０】

【表３】 非対称性のＢｓｔＸＩ両端の存在により、「頭−尾結
合」（head to tail ligation）の、約１０から１２コ
ピー数のＯＳＦ−２のｃＤＮＡがパッケージされた組換
えコスミド（cosmid）分子を得ることができる。得られ
た組換えコスミドＤＮＡは、多数コピーのマウスＯＳＦ
−２ ｃＤＮＡ断片を含み、チャイニーズハムスター卵
巣（Chinese hamster overy；CHO）細胞に通常よく使用
されているカルシウムリン酸共沈法により、導入され
た。この結果、Ｇ４１８耐性細胞がクローニングシリン
ダー（cloning cylinder）法により選択され、クローン
化された。

【００５１】得られた７個のクローンについて総ＲＮＡ
をグアニジン法により抽出し、ＯＳＦ−２ ｍＲＮＡの
発現の程度を、放射性標識化ＯＳＦ−２ ｃＤＮＡプロ
ーブを用いたノーザン法（Northern blot analysis）で
測定した。最も高い発現を示したクローン化細胞を１０
％牛胎児血清を含むａ−ＭＥＭ培地で培養した。培養２
４時間後、ＯＳＦ−２蛋白質の発現が、ウエスタン法
（Western blot analysis）で検出できるようになり、
増量されたＯＳＦ−２は、細胞自体又はコンディション
メディウム（condition medium）より回収できた。同様
な動物用のプラスミド発現ベクターと種々の動物細胞株
を、ヒトとマウスのＯＳＦ−２の動物細胞での生産に使
用することができる。

【００５２】〔実施例１０〕 抗ＯＳＦ−２抗血清の調
製 合成ペプチドを、マウスのＯＳＦ−２のアミノ酸配列か
ら抗原性の高い部分を選び出し、ペプチド合成機（Appl
ied Biosystems 社、モデル４３０Ａ）により、固相合
成法で合成した。合成ペプチドはグルタルアルデヒドを
カップリング剤としてオボアルブミン担体と結合して、
ウサギの免疫に使用した（参考文献： Regenmortel
ら、（1988）「Syhnthetic polypeptides as antigen
s」（Burden and Kinippenberg 編）、Elsevier 社、p9
5−205）。合成したペプチドは、ＯＳＦ−２.１（配列
番号６）、ＯＳＦ−２.２（配列番号７）、ＯＳＦ−２.
３（配列番号８）、ＯＳＦ−２.４（配列番号９）とＯ
ＳＦ−２.５（配列番号１０）である。こうして得られ
た抗血清は、新生児ラット全身切片中で、組織免疫化学
的にＯＳＦ−２の存在を検索したり、大腸菌、酵母及び
動物細胞中でのＯＳＦ−２の発現を検出するのに使用で
きた。

【００５３】

【発明の効果】本発明により提供されるＯＳＦ−２は、
骨疾患の治療薬として用いることができる。また、この
ＯＳＦ−２は、骨に対する臓器特異性が高く、骨疾患の
診断薬としても用いることができる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：3215 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：マウス（Mus musculus） 株名：骨芽細胞株 MC3T3E1 配列の特徴： 配列 GAATTCGCGG CCGCCGGAGC TCAGGGCTGA AG ATG GTT CCT CTC CTG CCC TTA 53 Met Val Pro Leu Leu Pro Leu -20 TAT GCT CTG CTG CTG CTG TTC CTG TGT GAT ATT AAC CCT GCA AAT GCC 101 Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Phe Leu Cys Asp Ile Asn Pro Ala Asn Ala -15 -10 -5 AAC AGT TAC TAT GAC AAG GTC CTG GCT CAC AGC CGC ATC AGG GGT CGG 149 Asn Ser Tyr Tyr Asp Lys Val Leu Ala His Ser Arg Ile Arg Gly Arg 1 5 10 15 GAT CAG GGC CCA AAC GTC TGT GCC CTC CAG CAA ATT CTG GGC ACC AAA 197 Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys 20 25 30 AAG AAA TAC TTC AGC TCC TGT AAG AAC TGG TAT CAA GGT GCT ATC TGC 245 Lys Lys Tyr Phe Ser Ser Cys Lys Asn Trp Tyr Gln Gly Ala Ile Cys 35 40 45 GGG AAG AAA ACC ACT GTG CTA TAT GAA TGC TGC CCT GGC TAT ATG AGA 293 Gly Lys Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg 50 55 60 ATG GAA GGG ATG AAA GGC TGC CCC GCA GTG ATG CCT ATT GAC CAT GTT 341 Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Met Pro Ile Asp His Val 65 70 75 80 TAT GGC ACG CTG GGC ATT GTG GGA GCC ACT ACC ACT CAG CAC TAC TCC 389 Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr Thr Gln His Tyr Ser 85 90 95 GAT GTC TCG AAG CTG AGA GAA GAG ATT GAA GGA AAA GGG TCA TAC ACG 437 Asp Val Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly Lys Gly Ser Tyr Thr 100 105 110 TAC TTC GCG CCG AGT AAC GAG GCT TGG GAG AAC CTG GAT TCT GAC ATT 485 Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Glu Asn Leu Asp Ser Asp Ile 115 120 125 CGC AGA GGA CTG GAG AAC AAT GTC AAT GTT GAG CTA CTG AAT GCC TTA 533 Arg Arg Gly Leu Glu Asn Asn Val Asn Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu 130 135 140 CAC AGC CAC ATG GTT AAT AAG AGA ATG TTA ACC AAG GAC CTG AAA CAC 581 His Ser His Met Val Asn Lys Arg Met Leu Thr Lys Asp Leu Lys His 145 150 155 160 GGC ATG GTT ATT CCT TCA ATG TAC AAC AAT CTG GGG CTT TTT ATT AAC 629 Gly Met Val Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn 165 170 175 CAT TAT CCC AAT GGG GTT GTC ACT GTG AAC TGT GCT CGA GTC ATC CAT 677 His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Val Ile His 180 185 190 GGG AAC CAG ATT GCC ACA AAT GGT GTC GTC CAT GTC ATT GAC CGT GTC 725 Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg Val 195 200 205 CTG ACA CAA ATT GGT ACC TCC ATC CAA GAC TTC CTT GAA GCA GAA GAC 773 Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe Leu Glu Ala Glu Asp 210 215 220 GAC CTT TCA TCA TTT AGA GCA GCC GCC ATC ACC TCT GAC CTC TTG GAG 821 Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr Ser Asp Leu Leu Glu 225 230 235 240 TCC CTT GGA AGA GAT GGT CAC TTC ACG CTC TTT GCT CCC ACC AAT GAA 869 Ser Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu 245 250 255 GCT TTC GAG AAA CTG CCA CGA GGT GTC CTA GAA AGG ATC ATG GGA GAC 917 Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu Arg Ile Met Gly Asp 260 265 270 AAA GTG GCT TCT GAA GCT CTC ATG AAG TAC CAC ATC CTA AAT ACC CTC 965 Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu 275 280 285 CAG TGC TCT GAG GCC ATC ACT GGA GGA GCC GTG TTT GAG ACC ATG GAA 1013 Gln Cys Ser Glu Ala Ile Thr Gly Gly Ala Val Phe Glu Thr Met Glu 290 295 300 GGA AAC ACT ATT GAG ATA GGG TGC GAA GGG GAC AGT ATC TCC ATT AAC 1061 Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Glu Gly Asp Ser Ile Ser Ile Asn 305 310 315 320 GGA ATC AAG ATG GTG AAC AAG AAA GAC ATT GTG ACT AAG AAT GGT GTC 1109 Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Lys Asn Gly Val 325 330 335 ATC CAC CTG ATT GAT GAA GTC CTC ATT CCT GAT TCT GCC AAA CAA GTT 1157 Ile His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val 340 345 350 ATT GAG CTG GCT GGA AAA CAG CAA ACC ACT TTC ACC GAC CTG GTA GCC 1205 Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala 355 360 365 CAA TTA GGC TTG GCA TCC TCT CTG AAG CCA GAT GGA GAG TAC ACC TTA 1253 Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ser Leu Lys Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu 370 375 380 TTA GCA CCT GTG AAC AAT GCG TTC TCT GAT GAC ACT CTG AGC ATG GAC 1301 Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp Thr Leu Ser Met Asp 385 390 395 400 CAA CGC CTT CTT AAG CTA ATT CTG CAA AAT CAC ATA TTG AAA GTA AAA 1349 Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His Ile Leu Lys Val Lys 405 410 415 GTT GGC CTT AGC GAC CTC TAC AAT GGA CAG ATA CTG GAA ACC ATT GGA 1397 Val Gly Leu Ser Asp Leu Tyr Asn Gly Gln Ile Leu Glu Thr Ile Gly 420 425 430 GGC AAA CAA CTC CGA GTC TTT GTG TAT CGG ACG GCT ATC TGC ATA GAA 1445 Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr Ala Ile Cys Ile Glu 435 440 445 AAC TCA TGC ATG GTG AGA GGA AGC AAG CAG GGA AGG AAT GGT GCC ATT 1493 Asn Ser Cys Met Val Arg Gly Ser Lys Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile 450 455 460 CAC ATA TTC CGA GAA ATC ATC CAA CCA GCA GAG AAA TCC CTG CAC GAC 1541 His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Gln Pro Ala Glu Lys Ser Leu His Asp 465 470 475 480 AAG CTG CGG CAA GAC AAG CGC TTT AGC ATC TTC CTC AGC CTC CTT GAA 1589 Lys Leu Arg Gln Asp Lys Arg Phe Ser Ile Phe Leu Ser Leu Leu Glu 485 490 495 GCT GCA GAT TTG AAA GAT CTC CTG ACA CAG CCC GGA GAT TGG ACC TTG 1637 Ala Ala Asp Leu Lys Asp Leu Leu Thr Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu 500 505 510 TTT GCA CCA ACC AAT GAT GCC TTC AAG GGA ATG ACT AGC GAA GAA AGG 1685 Phe Ala Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met Thr Ser Glu Glu Arg 515 520 525 GAG CTT CTG ATT GGG GAT AAA AAT GCT CTC CAA AAC ATC ATT CTT TAT 1733 Glu Leu Leu Ile Gly Asp Lys Asn Ala Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr 530 535 540 CAC CTG ACC CCA GGG GTT TAT ATT GGA AAG GGA TTC GAA CCC GGA GTC 1781 His Leu Thr Pro Gly Val Tyr Ile Gly Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val 545 550 555 560 ACT AAT ATC CTG AAG ACC ACA CAG GGA AGC AAA ATC TAT CTG AAA GGA 1829 Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys Ile Tyr Leu Lys Gly 565 570 575 GTA AAC GAA ACG CTT CTA GTG AAT GAG TTG AAG TCC AAA GAA TCT GAC 1877 Val Asn Glu Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp 580 585 590 ATC ATG ACG ACA AAT GGT GTC ATC CAC GTC GTG GAC AAA CTC CTC TAT 1925 Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr 595 600 605 CCA GCA GAT ATT CCA GTT GGA AAT GAT CAG CTC TTG GAA TTA CTG AAC 1973 Pro Ala Asp Ile Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu Leu Glu Leu Leu Asn 610 615 620 AAA CTG ATA AAA TAC ATC CAA ATC AAG TTT GTT CGT GGC AGC ACC TTC 2021 Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe 625 630 635 640 AAA GAA ATC CCC ATG ACT GTC TAT AGA CCT GCA ATG ACG AAG ATC CAA 2069 Lys Glu Ile Pro Met Thr Val Tyr Arg Pro Ala Met Thr Lys Ile Gln 645 650 655 ATT GAA GGT GAT CCC GAC TTC AGG CTG ATT AAA GAA GGC GAA ACG GTG 2117 Ile Glu Gly Asp Pro Asp Phe Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu Thr Val 660 665 670 ACA GAA GTG ATC CAC GGA GAG CCA GTC ATT AAA AAG TAC ACC AAA ATC 2165 Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Val Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile 675 680 685 ATA GAT GGA GTT CCT GTT GAA ATA ACT GAA AAA CAG ACT CGG GAA GAA 2213 Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys Gln Thr Arg Glu Glu 690 695 700 CGA ATC ATT ACA GGT CCT GAG ATA AAA TAT ACC AGG ATT TCC ACA GGA 2261 Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly 705 710 715 720 GGT GGA GAA ACA GGA GAG ACC TTG CAG AAA TTC TTG CAA AAA GAG GTC 2309 Gly Gly Glu Thr Gly Glu Thr Leu Gln Lys Phe Leu Gln Lys Glu Val 725 730 735 TCC AAG GTC ACA AAG TTC ATT GAA GGT GGC GAT GGT CAC TTA TTT GAA 2357 Ser Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp Gly His Leu Phe Glu 740 745 750 GAT GAG GAG ATT AAA AGA CTG CTT CAG GGA GAC ACA CCT GCA AAG AAG 2405 Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Ala Lys Lys 755 760 765 ATA CCA GCC AAC AAA AGG GTT CAA GGG CCT AGA AGA CGA TCA AGA GAA 2453 Ile Pro Ala Asn Lys Arg Val Gln Gly Pro Arg Arg Arg Ser Arg Glu 770 775 780 GGC CGT TCT CAG TGA AAACCCAGAG GCCAGACCAC AGAGTTTATA TAATCCTAAA 2508 Gly Arg Ser Gln *** 785 TCAACGATCT GATTTTAAGG GAAATTGTAA GAGCCACCAC ACTGACTTCA GAATCTGAAA 2568 TGACAACCAA CAGAAGCCAA TCTTCAAGCA AGTCCAAACA CAGAGTTCAT GTCTTTGTTT 2628 CTGCATGAGA AATATAAGAA AATGATAGCT AGTCTCCTGT GGGGTAGGAA CTGAGGAAAT 2688 ATAGGACCAT GCAGGGATTT TATCTCAATG AGAAAACTTC TGATTAAAGT AGAATCCACC 2748 AAAGAACATC ATTGTGACTG GGTCCATACA GCTAAGTCTT TGCACAGTAA AAACCTTCCG 2808 CCTCAGGAAG AGGCTGGAAA AACCCAAAGC ACACAGTTAC CTTTCCAGGG GAGGCTAAGG 2868 TATCAAAAGG GGTGTTCAGT TATACAACAT GCAAACAAAC CTACCAAATT ACGAACAGTG 2928 GTGTTACATA TTTCTCATGC AATGTGGGTT TCCTGCTAAA TTTTGTTATT TTTACACTTG 2988 ATTTATATCC TCGAGATGAT TGTCATAAGC TTCTTGCAAT ACAAATGTTT TCTCTCAAAC 3048 ATTTCAATAA AACCATTCTT CAGGTATAAA GAGAATTACT GCAGAGTTGG TAATTCAGAA 3108 AACTCAAGGT TTAAGTTAAA AGTGAGTTTA GACTTTGGAA TAGGACTTCA TACCTTTTTT 3168 TATTGTTAAC AAGTACTCAA TAAAGTAAAC TGAGCGGCCG CGAATTC 3215

【００５５】配列番号：2 配列の長さ：3092 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト（Homo sapiens） 組織の種類：胎盤 配列の特徴： 配列 GAATTCGGGG AACAGAACTG CAACGGAGAG ACTCAAG ATG ATT CCC TTT TTA CCC 55 Met Ile Pro Phe Leu Pro -20 ATG TTT TCT CTA CTA TTG CTG CTT ATT GTT AAC CCT ATA AAC GCC AAC 103 Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val Asn Pro Ile Asn Ala Asn -15 -10 -5 1 AAT CAT TAT GAC AAG ATC TTG GCT CAT AGT CGT ATC AGG GGT CGG GAC 151 Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser Arg Ile Arg Gly Arg Asp 5 10 15 CAA GGC CCA AAT GTC TGT GCC CTT CAA CAG ATT TTG GGC ACC AAA AAG 199 Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys 20 25 30 AAA TAC TTC AGC ACT TGT AAG AAC TGG TAT AAA AAG TCC ATC TGT GGA 247 Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr Lys Lys Ser Ile Cys Gly 35 40 45 CAG AAA ACG ACT GTT TTA TAT GAA TGT TGC CCT GGT TAT ATG AGA ATG 295 Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met 50 55 60 65 GAA GGA ATG AAA GGC TGC CCA GCA GTT TTG CCC ATT GAC CAT GTT TAT 343 Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu Pro Ile Asp His Val Tyr 70 75 80 GGC ACT CTG GGC ATC GTG GGA GCC ACC ACA ACG CAG CGC TAT TCT GAC 391 Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr Thr Gln Arg Tyr Ser Asp 85 90 95 GCC TCA AAA CTG AGG GAG GAG ATC GAG GGA AAG GGA TCC TTC ACT TAC 439 Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly Lys Gly Ser Phe Thr Tyr 100 105 110 TTT GCA CCG AGT AAT GAG GCT TGG GAC AAC TTG GAT TCT GAT ATC CGT 487 Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn Leu Asp Ser Asp Ile Arg 115 120 125 AGA GGT TTG GAG AGC AAC GTG AAT GTT GAA TTA CTG AAT GCT TTA CAT 535 Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu His 130 135 140 145 AGT CAC ATG ATT AAT AAG AGA ATG TTG ACC AAG GAC TTA AAA AAT GGC 583 Ser His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr Lys Asp Leu Lys Asn Gly 150 155 160 ATG ATT ATT CCT TCA ATG TAT AAC AAT TTG GGG CTT TTC ATT AAC CAT 631 Met Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His 165 170 175 TAT CCT AAT GGG GTT GTC ACT GTT AAT TGT GCT CGA ATC ATC CAT GGG 679 Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Ile Ile His Gly 180 185 190 AAC CAG ATT GCA ACA AAT GGT GTT GTC CAT GTC ATT GAC CGT GTG CTT 727 Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg Val Leu 195 200 205 ACA CAA ATT GGT ACC TCA ATT CAA GAC TTC ATT GAA GCA GAA GAT GAC 775 Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe Ile Glu Ala Glu Asp Asp 210 215 220 225 CTT TCA TCT TTT AGA GCA GCT GCC ATC ACA TCG GAC ATA TTG GAG GCC 823 Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr Ser Asp Ile Leu Glu Ala 230 235 240 CTT GGA AGA GAC GGT CAC TTC ACA CTC TTT GCT CCC ACC AAT GAG GCT 871 Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala TTT GAG AAA CTT CCA CGA GGT GTC CTA GAA AGG TTC ATG GGA GAC AAA 919 Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu Arg Phe Met Gly Asp Lys 260 265 270 GTG GCT TCC GAA GCT CTT ATG AAG TAC CAC ATC TTA AAT ACT CTC CAG 967 Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu Gln 275 280 285 TGT TCT GAG TCT ATT ATG GGA GGA GCA GTC TTT GAG ACG CTG GAA GGA 1015 Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val Phe Glu Thr Leu Glu Gly 290 295 300 305 AAT ACA ATT GAG ATA GGA TGT GAC GGT GAC AGT ATA ACA GTA AAT GGA 1063 Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp Ser Ile Thr Val Asn Gly 310 315 320 ATC AAA ATG GTG AAC AAA AAG GAT ATT GTG ACA AAT AAT GGT GTG ATC 1111 Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Asn Asn Gly Val Ile 325 330 335 CAT TTG ATT GAT CAG GTC CTA ATT CCT GAT TCT GCC AAA CAA GTT ATT 1159 His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile 340 345 350 GAG CTG GCT GGA AAA CAG CAA ACC ACC TTC ACG GAT CTT GTG GCC CAA 1207 Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala Gln 355 360 365 TTA GGC TTG GCA TCT GCT CTG AGG CCA GAT GGA GAA TAC ACT TTG CTG 1255 Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu 370 375 380 385 GCA CCT GTG AAT AAT GCA TTT TCT GAT GAT ACT CTC AGC ATG GTT CAG 1303 Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp Thr Leu Ser Met Val Gln 390 395 400 CGC CTC CTT AAA TTA ATT CTG CAG AAT CAC ATA TTG AAA GTA AAA GTT 1351 Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His Ile Leu Lys Val Lys Val 405 410 415 GGC CTT AAT GAG CTT TAC AAC GGG CAA ATA CTG GAA ACC ATC GGA GGC 1399 Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile Leu Glu Thr Ile Gly Gly 420 425 430 AAA CAG CTC AGA GTC TTC GTA TAT CGT ACA GCT GTC TGC ATT GAA AAT 1447 Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr Ala Val Cys Ile Glu Asn 435 440 445 TCA TGC ATG GAG AAA GGG AGT AAG CAA GGG AGA AAC GGT GCG ATT CAC 1495 Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile His 450 455 460 465 ATA TTC CGC GAG ATC ATC AAG CCA GCA GAG AAA TCC CTC CAT GAA AAG 1543 Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu Lys Ser Leu His Glu Lys 470 475 480 TTA AAA CAA GAT AAG CGC TTT AGC ACC TTC CTC AGC CTA CTT GAA GCT 1591 Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe Leu Ser Leu Leu Glu Ala 485 490 495 GCA GAC TTG AAA GAG CTC CTG ACA CAA CCT GGA GAC TGG ACA TTA TTT 1639 Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu Phe 500 505 510 GTG CCA ACC AAT GAT GCT TTT AAG GGA ATG ACT AGT GAA GAA AAA GAA 1687 Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met Thr Ser Glu Glu Lys Glu 515 520 525 ATT CTG ATA CGG GAC AAA AAT GCT CTT CAA AAC ATC ATT CTT TAT CAC 1735 Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His 530 535 540 545 CTG ACA CCA GGA GTT TTC ATT GGA AAA GGA TTT GAA CCT GGT GTT ACT 1783 Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val Thr 550 555 560 AAC ATT TTA AAG ACC ACA CAA GGA AGC AAA ATC TTT CTG AAA GAA GTA 1831 Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys Ile Phe Leu Lys Glu Val 565 570 575 AAT GAT ACA CTT CTG GTG AAT GAA TTG AAA TCA AAA GAA TCT GAC ATC 1879 Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile 580 585 590 ATG ACA ACA AAT GGT GTA ATT CAT GTT GTA GAT AAA CTC CTC TAT CCA 1927 Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro 595 600 605 GCA GAC ACA CCT GTT GGA AAT GAT CAA CTG CTG GAA ATA CTT AAT AAA 1975 Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu Leu Glu Ile Leu Asn Lys 610 615 620 625 TTA ATC AAA TAC ATC CAA ATT AAG TTT GTT CGT GGT AGC ACC TTC AAA 2023 Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys 630 635 640 GAA ATC CCC GTG ACT GTC TAT AAG CCA ATT ATT AAA AAA TAC ACC AAA 2071 Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Lys Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Lys 645 650 655 ATC ATT GAT GGA GTG CCT GTG GAA ATA ACT GAA AAA GAG ACA CGA GAA 2119 Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys Glu Thr Arg Glu 660 665 670 GAA CGA ATC ATT ACA GGT CCT GAA ATA AAA TAC ACT AGG ATT TCT ACT 2167 Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr 675 680 685 GGA GGT GGA GAA ACA GAA GAA ACT CTG AAG AAA TTG TTA CAA GAA GAG 2215 Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Lys Leu Leu Gln Glu Glu 690 695 700 705 GTC ACC AAG GTC ACC AAA TTC ATT GAA GGT GGT GAT GGT CAT TTA TTT 2263 Val Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp Gly His Leu Phe 710 715 720 GAA GAT GAA GAA ATT AAA AGA CTG CTT CAG GGA GAC ACA CCC GTG AGG 2311 Glu Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Val Arg 725 730 735 AAG TTG CAA GCC AAC AAA AAA GTT CAA GGT TCT AGA AGA CGA TTA AGG 2359 Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg Leu Arg 740 745 750 GAA GGT CGT TCT CAG TGA AAATCCAAAA ACCAGAAAAA AATGTTTATA 2407 Glu Gly Arg Ser Gln *** 755 CAACCCTAAG TCAATAACCT GACCTTAGAA AATTGTGAGA GCCAAGTTGA CTTCAGGAAC 2467 TGAAACATCA GCACAAAGAA GCAATCATCA AATAATTCTG AACACAAATT TAATATTTTT 2527 TTTTCTGAAT GAGAAACATG AGGGAAATTG TGGAGTTAGC CTCCTGTGGA GTTAGCCTCC 2587 TGTGGTAAAG GAATTGAAGA AAATATAACA CCTTACACCC TTTTTCATCT TGACATTAAA 2647 AGTTCTGGCT AACTTTGGAA TCCATTAGAG AAAAATCCTT GTCACCAGAT TCATTACAAT 2707 TCAAATCGAA GAGTTGTGAA CTGTTATCCC ATTGAAAAGA CCGAGCCTTG TATGTATGTT 2767 ATGGATACAT AAAATGCACG CAAGCCATTA TCTCTCCATG GGAAGCTAAG TTATAAAAAT 2827 AGGTGCTTGG TGTACAAAAC TTTTTATATC AAAAGGCTTT GCACATTTCT ATATGAGTGG 2887 GTTTACTGGT AAATTATGTT ATTTTTTACA ACTAATTTTG TACTCTCAGA ATGTTTGTCA 2947 TATGCTTCTT GCAATGCATA TTTTTTAATC TCAAACGTTT CAATAAAACC ATTTTTCAGA 3007 TATAAAGAGA ATTACTTCAA ATTGAGTAAT TCAGAAAAAC TCAAGATTTA AGTTAAAAAG 3067 TGGTTTGGAC TTGGGAACAG GACTT 3092

【００５６】配列番号：3 配列の長さ：3253 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ヒト（Homo sapiens） 細胞の種類：原発生骨腫瘍 配列の特徴： 配列 GAATTCGGAG ATCTACAGGG AGAGACTCAA G ATG ATT CCC TTT TTA CCC ATG 52 Met Ile Pro Phe Leu Pro Met -20 -15 TTT TCT CTA CTA TTG CTG CTT ATT GTT AAC CCT ATA AAC GCC AAC AAT 100 Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn -10 -5 1 CAT TAT GAC AAG ATC TTG GCT CAT AGT CGT ATC AGG GGT CGG GAC CAA 148 His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln 5 10 15 GGC CCA AAT GTC TGT GCC CTT CAA CAG ATT TTG GGC ACC AAA AAG AAA 196 Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys 20 25 30 TAC TTC AGC ACT TGT AAG AAC TGG TAT AAA AAG TCC ATC TGT GGA CAG 244 Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln 35 40 45 50 AAA ACG ACT GTT TTA TAT GAA TGT TGC CCT GGT TAT ATG AGA ATG GAA 292 Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu 55 60 65 GGA ATG AAA GGC TGC CCA GCA GTT TTG CCC ATT GAC CAT GTT TAT GGC 340 Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu Pro Ile Asp His Val Tyr Gly 70 75 80 ACT CTG GGC ATC GTG GGA GCC ACC ACA ACG CAG CGC TAT TCT GAC GCC 388 Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala 85 90 95 TCA AAA CTG AGG GAG GAG ATC GAG GGA AAG GGA TCC TTC ACT TAC TTT 436 Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe 100 105 110 GCA CCG AGT AAT GAG GCT TGG GAC AAC TTG GAT TCT GAT ATC CGT AGA 484 Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg 115 120 125 130 GGT TTG GAG AGC AAC GTG AAT GTT GAA TTA CTG AAT GCT TTA CAT AGT 532 Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu Leu Leu Asn Ala Leu His Ser 135 140 145 CAC ATG ATT AAT AAG AGA ATG TTG ACC AAG GAC TTA AAA AAT GGC ATG 580 His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr Lys Asp Leu Lys Asn Gly Met 150 155 160 ATT ATT CCT TCA ATG TAT AAC AAT TTG GGG CTT TTC ATT AAC CAT TAT 628 Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr 165 170 175 CCT AAT GGG GTT GTC ACT GTT AAT TGT GCT CGA ATC ATC CAT GGG AAC 676 Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Ile Ile His Gly Asn 180 185 190 CAG ATT GCA ACA AAT GGT GTT GTC CAT GTC ATT GAC CGT GTG CTT ACA 724 Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Asp Arg Val Leu Thr 195 200 205 210 CAA ATT GGT ACC TCA ATT CAA GAC TTC ATT GAA GCA GAA GAT GAC CTT 772 Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu 215 220 225 TCA TCT TTT AGA GCA GCT GCC ATC ACA TCG GAC ATA TTG GAG GCC CTT 820 Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu 230 235 240 GGA AGA GAC GGT CAC TTC ACA CTC TTT GCT CCC ACC AAT GAG GCT TTT 868 Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe 245 250 255 GAG AAA CTT CCA CGA GGT GTC CTA GAA AGG TTC ATG GGA GAC AAA GTG 916 Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu Arg Phe Met Gly Asp Lys Val 260 265 270 GCT TCC GAA GCT CTT ATG AAG TAC CAC ATC TTA AAT ACT CTC CAG TGT 964 Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys 275 280 285 290 TCT GAG TCT ATT ATG GGA GGA GCA GTC TTT GAG ACG CTG GAA GGA AAT 1012 Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn 295 300 305 ACA ATT GAG ATA GGA TGT GAC GGT GAC AGT ATA ACA GTA AAT GGA ATC 1060 Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile 310 315 320 AAA ATG GTG AAC AAA AAG GAT ATT GTG ACA AAT AAT GGT GTG ATC CAT 1108 Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val Thr Asn Asn Gly Val Ile His 325 330 335 TTG ATT GAT CAG GTC CTA ATT CCT GAT TCT GCC AAA CAA GTT ATT GAG 1156 Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu 340 345 350 CTG GCT GGA AAA CAG CAA ACC ACC TTC ACG GAT CTT GTG GCC CAA TTA 1204 Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu 355 360 365 370 GGC TTG GCA TCT GCT CTG AGG CCA GAT GGA GAA TAC ACT TTG CTG GCA 1252 Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala 375 380 385 CCT GTG AAT AAT GCA TTT TCT GAT GAT ACT CTC AGC ATG GTT CAG CGC 1300 Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp Thr Leu Ser Met Val Gln Arg 390 395 400 CTC CTT AAA TTA ATT CTG CAG AAT CAC ATA TTG AAA GTA AAA GTT GGC 1348 Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His Ile Leu Lys Val Lys Val Gly 405 410 415 CTT AAT GAG CTT TAC AAC GGG CAA ATA CTG GAA ACC ATC GGA GGC AAA 1396 Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys 420 425 430 CAG CTC AGA GTC TTC GTA TAT CGT ACA GCT GTC TGC ATT GAA AAT TCA 1444 Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser 435 440 445 450 TGC ATG GAG AAA GGG AGT AAG CAA GGG AGA AAC GGT GCG ATT CAC ATA 1492 Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly Arg Asn Gly Ala Ile His Ile 455 460 465 TTC CGC GAG ATC ATC AAG CCA GCA GAG AAA TCC CTC CAT GAA AAG TTA 1540 Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu Lys Ser Leu His Glu Lys Leu 470 475 480 AAA CAA GAT AAG CGC TTT AGC ACC TTC CTC AGC CTA CTT GAA GCT GCA 1588 Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala 485 490 495 GAC TTG AAA GAG CTC CTG ACA CAA CCT GGA GAC TGG ACA TTA TTT GTG 1636 Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val 500 505 510 CCA ACC AAT GAT GCT TTT AAG GGA ATG ACT AGT GAA GAA AAA GAA ATT 1684 Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile 515 520 525 530 CTG ATA CGG GAC AAA AAT GCT CTT CAA AAC ATC ATT CTT TAT CAC CTG 1732 Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu 535 540 545 ACA CCA GGA GTT TTC ATT GGA AAA GGA TTT GAA CCT GGT GTT ACT AAC 1780 Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn 550 555 560 ATT TTA AAG ACC ACA CAA GGA AGC AAA ATC TTT CTG AAA GAA GTA AAT 1828 Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn 565 570 575 GAT ACA CTT CTG GTG AAT GAA TTG AAA TCA AAA GAA TCT GAC ATC ATG 1876 Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met 580 585 590 ACA ACA AAT GGT GTA ATT CAT GTT GTA GAT AAA CTC CTC TAT CCA GCA 1924 Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala 595 600 605 610 GAC ACA CCT GTT GGA AAT GAT CAA CTG CTG GAA ATA CTT AAT AAA TTA 1972 Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu 615 620 625 ATC AAA TAC ATC CAA ATT AAG TTT GTT CGT GGT AGC ACC TTC AAA GAA 2020 Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu 630 635 640 ATC CCC GTG ACT GTC TAT ACA ACT AAA ATT ATA ACC AAA GTT GTG GAA 2068 Ile Pro Val Thr Val Tyr Thr Thr Lys Ile Ile Thr Lys Val Val Glu 645 650 655 CCA AAA ATT AAA GTG ATT GAA GGC AGT CTT CAG CCT ATT ATC AAA ACT 2116 Pro Lys Ile Lys Val Ile Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr 660 665 670 GAA GGA CCC ACA CTA ACA AAA GTC AAA ATT GAA GGT GAA CCT GAA TTC 2164 Glu Gly Pro Thr Leu Thr Lys Val Lys Ile Glu Gly Glu Pro Glu Phe 675 680 685 690 AGA CTG ATT AAA GAA GGT GAA ACA ATA ACT GAA GTG ATC CAT GGA GAG 2212 Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu Thr Ile Thr Glu Val Ile His Gly Glu 695 700 705 CCA ATT ATT AAA AAA TAC ACC AAA ATC ATT GAT GGA GTG CCT GTG GAA 2260 Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu 710 715 720 ATA ACT GAA AAA GAG ACA CGA GAA GAA CGA ATC ATT ACA GGT CCT GAA 2308 Ile Thr Glu Lys Glu Thr Arg Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu 725 730 735 ATA AAA TAC ACT AGG ATT TCT ACT GGA GGT GGA GAA ACA GAA GAA ACT 2356 Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr 740 745 750 CTG AAG AAA TTG TTA CAA GAA GAG GTC ACC AAG GTC ACC AAA TTC ATT 2404 Leu Lys Lys Leu Leu Gln Glu Glu Val Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile 755 760 765 770 GAA GGT GGT GAT GGT CAT TTA TTT GAA GAT GAA GAA ATT AAA AGA CTG 2452 Glu Gly Gly Asp Gly His Leu Phe Glu Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu 775 780 785 CTT CAG GGA GAC ACA CCC GTG AGG AAG TTG CAA GCC AAC AAA AAA GTT 2500 Leu Gln Gly Asp Thr Pro Val Arg Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val 790 795 800 CAA GGT TCT AGA AGA CGA TTA AGG GAA GGT CGT TCT CAG TGA 2542 Gln Gly Ser Arg Arg Arg Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gln *** 805 810 815 AAATCCAAAA ACCAGAAAAA AATGTTTATA CAACCCTAAG TCAATAACCT GACCTTAGAA 2602 AATTGTGAGA GCCAAGTTGA CTTCAGGAAC TGAAACATCA GCACAAAGAA GCAATCATCA 2662 AATAATTCTG AACACAAATT TAATATTTTT TTTTCTGAAT GAGAAACATG AGGGAAATTG 2722 TGGAGTTAGC CTCCTGTGGT AAAGGAATTG AAGAAAATAT AACACCTTAC ACCCTTTTTC 2782 ATCTTGACAT TAAAAGTTCT GGCTAACTTT GGAATCCATT AGAGAAAAAT CCTTGTCACC 2842 AGATTCATTA CAATTCAAAT CGAAGAGTTG TGAACTGTTA TCCCATTGAA AAGACCGAGC 2902 CTTGTATGTA TGTTATGGAT ACATAAAATG CACGCAAGCC ATTATCTCTC CATGGGAAGC 2962 TAAGTTATAA AAATAGGTGC TTGGTGTACA AAACTTTTTA TATCAAAAGG CTTTGCACAT 3022 TTCTATATGA GTGGGTTTAC TGGTAAATTA TGTTATTTTT TACAACTAAT TTTGTACTCT 3082 CAGAATGTTT GTCATATGCT TCTTGCAATG CATATTTTTT AATCTCAAAC GTTTCAATAA 3142 AACCATTTTT CAGATATAAA GAGAATTACT TCAAATTGAG TAATTCAGAA AAACTCAAGA 3202 TTTAAGTTAA AAAGTGGTTT GGACTTGGGA ACCCTGTAGA TCTCCGAATT C 3253

【００５７】配列番号：4 配列の長さ：62 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号5と相補的配列。 配列 CATGCAACAG TTACTATGAC AAGGTCCTGG CTCACAGCCG CATCAGGGGT CGGGATCAGG 60 GC 62

【００５８】配列番号：5 配列の長さ：55 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リンカーDNA。配列番号4と相補的配列。 配列 CTGATCCCGA CCCCTGATGC GGCTGTGAGC CAGGACCTTG TCATAGTAAC TGTTG 55

【００５９】配列番号：6 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-2.1 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-2の断片で122番目から137番目ま
で。 配列 Glu Asn Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Asn Asn Val Asn 5 10 15

【００６０】配列番号：7 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-2.2 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-2の断片で475番目から487番目ま
で。 配列 Glu Lys Ser Leu His Asp Lys Leu Arg Gln Asp Lys Arg 5 10

【００６１】配列番号：8 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-2.3 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-2の断片で772番目から787番目ま
で。 配列 Asn Lys Arg Val Gln Gly Pro Arg Arg Arg Ser Arg Glu Gly Arg Ser 5 10 15

【００６２】配列番号：9 配列の長さ：16 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-2.4 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-2の断片で246番目から261番目ま
で。 配列 Gly His Phe Thr Leu Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu 5 10 15

【００６３】配列番号：10 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：マウス 配列の特徴：OSF-2.5 （抗原ペプチド） 存在位置：マウスOSF-2の断片で330番目から347番目ま
で。 配列 Ile Val Thr Lys Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Glu Val Leu Ile 5 10 15 Pro Asp

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト胎盤ＯＳＦ−２の構造の模式図である。

【図２】 ヒトＯＳＦ−２（ｈＯＳＦ−２）とショウジ
ョウバエ（drosophila）のファシクリン−Ｉ（dFas-1）
の繰り返し領域（Ｒ１からＲ４）のアミノ酸残基の配列
比較表である。

【図３】 マウスとヒトのＯＳＦ−２のアミノ酸残基の
配列比較表（alignment）である。（−）は、ギャップ
を示し、配列の比較をしやすくするために挿入したもの
である。マウスとヒトのＯＳＦ−２の間で共通なアミノ
酸残基はドット（・）で示している。

【図４】 ｐＭＣ１６３−１の制限酵素地図である。太
線はｐＵＣ１１８ベクターの中に挿入されたクローン化
されたマウスＯＳＦ−２のｃＤＮＡを示す。矢印は、ア
ンピシリン耐性遺伝子の位置を示す。黒色の円は、プラ
スミドの複製開始部位を示す。ポリリンカー領域とＯＳ
Ｆ−２のｃＤＮＡ領域の中の制限酵素認識部位もそれぞ
れ示した。類似したプラスミドであるｐＭＣ１６３−２
は、同じマウスＯＳＦ−２のｃＤＮＡをｐＭＣ１６３−
１とは反対向きに同じベクターの中に挿入したものであ
る。

【図５】 マウスのＯＳＦ−２の組織特異的発現を示す
オートラジオグラフィーの図である。ＲＮＡを種々の組
織や細胞株から分離し、ドットブロット（dotblot）分
析を、実施例４に記載されたように実施したものであ
る。

【手続補正書】

【提出日】平成４年４月２１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】マウスＯＳＦ−２（ｍＯＳＦ−２）のｃＤ
ＮＡは、マウス骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３Ｅ１由来の
ｃＤＮＡライブラリーから、サブトラクションハイブリ
ダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ）法によりクローン化された。つづい
て、マウスＯＳＦ−２のｃＤＮＡをプローブとして、ヒ
ト胎盤及び骨腫瘍細胞由来の二種のヒトｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。それぞれのｃＤＮＡライ
ブラリーから、二種のＯＳＦ−２が得られ、それぞれｈ
ＯＳＦ−２ｐ１及びｈＯＳＦ−２ｏｓと名付けられ、そ
の塩基配列を決定した。これらは、それぞれ配列表の
１、２および３に示されている。これらのｃＤＮＡの配
列は現在利用できる種々のＤＮＡデータベースによる検
索で、新規であることが明らかにされた。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】〔実施例３〕 マウスのＯＳＦ−２のＤＮ
Ａ配列 ｐＭＣ１６３−１とｐＭＣ１６３−２を、制限酵素のＳ
ｐｈＩとＢａｍＨＩで酵素消化し、宝酒造から購入した
「キロシークエンスデレーションキット」をもちいて、
１２個のデレーションミュータントを作成した。それぞ
れのデレーションミュータントの両方向のＮＡ鎖の配列
は、米国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製
の自動ＤＮＡ配列読取り装置モデル３７０Ａ（ａｕｔｏ
ｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により決定
した。それぞれのクローンの塩基配列のうち、約３００
塩基対を決定し、全長のｃＤＮＡの配列は、重複部分を
連結させることにより決定した。この全長ｃＤＮＡの塩
基配列と、この塩基配列より翻訳したアミノ酸配列は配
列表１に示した。このｃＤＮＡにコードされている蛋白
質はマウスＯＳＦ−２と名づけられた。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４０】〔実施例６〕 ヒトＯＳＦ−２のＤＮＡ配
列上記 の実施例５でクローン化された、ｐＫＯＴ１３３と
ｐＫＯＴ１５８についても、制限酵素のＳｐｈＩとＸｂ
ａＩで酵素消化し、「キロシークエンスデレーションキ
ット」をもちいて、デレーションミュータントを作成し
た。ｐＫＯＴ１３３とｐＫＯＴ１５８のデレーションミ
ュータントのＤＮＡ鎖の配列は、米国Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製の自動ＤＮＡ配列読取り装
置３７３Ａ（ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ）により決定した。それぞれのクローンの塩基
配列のうち、約３００塩基対を決定し、全長のｃＤＮＡ
の配列は、重複部分を連結させることにより決定した。
この全長ｃＤＮＡの塩基配列と、この塩基配列より翻訳
したアミノ酸配列は配列表の配列番号２、３に示した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 8413−4Ｃ Ｎ 8413−4Ｃ 45/00 8415−4Ｃ 49/00 Ａ 9164−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 手塚 建一 埼玉県坂戸市八幡２丁目５番24号

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１において、１番から
   ７８８番目までのアミノ酸配列を有するｍＯＳＦ−２、
   配列番号２において、１番から７５８番目までのアミノ
   酸配列を有するｈＯＳＦ−２ｐｌ、配列番号３におい
   て、１番から８１５番目までのアミノ酸配列を有するｈ
   ＯＳＦ−２ｏｓ、または、これらのアナログ、または、
   これらの断片よりなる蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１の蛋白質をコードするＤＮＡま
   たはＲＮＡ。
3. 【請求項３】 シグナルペプチドのアミノ酸配列をコー
   ドするＤＮＡまたはＲＮＡが付加された請求項２のＤＮ
   ＡまたはＲＮＡ。
4. 【請求項４】 シグナルペプチドが哺乳動物のＯＳＦ−
   ２由来である請求項３のＤＮＡまたはＲＮＡ。
5. 【請求項５】 シグナルペプチドが酵母または大腸菌由
   来である請求項３のＤＮＡまたはＲＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号1において、−２３番
   から７８８番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ド、配列番号２において、−２１番から７５８番目まで
   のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、配列番
   号３において、−２１番から８１５番目までのアミノ酸
   配列を有するポリペプチドをコードする請求項３のＤＮ
   ＡまたはＲＮＡ。
7. 【請求項７】 哺乳動物の組換えＯＳＦ−２又はそのア
   ナログを産生させる方法であって、以下の手順を含む方
   法： （ａ）以下のＤＮＡ配列より成る異種ＤＮＡを含む細胞
   集団を得ること。 （ｉ）当該細胞で機能しうる転写と翻訳をコントロール
   する配列。 （ii）上記のコントロール配列の下に結合した哺乳動物
   のＯＳＦ−２又はそのアナログより成るポリペプチドを
   コードするＤＮＡ配列。 （ｂ）当該細胞集団を当該ポリペプチドが産生される条
   件下で培養すること。
8. 【請求項８】 細胞集団が微生物である請求項７の産生
   方法。
9. 【請求項９】 細胞集団が酵母または大腸菌である請求
   項７の産生方法。
10. 【請求項１０】 細胞集団が哺乳動物細胞である請求項
    ７の産生方法。
11. 【請求項１１】 請求項１の蛋白質に対するポリクロー
    ナル及びモノクローナル抗体。
12. 【請求項１２】 請求項１１の抗体を含む診断方法。
13. 【請求項１３】 請求項２〜６のいずれかの項に記載の
    ＤＮＡあるいはＲＮＡの全てまたは一部分を含む診断方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１のアミノ酸配列に基づいて合
    成されたペプチドを含む診断方法。
15. 【請求項１５】 請求項１の蛋白質を含む医薬品。