JPH05268997A - 酵素的増幅測定方法 - Google Patents
酵素的増幅測定方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＣｏＡサイクリング系内で生じるＮＡＤＨの
量を直接測定することにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又
はピルビン酸を定量する、新規な測定原理に基づく酵素
的増幅測定方法を提供する。 【構成】 還元型補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）と、ピルビ
ン酸又はα−ケトグルタル酸とを含有する試料に、Ｃｏ
Ａ−ＳＨとＮＡＤとからアセチルＣｏＡ又はスクシニル
ＣｏＡとＮＡＤＨとを生成し得る第一の酵素、並びに、
アセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡからＣｏＡ−ＳＨ
を生成し得る第二の酵素を、ＮＡＤ及び第二の酵素に必
要な基質の存在下で作用させ、ＣｏＡ又はピルビン酸を
サイクリングさせて生成するＮＡＤＨの量を測定するこ
とにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸の量を
増幅させて定量する酵素的増幅測定方法。
量を直接測定することにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又
はピルビン酸を定量する、新規な測定原理に基づく酵素
的増幅測定方法を提供する。 【構成】 還元型補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）と、ピルビ
ン酸又はα−ケトグルタル酸とを含有する試料に、Ｃｏ
Ａ−ＳＨとＮＡＤとからアセチルＣｏＡ又はスクシニル
ＣｏＡとＮＡＤＨとを生成し得る第一の酵素、並びに、
アセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡからＣｏＡ−ＳＨ
を生成し得る第二の酵素を、ＮＡＤ及び第二の酵素に必
要な基質の存在下で作用させ、ＣｏＡ又はピルビン酸を
サイクリングさせて生成するＮＡＤＨの量を測定するこ
とにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸の量を
増幅させて定量する酵素的増幅測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＣｏＡ−ＳＨからアセ
チルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡを生成する酵素反応及
びアセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡからＣｏＡ−Ｓ
Ｈを生成する酵素反応の共役系に、ＮＡＤからＮＡＤＨ
を生成する酵素反応を共役させて、ＣｏＡ−ＳＨ又はピ
ルビン酸の量を増幅させることによる、酵素的増幅測定
方法に関する。
チルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡを生成する酵素反応及
びアセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡからＣｏＡ−Ｓ
Ｈを生成する酵素反応の共役系に、ＮＡＤからＮＡＤＨ
を生成する酵素反応を共役させて、ＣｏＡ−ＳＨ又はピ
ルビン酸の量を増幅させることによる、酵素的増幅測定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、微量の物質を定量するために、こ
の物質を基質とする別の酵素の反応によって、量的に増
幅させて定量する方法が、酵素的増幅測定方法（酵素的
サイクリング）として知られている。中でもＮＡＤ
（Ｈ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＣｏＡ、アセチルＣｏＡ等
は、二種の共役酵素反応系を利用することにより容易に
増幅できるのでよく利用されている。
の物質を基質とする別の酵素の反応によって、量的に増
幅させて定量する方法が、酵素的増幅測定方法（酵素的
サイクリング）として知られている。中でもＮＡＤ
（Ｈ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＣｏＡ、アセチルＣｏＡ等
は、二種の共役酵素反応系を利用することにより容易に
増幅できるのでよく利用されている。
【０００３】ＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを利用する方法
としては、例えば下記式（Ａ）に示すＣｏＡサイクリン
グが知られている。
としては、例えば下記式（Ａ）に示すＣｏＡサイクリン
グが知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】上記式（Ａ）で示されるＣｏＡサイクリン
グに於ては、生成するクエン酸の量を測定することによ
りＣｏＡ及びアセチルＣｏＡの増幅された量を測定す
る。即ち、増幅されたクエン酸にアコニターゼを作用さ
せて、ｃｉｓ−アコニット酸を経てイソクエン酸を生成
させ、イソクエン酸とＮＡＤＰとにイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼを作用させてα−ケトグルタル酸及びＮＡＤ
ＰＨを生成させ、ＮＡＤＰＨを吸光度測定又は蛍光測定
することにより定量する。従って、上記のＣｏＡサイク
リングは、クエン酸の検出系でこのように多くの共役酵
素を使用するために、混入酵素等による影響により測定
誤差が生じ易いと言う問題点がある。
グに於ては、生成するクエン酸の量を測定することによ
りＣｏＡ及びアセチルＣｏＡの増幅された量を測定す
る。即ち、増幅されたクエン酸にアコニターゼを作用さ
せて、ｃｉｓ−アコニット酸を経てイソクエン酸を生成
させ、イソクエン酸とＮＡＤＰとにイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼを作用させてα−ケトグルタル酸及びＮＡＤ
ＰＨを生成させ、ＮＡＤＰＨを吸光度測定又は蛍光測定
することにより定量する。従って、上記のＣｏＡサイク
リングは、クエン酸の検出系でこのように多くの共役酵
素を使用するために、混入酵素等による影響により測定
誤差が生じ易いと言う問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、増幅
された生成物の検出酵素反応系を必要とすることなく、
ＣｏＡサイクリング系内で生じるＮＡＤＨの量を直接測
定することにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン
酸を定量する、新規な測定原理に基づく酵素的増幅測定
方法を提供することにある。
された生成物の検出酵素反応系を必要とすることなく、
ＣｏＡサイクリング系内で生じるＮＡＤＨの量を直接測
定することにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン
酸を定量する、新規な測定原理に基づく酵素的増幅測定
方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、還元型補酵素
Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）と、ピルビン酸又はα−ケトグルタ
ル酸とを含有する試料に、ＣｏＡ−ＳＨとＮＡＤとから
アセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡとＮＡＤＨとを生
成し得る第一の酵素、並びに、アセチルＣｏＡ又はスク
シニルＣｏＡからＣｏＡ−ＳＨを生成し得る第二の酵素
を、ＮＡＤ及び第二の酵素に必要な基質の存在下で作用
させ、ＣｏＡ又はピルビン酸をサイクリングさせて生成
するＮＡＤＨの量を測定することにより、試料中のＣｏ
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸の量を増幅させて定量すること
を特徴とする、酵素的増幅測定方法である。
Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）と、ピルビン酸又はα−ケトグルタ
ル酸とを含有する試料に、ＣｏＡ−ＳＨとＮＡＤとから
アセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡとＮＡＤＨとを生
成し得る第一の酵素、並びに、アセチルＣｏＡ又はスク
シニルＣｏＡからＣｏＡ−ＳＨを生成し得る第二の酵素
を、ＮＡＤ及び第二の酵素に必要な基質の存在下で作用
させ、ＣｏＡ又はピルビン酸をサイクリングさせて生成
するＮＡＤＨの量を測定することにより、試料中のＣｏ
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸の量を増幅させて定量すること
を特徴とする、酵素的増幅測定方法である。
【０００８】本発明の好適な態様は下記の通りである。 （１）上記の第一の酵素が、ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼ複合体又は２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複
合体であることを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
ゼ複合体又は２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複
合体であることを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
【０００９】（２）上記の第一の酵素がピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵素が特定の
基質とアセチルＣｏＡとから該特定の基質のアセチル化
物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する酵素であり、ＣｏＡをサ
イクリングさせることを特徴とする上記の酵素的増幅測
定方法。
ドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵素が特定の
基質とアセチルＣｏＡとから該特定の基質のアセチル化
物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する酵素であり、ＣｏＡをサ
イクリングさせることを特徴とする上記の酵素的増幅測
定方法。
【００１０】（３）上記の第一の酵素が２−オキソグル
タル酸デヒドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵
素が特定の基質とスクシニルＣｏＡとから該特定の基質
のスクシニル化物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する酵素であ
り、ＣｏＡをサイクリングさせることを特徴とする上記
の酵素的増幅測定方法。
タル酸デヒドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵
素が特定の基質とスクシニルＣｏＡとから該特定の基質
のスクシニル化物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する酵素であ
り、ＣｏＡをサイクリングさせることを特徴とする上記
の酵素的増幅測定方法。
【００１１】（４）上記の第一の酵素がピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵素がギ酸ア
セチルトランスフェラーゼであり、ピルビン酸をサイク
リングさせることを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
ドロゲナーゼ複合体であり、上記の第二の酵素がギ酸ア
セチルトランスフェラーゼであり、ピルビン酸をサイク
リングさせることを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
【００１２】（５）ＮＡＤＨの量の測定を、ＮＡＤＨの
紫外部に於ける吸収又は蛍光を測定することにより行う
ことを特徴とする上記の酵素的増幅測定方法。
紫外部に於ける吸収又は蛍光を測定することにより行う
ことを特徴とする上記の酵素的増幅測定方法。
【００１３】（６）ＮＡＤＨの量の測定を、ＮＡＤＨと
反応して検出可能な物質に変化できる指示薬組成物（呈
色試薬組成物、蛍光試薬組成物、発光試薬組成物等）を
使用して行うことを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
反応して検出可能な物質に変化できる指示薬組成物（呈
色試薬組成物、蛍光試薬組成物、発光試薬組成物等）を
使用して行うことを特徴とする上記の酵素的増幅測定方
法。
【００１４】本発明の酵素的増幅測定方法は、特定の第
一酵素と第二酵素とを組み合わせて、ＣｏＡ又はピルビ
ン酸をサイクリングさせ、同じ系内で生成する増幅され
たＮＡＤＨの量を直接測定することにより、試料中のＣ
ｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を定量する新規な測定原理に
基づくものである。従来の酵素的増幅測定方法に於いて
ＣｏＡをサイクリングさせる方法は知られているが、本
発明の酵素的増幅測定方法は、容易に正確に定量するこ
とができるＮＡＤＨがＣｏＡのサイクリング系で生成
し、ＮＡＤＨの量を直接測定できる点に於いて、従来の
酵素的増幅測定方法とは基本的に全く異なる新規な方法
である。また、ピルビン酸のサイクリング系については
従来知られていなかった。なお、本明細書に於ては、ピ
ルビン酸はピルビン酸塩をも含めて意味するものであ
り、α−ケトグルタル酸はα−ケトグルタル酸塩をも含
めて意味するものである。
一酵素と第二酵素とを組み合わせて、ＣｏＡ又はピルビ
ン酸をサイクリングさせ、同じ系内で生成する増幅され
たＮＡＤＨの量を直接測定することにより、試料中のＣ
ｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を定量する新規な測定原理に
基づくものである。従来の酵素的増幅測定方法に於いて
ＣｏＡをサイクリングさせる方法は知られているが、本
発明の酵素的増幅測定方法は、容易に正確に定量するこ
とができるＮＡＤＨがＣｏＡのサイクリング系で生成
し、ＮＡＤＨの量を直接測定できる点に於いて、従来の
酵素的増幅測定方法とは基本的に全く異なる新規な方法
である。また、ピルビン酸のサイクリング系については
従来知られていなかった。なお、本明細書に於ては、ピ
ルビン酸はピルビン酸塩をも含めて意味するものであ
り、α−ケトグルタル酸はα−ケトグルタル酸塩をも含
めて意味するものである。
【００１５】本発明に於ける第一の測定原理［以下、測
定原理（１）と言うことがある］を下記式（１）に示
す。
定原理（１）と言うことがある］を下記式（１）に示
す。
【００１６】
【化２】
【００１７】式（１）から明らかなように、測定原理
（１）に於ては、第一の酵素としてピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素として特定の基質
（１）とアセチルＣｏＡとから基質（１）のアセチル化
物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する第二の酵素（１）を使用
し、ＣｏＡをサイクリングしている。測定原理（１）に
於ては、ピルビン酸、ＮＡＤ及び基質（１）を過剰に添
加し、ＣｏＡのサイクリング回数に比例した量でＮＡＤ
Ｈが生成するので、増幅されたＮＡＤＨの量を定量し、
その測定値を増幅反応時間とサイクリング率（単位時間
当りのサイクル数）で除すことにより、ＣｏＡの量を求
めることができる。
（１）に於ては、第一の酵素としてピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素として特定の基質
（１）とアセチルＣｏＡとから基質（１）のアセチル化
物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する第二の酵素（１）を使用
し、ＣｏＡをサイクリングしている。測定原理（１）に
於ては、ピルビン酸、ＮＡＤ及び基質（１）を過剰に添
加し、ＣｏＡのサイクリング回数に比例した量でＮＡＤ
Ｈが生成するので、増幅されたＮＡＤＨの量を定量し、
その測定値を増幅反応時間とサイクリング率（単位時間
当りのサイクル数）で除すことにより、ＣｏＡの量を求
めることができる。
【００１８】第二の酵素（１）としては、上記の機能を
有するものであればどのようなものであってもよく、例
えば、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.
3.1.1）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.2）、グルコサミンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ 2.3.1.3）、グルコサミンホスフェートア
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.4）、アリルア
ミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.5）、コ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.6）、カ
ルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.
7）、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.8）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラー
ゼ（ＥＣ 2.3.1.9）、硫化水素アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.10 ）、チオエタノールアミンアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.11 ）、アセチルＣ
ｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.16 ）、ア
スパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.
1.17 ）、ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.18 ）、コルチゾールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.27 ）、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.3.1.28 ）、グリシ
ンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.29 ）、セ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.30 ）、
ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.3
1 ）、ヒスチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.33 ）、Ｄ−トリプトファンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.34 ）、Ｄ−アミノ酸アセチルト
ランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.36 ）、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸４−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.44 ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸９（又は７）
−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.45
）、フェニルアラニンアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.53 ）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.54 ）、カナマイシン６’−アセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.55 ）、プトレッシンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.57 ）、ゲンタマ
イシン２’−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.
1.59 ）、ゲンタマイシン３−アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.60 ）、アセチルＣｏＡヒドロラーゼ
（ＥＣ 3.1.2.1）等を挙げることができる。
有するものであればどのようなものであってもよく、例
えば、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.
3.1.1）、イミダゾールアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.2）、グルコサミンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ 2.3.1.3）、グルコサミンホスフェートア
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.4）、アリルア
ミンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.5）、コ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.6）、カ
ルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.
7）、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.8）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラー
ゼ（ＥＣ 2.3.1.9）、硫化水素アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.10 ）、チオエタノールアミンアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.11 ）、アセチルＣ
ｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.16 ）、ア
スパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.
1.17 ）、ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.18 ）、コルチゾールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.27 ）、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ2.3.1.28 ）、グリシ
ンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.29 ）、セ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.30 ）、
ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.3
1 ）、ヒスチジンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.33 ）、Ｄ−トリプトファンアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.34 ）、Ｄ−アミノ酸アセチルト
ランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.36 ）、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸４−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
2.3.1.44 ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸９（又は７）
−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.45
）、フェニルアラニンアセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.53 ）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ
（ＥＣ 2.3.1.54 ）、カナマイシン６’−アセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.55 ）、プトレッシンアセ
チルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.57 ）、ゲンタマ
イシン２’−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.
1.59 ）、ゲンタマイシン３−アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.60 ）、アセチルＣｏＡヒドロラーゼ
（ＥＣ 3.1.2.1）等を挙げることができる。
【００１９】上記基質（１）は、第二の酵素（１）に対
応して特定される物質である。
応して特定される物質である。
【００２０】例えば、第二の酵素（１）としてセリンア
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.30 ）を選択し
た場合、測定原理（１）は下記式（１−１）のように表
される。
セチルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.30 ）を選択し
た場合、測定原理（１）は下記式（１−１）のように表
される。
【００２１】
【化３】
【００２２】本発明に於ける第二の測定原理［以下、測
定原理（２）と言うことがある］を下記式（２）に示
す。
定原理（２）と言うことがある］を下記式（２）に示
す。
【００２３】
【化４】
【００２４】式（２）から明らかなように、測定原理
（２）に於ては、第一の酵素として２−オキソグルタル
酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素として
特定の基質（２）とスクシニルＣｏＡとから基質（２）
のスクシニル化物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する第二の酵
素（２）を使用し、ＣｏＡをサイクリングしている。測
定原理（２）に於ては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ及
び基質（２）を過剰に添加し、ＣｏＡのサイクリング回
数に比例した量でＮＡＤＨが生成するので、増幅された
ＮＡＤＨの量を定量し、測定原理（１）に於けると同様
にしてＣｏＡの量を求めることができる。
（２）に於ては、第一の酵素として２−オキソグルタル
酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素として
特定の基質（２）とスクシニルＣｏＡとから基質（２）
のスクシニル化物とＣｏＡ−ＳＨとを生成する第二の酵
素（２）を使用し、ＣｏＡをサイクリングしている。測
定原理（２）に於ては、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤ及
び基質（２）を過剰に添加し、ＣｏＡのサイクリング回
数に比例した量でＮＡＤＨが生成するので、増幅された
ＮＡＤＨの量を定量し、測定原理（１）に於けると同様
にしてＣｏＡの量を求めることができる。
【００２５】第二の酵素（２）としては、上記の機能を
有するものであればどのようなものであってもよく、例
えば、δ−アミノレブリン酸シンセターゼ（ＥＣ 2.3.
1.37）、ジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.61 ）、ホモセリンサクシニルトラン
スフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.46 ）、サクシニルＣｏＡヒ
ドロラーゼ（ＥＣ 3.1.2.3）等を挙げることができる。
有するものであればどのようなものであってもよく、例
えば、δ−アミノレブリン酸シンセターゼ（ＥＣ 2.3.
1.37）、ジヒドロリポアミドサクシニルトランスフェラ
ーゼ（ＥＣ 2.3.1.61 ）、ホモセリンサクシニルトラン
スフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.46 ）、サクシニルＣｏＡヒ
ドロラーゼ（ＥＣ 3.1.2.3）等を挙げることができる。
【００２６】本発明に於ける第三の測定原理［以下、測
定原理（３）と言うことがある］を下記式（３）に示
す。
定原理（３）と言うことがある］を下記式（３）に示
す。
【００２７】
【化５】
【００２８】式（３）から明らかなように、測定原理
（３）に於ては、第一の酵素としてピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素としてギ酸アセチ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.54 ）を使用し、ピ
ルビン酸をサイクリングしている。測定原理（３）に於
ては、ＣｏＡ−ＳＨ、ＮＡＤ及びギ酸アセチルトランス
フェラーゼの基質であるギ酸（又はギ酸塩）を過剰に添
加し、ピルビン酸のサイクリング回数に比例した量でＮ
ＡＤＨが生成するので、増幅されたＮＡＤＨの量を定量
し、測定原理（１）に於けると同様にしてピルビン酸の
量を求めることができる。
（３）に於ては、第一の酵素としてピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ複合体を使用し、第二の酵素としてギ酸アセチ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.3.1.54 ）を使用し、ピ
ルビン酸をサイクリングしている。測定原理（３）に於
ては、ＣｏＡ−ＳＨ、ＮＡＤ及びギ酸アセチルトランス
フェラーゼの基質であるギ酸（又はギ酸塩）を過剰に添
加し、ピルビン酸のサイクリング回数に比例した量でＮ
ＡＤＨが生成するので、増幅されたＮＡＤＨの量を定量
し、測定原理（１）に於けると同様にしてピルビン酸の
量を求めることができる。
【００２９】測定原理（３）で使用する第一の酵素は測
定原理（１）で使用される第一の酵素と同じであり、測
定原理（３）で使用する第二の酵素は、測定原理（１）
で使用される第二の酵素の一種である。しかしながら、
測定原理（１）に於ては、ピルビン酸を試薬として多量
に添加しＣｏＡサイクリングにより微量のＣｏＡ−ＳＨ
を増幅測定することができるのに対し、測定原理（３）
に於ては、ＣｏＡ−ＳＨを試薬として多量に添加しピル
ビン酸サイクリングにより微量のピルビン酸を増幅測定
することができる。
定原理（１）で使用される第一の酵素と同じであり、測
定原理（３）で使用する第二の酵素は、測定原理（１）
で使用される第二の酵素の一種である。しかしながら、
測定原理（１）に於ては、ピルビン酸を試薬として多量
に添加しＣｏＡサイクリングにより微量のＣｏＡ−ＳＨ
を増幅測定することができるのに対し、測定原理（３）
に於ては、ＣｏＡ−ＳＨを試薬として多量に添加しピル
ビン酸サイクリングにより微量のピルビン酸を増幅測定
することができる。
【００３０】上記の各測定原理の反応で生成するＮＡＤ
Ｈの定量方法は、それ自体公知であり容易に実施するこ
とができるものであり、本発明に於けるＮＡＤＨの量の
測定のために、全ての公知のＮＡＤＨの定量方法を使用
することができる。例えば、ＮＡＤＨの紫外部（例えば
３４０ｎｍ）での吸光度を測定する方法、ＮＡＤＨに紫
外線を照射し発生する蛍光の強さを測定する方法、ＮＡ
ＤＨと反応して検出可能な物質に変化できる指示薬組成
物（呈色試薬組成物、蛍光試薬組成物、発光試薬組成物
等）を使用してＮＡＤＨの量を測定する方法（例えば、
レサズリンの共存下にジアホラーゼを作用させて生成す
るレゾルフィンの蛍光を測定する方法、ジアホラーゼ、
フェナジン誘導体等の電子伝達剤の存在下にテトラゾリ
ウム塩を還元して、生成したホルマザンを比色する方
法）などが使用できる。
Ｈの定量方法は、それ自体公知であり容易に実施するこ
とができるものであり、本発明に於けるＮＡＤＨの量の
測定のために、全ての公知のＮＡＤＨの定量方法を使用
することができる。例えば、ＮＡＤＨの紫外部（例えば
３４０ｎｍ）での吸光度を測定する方法、ＮＡＤＨに紫
外線を照射し発生する蛍光の強さを測定する方法、ＮＡ
ＤＨと反応して検出可能な物質に変化できる指示薬組成
物（呈色試薬組成物、蛍光試薬組成物、発光試薬組成物
等）を使用してＮＡＤＨの量を測定する方法（例えば、
レサズリンの共存下にジアホラーゼを作用させて生成す
るレゾルフィンの蛍光を測定する方法、ジアホラーゼ、
フェナジン誘導体等の電子伝達剤の存在下にテトラゾリ
ウム塩を還元して、生成したホルマザンを比色する方
法）などが使用できる。
【００３１】本発明の酵素的増幅測定方法は、試料中に
含有される微量のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を定量す
る方法であるが、反応（好ましくは酵素反応）中にＣｏ
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸を生成するような反応と本発明
の酵素的増幅測定方法とを組み合わせることにより、Ｃ
ｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生成するような反応の原料
を対象として定量することも可能である。
含有される微量のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を定量す
る方法であるが、反応（好ましくは酵素反応）中にＣｏ
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸を生成するような反応と本発明
の酵素的増幅測定方法とを組み合わせることにより、Ｃ
ｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生成するような反応の原料
を対象として定量することも可能である。
【００３２】例えば、下記に示すような反応生成物とし
てＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生成する酵素反応と、
本発明の酵素的増幅測定方法とを組み合わせることによ
り、下記の酵素反応の原料を定量することができる。
てＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生成する酵素反応と、
本発明の酵素的増幅測定方法とを組み合わせることによ
り、下記の酵素反応の原料を定量することができる。
【００３３】
【化６】
【００３４】
【化７】
【００３５】
【化８】
【００３６】
【化９】
【００３７】上記の酵素反応は、反応生成物としてＣｏ
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸を生成する酵素反応の例であっ
て、反応生成物としてＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生
成するものであれば、どのような酵素反応であってもよ
い。
Ａ−ＳＨ又はピルビン酸を生成する酵素反応の例であっ
て、反応生成物としてＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生
成するものであれば、どのような酵素反応であってもよ
い。
【００３８】これらの酵素反応は、本発明の酵素的増幅
測定方法とは別個に行ってもよいが、一般に、これらの
酵素反応と本発明の酵素的増幅測定方法に於ける反応と
を一緒に行うことが好ましい。
測定方法とは別個に行ってもよいが、一般に、これらの
酵素反応と本発明の酵素的増幅測定方法に於ける反応と
を一緒に行うことが好ましい。
【００３９】更に、上記の酵素反応は、一段の反応に限
られることなく、他の酵素反応と組み合わされたもので
あってもよい。
られることなく、他の酵素反応と組み合わされたもので
あってもよい。
【００４０】本発明に於いて、試薬として反応系に添加
するピルビン酸（ＣｏＡサイクリングの場合）、ＣｏＡ
−ＳＨ（ピルビン酸サイクリングの場合）、α−ケトグ
ルタル酸、ＮＡＤ、第二酵素の基質、第一の酵素、及び
第二の酵素の量は、十分な精度で測定できる量のＮＡＤ
Ｈが生成するような量にすることが必要であり、試料中
の測定対象のＣｏＡ−ＳＨ（ＣｏＡサイクリングの場
合）又はピルビン酸（ピルビン酸サイクリングの場合）
の量、サイクリング回数、等により変わるが、一般的
に、ピルビン酸（ＣｏＡサイクリングの場合）：０．５
〜２０ｍＭ、ＣｏＡ−ＳＨ（ピルビン酸サイクリングの
場合）：０．５〜２０ｍＭ、α−ケトグルタル酸：０．
５〜２０ｍＭ、ＮＡＤ：０．５〜５ｍＭ、第二酵素の基
質：０．５〜２０ｍＭ、第一の酵素：０．１〜１０単位
／ｍｌ、及び第二の酵素：０．１〜５０単位／ｍｌであ
ることが好ましい。
するピルビン酸（ＣｏＡサイクリングの場合）、ＣｏＡ
−ＳＨ（ピルビン酸サイクリングの場合）、α−ケトグ
ルタル酸、ＮＡＤ、第二酵素の基質、第一の酵素、及び
第二の酵素の量は、十分な精度で測定できる量のＮＡＤ
Ｈが生成するような量にすることが必要であり、試料中
の測定対象のＣｏＡ−ＳＨ（ＣｏＡサイクリングの場
合）又はピルビン酸（ピルビン酸サイクリングの場合）
の量、サイクリング回数、等により変わるが、一般的
に、ピルビン酸（ＣｏＡサイクリングの場合）：０．５
〜２０ｍＭ、ＣｏＡ−ＳＨ（ピルビン酸サイクリングの
場合）：０．５〜２０ｍＭ、α−ケトグルタル酸：０．
５〜２０ｍＭ、ＮＡＤ：０．５〜５ｍＭ、第二酵素の基
質：０．５〜２０ｍＭ、第一の酵素：０．１〜１０単位
／ｍｌ、及び第二の酵素：０．１〜５０単位／ｍｌであ
ることが好ましい。
【００４１】本発明の酵素的増幅測定方法は、前記のよ
うな物質を使用する他は、従来の酵素的増幅測定方法の
操作手順、条件に従って実施することができる。例え
ば、反応は一般に、１５〜４０℃の範囲内の温度、５．
５〜９．０の範囲内のｐＨで行うことができる。反応系
には、必要に応じて更に、界面活性剤、キレ−ト剤、高
分子化合物、各種塩類等を存在させてもよい。
うな物質を使用する他は、従来の酵素的増幅測定方法の
操作手順、条件に従って実施することができる。例え
ば、反応は一般に、１５〜４０℃の範囲内の温度、５．
５〜９．０の範囲内のｐＨで行うことができる。反応系
には、必要に応じて更に、界面活性剤、キレ−ト剤、高
分子化合物、各種塩類等を存在させてもよい。
【００４２】本発明の酵素的増幅測定方法に於ては、個
々の試薬を使用して反応液を調製してもよく、また、酵
素反応の常法に従って、予め二個又は三個以上の試薬系
を調製しておき、酵素的増幅測定に際してこれらの試薬
系を適宜使用するようにしてもよい。
々の試薬を使用して反応液を調製してもよく、また、酵
素反応の常法に従って、予め二個又は三個以上の試薬系
を調製しておき、酵素的増幅測定に際してこれらの試薬
系を適宜使用するようにしてもよい。
【００４３】
【実施例】次に、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００４４】［実施例１］本発明によるＬ−カルニチン
の酵素的増幅測定方法を示す。
の酵素的増幅測定方法を示す。
【００４５】実施例１に於ける測定原理は下記の通りで
ある。
ある。
【００４６】
【化１０】
【００４７】下記の組成を有する反応液（１）及び反応
液（２）を調製した。
液（２）を調製した。
【００４８】反応液（１）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ７．８） １ｍＭ パルミトイルＣｏＡ ２単位／ｍｌ カルニチンパルミトイルトランスフェ
ラーゼ
Ｈ７．８） １ｍＭ パルミトイルＣｏＡ ２単位／ｍｌ カルニチンパルミトイルトランスフェ
ラーゼ
【００４９】反応液（２）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ７．８） ５ｍＭ ピルビン酸 ５ｍＭ Ｌ−セリン ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ ＴＰＰ ５単位／ｍｌ ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体 ５単位／ｍｌ セリンアセチルトランスフェラーゼ
Ｈ７．８） ５ｍＭ ピルビン酸 ５ｍＭ Ｌ−セリン ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ ＴＰＰ ５単位／ｍｌ ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体 ５単位／ｍｌ セリンアセチルトランスフェラーゼ
【００５０】上記の反応液（１）０．５ｍｌに、試料と
して、それぞれＬ−カルニチンを５、１０、２０、３
０、４０又は５０μＭの濃度で含有するＬ−カルニチン
標準水溶液を５０μｌ添加し、得られた混合液を３７℃
で５分間インキュベートした。
して、それぞれＬ−カルニチンを５、１０、２０、３
０、４０又は５０μＭの濃度で含有するＬ−カルニチン
標準水溶液を５０μｌ添加し、得られた混合液を３７℃
で５分間インキュベートした。
【００５１】次に、この混合液に上記の反応液（２）
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
Ｌ−カルニチン濃度との関係をプロットした図を図１に
示す。
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
Ｌ−カルニチン濃度との関係をプロットした図を図１に
示す。
【００５２】図１から明らかなように、実施例１に於て
は吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係は広範囲のＬ−
カルニチン濃度に亙って原点を通る直線性を示してお
り、本発明の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏する
ことを示している。
は吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係は広範囲のＬ−
カルニチン濃度に亙って原点を通る直線性を示してお
り、本発明の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏する
ことを示している。
【００５３】［実施例２］本発明によるＬ−カルニチン
の酵素的増幅測定方法を示す。
の酵素的増幅測定方法を示す。
【００５４】実施例２に於ける測定原理は下記の通りで
ある。
ある。
【００５５】
【化１１】
【００５６】下記の組成を有する反応液（１）及び反応
液（２）を調製した。
液（２）を調製した。
【００５７】反応液（１）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ７．８） ２ｍＭ アセチルＣｏＡ ２単位／ｍｌ カルニチンアセチルトランスフェラー
ゼ
Ｈ７．８） ２ｍＭ アセチルＣｏＡ ２単位／ｍｌ カルニチンアセチルトランスフェラー
ゼ
【００５８】反応液（２）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ７．０） ５ｍＭ α−ケトグルタル酸ナトリウム ５ｍＭ グリシン ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ ＴＰＰ ５単位／ｍｌ ２−オキソグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ複合体 ５単位／ｍｌ δ−アミノレブリン酸シンセターゼ
Ｈ７．０） ５ｍＭ α−ケトグルタル酸ナトリウム ５ｍＭ グリシン ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ ＴＰＰ ５単位／ｍｌ ２−オキソグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ複合体 ５単位／ｍｌ δ−アミノレブリン酸シンセターゼ
【００５９】上記の反応液（１）０．５ｍｌに、試料と
して、それぞれＬ−カルニチンを５、１０、２０、３
０、４０又は５０μＭの濃度で含有するＬ−カルニチン
標準水溶液を５０μｌ添加し、得られた混合液を３７℃
で５分間インキュベートした。
して、それぞれＬ−カルニチンを５、１０、２０、３
０、４０又は５０μＭの濃度で含有するＬ−カルニチン
標準水溶液を５０μｌ添加し、得られた混合液を３７℃
で５分間インキュベートした。
【００６０】次に、この混合液に上記の反応液（２）
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
Ｌ−カルニチン濃度との関係をプロットした図を図２に
示す。
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
Ｌ−カルニチン濃度との関係をプロットした図を図２に
示す。
【００６１】図２から明らかなように、実施例２に於て
は吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係は広範囲のＬ−
カルニチン濃度に亙って原点を通る直線性を示してお
り、本発明の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏する
ことを示している。
は吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係は広範囲のＬ−
カルニチン濃度に亙って原点を通る直線性を示してお
り、本発明の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏する
ことを示している。
【００６２】［実施例３］本発明によるアンモニアの酵
素的増幅測定方法を示す。
素的増幅測定方法を示す。
【００６３】実施例３に於ける測定原理は下記の通りで
ある。
ある。
【００６４】
【化１２】
【００６５】下記の組成を有する反応液（１）及び反応
液（２）を調製した。
液（２）を調製した。
【００６６】反応液（１）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ７．０） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸 ２ｍＭ ホスホエノールピルベート ３ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＴＰＰ １ｍＭ ＡＴＰ ２単位／ｍｌ グルタミンシンセターゼ ４単位／ｍｌ ピルベートキナーゼ ２ｍＭ ＣｏＡ−ＳＨ
Ｈ７．０） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸 ２ｍＭ ホスホエノールピルベート ３ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＴＰＰ １ｍＭ ＡＴＰ ２単位／ｍｌ グルタミンシンセターゼ ４単位／ｍｌ ピルベートキナーゼ ２ｍＭ ＣｏＡ−ＳＨ
【００６７】反応液（２）組成 ５０ｍＭ ＢＥＳを緩衝剤とするグッドの緩衝液（ｐ
Ｈ８．０） ４単位／ｍｌ ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体 ５ｍＭ ギ酸ナトリウム ４単位／ｍｌ ギ酸アセチルトランスフェラーゼ
Ｈ８．０） ４単位／ｍｌ ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体 ５ｍＭ ギ酸ナトリウム ４単位／ｍｌ ギ酸アセチルトランスフェラーゼ
【００６８】上記の反応液（１）の０．５ｍｌに、試料
として、それぞれアンモニアを１０、２０、４０、６
０、８０又は１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するアンモ
ニア標準水溶液を２０μｌ添加し、得られた混合液を３
７℃で５分間インキュベートした。
として、それぞれアンモニアを１０、２０、４０、６
０、８０又は１００μｇ／ｍｌの濃度で含有するアンモ
ニア標準水溶液を２０μｌ添加し、得られた混合液を３
７℃で５分間インキュベートした。
【００６９】次に、この混合液に上記の反応液（２）の
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
アンモニア濃度との関係をプロットした図を図３に示
す。
０．５ｍｌを添加し、得られた混合液を３７℃で５分間
インキュベートした。その後分光光度計により、この混
合液の波長３４０ｎｍに於けるＮＡＤＨに基づく吸光度
を測定した。なお、試薬ブランク用として精製水を試料
として添加した。得られた３４０ｎｍに於ける吸光度と
アンモニア濃度との関係をプロットした図を図３に示
す。
【００７０】図３から明らかなように、実施例３に於て
は吸光度とアンモニア濃度との関係は広範囲のアンモニ
ア濃度に亙って原点を通る直線性を示しており、本発明
の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏することを示し
ている。
は吸光度とアンモニア濃度との関係は広範囲のアンモニ
ア濃度に亙って原点を通る直線性を示しており、本発明
の酵素的増幅測定方法が優れた効果を奏することを示し
ている。
【００７１】
【発明の効果】本発明の酵素的増幅測定方法は、増幅さ
れた生成物の別個の検出酵素反応系を必要とすることな
く、ＣｏＡサイクリング系内で生じるＮＡＤＨの量を直
接測定することにより、試料中の微量のＣｏＡ−ＳＨ又
はピルビン酸を定量することができると言う顕著に優れ
た効果を奏するものである。本発明の酵素的増幅測定方
法は、酵素反応によりＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生
成する反応と組み合わせることにより、その原料を定量
することが可能であり、極めて広範囲の物質の定量分析
に利用することができるものである。
れた生成物の別個の検出酵素反応系を必要とすることな
く、ＣｏＡサイクリング系内で生じるＮＡＤＨの量を直
接測定することにより、試料中の微量のＣｏＡ−ＳＨ又
はピルビン酸を定量することができると言う顕著に優れ
た効果を奏するものである。本発明の酵素的増幅測定方
法は、酵素反応によりＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸を生
成する反応と組み合わせることにより、その原料を定量
することが可能であり、極めて広範囲の物質の定量分析
に利用することができるものである。
【図１】実施例１に於いて得られた、３４０ｎｍに於け
る吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係をプロットした
図である。
る吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係をプロットした
図である。
【図２】実施例２に於いて得られた、３４０ｎｍに於け
る吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係をプロットした
図である。
る吸光度とＬ−カルニチン濃度との関係をプロットした
図である。
【図３】実施例３に於いて得られた、３４０ｎｍに於け
る吸光度とアンモニア濃度との関係をプロットした図で
ある。
る吸光度とアンモニア濃度との関係をプロットした図で
ある。
Claims (1)
- 【請求項１】 還元型補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）と、ピ
ルビン酸又はα−ケトグルタル酸とを含有する試料に、
ＣｏＡ−ＳＨとＮＡＤとからアセチルＣｏＡ又はスクシ
ニルＣｏＡとＮＡＤＨとを生成し得る第一の酵素、並び
に、アセチルＣｏＡ又はスクシニルＣｏＡからＣｏＡ−
ＳＨを生成し得る第二の酵素を、ＮＡＤ及び第二の酵素
に必要な基質の存在下で作用させ、ＣｏＡ又はピルビン
酸をサイクリングさせて生成するＮＡＤＨの量を測定す
ることにより、試料中のＣｏＡ−ＳＨ又はピルビン酸の
量を増幅させて定量することを特徴とする、酵素的増幅
測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10582892A JPH05268997A (ja) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | 酵素的増幅測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10582892A JPH05268997A (ja) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | 酵素的増幅測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268997A true JPH05268997A (ja) | 1993-10-19 |
Family
ID=14417920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10582892A Withdrawn JPH05268997A (ja) | 1992-03-30 | 1992-03-30 | 酵素的増幅測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05268997A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8880971B2 (en) | 2007-03-06 | 2014-11-04 | Industry Academy Cooperation Foundation Of Kyunghee University | Cooperative H-ARQ supporting method |
-
1992
- 1992-03-30 JP JP10582892A patent/JPH05268997A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8880971B2 (en) | 2007-03-06 | 2014-11-04 | Industry Academy Cooperation Foundation Of Kyunghee University | Cooperative H-ARQ supporting method |
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