JPS6214799A - ピルビン酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上利用する分野 本発明はピルビン酸の酵素的サイクリング反応を利用し
てピルビン酸を定量する方法に関する。

従来技術 従来、ピルビン酸の酵素的測定法としては、ピルビン酸
オキシダーゼを用い過酸化水素、アセチル−１−リン酸
、炭酸ガスを生成させ生成物を測定する方法、乳酸デヒ
ドロゲナーゼを作用させて乳酸とＮＡＤを生成させ、Ｎ
ＡＤＨの減少を測定する方法〔メソッド・オブ・エンザ
イマティク・アナリシス１４５２ページ、アカデミツク
・プレス、（１９７４））　、ピルビン酸キナーゼを作
用させＡＤＰとホスホエノールピルベートを生成させ、
生成物を測定する方法、ピルビン酸カルボキシラーゼを
作用させ、ＡＤＰ、オキザロ酢酸および無機リンを生成
させ、生成物を測定する方法などが知られている。しか
し、これらの測定は被検ピルビン酸１モルに対し、検出
物１モルを生成する反応であり、＠量のピルビン酸測定
においては、検出感度の点で問題がある。

ピルビン酸の高感度測定法として次式のピルビン酸サイ
クリング反応があるが、還元性のＮＡＤが大量に共存す
るため生成する過酸化水素とのインターラクションがあ
り、正確に定量できない。

試料中に存在する微量のピルビン酸を高感度で定量する
方法は見出されていない。

問題点を解決するための手段 本発明によれば試料中のピルビン酸もしくはその塩は下
記サイクリング反応系を利用して生成する物質の検出で
きる変化量を定量することによって定量できる。

即ち本発明によればピルビン酸もしくはその塩とＤ−グ
ルタミン酸からＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ
（以下ＡＡＴという）の作用によってアラニン及び２−
オキソグルクール酸を生成させ、アラニンをＤ−グルタ
ミン酸に作用しないＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用さ
せピルビン酸、過酸化水素及びアンモニアを生成させ、
生成した２−オキソグルクール酸、過酸化水素もしくは
アンモニアの変化量をそれ自体公知の定量法により定量
することによって高感度でピルビン酸もしくはその塩を
定量できる。

本発明の原理は単位時間当りの酵素サイクリング反応に
よって増巾されて生成する検出できる変化量は試料中に
存在するもしくは反応によって生成した微量のピルビン
酸もしくはその塩の量に化学量論釣に対応していること
に基づいている。

本発明方法はピルビン酸もしくはその塩を含有する試料
もしくはこれを生成する反応系に係る物質の定量に適用
できる。

かかる反応系の例が以下に示される。

し−乳酸デヒドロゲナーゼ （１）Ｌ−乳酸＋Ｎ＾Ｄ　−一一　　ピルビン酸＋ＮＡ
Ｄ）Ｉ↓ （１）の反応により検出 （４）ホスホエノールピルベート十　−−一一一一一一
−−→　　ピルビン酸十ＡＴＰＡＤＰ　　　　　　　　
　　　ピルビン酸キナーゼ（７）オキザロ酢酸　　　−
一一−−−−−−−−−−−−−→　　ピルビン酸十日
２０２オキザロＩｆ［デカルボキシラーゼ 本発明方法を実施するに際しては試料にＤ−グルタミン
酸、ＡＡＴ％Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを加え通常適当
な緩衝液例えばリン酸バッファーＧｏｏｄバッファー等
中で酵素の失活しない温度、通常３０〜４０℃で適当な
時間反応させる。反応を停止させた後２−オキソグルク
ール酸、過酸化水素もしくはアンモニアをそれ自体公知
の手法で定量することにより単位時間当たりの生成物の
変化量を求める。予め試料中のピルビン酸量と特定の反
応時間による生成物の量の関係を求めて検量線を作成し
ておき、これを利用して試料中のピルビン酸が求められ
る。

反応の停止はＡＡＴ阻害剤例えばＤ−サクロセリン、ア
ミノオキシ酢酸、ＳＨ試薬等、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ阻害剤例えば重金属、ＳＨ試薬、ヒドロキシ酪酸等が
用いられる。

本発明で用いられる酵素はいずれも公知の酵素で市販さ
れていて容易に入手できる。

反応を行わせるに際し用いる酵素、反応に係る基質等は
試料中に存在もしくは生成するピルビン酸もしくはその
塩より過剰であればよいが、通常１００倍モル以上の濃
度で用いられる。

反応生成物の定量については公知の手段がいずれ・も適
用できるが、過酸化水素を可視部に極大吸収値を有する
色素に導き、生成した色素によって着色した反応液の色
素の極大吸収波長における吸収を測定することによって
過酸化水素を定量する方法が簡便である。

かかる色素を生成する色原体として酸化されて色素を生
成する色原体であればいずれも用いつるが例えば４−ア
ミノアンチピリンとフェノール等が用いられ、この場合
定量にパーオキシダーゼが必要である。

又アンモニアおよび２−オキソグルクール酸の定量はグ
ルタメートデヒドロゲナーゼとＮＡ口（Ｐ）Ｈを用いる
酵素法〔メソッド・オブ・エンザイマティック・アナリ
シス１８０２ページ（１９７４）アカデミツク・プレス
・インク、二ニー・ヨーク〕などが用いられる。

試料中の測定すべき物質がピルビン酸でない場合には、
この物質をピルビン酸もしくはその塩に変換した後、前
述の方法によってピルビン酸もしくはその塩を定量する
ことにより目的を達成できる。

ピルビン酸もしくはその塩を生成する反応系が酵素反応
である場合は反応を順次行ってよいが、測定すべき物質
をピルビン酸もしくはその塩に変換するに必要な酵素お
よび物質、及びピルビン酸もしくはその塩の定量に必要
な酵素、基質、色原体等を試料に一度に加えて反応させ
、特定の生成物の変化量を測定することによって目的を
達成できる。この場合各酵素反応が互いに競合しないこ
とが必要である。

以下に本発明の態様を実施例によって説明する。

実施例１ 下記の組成の試薬Ｉ、■を用い血清中のピルビン酸を定
量した。

試薬Ｉ リン酸カリ緩衝＊　ｐＨ７，５１０（ｌｎＭ７　ｓ　／
−ル１０ｄ Ｄ−グルタミン酸　　　　　　　　２００ｍＭ４−アミ
ノアンチピリン　　　　　１ｍＭアルブミン　　　　　
　　　　　　０．１％ＡＡＴ　（バチルス属の微生物由
来）　　　２５０ｍＵ／ｍｌペルオキシダーゼ　　　　
　　　　ＩＱＵ／ｍｌ試薬■反応試薬液 反応停止液緩衝液ｐ　Ｈ７，５１００ｍＭＮａＮ５　　
　　　　　　　　　　　　　３％上記、試薬Ｉ　　Ｑ、
Ｑｍｌに被検液または各々ピルビン酸を１．２．３．５
■／ｄを含んだ標準液０．１ｍｌを加え、３７℃で１時
間反応させた。ついで反応停止液１．Ｑｍｌを添加、攪
拌し、直ちに生成した過酸化水素に応じて生成した色素
による反応液の着色を５０５ｎｍの波長で比色定量した
。その結果を第１表に示す。ピルビン酸の０〜３■／ｄ
１と反応液の吸光度は直線的比例関係にある。

ヒト血清Ａ、Ｂを乳酸脱水素酵素・ＮＡＤＨを使用する
ベーリン力−社製試薬キット（ピルビン酸テスト）で測
定したところ各々０．３．１．３ｍｇ／ｄ１であった。

実施例２ 実施例１の試薬組成のうち、ＡＡＴを６　Ｕ　／＋＋＋
１に、また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを２．２６０／
ｍｌに変えた試薬Ｉ　　１．Ｑｍｌにピルビン酸標準液
１゜２．３．５ｍｇ／Ｊを各々０．１ｍｌ添加し、３７
℃で１０分間反応させたのち、反応停止液１．Ｑｍｌを
添加、攪拌し直ちに５０５ｎｍの波長で吸光度を測定し
た。結果は第２表に示す通りで、０〜３のｇ／Ｊの定量
値が認められた。

ピルビン酸３ｍｇ／Ｊ　（０，３４ｍＭ）の吸光度０、
４０８とフェノール−４−アミノアンチピリンによるキ
ノン色素分子吸光係数ε＝１２Ｘ１０’から、本試薬条
件でのサイクル反応はｌＯ分間当たり６サイクルと算出
された。

第　　　２　　　表 実施例３ ノイラミニダーゼ０．４Ｕおよびノイラミン酸アルドラ
ーゼ４．ＩＵを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）　０．５ｍｌを２本の試験管ニトリ、各々ニジアール
酸２００■／ｄｌの標準液または血清を１０４加え、２
０分間反応させ、ジアール酸をピルビン酸にする。次に
実施例１の試薬１を１．５ｍｌ加え、３７℃で１時間サ
イクリング反応をさせた。

ついで実施例１の反応停止液１．Ｑｍｌを添加し、攪拌
後直ちに反応液の着色を５０５ｎｍの波長で比色定量し
た。

ジアール酸標準液の着色度を基準にして、血清のジアー
ル酸濃度は１２８■／ｄｌと算出された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中に含有するピルビン酸もしくはその塩また
   はピルビン酸もしくはその塩を生成する反応系に係る物
   質をピルビン酸もしくはその塩に変換させ生成したピル
   ビン酸もしくはその塩を下記サイクリング反応に従わせ
   て生成する検出できる変化量を定量することを特徴とす
   るピルビン酸もしくはその塩の定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼