JPH0779779A - 毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 - Google Patents
毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途Info
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 直接的で簡便、迅速かつ確実な耐熱性腸管毒
素を産生する毒素原性大腸菌の判定に用いる新規なオリ
ゴヌクレオチドを提供する。 【構成】 配列表・配列番号１〜配列番号８に示す核酸
配列を有するか、またはそれらの相補配列を有する毒素
原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌク
レオチドを標識化した標識オリゴヌクレオチド、及び該
オリゴヌクレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを
使用する毒素原性大腸菌の検出法および検出用試薬キッ
ト。
素を産生する毒素原性大腸菌の判定に用いる新規なオリ
ゴヌクレオチドを提供する。 【構成】 配列表・配列番号１〜配列番号８に示す核酸
配列を有するか、またはそれらの相補配列を有する毒素
原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌク
レオチドを標識化した標識オリゴヌクレオチド、及び該
オリゴヌクレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを
使用する毒素原性大腸菌の検出法および検出用試薬キッ
ト。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は大腸菌（Escherichia co
li）の一種である細菌の中から、耐熱性腸管毒素（heat
-stable enterotoxins，以下、ＳＴと略す）を産生する
遺伝子を有する細菌（以下、毒素原性大腸菌と呼ぶ）を
検出するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを
使用する毒素原性大腸菌の検出法およびその検出用試薬
キットに関する。
li）の一種である細菌の中から、耐熱性腸管毒素（heat
-stable enterotoxins，以下、ＳＴと略す）を産生する
遺伝子を有する細菌（以下、毒素原性大腸菌と呼ぶ）を
検出するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを
使用する毒素原性大腸菌の検出法およびその検出用試薬
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌は通常非病原性であるが、一部の
大腸菌が乳幼児に下痢を起こすことは古くから知られ、
病原性大腸菌と総称されている。最近では下痢原性大腸
菌とも呼ばれることもある。その作用機序から大腸菌は
以下の４種に分類される。 腸管病原性（Enteropathogenic）大腸菌 細胞侵入性（Enteroinvasive）大腸菌 腸管出血性（Enterohemorrhagic) 大腸菌 毒素原性（Enterotoxigenic) 大腸菌
大腸菌が乳幼児に下痢を起こすことは古くから知られ、
病原性大腸菌と総称されている。最近では下痢原性大腸
菌とも呼ばれることもある。その作用機序から大腸菌は
以下の４種に分類される。 腸管病原性（Enteropathogenic）大腸菌 細胞侵入性（Enteroinvasive）大腸菌 腸管出血性（Enterohemorrhagic) 大腸菌 毒素原性（Enterotoxigenic) 大腸菌
【０００３】腸管病原性大腸菌（EPEC）の作用機序の詳
細は未だ不明であるがサルモネラ型の下痢を起こす。細
胞侵入性大腸菌（EIEC）は赤痢菌と同様、大腸粘膜上皮
細胞内に侵入、増殖し赤痢型の下痢を起こす。腸管出血
性大腸菌（EHEC）は多量の出血を伴った下痢を起こす。
細は未だ不明であるがサルモネラ型の下痢を起こす。細
胞侵入性大腸菌（EIEC）は赤痢菌と同様、大腸粘膜上皮
細胞内に侵入、増殖し赤痢型の下痢を起こす。腸管出血
性大腸菌（EHEC）は多量の出血を伴った下痢を起こす。
【０００４】毒素原性大腸菌（ETEC）はコレラ様の水様
性下痢を惹起する腸管病原菌で、開発途上国の感染性下
痢症の主要原因菌である。また、途上国への渡航者の多
くはこれによる下痢症で悩まされている。空港検疫所で
申告される入帰国者の下痢症の２０〜３０％はこの毒素
原性大腸菌が原因と考えられる。海外渡航とは無関係の
国内集団食中毒事例や散発下痢症からも本菌が分離され
ており、その頻度は散発事例の水様性下痢患者の１０％
前後と推定される。また、ヒトのみならず、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギなど家畜の重篤下痢原因菌としても重
要な菌である。
性下痢を惹起する腸管病原菌で、開発途上国の感染性下
痢症の主要原因菌である。また、途上国への渡航者の多
くはこれによる下痢症で悩まされている。空港検疫所で
申告される入帰国者の下痢症の２０〜３０％はこの毒素
原性大腸菌が原因と考えられる。海外渡航とは無関係の
国内集団食中毒事例や散発下痢症からも本菌が分離され
ており、その頻度は散発事例の水様性下痢患者の１０％
前後と推定される。また、ヒトのみならず、ウシ、ブ
タ、ヒツジ、ヤギなど家畜の重篤下痢原因菌としても重
要な菌である。
【０００５】毒素原性大腸菌が産生する腸管下痢毒素
（エンテロトキシン）には大別して耐熱性毒素ＳＴと易
熱性毒素（heat-labile enterotoxins，以下、ＬＴと略
す）の２種がある。毒素原性大腸菌はこのＳＴとＬＴを
どちらか一方または両方産生することにより、下痢を起
こすことがわかっている。ＳＴは比較的低分子量の蛋白
質で１００℃、３０分の加熱に対しても安定である。一
方ＬＴはコレラ毒素（cholerae enterotoxin,)とその分
子構造、作用機構が類似している。
（エンテロトキシン）には大別して耐熱性毒素ＳＴと易
熱性毒素（heat-labile enterotoxins，以下、ＬＴと略
す）の２種がある。毒素原性大腸菌はこのＳＴとＬＴを
どちらか一方または両方産生することにより、下痢を起
こすことがわかっている。ＳＴは比較的低分子量の蛋白
質で１００℃、３０分の加熱に対しても安定である。一
方ＬＴはコレラ毒素（cholerae enterotoxin,)とその分
子構造、作用機構が類似している。
【０００６】耐熱性毒素ＳＴにはいくつかの種類がある
ことが知られている。その一つはＳＴａ（またはＳＴ
Ｉ）と呼ばれ、ヒトの下痢原因毒素である。他にＳＴｂ
（またはＳＴII）と呼ばれ、ブタの下痢症に関係してい
るが、ヒトへの病原性については明確でない毒素も知ら
れている。ＳＴａはヒトはもちろんウシ、ブタ、ヒツ
ジ、ヤギなどの家畜の下痢症も引き起こす毒素である。
家畜から分離される大腸菌はどれも同じ種類のＳＴａを
産生する。ところが、ヒトから分離される大腸菌は２種
類のＳＴａを産生する。家畜から分離されるものをＳＴ
ｐ（またはＳＴＩａ）、ヒトから分離されるものをＳＴ
ｈ（またはＳＴＩｂ）と呼ぶ。ヒトからはこのＳＴｈと
ＳＴｐがほぼ同じ頻度で検出される。これらは分子を構
成しているアミノ酸の種類が少し違うだけで構造、毒素
作用ともほとんど差が見られない。一方ＳＴｂはＳＴａ
と分子量、作用性など異なった点も多く性状を異にす
る。
ことが知られている。その一つはＳＴａ（またはＳＴ
Ｉ）と呼ばれ、ヒトの下痢原因毒素である。他にＳＴｂ
（またはＳＴII）と呼ばれ、ブタの下痢症に関係してい
るが、ヒトへの病原性については明確でない毒素も知ら
れている。ＳＴａはヒトはもちろんウシ、ブタ、ヒツ
ジ、ヤギなどの家畜の下痢症も引き起こす毒素である。
家畜から分離される大腸菌はどれも同じ種類のＳＴａを
産生する。ところが、ヒトから分離される大腸菌は２種
類のＳＴａを産生する。家畜から分離されるものをＳＴ
ｐ（またはＳＴＩａ）、ヒトから分離されるものをＳＴ
ｈ（またはＳＴＩｂ）と呼ぶ。ヒトからはこのＳＴｈと
ＳＴｐがほぼ同じ頻度で検出される。これらは分子を構
成しているアミノ酸の種類が少し違うだけで構造、毒素
作用ともほとんど差が見られない。一方ＳＴｂはＳＴａ
と分子量、作用性など異なった点も多く性状を異にす
る。
【０００７】この毒素原性大腸菌は通常の生化学的、生
物学的性状試験では常在する大腸菌と区別することは出
来ない。
物学的性状試験では常在する大腸菌と区別することは出
来ない。
【０００８】本発明は容易かつ迅速に耐熱性毒素（Ｓ
Ｔ）を産生する毒素原性大腸菌を検出する方法を提供す
る。本発明により臨床診断分野のみならず食品衛生分野
においても毒素原性大腸菌の検出を容易かつ迅速に実施
することが可能となる。従来から毒素原性大腸菌と常在
菌である一般の大腸菌との区別は、ＬＴまたはＳＴの産
生能を調べる以外にはなく、これらの毒素の検出法が起
病菌決定のために必須である。
Ｔ）を産生する毒素原性大腸菌を検出する方法を提供す
る。本発明により臨床診断分野のみならず食品衛生分野
においても毒素原性大腸菌の検出を容易かつ迅速に実施
することが可能となる。従来から毒素原性大腸菌と常在
菌である一般の大腸菌との区別は、ＬＴまたはＳＴの産
生能を調べる以外にはなく、これらの毒素の検出法が起
病菌決定のために必須である。
【０００９】ＳＴａの検出は従来、乳飲みマウスを用い
た生物学的方法（Dean,A.G. et.al.: ジャーナル・オブ
・インフェクシャス・ディジーズ,125巻 407頁1972年）
が用いられてきた。本法は生後２〜３日の乳飲みマウス
に毒素を経口投与して腸管内の液体貯溜を観察するもの
である。しかし本法では生後２〜３日の乳飲みマウスを
必要とし、多数の検査が困難、実験手技も煩雑であり、
かつ熟練を要するなどの問題も多い。更に再現性、定量
性にも問題がある。ＳＴｂは乳飲みマウスに対する毒性
はなく乳飲みブタを用いた検査が必要となり更に困難と
なる。
た生物学的方法（Dean,A.G. et.al.: ジャーナル・オブ
・インフェクシャス・ディジーズ,125巻 407頁1972年）
が用いられてきた。本法は生後２〜３日の乳飲みマウス
に毒素を経口投与して腸管内の液体貯溜を観察するもの
である。しかし本法では生後２〜３日の乳飲みマウスを
必要とし、多数の検査が困難、実験手技も煩雑であり、
かつ熟練を要するなどの問題も多い。更に再現性、定量
性にも問題がある。ＳＴｂは乳飲みマウスに対する毒性
はなく乳飲みブタを用いた検査が必要となり更に困難と
なる。
【００１０】ＳＴの分子量はＳＴａで約２０００、ＳＴ
ｂで約５０００と小さく、したがって抗体が出来にくく
免疫学的測定が困難であり報告も少ない。131Iで標識し
たＳＴを用いるラジオイムノアッセイ（Giannella,R.A.
et.al.:Infect. Immun.,33:186,1981, Frantz,j.c. e
t.al.:Infect. Immun.,33:193,1981 ）やＥＬＩＳＡ（K
lipstein,F.A. et.al.: J.Clin.Microbiol.,19:798,198
4, Thompson,M.R. et.al.:J.Clin.Microbiol.,20:59,19
84)などがある。しかし抗ＳＴ抗体を用いる場合一定品
質の抗体を得ることが困難である。更にELISAでは非特
異反応による疑陽性が頻繁に出て判定が出来ない場合も
ある。その他ラット腸管上皮細胞のグアニレート・シク
ラーゼがＳＴで活性化される性質を用いた方法（Walldm
an,S.A. et.al.:J. Infect. Dis.,149:83,1984）、ＳＴ
産生株を特異的に溶菌するファージを用いる方法（Soed
armono,P. et.al.:Biken J.,26:113,198）などが報告さ
れているが簡便な方法ではない。
ｂで約５０００と小さく、したがって抗体が出来にくく
免疫学的測定が困難であり報告も少ない。131Iで標識し
たＳＴを用いるラジオイムノアッセイ（Giannella,R.A.
et.al.:Infect. Immun.,33:186,1981, Frantz,j.c. e
t.al.:Infect. Immun.,33:193,1981 ）やＥＬＩＳＡ（K
lipstein,F.A. et.al.: J.Clin.Microbiol.,19:798,198
4, Thompson,M.R. et.al.:J.Clin.Microbiol.,20:59,19
84)などがある。しかし抗ＳＴ抗体を用いる場合一定品
質の抗体を得ることが困難である。更にELISAでは非特
異反応による疑陽性が頻繁に出て判定が出来ない場合も
ある。その他ラット腸管上皮細胞のグアニレート・シク
ラーゼがＳＴで活性化される性質を用いた方法（Walldm
an,S.A. et.al.:J. Infect. Dis.,149:83,1984）、ＳＴ
産生株を特異的に溶菌するファージを用いる方法（Soed
armono,P. et.al.:Biken J.,26:113,198）などが報告さ
れているが簡便な方法ではない。
【００１１】一般に外毒素の生物活性は高いが産生量は
きわめて微量であるために、外毒素を物質として検出す
ることが困難であること、また毒素としての生物作用を
検出するには、なんらかの生物系を使用しなければなら
ず煩雑である。これらの理由で、菌の外毒素産生能の有
無の判定は容易ではない。
きわめて微量であるために、外毒素を物質として検出す
ることが困難であること、また毒素としての生物作用を
検出するには、なんらかの生物系を使用しなければなら
ず煩雑である。これらの理由で、菌の外毒素産生能の有
無の判定は容易ではない。
【００１２】近年、ＤＮＡプローブによる毒素産生遺伝
子の検出が行われるようになってきた。ＳＴをコードす
る遺伝子はすでにクローン化（So, M. et.al.:Proc. Na
tl.Acad. Sci. U.S.A.,77:4011,1980，Lee, C. H. et.a
l.:Infect. Immun.,42:264,1983）され、その配列も決
定されている。クローン化された毒素遺伝子を含むＤＮ
Ａフラグメントをプローブとして毒素原性大腸菌を検出
した例（Echeverria,P. et.al.:J.Clin.Microbiol.,16:
1086,1982, Seriwatana, J. et.al.:Infect.Immun.,42:
152,1983）も報告されている。これらのプローブは制限
酵素断片を用いているが、その制限酵素断片の調製には
多大の労力が必要でかつ困難である。更にこれらのプロ
ーブはクローニングしたベクターのＤＮＡを含んでいる
場合があり、特異性に問題がある。また長いプローブを
用いた場合、ハイブリダイゼーションに長時間を要し、
測定に時間がかかるという欠点もある。ＳＴ遺伝子を32
Ｐで標識したプローブを用いるコロニーハイブリダイゼ
ーション法（Moseley,S.L. et.al.:J. Infect. Dis.,14
2:892,1980）も報告されているがＲＩを用いた方法で容
易にできる方法ではない。
子の検出が行われるようになってきた。ＳＴをコードす
る遺伝子はすでにクローン化（So, M. et.al.:Proc. Na
tl.Acad. Sci. U.S.A.,77:4011,1980，Lee, C. H. et.a
l.:Infect. Immun.,42:264,1983）され、その配列も決
定されている。クローン化された毒素遺伝子を含むＤＮ
Ａフラグメントをプローブとして毒素原性大腸菌を検出
した例（Echeverria,P. et.al.:J.Clin.Microbiol.,16:
1086,1982, Seriwatana, J. et.al.:Infect.Immun.,42:
152,1983）も報告されている。これらのプローブは制限
酵素断片を用いているが、その制限酵素断片の調製には
多大の労力が必要でかつ困難である。更にこれらのプロ
ーブはクローニングしたベクターのＤＮＡを含んでいる
場合があり、特異性に問題がある。また長いプローブを
用いた場合、ハイブリダイゼーションに長時間を要し、
測定に時間がかかるという欠点もある。ＳＴ遺伝子を32
Ｐで標識したプローブを用いるコロニーハイブリダイゼ
ーション法（Moseley,S.L. et.al.:J. Infect. Dis.,14
2:892,1980）も報告されているがＲＩを用いた方法で容
易にできる方法ではない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】また最近、合成オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いた毒素原性大腸菌−ＳＴの
検出法（Seriwatana, J. et.al.:J.Clin.Microbiol.,2
5:1438,1987, Echeverria, P. et.al.:J.Clin.Microbi
ol.,25:106,1987）が開示された。しかし、これらの方
法ではバイオアッセイやクローニングしたプローブを用
いた方法に比べ感度が低いとの報告もあり（Jounal of
Clinical Microbiology;25(1),106-109,1987）、充分満
足できるものとは言えない。
ヌクレオチドプローブを用いた毒素原性大腸菌−ＳＴの
検出法（Seriwatana, J. et.al.:J.Clin.Microbiol.,2
5:1438,1987, Echeverria, P. et.al.:J.Clin.Microbi
ol.,25:106,1987）が開示された。しかし、これらの方
法ではバイオアッセイやクローニングしたプローブを用
いた方法に比べ感度が低いとの報告もあり（Jounal of
Clinical Microbiology;25(1),106-109,1987）、充分満
足できるものとは言えない。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはオリゴヌク
レオチドに関する種々の検討を重ねた結果、新規なオリ
ゴヌクレオチドを用いた核酸プローブを用いて、高い検
出感度で耐熱性毒素（ＳＴ）を産生する毒素原性大腸菌
を特異的に検出することに成功し、本発明に至った。
レオチドに関する種々の検討を重ねた結果、新規なオリ
ゴヌクレオチドを用いた核酸プローブを用いて、高い検
出感度で耐熱性毒素（ＳＴ）を産生する毒素原性大腸菌
を特異的に検出することに成功し、本発明に至った。
【００１５】すなわち本発明は核酸配列が配列表・配列
番号１〜８に記載される配列であるか、またはそれらの
相補鎖であるオリゴヌクレオチドを含有することを特徴
とする毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドであ
る。
番号１〜８に記載される配列であるか、またはそれらの
相補鎖であるオリゴヌクレオチドを含有することを特徴
とする毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドであ
る。
【００１６】また本発明は上記毒素原性大腸菌検出用オ
リゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識または交雑しなかった標識を測定すること
を特徴とする試料中の毒素原性大腸菌の検出法である。
リゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識または交雑しなかった標識を測定すること
を特徴とする試料中の毒素原性大腸菌の検出法である。
【００１７】さらに本発明は上記毒素原性大腸菌検出用
オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとする
か、または標識化して得られた標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、次いでプライマ
ー伸長させ、得られた伸長生成物を測定することを特徴
とする試料中の毒素原性大腸菌の検出法である。
オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとする
か、または標識化して得られた標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、次いでプライマ
ー伸長させ、得られた伸長生成物を測定することを特徴
とする試料中の毒素原性大腸菌の検出法である。
【００１８】また本発明は上記毒素原性大腸菌検出用オ
リゴヌクレオチドを標識化して得られた標識核酸プロー
ブを含む毒素原性大腸菌の検出用キットである。
リゴヌクレオチドを標識化して得られた標識核酸プロー
ブを含む毒素原性大腸菌の検出用キットである。
【００１９】さらに本発明は上記毒素原性大腸菌検出用
オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、または該オ
リゴヌクレオチドを標識化して得られた標識核酸プライ
マー、デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラ
ーゼおよび／または逆転写酵素を含む毒素原性大腸菌の
検出用キットである。
オリゴヌクレオチドである核酸プライマー、または該オ
リゴヌクレオチドを標識化して得られた標識核酸プライ
マー、デオキシリボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラ
ーゼおよび／または逆転写酵素を含む毒素原性大腸菌の
検出用キットである。
【００２０】本発明に使用する核酸配列は、配列表にお
ける配列番号１〜８、またはそれらの相補鎖の配列を有
するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするオ
リゴヌクレオチドであり、これらは核酸プローブ、また
は核酸プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチ
ド数は２１〜５０である。本発明ではこれらの核酸の一
部が修飾され、または抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
により標識され、または遺伝情報中に欠失変異あるいは
点変異が存在するオリゴヌクレオチドであってもよい。
ける配列番号１〜８、またはそれらの相補鎖の配列を有
するオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とするオ
リゴヌクレオチドであり、これらは核酸プローブ、また
は核酸プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチ
ド数は２１〜５０である。本発明ではこれらの核酸の一
部が修飾され、または抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
により標識され、または遺伝情報中に欠失変異あるいは
点変異が存在するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２１】これらの核酸プローブ及び核酸プライマー
用のオリゴヌクレオチドの調製は公知の方法により実施
することが可能である。化学合成法は安価に且つ短期間
に一定の品質をもった核酸が調製できるために一般的に
用いられている。これらは例えばＡＢＩ社（Applied Bi
osystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。他にもリン
酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファ
イト法等が知られている。また生物学的起源、例えば制
限エンドヌクレアーゼ消化物から単離することも可能で
ある。
用のオリゴヌクレオチドの調製は公知の方法により実施
することが可能である。化学合成法は安価に且つ短期間
に一定の品質をもった核酸が調製できるために一般的に
用いられている。これらは例えばＡＢＩ社（Applied Bi
osystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成できる。他にもリン
酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファ
イト法等が知られている。また生物学的起源、例えば制
限エンドヌクレアーゼ消化物から単離することも可能で
ある。
【００２２】オリゴヌクレオチドの標識は核酸プローブ
や核酸プライマーの標識化のための公知の方法により実
施することが可能である。このような標識物質としては
例えば32Ｐや 3Ｈによる放射性物質、蛍光物質や発光物
質や酵素基質あるいはそれらの前駆体、酵素、抗体、抗
原、ハプテン、ビオチンなどの生理活性物質あるいはラ
テックス粒子のような不溶性担体であってもよい。例え
ば特開昭６０−５００７１７号公報に開示の方法により
リンカーを有するオリゴヌクレオチドのリンカー部分に
アルカリホスファターゼを結合させた酵素標識プローブ
を用いることが出来る。
や核酸プライマーの標識化のための公知の方法により実
施することが可能である。このような標識物質としては
例えば32Ｐや 3Ｈによる放射性物質、蛍光物質や発光物
質や酵素基質あるいはそれらの前駆体、酵素、抗体、抗
原、ハプテン、ビオチンなどの生理活性物質あるいはラ
テックス粒子のような不溶性担体であってもよい。例え
ば特開昭６０−５００７１７号公報に開示の方法により
リンカーを有するオリゴヌクレオチドのリンカー部分に
アルカリホスファターゼを結合させた酵素標識プローブ
を用いることが出来る。
【００２３】標識の検出はそれぞれに適した一般的な方
法により実施することができる。例えば蛍光測定、発光
測定、吸光度測定、色素の沈着、凝集反応、沈澱反応な
どがある。これらの技術は例えばアルカリホスファター
ゼならば、４−メチルウンベリフェリルリン酸を基質と
して生成する４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定
する方法、またブロムクロロインドリールホスフェート
を基質として生成したブロムクロロインドールにニトロ
ブルーテトラゾリウムを反応させて紫色の色素沈着を測
定する方法、基質としてジオキセタン化合物のリン酸エ
ステルを用い化学発光を測定する方法などがある。
法により実施することができる。例えば蛍光測定、発光
測定、吸光度測定、色素の沈着、凝集反応、沈澱反応な
どがある。これらの技術は例えばアルカリホスファター
ゼならば、４−メチルウンベリフェリルリン酸を基質と
して生成する４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定
する方法、またブロムクロロインドリールホスフェート
を基質として生成したブロムクロロインドールにニトロ
ブルーテトラゾリウムを反応させて紫色の色素沈着を測
定する方法、基質としてジオキセタン化合物のリン酸エ
ステルを用い化学発光を測定する方法などがある。
【００２４】次に本発明の核酸プローブを用いて毒素原
性大腸菌を検出する方法について具体的に述べる。毒素
原性大腸菌の存在が疑われる下痢患者の糞便や感染源と
推定される食物などから直接またはその培養物などから
核酸を分離する。続いて核酸を変性させ、本発明の核酸
プローブを添加する。この核酸プローブは、予め一本鎖
に変性された標的核酸の相補的配列とのみ水素結合を介
して二重鎖を形成する。標的核酸の変性は煮沸による変
性、または塩基性媒体中でインキュベートするなど公知
の方法を用いることができる。
性大腸菌を検出する方法について具体的に述べる。毒素
原性大腸菌の存在が疑われる下痢患者の糞便や感染源と
推定される食物などから直接またはその培養物などから
核酸を分離する。続いて核酸を変性させ、本発明の核酸
プローブを添加する。この核酸プローブは、予め一本鎖
に変性された標的核酸の相補的配列とのみ水素結合を介
して二重鎖を形成する。標的核酸の変性は煮沸による変
性、または塩基性媒体中でインキュベートするなど公知
の方法を用いることができる。
【００２５】反応した核酸プローブと未反応の核酸プロ
ーブは公知の方法で分離することができる。例えば耐熱
性毒素を産生する遺伝子を測定するには、検出用核酸プ
ローブが反応する部分とは異なる遺伝子配列部分のオリ
ゴヌクレオチドを担体に固定した捕捉用核酸プローブと
して使用するサンドイッチ測定法を用いれば容易に分離
することができる。これらの検出用核酸プローブと捕捉
用核酸プローブとを用いるサンドイッチ測定法の技術
は、例えば特開昭５８−４００９９号公報に示されてい
る。この場合、標的となる二本鎖核酸のうち一方の核酸
鎖に相補的且つ排他的な核酸配列を標識及び捕捉プロー
ブとして用いる様に設計しておくことは言うまでもな
い。核酸プローブと標的核酸が形成した二重鎖の検出は
核酸プローブに標識された標識物質をその標識物質に適
した種々の方法で実施することができる。
ーブは公知の方法で分離することができる。例えば耐熱
性毒素を産生する遺伝子を測定するには、検出用核酸プ
ローブが反応する部分とは異なる遺伝子配列部分のオリ
ゴヌクレオチドを担体に固定した捕捉用核酸プローブと
して使用するサンドイッチ測定法を用いれば容易に分離
することができる。これらの検出用核酸プローブと捕捉
用核酸プローブとを用いるサンドイッチ測定法の技術
は、例えば特開昭５８−４００９９号公報に示されてい
る。この場合、標的となる二本鎖核酸のうち一方の核酸
鎖に相補的且つ排他的な核酸配列を標識及び捕捉プロー
ブとして用いる様に設計しておくことは言うまでもな
い。核酸プローブと標的核酸が形成した二重鎖の検出は
核酸プローブに標識された標識物質をその標識物質に適
した種々の方法で実施することができる。
【００２６】次に本発明の核酸プライマーを用いて毒素
原性大腸菌を検出する方法について述べる。核酸増幅法
（ＰＣＲ）を行うに際して、二種のプライマーのうち、
少なくとも一方のプライマーとして本発明の核酸プライ
マーを用いることにより毒素原性大腸菌のみを増幅する
ことが可能となる。従って増幅された核酸を種々の方法
で確認すれば毒素原性大腸菌の存在を検出することがで
きる。例えば増幅反応後、電気泳動により特定の長さの
核酸のバンドを見ることで確認が可能であり、更に増幅
反応の際、放射性元素標識のデオキシリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＵＴＰ
等）を適量加えておけばより感度よく測定できる。また
増幅産物を他の核酸プローブで検出することも可能であ
る。核酸プライマーに標識を導入することも可能であ
る。すなわちＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写
酵素反応を阻害することのないような種々の標識を核酸
プライマーに導入することができる。例えばビオチン、
ハプテン、蛍光物質、発光物質、酵素基質等低分子の標
識を核酸プライマーの５’末端側に標識しても、ＤＮＡ
ポリメラーゼを阻害することなくＰＣＲを実施できるこ
とが知られている。二つのプライマーを二種の標識物質
で標識しておき、一方を担体に結合したレセプターで捕
捉すれば、ＰＣＲにより増幅が起こる、即ち毒素原性大
腸菌が存在した時のみ他方の標識物質が担体に捕捉さ
れ、これを測定することで容易に毒素原性大腸菌を検出
することができる。捕捉される物質としてビオチン、担
体に結合したレセプターとしてアビジン、ストレプトア
ビジンや抗ビオチン抗体を用いる方法が一般的によく知
られている。
原性大腸菌を検出する方法について述べる。核酸増幅法
（ＰＣＲ）を行うに際して、二種のプライマーのうち、
少なくとも一方のプライマーとして本発明の核酸プライ
マーを用いることにより毒素原性大腸菌のみを増幅する
ことが可能となる。従って増幅された核酸を種々の方法
で確認すれば毒素原性大腸菌の存在を検出することがで
きる。例えば増幅反応後、電気泳動により特定の長さの
核酸のバンドを見ることで確認が可能であり、更に増幅
反応の際、放射性元素標識のデオキシリボヌクレオチド
（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＵＴＰ
等）を適量加えておけばより感度よく測定できる。また
増幅産物を他の核酸プローブで検出することも可能であ
る。核酸プライマーに標識を導入することも可能であ
る。すなわちＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写
酵素反応を阻害することのないような種々の標識を核酸
プライマーに導入することができる。例えばビオチン、
ハプテン、蛍光物質、発光物質、酵素基質等低分子の標
識を核酸プライマーの５’末端側に標識しても、ＤＮＡ
ポリメラーゼを阻害することなくＰＣＲを実施できるこ
とが知られている。二つのプライマーを二種の標識物質
で標識しておき、一方を担体に結合したレセプターで捕
捉すれば、ＰＣＲにより増幅が起こる、即ち毒素原性大
腸菌が存在した時のみ他方の標識物質が担体に捕捉さ
れ、これを測定することで容易に毒素原性大腸菌を検出
することができる。捕捉される物質としてビオチン、担
体に結合したレセプターとしてアビジン、ストレプトア
ビジンや抗ビオチン抗体を用いる方法が一般的によく知
られている。
【００２７】また本発明の核酸プライマーを用いて毒素
原性大腸菌の核酸配列を決定することができる。すなわ
ち本発明の核酸プライマーを一種用いてＤＮＡポリメラ
ーゼにより目的核酸を鋳型としてシーケンシングを行え
ば、毒素原性大腸菌が存在する時のみ反応が起こる。サ
ンガー法によるシーケンシングを実施し、電気泳動を行
えば容易に毒素原性大腸菌の核酸配列を測定することが
できる。前述のように核酸プライマーを標識することも
可能であり、放射性元素で標識したデオキシリボヌクレ
オチドを添加して標識を導入することも可能である。こ
のようにして毒素原性大腸菌の核酸配列を比較すれば配
列中に突然変異、欠失などが存在する場合容易に解析す
ることができる。このような核酸配列の変化が食中毒の
患者と汚染源と考えられる食品の両者から検出されたな
らば汚染の因果関係をより明確に推定することも可能と
なる。
原性大腸菌の核酸配列を決定することができる。すなわ
ち本発明の核酸プライマーを一種用いてＤＮＡポリメラ
ーゼにより目的核酸を鋳型としてシーケンシングを行え
ば、毒素原性大腸菌が存在する時のみ反応が起こる。サ
ンガー法によるシーケンシングを実施し、電気泳動を行
えば容易に毒素原性大腸菌の核酸配列を測定することが
できる。前述のように核酸プライマーを標識することも
可能であり、放射性元素で標識したデオキシリボヌクレ
オチドを添加して標識を導入することも可能である。こ
のようにして毒素原性大腸菌の核酸配列を比較すれば配
列中に突然変異、欠失などが存在する場合容易に解析す
ることができる。このような核酸配列の変化が食中毒の
患者と汚染源と考えられる食品の両者から検出されたな
らば汚染の因果関係をより明確に推定することも可能と
なる。
【００２８】本発明はまたこれらのオリゴヌクレオチド
を用いた毒素原性大腸菌−ＳＴの検出法及びそのための
キットも提供する。
を用いた毒素原性大腸菌−ＳＴの検出法及びそのための
キットも提供する。
【００２９】
【実施例】以下に、実施例により本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。参考例−１．オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は配列番号３〜６であ
る。合成されたオリゴヌクレオチドは27％アンモニア水
で55℃、４時間脱保護処理を施した後、陰イオン交換高
速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシア
社）を用いて精製した。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。参考例−１．オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は配列番号３〜６であ
る。合成されたオリゴヌクレオチドは27％アンモニア水
で55℃、４時間脱保護処理を施した後、陰イオン交換高
速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシア
社）を用いて精製した。
【００３０】参考例−２．アルカリホスファターゼ標識
オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は A) 5'-GAAGAGTCAA GXGATTCAGT TGAC-3' B) 5'-TGAAGACTCT ACXGGTTTAG CATC-3' C) 5'-TTGCTACAAA XGCCTATGCA TC-3' D) 5'-TGTGTGAACA TTAXAGACAA ATAGCC-3' E) 5'-GTCAACTGAA XCACTTGACT CTTC-3' である。（A,B,C,D,E は配列番号1,2,7,8 のオリゴヌク
レオチドおよび配列番号１の相補鎖のうちのそれぞれ1
2,13,11,14,11 番目のＴをＸに変更している。Ｘは特表
昭60-500717 号公報に開示された方法により調製した、
５位にリンカーアームを有するウリジン残基を示す。）
合成されたオリゴヌクレオチドは参考例１と同様に精製
した。
オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダイ
ト法により合成した。塩基配列は A) 5'-GAAGAGTCAA GXGATTCAGT TGAC-3' B) 5'-TGAAGACTCT ACXGGTTTAG CATC-3' C) 5'-TTGCTACAAA XGCCTATGCA TC-3' D) 5'-TGTGTGAACA TTAXAGACAA ATAGCC-3' E) 5'-GTCAACTGAA XCACTTGACT CTTC-3' である。（A,B,C,D,E は配列番号1,2,7,8 のオリゴヌク
レオチドおよび配列番号１の相補鎖のうちのそれぞれ1
2,13,11,14,11 番目のＴをＸに変更している。Ｘは特表
昭60-500717 号公報に開示された方法により調製した、
５位にリンカーアームを有するウリジン残基を示す。）
合成されたオリゴヌクレオチドは参考例１と同様に精製
した。
【００３１】続いて、合成したリンカーオリゴヌクレオ
チドと、そのリンカーアームを介してのアルカリホスフ
ァターゼとの結合を、文献 (Nucleic Acids Research,1
4,6115,1986)に従って行なった。リンカーオリゴヌクレ
オチド 1.0 A260 を 0.2M NaHCO3 60 μl に溶解し、こ
こへスベリン酸ジスクシニミジル（DSS)1.25mgを加えて
室温、２分間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH
5.0）で平衡化したSephadex G-25 カラム(1cmφx30cm)
でゲル濾過して過剰のDSS を除去した。末端のアミノ基
が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更にモ
ル比で２倍等量のアルカリホスファターゼ (100mM NaHC
O3, 3M NaCl に溶解したもの）と室温、16時間反応させ
ることでアルカリホスファターゼ標識核酸プローブを得
た。
チドと、そのリンカーアームを介してのアルカリホスフ
ァターゼとの結合を、文献 (Nucleic Acids Research,1
4,6115,1986)に従って行なった。リンカーオリゴヌクレ
オチド 1.0 A260 を 0.2M NaHCO3 60 μl に溶解し、こ
こへスベリン酸ジスクシニミジル（DSS)1.25mgを加えて
室温、２分間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH
5.0）で平衡化したSephadex G-25 カラム(1cmφx30cm)
でゲル濾過して過剰のDSS を除去した。末端のアミノ基
が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、更にモ
ル比で２倍等量のアルカリホスファターゼ (100mM NaHC
O3, 3M NaCl に溶解したもの）と室温、16時間反応させ
ることでアルカリホスファターゼ標識核酸プローブを得
た。
【００３２】得られた標識プローブは、陰イオン交換高
速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC(ファルマシア
社) を用いて精製した。標識プローブを含む画分を集
め、セントリコン３０Ｋを用いて限外濾過法により濃縮
した。
速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC(ファルマシア
社) を用いて精製した。標識プローブを含む画分を集
め、セントリコン３０Ｋを用いて限外濾過法により濃縮
した。
【００３３】実施例−１．アルカリホスファターゼ標識
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファターゼ標識核酸プ
ローブA,B の感度を検討した。プローブはA,B を等量混
合して用いた。検体は大阪空港検疫所において海外渡航
者の下痢便より単離、保存した大腸菌１００株を用い
た。各菌株をBrain heat infusion 寒天培地に植菌し、
37℃で一晩培養した。生育したコロニーをそれぞれ1.5m
l のエッペンドルフチューブにかきとり、希釈緩衝液
(0.1M NaH2PO4, pH7.0) 300μl に懸濁した。さらにこ
こへプロテイナーゼＫ（ナカライテスク社）０．６mg、
溶菌液（８Ｍ尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、0.
25％ラウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA, pH7.
6) 600 μl を加えて攪拌し、60℃で３０分間インキュ
ベートした。
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファターゼ標識核酸プ
ローブA,B の感度を検討した。プローブはA,B を等量混
合して用いた。検体は大阪空港検疫所において海外渡航
者の下痢便より単離、保存した大腸菌１００株を用い
た。各菌株をBrain heat infusion 寒天培地に植菌し、
37℃で一晩培養した。生育したコロニーをそれぞれ1.5m
l のエッペンドルフチューブにかきとり、希釈緩衝液
(0.1M NaH2PO4, pH7.0) 300μl に懸濁した。さらにこ
こへプロテイナーゼＫ（ナカライテスク社）０．６mg、
溶菌液（８Ｍ尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、0.
25％ラウリルサルコシンナトリウム、50mM EDTA, pH7.
6) 600 μl を加えて攪拌し、60℃で３０分間インキュ
ベートした。
【００３４】得られた溶解液を、フェノールで２回、ク
ロロホルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得
た。核酸は 260nmのＵＶ吸収により定量し100 μg ／ml
の濃度でＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Tris-HCl,１ｍＭ EDTA,
pH8.0)に溶解した。この核酸液10μｌ（核酸 1μg)に
0.3N NaOH 100μl を加え室温で15分間変性し、ドット
ブロッター(BRL社）を用いて 5xSSCで湿潤したナイロン
膜 (アマシャム社製 Hybond-N+ ) にブロットした。
ロロホルムで１回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得
た。核酸は 260nmのＵＶ吸収により定量し100 μg ／ml
の濃度でＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Tris-HCl,１ｍＭ EDTA,
pH8.0)に溶解した。この核酸液10μｌ（核酸 1μg)に
0.3N NaOH 100μl を加え室温で15分間変性し、ドット
ブロッター(BRL社）を用いて 5xSSCで湿潤したナイロン
膜 (アマシャム社製 Hybond-N+ ) にブロットした。
【００３５】この膜を８０℃３０分間加熱処理して核酸
を固定化した後、以下に示した手順でハイブリダイゼー
ションを行った。乾燥した膜(9x9cm）を5xSSC に５分間
浸した。なおSSC とは15mMクエン酸３ナトリウム、150m
M 塩化ナトリウム溶液を示し、５×SSC とはSSC の５培
濃厚液を示す。次にハイブリダイゼーションバック(BRL
社）に膜を移し、ハイブリダイゼーションバッファー
(5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニール
ピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム）５mlを加えて
ポリシーラーでシールし、50℃、15分間プレハイブリダ
イゼーションを行なった。次に250ng のアルカリホスフ
ァターゼ標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーシ
ョンバッファー５mlで50℃、15分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
を固定化した後、以下に示した手順でハイブリダイゼー
ションを行った。乾燥した膜(9x9cm）を5xSSC に５分間
浸した。なおSSC とは15mMクエン酸３ナトリウム、150m
M 塩化ナトリウム溶液を示し、５×SSC とはSSC の５培
濃厚液を示す。次にハイブリダイゼーションバック(BRL
社）に膜を移し、ハイブリダイゼーションバッファー
(5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニール
ピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム）５mlを加えて
ポリシーラーでシールし、50℃、15分間プレハイブリダ
イゼーションを行なった。次に250ng のアルカリホスフ
ァターゼ標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーシ
ョンバッファー５mlで50℃、15分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。
【００３６】膜をポリバッグから取り出し、洗浄液-1(1
xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム）で50℃、５分間で２
回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2(1xSSC, 1%トリトン
X-100）で50℃、５分間で２回、室温５分間で２回振と
う洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSSC)で室温５分間で２
回振とう洗浄した。膜を新しいハイブリダイゼーション
バッグに移し、基質液(0.1M Tris-HCl pH8.0, 0.1M NaC
l, 0.1M MgCl2 0.3mg/ml ニトロテトラゾリウムブル
ー、0.3mg/mlブロムクロロインドリールホスフェート)
7.5 mlを入れポリシーラーでシールし37℃で３時間イン
キュベートした。
xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム）で50℃、５分間で２
回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2(1xSSC, 1%トリトン
X-100）で50℃、５分間で２回、室温５分間で２回振と
う洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSSC)で室温５分間で２
回振とう洗浄した。膜を新しいハイブリダイゼーション
バッグに移し、基質液(0.1M Tris-HCl pH8.0, 0.1M NaC
l, 0.1M MgCl2 0.3mg/ml ニトロテトラゾリウムブル
ー、0.3mg/mlブロムクロロインドリールホスフェート)
7.5 mlを入れポリシーラーでシールし37℃で３時間イン
キュベートした。
【００３７】アルカリホスファターゼにより生じる紫色
色素のスポットを肉眼判定した。結果を下記表１に示
す。乳飲みマウスを用いた生物学的方法（Dean,A.G. e
t.al.:J. Infect. Diseas.,125 巻 407頁1972年）で測
定した結果を基準とした。
色素のスポットを肉眼判定した。結果を下記表１に示
す。乳飲みマウスを用いた生物学的方法（Dean,A.G. e
t.al.:J. Infect. Diseas.,125 巻 407頁1972年）で測
定した結果を基準とした。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例−２．アルカリホスファターゼ標識
核酸プローブの特異性の検討 実施例１で用いたアルカリホスファターゼ標識核酸プロ
ーブの特異性を検討した。下痢起炎菌となりうる細菌25
種、ウィルス５種、ヒト胎盤由来のDNA 、およびヒト健
常便由来のDNA を用いてクロスハイブリダイゼーション
の有無を調べた。細菌は全て臨床分離株を用い、適当な
培地で増殖させ、実施例１と同様の方法で核酸を精製し
た。ウィルスは、感染便よりウィルス粒子を精製し、同
様の方法で核酸を精製した。
核酸プローブの特異性の検討 実施例１で用いたアルカリホスファターゼ標識核酸プロ
ーブの特異性を検討した。下痢起炎菌となりうる細菌25
種、ウィルス５種、ヒト胎盤由来のDNA 、およびヒト健
常便由来のDNA を用いてクロスハイブリダイゼーション
の有無を調べた。細菌は全て臨床分離株を用い、適当な
培地で増殖させ、実施例１と同様の方法で核酸を精製し
た。ウィルスは、感染便よりウィルス粒子を精製し、同
様の方法で核酸を精製した。
【００４０】得られた核酸 1μg を実施例１と同様の手
順で測定した。結果はETEC−ＳＴのみが陽性であった。
この結果は、32P-標識遺伝子断片プローブを用いた結果
とよく一致した。以下にその結果を示す。
順で測定した。結果はETEC−ＳＴのみが陽性であった。
この結果は、32P-標識遺伝子断片プローブを用いた結果
とよく一致した。以下にその結果を示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例３ 増幅用プライマーとしての性能
の評価 参考例２で調製したオリゴヌクレオチドをプライマーと
してＰＣＲ増幅を実施した。オリゴヌクレオチド３と
４、５と６をそれぞれ組み合わせて実施した。オリゴヌ
クレオチドを各々40pmole 、実施例１で使用した大腸菌
のうちの２０株の培養菌から分離、部分精製したゲノム
核酸1ng を50ulの反応液に加えた。94℃に５分間保った
後、Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）4unit 加え、94
℃に１分間保った後、下記のサイクルにより増幅を行っ
た。 変性 ９４℃ ６０秒 アニール ５８℃ １２０秒 伸長反応 ７５℃ ９０秒 サイクル数 ３０回
の評価 参考例２で調製したオリゴヌクレオチドをプライマーと
してＰＣＲ増幅を実施した。オリゴヌクレオチド３と
４、５と６をそれぞれ組み合わせて実施した。オリゴヌ
クレオチドを各々40pmole 、実施例１で使用した大腸菌
のうちの２０株の培養菌から分離、部分精製したゲノム
核酸1ng を50ulの反応液に加えた。94℃に５分間保った
後、Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）4unit 加え、94
℃に１分間保った後、下記のサイクルにより増幅を行っ
た。 変性 ９４℃ ６０秒 アニール ５８℃ １２０秒 伸長反応 ７５℃ ９０秒 サイクル数 ３０回
【００４３】反応液 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．９） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ８０ｍＭ ＫＣｌ ５００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．１％ コール酸ナトリウム ０．１％ トリトンＸ１００ ０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰ
ＴＰ
【００４４】ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動して
検出した。アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）と
し、臭化エチジウム（０．５ｕｇ／ｍｌ）を含むものを
用いた。泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、時間は３０分
行った。操作方法ならびに他の条件はMolecular Clonin
g(1982) に記載の方法に従った。分子量マーカーも同時
に泳動し、相対泳動度から増幅物の分子量を推定した。
プライマーの位置から増幅産物の大きさは134merである
ことが判っているのでこの大きさのバンドが出たものを
陽性とした。
検出した。アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）と
し、臭化エチジウム（０．５ｕｇ／ｍｌ）を含むものを
用いた。泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、時間は３０分
行った。操作方法ならびに他の条件はMolecular Clonin
g(1982) に記載の方法に従った。分子量マーカーも同時
に泳動し、相対泳動度から増幅物の分子量を推定した。
プライマーの位置から増幅産物の大きさは134merである
ことが判っているのでこの大きさのバンドが出たものを
陽性とした。
【００４５】結果 結果を以下の表３に示す。
【００４６】
【表３】
【００４７】上表のように乳飲みマウスの結果とよく一
致した。プライマーの種類によりSTp とSTh を区別でき
たことを示している。この結果は、32Ｐ-標識遺伝子断
片プローブを用いた結果とよく一致した。
致した。プライマーの種類によりSTp とSTh を区別でき
たことを示している。この結果は、32Ｐ-標識遺伝子断
片プローブを用いた結果とよく一致した。
【００４８】実施例−４．アルカリホスファターゼ標識
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファターゼ標識核酸プ
ローブC,D を用いて実施例１，２と同様の検討を行っ
た。大腸菌は福井県の養豚場より入手したブタ便検体よ
り分離した５０株を用いた。結果はアルカリホスファタ
ーゼ標識核酸プローブC,D ともに32P-標識遺伝子断片プ
ローブを用いた結果とよく一致してＳＴｂ遺伝子を持つ
大腸菌とのみ反応した。
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファターゼ標識核酸プ
ローブC,D を用いて実施例１，２と同様の検討を行っ
た。大腸菌は福井県の養豚場より入手したブタ便検体よ
り分離した５０株を用いた。結果はアルカリホスファタ
ーゼ標識核酸プローブC,D ともに32P-標識遺伝子断片プ
ローブを用いた結果とよく一致してＳＴｂ遺伝子を持つ
大腸菌とのみ反応した。
【００４９】実施例−５．アルカリホスファダーゼ標識
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファダーゼ標識核酸プ
ローブE を用いて実施例１，２と同様の検討を行った。
検体は大阪空港検疫所において海外渡航者の下痢便より
単離、保存した大腸菌１００株を用いた。結果はアルカ
リホスファターゼ標識核酸プローブA と同様の結果が得
られ、相補鎖を用いたプローブでもＳＴｐ遺伝子を持つ
大腸菌とのみ反応する事が確認された。
核酸プローブの感度の検討 参考例２で得られたアルカリホスファダーゼ標識核酸プ
ローブE を用いて実施例１，２と同様の検討を行った。
検体は大阪空港検疫所において海外渡航者の下痢便より
単離、保存した大腸菌１００株を用いた。結果はアルカ
リホスファターゼ標識核酸プローブA と同様の結果が得
られ、相補鎖を用いたプローブでもＳＴｐ遺伝子を持つ
大腸菌とのみ反応する事が確認された。
【００５０】
配列番号：1 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴｐ遺伝子の60番目から83
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAAGAGTCAA GTGATTCAGT TGAC 24
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAAGAGTCAA GTGATTCAGT TGAC 24
【００５１】配列番号：2 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴh 遺伝子の61番目から84
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGAAGACTCT ACTGGTTTAG CATC 24
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGAAGACTCT ACTGGTTTAG CATC 24
【００５２】配列番号：3 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴp 遺伝子の131 番目から
151 番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 ACAACAGTGA AAAAAAATCA G 21
151 番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 ACAACAGTGA AAAAAAATCA G 21
【００５３】配列番号：4 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴp 遺伝子の224 番目から
244 番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 AAAATAAAGA TTCCCTCTAT G 21
244 番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 AAAATAAAGA TTCCCTCTAT G 21
【００５４】配列番号：5 ....プライマー 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴh 遺伝子の131 番目から
151 番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 AAAGTAATAA AAGTGGTCCT G 21
151 番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 AAAGTAATAA AAGTGGTCCT G 21
【００５５】配列番号：6 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴh 遺伝子の224 番目から
244 番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAACTGTTTA GTTCCCTTTA T 21
244 番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAACTGTTTA GTTCCCTTTA T 21
【００５６】配列番号：7 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴb 遺伝子（シグナルペプ
チドを含む）の５０番目から７１番目の配列と相同的な
配列を有する。 配列 TTGCTACAAA TGCCTATGCA TC 22
チドを含む）の５０番目から７１番目の配列と相同的な
配列を有する。 配列 TTGCTACAAA TGCCTATGCA TC 22
【００５７】配列番号：8 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..26 他の特徴：毒素原性大腸菌ＳＴb 遺伝子（シグナルペプ
チドを含む）の９５番目から120 番目の配列と相同的な
配列を有する。 配列 TGTGTGAACA TTATAGACAA ATAGCC 26
チドを含む）の９５番目から120 番目の配列と相同的な
配列を有する。 配列 TGTGTGAACA TTATAGACAA ATAGCC 26
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柴田 秀司 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 核酸配列が配列表・配列番号１〜８に記
載される配列であるか、またはそれらの相補鎖であるオ
リゴヌクレオチドを含有することを特徴とする毒素原性
大腸菌検出用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 核酸配列が配列表・配列番号１〜８に記
載される配列であるか、またはそれらの相補鎖であるオ
リゴヌクレオチドを含有する毒素原性大腸菌検出用オリ
ゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを試料中
のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標
識または交雑しなかった標識を測定することを特徴とす
る試料中の毒素原性大腸菌の検出法。 - 【請求項３】 核酸配列が配列表・配列番号１〜８に記
載される配列であるか、またはそれらの相補鎖であるオ
リゴヌクレオチドを含有する毒素原性大腸菌検出用オリ
ゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、ま
たは該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライ
マーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、次いで
プライマー伸長させ、得られた伸長生成物の標識または
交雑しなかった標識を測定することを特徴とする試料中
の毒素原性大腸菌の検出法。 - 【請求項４】 核酸配列が配列表・配列番号１〜８に記
載される配列であるか、またはそれらの相補鎖であるオ
リゴヌクレオチドを含有する毒素原性大腸菌検出用オリ
ゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを含むこ
とを特徴とする毒素原性大腸菌検出用試薬キット。 - 【請求項５】 核酸配列が配列表・配列番号１〜８に記
載される配列であるか、またはそれらの相補鎖であるオ
リゴヌクレオチドを含有する毒素原性大腸菌検出用オリ
ゴヌクレオチドである核酸プライマーまたは該オリゴヌ
クレオチドを標識化した標識核酸プライマー、デオキシ
リボヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼおよび／ま
たは逆転写酵素を含むことを特徴とする毒素原性大腸菌
検出用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5227383A JPH0779779A (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5227383A JPH0779779A (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0779779A true JPH0779779A (ja) | 1995-03-28 |
Family
ID=16859959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5227383A Pending JPH0779779A (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 毒素原性大腸菌検出用オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779779A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042057A1 (ja) * | 2002-11-07 | 2004-05-21 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 遺伝子変異検出法 |
| KR101468622B1 (ko) * | 2012-03-16 | 2014-12-04 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 대장균의 독소형 감별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 |
-
1993
- 1993-09-13 JP JP5227383A patent/JPH0779779A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004042057A1 (ja) * | 2002-11-07 | 2004-05-21 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 遺伝子変異検出法 |
| KR101468622B1 (ko) * | 2012-03-16 | 2014-12-04 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 대장균의 독소형 감별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 키트 |
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