JPH0710233B2

JPH0710233B2 - 固定化酵素およびその製造方法

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Publication number: JPH0710233B2
Application number: JP62047400A
Authority: JP
Inventors: 秀季横道; 毅安増; 和広中村; 義治河原
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1987-03-02
Filing date: 1987-03-02
Publication date: 1995-02-08
Anticipated expiration: 2010-02-08
Also published as: JPS63214184A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、固定化酵素およびその製造方法に関するもの
である。更に詳しくは、リパーゼによるエステル交換及
びエステル合成反応に適した固定化リパーゼと、その製
造方法に関するものである。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に水素添加と並ぶ重要な
技術である。

エステル類の合成反応は、アルコールと脂肪酸からアル
コール脂肪酸エステルの合成、モノグリセリド、ポリグ
リセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価アル
コール脂肪酸エステルの合成、ゲラニルブチレイトとい
った香料の製造方法として重要な技術である。

〔従来の技術及びその問題点〕

油脂類およびエステル類のエステル交換およびエステル
合成反応はリパーゼが穏和な条件下で反応する事、位置
選択性、アルキル選択性等の特徴を持つ事を利用してい
る。しかし、これらの反応はリパーゼ本来の加水分解反
応と異なり、水分の限定された系でのみ進みうる反応で
ある。

一方、リパーゼのエステル交換およびエステル合成活性
を増大せしめるためには、酵素としてある程度の水分を
必要とする。特開昭55−71797号公報に開示された低水
分系のエステル交換反応では、充分な反応速度が得られ
ず、また反応速度を増大させるために必要以上の水分を
与えると、エステルの分解反応が優先的に進行するとい
う問題点がある。また特開昭60−19495号公報及び特開
昭60−203196号公報に開示されたエステル交換反応を多
水分系の分解工程と、水分を除去する合成工程の二段階
に分けて行う方法の提案もあるが後者の合成反応速度は
通常のエステル交換速度に比して充分であるとは言え
ず、工程操作の複雑化も避けられない。

リパーゼによるグリセリドおよびエステル類の合成反応
については、岩井、辻坂らの研究（M.Iwai,Y.Tsujisak
a,J.Fukumoto,J.Gen.Appl.Microbiol.,10,13（1964））
および日本特許第831834号、第1056738号等により知ら
れているが、加水分解作用と合成作用の平衡関係は反応
系内の水分により支配され、水の存在下では大きく分解
に偏り合成率はおのずと小さくなる。この点を解決する
手段として、特開昭57−8787号公報に開示された反応を
可及的に乾燥した系で行い、かつ反応により生成する水
分を系外に排出させるという方法の提案もあるが、低水
分下では酵素の合成活性は極めて小さく、合成率の低下
および反応の長時間化は避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。
リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来、リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に
均一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼ
を不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分
散可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるた
め、低水分下でのエステル交換および合成反応が容易と
なる。また触媒としてなお高価格であるリパーゼの回収
再使用が容易となり、エステル交換またはエステル合成
反応の工業的実施においても反応装置の連続化等が容易
となる点等である。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。例えば、Journal of American Oil
Chemist's Soc.,第60巻291-294（1983）にも微量な水分
を与えた場合、加水分解反応が進行することが指摘され
ている。

また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを
添加した場合では加水分解反応はある程度抑制される
が、エステル交換およびエステル合成反応は遅くなる。
また特開昭59-213390号公報に開示された、酵素水分の
保持を狙い、多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包
括固定化後、粉砕した担体を用いる方法によってもエス
テル化反応ではなお20時間以上を要し、合成速度は十分
であるとは言えない。

以上のようにリパーゼによる油脂類のエステル交換およ
びエステル合成反応は、前述の化学的な方法に比べ特徴
的かつ有利な点を持つ反面、未だ解決しなければならな
い多くの問題点があり、工業的に実施するにはこれらの
問題点を解決する必要がある。

上記のようにエステル交換反応およびエステル合成反応
においては、固定化酵素の水分を確実にコントロールす
るか、またはよりエステル交換およびエステル合成活性
の高い固定化酵素の開発が望まれる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭60−203196号公
報）においても行われているが、装置的に煩雑であるこ
と、また第１段の分解工程において1,2−ジグリセリド
を選択的、高収率で得ることと、更に第２段で1,2−ジ
グリセリドから1,3−ジグリセリドへ転移させることな
く、選択的に目的のトリグリセリドを合成することは難
しい。特に温度が高くなるほどこの転移の悪影響を抑え
る事は難しくなる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまってい
る。しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水
分条件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収
も容易であるが、この場合においても通常の化学的方法
と同等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化
酵素の開発が望まれる。

以上のような問題点を解決するため、固定化リパーゼの
エステル合成活性及びエステル交換活性を増加させる方
法が種々検討されてきた。しかし現在迄に、特開昭60−
25188号公報に開示されたリパーゼに油脂を加え加水分
解反応をさせながら固定化を行う方法以外に何も見つか
っていない。

一方、固定化リパーゼを加水分解に用いた系でも、安定
化効果も含めて僅かにCa塩の添加が知られているにすぎ
ない（J.Am.Oil Chemist's Soc.,61,776-781（198
4））。また、酵素水溶液の状態では、加水分解反応系
として、Ca塩、胆汁酸、各種界面活性剤などを添加する
と活性化作用があることが知られているが、エステル交
換およびエステル合成反応の系については、ほとんど知
られていないのが実状である。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはリパーゼのエステル交換活性およ
びエステル合成活性を増大させる因子について鋭意研究
を重ねた結果、リパーゼにリン脂質が接触・結合した状
態で、著しいエステル交換およびエステル合成活性の増
大が見られる事を発見した。更に本発明者らはこの事実
をもとに、リン脂質を結合させたリパーゼを種々の不溶
性担体上に固定化する事に応用する事により本発明の完
成に至った。

従来、リパーゼとリン脂質との関係については、岩井ら
により1969年の日本化学会において報告がなされて以
来、多くの報告がなされたが、いずれも加水分解反応で
の基質特異性の変化についてか、または発酵生産の安定
化方法についてのみであり、エステル交換およびエステ
ル合成反応での活性化についての報告は見られない。

また門田則昭らにより1986年４月の日本農芸化学会で報
告された、リン脂質によるミセル内へ酵素を取り込み反
応させる方法がある。さらにこの方法の応用としてのリ
パーゼをW/O（Ｗは水相、０は油相を意味する。）エマ
ルジョン内へ取り込み、その後このエマルジョンをW/O/
Wのエマルジョンとして固定化し、多価アルコール脂肪
酸エステルの製造を行ったという報告がある。この方法
は一旦W/Oエマルジョンを作り、しかもそのエマルジョ
ン内に酵素を取り込ませ、次いでそのエマルジョンを油
相中で壊れないようにW/O/Wにする。しかも、そのエマ
ルジョン固定化酵素が物理的に不安定なため、光架橋性
樹脂で取り囲むという非常に煩雑な工程を必要とする。

これに対し本発明は、リパーゼにリン脂質を水相中で接
触・結合させた状態でこれを不溶性担体と結合させるだ
けでよく、W/Oエマルジョンといった油相中に分散させ
る必要もない。具体的にはリン脂質とリパーゼを含有す
る溶液中に不溶性担体を添加し、該担体上にリパーゼと
リン脂質を固定化した後にろ過するだけで良い。

即ち、本発明は、リパーゼとリン脂質を接触・結合させ
た状態で不溶性担体に固定化してなる、エステル交換及
びエステル合成に適した固定化酵素に関するものであ
る。

また、本発明は、リパーゼを不溶性担体に固定化する前
または固定化時にリン脂質を添加する事によりリパーゼ
のエステル交換活性およびエステル合成活性を増大させ
て固定化することを特徴とする固定化酵素の製造方法に
関するものである。

本発明は具体的には次のようである。即ち、リパーゼ溶
液もしくはリパーゼを含む発酵培養液に不溶性担体を加
えリパーゼを固定化するにあたり、固定化する前にリパ
ーゼ溶液もしくはリパーゼを含む発酵培養液に対しリン
脂質又は、リン脂質を分散もしくは溶解させた溶液を添
加することにより、リパーゼとリン脂質を接触・結合せ
しめる。あるいはリン脂質を懸濁もしくは溶解させた水
又は緩衝液中に市販リパーゼを溶解してもよい。次に該
溶液中に不溶性担体を添加し１分〜20時間、好ましくは
30分〜２時間接触させ、次いで、該溶液より不溶性担体
をろ過し水により洗浄する。こうして得られた固定化リ
パーゼを乾燥させ本発明の固定化リパーゼを得る。さら
に好ましくは、リパーゼ溶液もしくはリパーゼを含む発
酵培養液に、リン脂質と油脂類または脂肪酸類を溶解し
たアルコール溶液（好ましくは炭素数８以下の脂肪族１
価アルコール）を添加し撹拌した後、そこへ不溶性担体
を添加し５分ないし20時間、好ましくは30分ないし２時
間接触させ、次いで該溶液より不溶性担体をろ過し、水
により洗浄する。こうして得られた固定化リパーゼを乾
燥させ本発明の固定化リパーゼを得る。

本発明に用いる固定化リパーゼ用のリパーゼとしては、
位置選択性に優れたリゾプス（Rhizopus）属、アスペル
ギルス（Aspergillus）属、クロモバクテリウム（Chrom
obacterium）属、ムコール（Mucor）属、シュードモナ
ス（Pseudomonas）属、ペニシリウム（Penicillium）
属、脂肪酸特異性を有するジオトリケム（Geotrichum）
属、特異性を示さないキャンディダ（Candida）属等の
微生物起源のリパーゼ及びすい臓リパーゼ等の動物リパ
ーゼが挙げられる。これらのうち、特に合成活性の高い
微生物起源のリパーゼとして、キャンディダ・シリンド
ラッセ（Candida cylindracea）、リゾプス・ジャポニ
カス（Rhizopus japonicus）、ムコール・ミーハイ（Mu
cor miehei）、クロモバクテリウム・ビスカス（Chromo
bacterium viscoum）起源のリパーゼが一層好ましい。

固定化に用いる担体としては、水、アルコール、各種有
機溶剤、油脂類のいずれにも不溶性の担体なら良く、セ
ライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、パー
ライト、モレキュラーシーブ、多孔質ガラス、活性炭、
炭酸カルシウム等の無機担体、及びセルロースパウダ
ー、ポリビニルアルコール、キトサン、イオン交換樹
脂、吸着樹脂等の有機高分子の様な、リパーゼ活性に影
響を与えず、操作上から物理的・化学的に安定なもので
あれば何れも使用できる。また担体の形状としては、粉
末状、果粒状、繊維状、スポンジ状等、種々あるが、そ
のいずれでも使用できる。特に工程操作上の面からは40
0〜1000μｍの粒径を有し、細孔径100〜1500Åの多孔性
の担体を用いることが良い。特にこの種の固定化担体と
しては、マクロ多孔性フェノールホルムアルデヒド系の
吸着樹脂及びイオン交換樹脂があげられる。

本発明で用いるリン脂質としては、天然に産出する大豆
レシチン、卵黄レシチン等の粗製及び又は精製混合レシ
チン等を用いてもよく、またこれらを分画して得たホス
ファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスフ
ァチジン酸等を単独又は混合して用いても良い。また各
種合成法により得た合成リン脂質及びこれらの誘導体も
用いることができる。操作上低融点のリン脂質としてア
ルキル基が短鎖または不飽和であるものが扱い易いがこ
れに限定されるものではない。

リン脂質とリパーゼの接触方法としては、リパーゼ水溶
液に前記リン脂質をそのまま加えても良いが、リン脂質
の水中への分散性を良くするためリパーゼの活性に影響
を与えない溶剤にリン脂質を一旦分散もしくは溶解させ
た後に加えることが一層効果的である。溶剤としては脂
肪族１価アルコール、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等が
あげられるが、水との相溶性の点から炭素数８以下の脂
肪族１価アルコールが好適である。

またリパーゼとリン脂質を接触させるにあたり、基質と
しての脂肪酸、油脂類等を共存させることにより更に高
活性の固定化酵素を得ることができる。脂肪酸の種類と
しては炭素数２〜24の直鎖で通常自然界に存在するも
の、例としてはパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂
肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸等の不飽和の脂
肪酸を用いることができる。また油脂類としては、一般
的な植物性油脂、動物性油脂もしくは加工油脂、あるい
はこれらの混合油脂があげられる。またこれらの油脂及
び／又は脂肪酸とグリセリンより誘導して得たジグリセ
リド、モノグリセリドを用いても同等の効果が得られ
る。

本発明において固定化を行う温度としては、リパーゼの
活性を損なわない温度であればよく、０〜60℃好ましく
は20〜40℃がよい。またリパーゼ溶液のpHはリパーゼの
変性が起きないような範囲であればよく、pH3〜９の範
囲が好ましい。特に至適pHが酸性とされているリパーゼ
を用いる場合に最大の活性を得るには、pH4〜６とする
ことがよい。またリパーゼ溶液に用いる緩衝液の種類は
特に規定しないが、一般的な酢酸緩衝液、リン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中のリパー
ゼ濃度は特に規定しないが、固定化効率の点から前記リ
パーゼの溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ま
しい。また必要に応じて不溶部を遠心分離により除去
し、上澄を使用しても良い。また、リパーゼとリン脂質
とはリパーゼ１重量部に対しリン脂質0.01〜１重量部の
割合で接触・結合させるのが好ましい。更に、リパーゼ
と固定化担体の使用割合（重量比）としては、固定化担
体１重量部に対しリパーゼ0.01〜１重量部が好ましい
が、特にこれに限定されるものではない。

本発明において、固定化前の担体及び／又は固定化終了
後、酵素溶液を分離して得たリパーゼの結合した担体
に、多官能性架橋剤を用いて架橋することにより、固定
化酵素の繰り返し使用における耐久性向上をはかること
ができる。多官能性の架橋剤としては、グリオキザー
ル、グルタルアルデヒド、マロンアルデヒド、スクシニ
ルアルデヒドなどのポリアルデヒド類が好ましく、ヘキ
サメチレンジチオイソシアネート、N,N′−エチレンビ
スマレイミドなども使用可能である。また多官能性架橋
剤による架橋は前記の固定化操作中に同時に行ってもよ
い。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、リパーゼの持つ合成活性を十分に発揮
させる為のものであり、リパーゼのエステル交換活性お
よびエステル合成活性が、リン脂質との結合により著し
く増大することを見いだし、これを固定化に応用した結
果得られたものである。

本発明における固定化リパーゼを用いるエステル交換反
応の例としては、エステルと脂肪酸によるアシドリシス
反応、エステルとアルコールによるアルコリシス反応、
エステル同志によるインターエステル化反応がある。ま
たエステル合成反応の例としては、通常のメタノール、
エタノール、プロパノール等の１価アルコール、又はプ
ロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールおよび
ポリグリセリン等の多価のアルコール、又はゲラニオー
ル、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコー
ルと炭素数２〜24の脂肪酸とのエステル化反応があげら
れる。

本発明の効果として、特に位置選択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、飽和の脂肪酸とのエステル交換反応により、天然
のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製造
を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対称
型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低減
が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられなかった。こうした場合に本
発明の方法による固定化リパーゼを用いると、低水分条
件下においても十分なエステル合成活性を保持している
ため、短時間の間に高いエステル化率が達成され、反応
の長時間化による着色および異臭の生成等の副反応によ
る品質の低下が見られないという利点を有する。

以上のようにリン脂質とリパーゼの接触・結合によりそ
のエステル交換およびエステル合成活性が増大すること
を発見した事により、工業的実施にあたって簡便かつ廉
価に高活性の固定化リパーゼを製造することが可能とな
った。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１リゾプス・ジャポニカス起源の市販リパーゼ〔商品名＜
リパーゼ・サイケン100＞大阪細菌研究所株式会社製、
分解活性35,000Unit/g〕10gを、pH5.0の10mMの酢酸緩衝
液95mlに溶解した。別に5mlのイオン交換水に市販の大
豆レシチン（試薬、和光純薬工業株式会社製）1gを懸濁
させた液を調製し、先のリパーゼ溶液に添加し１時間撹
拌してリパーゼとレシチンの懸濁液を得た。このリパー
ゼとレシチンの懸濁液に、フェノールホルムアルデヒド
系弱アニオン交換樹脂〔商品名＜デュオライト（Duolit
e）ES-568＞ダイアモンドシャムロック社製〕10g（水分
10％）を加え30℃で２時間撹拌した。このとき混合後の
液のpHを5.0となるように調整した。次に該懸濁液より
弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した後、水分５
％となるように常温にて減圧乾燥を行い10.5gの固定化
リパーゼを得た。この時ろ液の分解活性は1,295Unit/ml
であった、この結果から得られた固定化リパーゼには当
初用いたリパーゼの63％が固定化されていた。

本実施例で得られた固定化リパーゼを1g用いて、パーム
油中融点部（沃素価32.5、シグリセリド含量4.6％）10g
と市販のステアリン酸〔商品名ルナックS-90,ステアリ
ン酸純度93％，花王株式会社製〕10gを加え65℃で５時
間反応を行った。反応後、フロリジル（フロリジン社
製:60〜100mesh、溶離液ヘキサン：エーテル＝2:3）カ
ラムクロマトグラフィーによりグリセリド画分を分離し
基準油脂分析試験法に従いメチルエステルとし、グリセ
リド中に含まれるステアリン酸含量をガスクロマトグラ
フィーにより分析した。次式で示される平衡値を100％
とした反応率を算出した。

上の式において、 St:時間ｔにおける油脂中のステアリン酸含量 So:反応前の原料油脂中のステアリン酸含量Ｓ∞:1,3ランダム平衡時のステアリン酸含量を意味す
る。

その結果は第１表に示した。

比較例１実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液100mlに溶解し１時間撹拌してリパーゼ溶液を
得た。このリパーゼ溶液に、デュオライトES-568を10g
（水分10％）加え30℃で２時間撹拌した。このとき混合
後の溶液のpHを５となるように調整した。次に該溶液よ
り樹脂（デュオライトES-568）をろ別し、水で洗浄した
後、水分５％となるように常温にて減圧乾燥を行い10.7
gの固定化リパーゼを得た。この固定化リパーゼを用い
て実施例１と同様にエステル交換反応を行った。

その結果は第１表に示した。

第１表に示した結果から、リン脂質処理によるリパーゼ
のエステル交換活性の増大効果が認められる。

実施例２実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液95mlに溶解し、１時間撹拌してリパーゼ溶液を
調整した。別に5mlのブタノールに大豆レシチン1gを溶
解させた溶液を調製し、これを先のリパーゼ溶液に添加
し１時間撹拌して混合物Ａ（リパーゼ、レシチン、ブタ
ノールなどを含有）を得た。この混合物Ａに実施例１で
用いた弱アニオン交換樹脂（デュオライトES-568）10g
（水分10％）を混合し30℃で２時間撹拌した。このとき
のpHは５に調製した。次に該混合物から樹脂をろ別し、
水で洗浄した後、水分５％となるように室温にて減圧乾
燥を行い11.2gの固定化リパーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様に（即ち、実施例１で用いたパーム油中融点部10gと
ステアリン酸10gを加え、65℃で５時間）エステル交換
反応を行った。

その結果は第２表に示した。

比較例２実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液95mlに溶解した。このリパーゼ溶液に5mlにブ
タノールを添加し１時間撹拌して混合物Ｂ（リパーゼ、
ブタノールを含有、レシチンは含有しない）を得た。こ
の混合物Ｂに実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂（デ
ュオライトES-568）10g（水分10％）を混合し30℃で２
時間撹拌した。このときのpHは5.0に調製した。次に該
混合物から弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した
後、水分５％となるように室温にて減圧乾燥を行い10.3
gの固定化リパーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて、実施例１と同
様にエステル交換反応を行った。

その結果は第２表に示した。

実施例３この例ではリン脂質の溶媒についての選択を行った。

即ち、実施例２においては、ブタノールに代えてメタノ
ール、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキ
サノール、ヘプタノール、オクタノールをそれぞれ用い
た以外は実施例２の方法と同一の操作を行った。

その結果は第２表に示した。

第２表に示す結果から、リン脂質の分散溶剤として炭素
数８以下のアルコールが有効である事が明らかとなっ
た。

実施例４この例ではリン脂質の種類についての検索を行った。

即ち、実施例２において、市販の大豆レシチンにかえ
て、リン脂質としてホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルセリン（試薬、何れもシグマ社製）をそ
れぞれ用いた以外は実施例２と全く同一の操作を行っ
た。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。結果は第３表に示したが、い
ずれのリン脂質でも十分な効果が認められた。

実施例５実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液95mlに溶解した。別に5mlのブタノールにホス
ファチジルコリン1gとオリーブ油（局方オリーブ油、和
光純薬工業株式会社製）1gを添加し、撹拌して均一な混
合物を調製し、これを先のリパーゼ溶液に添加し１時間
撹拌し混合物Ｃ（リパーゼ、ホスファチジルコリン、オ
リーブ油、ブタノールなどを含有）を得た。該混合物Ｃ
に実施例１で用いた弱アニオン交換樹脂（デュオライト
ES-568）10g（水分10％）を混合し30℃で２時間撹拌し
た。なお混合時のpHは5.0に調整した。次に該混合物か
ら弱アニオン交換樹脂をろ別し、水で洗浄した後、水分
５％となるように常温にて減圧乾燥を行って固定化リパ
ーゼを得た。

ここで得られた固定化リパーゼを用いて実施例１と同様
にエステル交換反応を行った。

その結果は第４表に示した。

比較例３実施例１で用いた市販のリパーゼ10gをpH5.0の10mMの酢
酸緩衝液95mlに溶解した。別に5mlのブタノールに実施
例５で用いたオリーブ油1gを添加し、撹拌して均一な混
合物を調製し、先のリパーゼ溶液に添加し１時間撹拌し
リパーゼ、オリーブ油、ブタノールなどを含有する混合
物Ｄを得た。該混合物Ｄに実施例１で用いた弱アニオン
交換樹脂（デュオライトES-568）10g（水分10％）を混
合し30℃で２時間撹拌した。なお混合時のpHは5.0に調
整した。次にこの混合物から弱アニオン交換樹脂をろ別
し、水で洗浄した後、水分５％となるように常温にて減
圧乾燥を行って固定化リパーゼを得た。

その結果は第４表に示した。

実施例６実施例５において、オリーブ油にかえてオレイン酸ジグ
リセリド（試薬、シグマ社製）、オレイン酸モノグリセ
リド（商品名エキセルO-95、花王株式会社製）、オレイ
ン酸（商品名ルナックO-LL、花王株式会社製）をそれぞ
れ用いた以外は全く実施例５と同一の操作を行った。

その結果は第４表に示した。

実施例５、実施例６及び比較例３の結果、及び実施例４
のホスファチジルコリン単独の結果も第４表に一括表示
したが、之等の結果から、リン脂質とリパーゼの基質と
なる油脂類を共存させる事により効果の増大が認められ
た。

実施例７実施例５において、弱アニオン交換樹脂デュオライトES
-568にかえて、デュオライトES-562、フェノールホルム
アルデヒド吸着樹脂デュオライトS-861、ダウエックスM
WA-10（ダウケミカル社製）、無機担体としてセライト5
45（マリンビル社製）をそれぞれ用いた以外は実施例５
と全く同様の操作を行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様なエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第５表に示したがイオン交換樹脂のみならず
無機担体でも同様な効果が認められた。

実施例８実施例２において、市販リパーゼとしてキャンディダ・
シリンドラッセ起源のリパーゼ〔商品名＜リパーゼOF＞
名糖産業株式会社製、36万Unit/g〕0.97gを用いた以外
は実施例２と全く同様の方法で行った。

ここで得られた固定化酵素を用いて実施例１と同様にエ
ステル交換反応を行った。

その結果は第６表に示した。

実施例９実施例２において、市販リパーゼとしてリゾプス・デレ
マー起源のリパーゼ〔商品名＜タリパーゼ＞田辺製薬
（株）製、6000Unit/g〕58gを用いた以外は実施例２と
全く同様の方法で行った。

その結果は第６表に示した。

実施例10 実施例２において、市販リパーゼとしてアスペルギルス
・ニガー起源のリパーゼ〔商品名＜リパーゼAP6＞天野
製薬株式会社製、６万Unit/g〕5.8gを用いた以外は実施
例２と全く同様の方法で行った。

その結果は第６表に示した。

実施例11 実施例２において、市販リパーゼとしてムコール起源の
市販リパーゼ〔商品名＜リパーゼAP10＞天野製薬株式会
社製、１万Unit/g〕35gを用いた以外は実施例２と全く
同様の方法で行った。

その結果は第６表に示した。

実施例８〜11の結果を第６表に一括表示したが、いずれ
の微生物起源の酵素を用いても同様の効果が認められ
た。

実施例12 この例では実施例２及び実施例８〜11で得られた固定化
リパーゼをエステル化に用いた。

即ち、実施例２又は実施例８〜11で得られた固定化酵素
それぞれ1gを、オクチルアルコール6.3g（和光純薬工業
株式会社製）及びオレイン酸（商品名ルナックO-LL、花
王株式会社製）13.7gと混合し、40℃にて攪拌しながら
エステル合成（エステル化）反応を行った。経時的に反
応液の一部を試料として取り出し、基準油脂分析試験法
に従って試料の酸価を測定した。試料の酸化より次式に
よりエステル化率を求めた。

ここで、AVt:t時間後の試料の酸価 AVo:反応前の混合試料の酸価を表す。

その結果は第７表に示した。

比較例４実施例２及び実施例８〜11で用いた市販のリパーゼをそ
れぞれ35,000unit/g用いて、実施例12と同様にエステル
合成反応を行った。

その結果を第７表に示した。

第７表に示される結果から、本発明における固定化酵素
が、エステル合成反応にも適していることが明らかであ
る。

実施例13 次に上記のようにして得られた固定化酵素についてその
耐久性を調べた。

即ち、実施例２と比較例３で用意した固定化酵素5gをそ
れぞれジャケット付カラムに充填し、70℃の温水にて保
温した。そこにパーム油中融点部とステアリン酸を等量
混合溶解したものを18g/Hrの速度で連続的に通液し活性
の低下を調べた。

初期の反応活性に対する半減期は未処理（比較例３）の
場合が約50時間であるのに対し、リン脂質処理固定化酵
素（実施例２）では約400時間となり耐久性が向上して
いる。この間に固定化酵素1kgに対して1440kgの反応液
が処理された。

実施例14 実施例４で得られた固定化酵素5gに２％グルタルアルデ
ヒド水溶液5mlを加え室温で１時間架橋反応を行った。
次にデカンテーションにより余剰のグルタルアルデヒド
を除去した後、20mlのイオン交換水により２回水洗し
た。濾過後に室温にて水分５％となるように減圧乾燥し
固定化酵素架橋品を得た。ここで得られた固定化酵素は
81％の活性残存率であった。この固定化酵素を用いて実
施例13と同様の連続通液試験を行った。初期の反応活性
に対する半減期は約630時間となり、架橋による安定化
が認められた。この間に固定化酵素1kgあたり2300kgの
反応液が処理された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リパーゼとリン脂質を接触・結合させた状
態で不溶性担体に固定化してなる、エステル交換及びエ
ステル合成に適した固定化酵素。
【請求項２】不溶性担体がマクロ多孔性樹脂であり、固
定化が吸着固定化である特許請求の範囲第１項記載の固
定化酵素。
【請求項３】リパーゼを不溶性担体に固定化する前また
は固定化時にリン脂質を添加する事によりリパーゼのエ
ステル交換活性およびエステル合成活性を増大させて固
定化することを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項４】リパーゼにリン脂質を添加し、リパーゼと
リン脂質とを接触させるにあたり、炭素数８以下の脂肪
族１価アルコールを用いることにより、リン脂質とリパ
ーゼとの結合を促進させる特許請求の範囲第３項記載の
固定化酵素の製造方法。
【請求項５】リパーゼを溶解するため、リパーゼに緩衝
液を添加する特許請求の範囲第３項又は第４項記載の固
定化酵素の製造方法。
【請求項６】リパーゼを溶解するための緩衝液をpH3〜
９に制御することにより、リパーゼの失活を抑制する特
許請求の範囲第５項記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項７】リパーゼとリン脂質とを不溶性担体に固定
化する際に、リパーゼの基質となる油脂類、脂肪酸、又
はそれらの誘導体（ジグリセリド又はモノグリセリド）
を添加し、リパーゼの活性部位を保護し失活を抑制する
特許請求の範囲第３項又は第４項記載の固定化酵素の製
造方法。
【請求項８】不溶性担体を、リパーゼ及びリン脂質と接
触させる前、又は接触中、又は接触させた後に、多官能
性架橋剤で処理し、然る後、残存する架橋剤を除去する
特許請求の範囲第３〜７項のいずれか一項に記載の固定
化酵素の製造方法。
【請求項９】固定化が、マクロ多孔性樹脂への吸着固定
化である特許請求の範囲第３〜８項のいずれか一項に記
載の固定化酵素の製造方法。
【請求項１０】固定化の温度が０〜60℃である、特許請
求の範囲第９項記載の固定化酵素の製造方法。