JPH05306238A - 特異的抗体及びカイコ感染症防除組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カイコ感染症病原体で過免疫された産卵鶏あ
るいは哺乳類の鶏卵又は乳汁より得られ、カイコ感染症
の防除に用いられる該病原体に対する特異的抗体。およ
び該特異的抗体をカイコ感染症防除の有効成分として配
合した組成物。 【構成】 本発明のカイコ感染症病原体に対する特異的
抗体、および該特異的抗体を感染症防除有効成分として
配合した組成物をカイコに投与すれば、対応するカイコ
感染症の効果的な防除が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カイコの感染症病原体
に対し特異的に結合活性を有する抗体及び該抗体を配合
した飼料に関する。

【０００２】

【従来の技術】カイコは、古来より絹の生産源として、
世界中で大量飼育されている。また、大規模養蚕を支え
る技術として、桑の葉を含まないか、又は粉末化した桑
葉を一定の割合で添加した人工飼料の開発が活発に進め
られてきた。近年の蚕用人工飼料の著しい発展により、
天然の桑の葉を用いて飼育した場合と比べて、カイコの
成長速度、成育の均一性、得られる繭の質などの点にお
いて遜色のない大量飼育方法がほぼ確立したと言える。
しかし、その反面、人工飼料で飼育しているカイコは各
種感染症に罹りやすい傾向があると言われる。カイコに
は色々な病気があるが、特にウイルス病は最も伝染力が
強く、被害が大きい。現在、カイコの病原性ウイルスと
して、核多角体病ウイルス、細胞質多角体病ウイルス、
軟化病ウイルスの３種が報告されている。

【０００３】これらウイルス性感染症に対する防除対策
として、抗生物質などが検討されているが、カイコの成
長に影響を与えず、効果的に疾病を予防または治療する
薬剤は今だ開発されていない。唯一、酵母細胞から抽出
したトランスファ−リボ核酸を飼料に添加することによ
り、カイコ核多角体病を抑制する方法（特公昭６２−３
６４８８）が報告されているのみである。

【０００４】ウイルス性感染症を予防する手段として、
人または家畜などでは、一般的にワクチン接種が行われ
ている。すなわち、不活化したウイルスまたはウイルス
構成成分を人または家畜に接種することにより、個体自
身の持っている免疫能力を賦活化し、病原体に対する抵
抗力を増加させるものである。ワクチン接種を受けた個
体は、ウイルスに対する特異的抗体を自身の体内に準備
し、その後の感染に備える。この特異的抗体産生能力
は、脊椎動物のような高等動物が持つ自己防衛機能の重
要な位置を占めている。

【０００５】一方、カイコを含む昆虫類では、このよう
な特異的抗体を体内に準備する能力がないと言われる。
従って、カイコウイルス病を予防する目的でワクチン接
種することは意味がない。

【０００６】ワクチン接種の他にウイルス性感染症を防
除する手段として、受動免疫がある。受動免疫とは、ウ
イルスに対する特異的抗体を予め経口的に投与してお
き、その後の感染を抑制する方法である。

【０００７】受動免疫の公知例としては、虫歯菌（スト
レプトコッカスミュ−タンス菌）に対する特異的抗体を
用いた虫歯の予防（J.Dent.Res., 70, 162-166, 1991
年）、ロタウイルスに対する特異的抗体を用いたロタウ
イルス性下痢症の予防（Microbiol.Immunol., 34, 617-
629, 1990 年）等が報告されている。

【０００８】また、養殖分野における受動免疫の公知例
では、ブリ類結節症の予防、ヒラメ稚魚腸管白濁症の予
防など、魚類の感染症に対する特異的抗体の有効性につ
いて報告されている（特開平１−１６８２４６）。

【０００９】しかしながら、カイコ等の昆虫類のウイル
ス性感染症に対して、受動免疫が有効かどうかについて
の報告は全くない。生体機能的にも、ライフサイクル面
からも脊椎動物とは全く異質のカイコにおいて、特異的
抗体を投与する受動免疫法の有効性を類推することは困
難である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】天然の桑の葉を使わな
い人工飼料の開発の飛躍的な発展により、大規模養蚕が
可能となった。しかし、桑葉を用いていた場合よりウイ
ルス性感染症が多発するという問題が発生し、養蚕業界
に大きな被害をもたらしている。ウイルス性感染症に対
しては、抗生物質等の開発も進められているが、今だ、
顕著な防御効果を見るまでにはいたっていない。また、
薬剤の使用がカイコの成育に影響を与えるなどの問題点
も指摘されている。

【００１１】本発明の目的は、受動免疫法、すなわち特
異的抗体をカイコに投与することにより、カイコのウイ
ルス性感染症を防除することにある。また、該受動免疫
で用いられるカイコウイルスに対し結合活性を有する特
異的抗体を提供することにある。さらには、該特異的抗
体を配合したカイコウイルス性感染症防除に有効な組成
物を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決する為の手段】本発明者らは、前記課題を
解決するために、カイコ感染症の防除方法として受動免
疫に着目し、研究を進めた結果、カイコのウイルスに対
する特異的抗体の調製に成功した。また、該特異的抗体
を配合した組成物としてカイコの飼料を調製し、該特異
的抗体の経口投与によるカイコのウイルス性感染症の受
動免疫効果について、初めて実証した。即ち、本発明
は、カイコ感染症の防除に用いる特異的抗体及び該抗体
を配合してなるカイコ感染症防除組成物に関する。

【００１３】本発明のカイコ感染症とは、核多角体病ウ
イルス、細胞質多角体病ウイルス、軟化病ウイルスその
他のウイルス性病原体による感染症を言う。

【００１４】本発明の特異的抗体とは、カイコの感染症
病原体に対して特異的に結合する抗体を言い、抗体の種
類としては、カイコ感染症病原体で過免疫された産卵鶏
の卵より得られる鶏卵抗体、あるいはカイコ感染症病原
体で過免疫された哺乳類の乳汁より得られる乳汁抗体を
言い、その抗体純度については限定しない。即ち、抗体
の純品であってもよいし、鶏卵抗体の場合はそれを含む
全卵粉末、卵黄粉末、あるいは卵黄の水溶性蛋白質画分
粉末であってもよい。また、乳汁抗体の場合はそれを含
む全脂粉乳、脱脂粉乳、あるいは乳清蛋白質粉末であっ
てもよい。

【００１５】カイコ感染症病原体で過免疫される動物と
しては、該病原体に対する特異的抗体を産生できる動物
であればよいが、本発明の目的であるカイコ感染症の防
除に用いられる抗体及びその抗体組成物の提供という実
用的観点から考えると、大量の特異的抗体を産生できる
産卵鶏、あるいは牛、ヤギ、羊等の哺乳類に限定され
る。これらの中でも、過免疫の作業性、抗体産生能力、
動物飼育コスト等の観点から、産卵鶏に病原体を免疫
し、その鶏卵より抗体を得る方法が最も望ましい。

【００１６】産卵鶏を過免疫する方法としては、カイコ
の感染症病原体を抗原として産卵鶏に繰り返し投与する
ことにより、鶏卵中に特異的抗体を増加させるとよい。
また、哺乳類を過免疫する方法としては、牛、ヤギ、羊
等の動物に該抗原を繰り返し投与することにより、乳汁
中に特異的抗体を増加させるとよい。

【００１７】この場合用いられる抗原の調製について
は、公知の方法で行えばよい。例えば、カイコ感染症の
病原ウイルスを大量培養した後、ホルマリン等の公知の
不活化剤で処理することにより、抗原の大量調製が可能
である。または、感染症で斃死したカイコを集め、その
罹患部をホモジネ−ション等の方法で均質化し、抗原と
することも可能である。または、罹患部のホモジネ−ト
中に含まれる病原ウイルスの純度を上昇させる目的で、
遠心分離、カラムクロマトグラフィ−、濾過などの公知
の方法を組み合わせることにより、病原ウイルスを精製
し、抗原として用いることも可能である。

【００１８】抗原を産卵鶏あるいは哺乳類に投与する方
法としては、筋肉注射、皮下注射、静脈注射、腹腔内注
射、あるいは飲水による経口投与等、一般的な投与法が
用いられるが、操作性及び特異的抗体の産生効率などの
観点より筋肉注射が望ましい。投与に用いられる抗原
は、カイコ感染症病原体の溶液又は浮遊けん濁液、ある
いは該液と水酸化アルミニウムゲルやフロイントアジュ
バントを混合したものが一般的に用いられる。

【００１９】抗原の投与は、鶏卵中あるいは乳汁中に現
れる特異的抗体量を酵素免疫測定法などの方法で調べな
がら、該抗体量が最大値になるまで繰り返し実施され
る。なお、該抗体量は、適当な間隔で産卵鶏あるいは哺
乳類に抗原を繰り返し投与することにより、産卵期間ま
たは乳汁分泌期間を通してある一定レベル以上の特異的
抗体量を維持することができる。

【００２０】投与される抗原の量は、被投与動物の種
類、抗原の種類等により異なるため、適時、予備試験等
により選択する必要があるが、産卵鶏への投与の場合、
一般的には、ウイルス量として10μｇ〜１ｍｇ／羽／回
の抗原量が選択される。

【００２１】カイコ感染症病原体を抗原として産卵鶏あ
るいは哺乳類に投与した後、該抗原に対する特異的抗体
を含有する鶏卵あるいは乳汁を集め、これより本発明の
カイコ感染症の防除に用いられるカイコ感染症病原体に
対する特異的抗体を調製することができる。鶏卵を用い
る場合、割卵後、全卵液または卵黄液を分離し、ホモジ
ナイザ−等で均質化した後、殺菌し熱風乾燥あるいは凍
結乾燥により用いた抗原に対する特異的抗体含有全卵粉
末あるいは卵黄粉末を得ることができる。また、該卵黄
液または卵黄粉末より公知の鶏卵抗体精製法（特開昭６
４−３８０９８、Ａgric.Biol.Chem. 54(10)、2531-253
5 、1990年等）により、用いた抗原に対する特異的抗体
純度を高めた卵黄水溶性タンパク質粉末あるいは特異的
抗体の純品粉末等が調製できる。乳汁を用いる場合、該
乳汁あるいは該乳汁中の脂質成分をクリ−ムセパレ−タ
−等で分離した脱脂乳を殺菌後、熱風乾燥あるいは凍結
乾燥し用いた抗原に対する特異的抗体を含有する全脂粉
乳あるいは脱脂粉乳が得られる。また該乳汁あるいは該
脱脂乳より、公知の方法で用いた抗原に対する特異的抗
体純度を高めたホエ−タンパク質粉末あるいは特異的抗
体の純品等が調製できる。

【００２２】本発明のカイコ感染症防除組成物とは、カ
イコ感染症の病原体に対する特異的抗体として過免疫鶏
の卵より得られる全卵粉末、卵黄粉末、卵黄水溶性タン
パク質粉末、鶏卵抗体純品粉末、あるいは過免疫哺乳類
の乳汁より得られる全脂粉乳、脱脂粉乳、ホエ−タンパ
ク質粉末、乳汁抗体純品粉末等の粉末をカイコ感染症の
防除有効成分として配合した組成物を言う。組成物の他
の補助成分として、ビタミン、ミネラル類、カイコの摂
食誘引物質等、抗生物質などを同時に配合することがで
きる。

【００２３】本発明の組成物の給餌における形態として
は、稚蚕期はスライス状、リボン状、また壮蚕期はリボ
ン状、ブロック状のものが望ましいが、カイコが摂食で
きればどのような形態でもよい。また、カイコ感染症病
原体に対する特異的抗体を含有する粉末を他の補助成分
とともに水に懸濁することにより液剤とし、カイコ用飼
料に塗布して用いてもよい。

【００２４】

【実施例】以下、実施例、試験例により本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなん
ら制限されるものではない。 実施例１．カイコ核多角体病ウイルスに対する鶏卵抗体
の調製 （抗原）カイコの多角体（ウイルスの封入体）500 ｍｇ
を、0.5 ％炭酸ナトリウム水溶液50ｍｌに懸濁し、０
℃、30分間攪拌した。ｐＨを8.5 に調製後、4000rpm ，
15分間遠心分離し、その上清をウイルス粗精製液として
さらに超遠心分離法により、ウイルスの精製を行った。
すなわち、48,000ｇ，90分間超遠心分離した後、得られ
た沈殿（ウイルス）を10ｍＭTris-HCl（ｐＨ 8.5）に懸
濁した。さらにもう一度4,000 rpm ，15分間遠心分離
し、その上清を48,000ｇ，90分間超遠心分離した。得ら
れた沈殿を10ｍＭTris-HCl（ｐＨ 8.5）懸濁したものを
最終的に精製ウイルス抗原液（１ｍｇ／ｍｌ）とした。 （免疫）産卵鶏３羽に対し、精製ウイルス抗原液（１ｍ
ｇ／ｍｌ）をフロイントコンプリ−トアジュバントと同
量混合乳化したものを、１羽当たり２ｍｌ筋肉内に免疫
注射した。免疫注射は毎週１回で合計４回行った。 （鶏卵抗体の調製）抗原に対する特異的抗体力価の上昇
した鶏卵（免疫１ケ月後より５ケ月間）を割卵し、卵黄
液4.4 ｋｇを得た。該卵黄液をスプレ−ドライ法（入風
温度150 ℃、排風温度80℃）で粉末化し、カイコ核多角
体病ウイルスに対する鶏卵抗体（卵黄粉末）2.1 ｋｇを
得た。

【００２５】実施例２．カイコウイルス感染症防除飼料
の調製 ＜蚕用基本人工飼料＞ 桑葉粉末 ３１％ 脱脂大豆粉末 ２０％ セルロ−ス粉末 ２０％ 寒天 １０％ 馬鈴薯澱粉 １０％ ビタミンＣ ２％ クエン酸 ２％ ミネラル混合 ２％ プロピオン酸 １％ ビタミンＢ群 １％ 大豆油 １％ 蚕用基本人工飼料100 ｇに対し水240 ｇ加え、よく混合
した後、オ−トクレ−ブで高圧滅菌処理した。該人工飼
料170 ｇに対し、カイコ核多角体病ウイルスに対する鶏
卵抗体（卵黄粉末）の懸濁液（20ｍｇ／ｍｌ）を17ｍｌ
滴下し、よくしみこませてカイコウイルス感染症防除飼
料187 ｇを得た。

【００２６】試験例１．鶏卵抗体の抗体力価測定 鶏卵抗体の抗体力価は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に
より測定した。基本的な手順を以下に示す。 （１）ＥＬＩＳＡプレ−ト：９６穴ポリスチレンプレ−
ト（ヌンク社製）を用いた。 （２）抗原のコ−ティング：免疫に用いた精製ウイルス
抗原液を0.05Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ9.6 ）で１０μｇ／ｍ
ｌに希釈し、その100 μｌをＥＬＩＳＡプレ−トの各ウ
エルへ添加し、５℃、一夜放置した。 （３）洗浄：0.5 ％Ｔｗｅｅｎ２０含有20ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ7.4 、以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略す。）を
ウエル当たり200 μｌ添加して洗浄した。洗浄は４回行
った。 （４）ブロッキング：10ｍｇ／ｍｌオボアルブミン含有
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎをウエル当たり100 μｌ添加し、37
℃、１時間放置した。 （５）洗浄：（３）と同様に行った。 （６）サンプル添加：ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈したサ
ンプル液を100 μｌ／ウエルで添加し、37℃、１時間放
置した。 （７）洗浄：（３）と同様に行った。 （８）２次抗体添加：抗ニワトリＩｇＧウサギＩｇＧ−
アルカリホスファタ−ゼコンジュゲ−ト（ザイメット社
製）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで2,000 倍希釈し100 μｌ／
ウエルで添加し、37℃、１時間放置した． （９）洗浄：３）と同様に行った。 （10）酵素反応：基質として、シグマ社製のＰ−ニトロ
フェニルホスフェ−ト・210 を用いた。基質１ｍｇ／ｍ
ｌを溶解した0.1 Ｍエタノ−ルアミン緩衝液（ｐＨ9.8
）をウエル当たり100 μｌ添加し、37℃、20分間酵素
反応を行った後、２ＭＮａＯＨ溶液を50μｌ／ウエル添
加し、反応を停止した。 （11）吸光度測定：各ウエルの405 ｎｍにおける吸光度
を測定し、ブランク（サンプルの代わりにＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎを添加したウエル）の吸光度を差し引いた値をＥ
ＬＩＳＡ値とした。

【００２７】実施例１の免疫の結果得られた鶏卵卵黄に
ついて、カイコ核多角体病ウイルスに対する特異的抗体
力価をＥＬＩＳＡにより測定した。すなわち免疫後、１
週毎の鶏卵卵黄を分取して、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで500
倍希釈したものをＥＬＩＳＡ用のサンプルとして供し
た。図１にカイコ核多角体病ウイルスに対する特異的抗
体力価の推移を示す。毎週計４回の免疫により、抗体力
価の上昇が見られることがわかった。

【００２８】試験例２．カイコ核多角体病に対する鶏卵
抗体の効果 実施例２で調製したカイコウイルス感染症防除飼料187
ｇの上に、３齢３日目のカイコ20頭を置き、２日間添食
した。この際、対照として、抗原で免疫していない鶏卵
卵黄粉末を蚕用基本人工飼料に同濃度添加した飼料を与
える群も用意した。又、蚕用基本人工飼料のみを与える
群も用意した。一方、精製した多角体（ウイルス封入
体）をペニシリンおよびストレプトマイシンで消毒し、
滅菌水に懸濁したものをさらに滅菌水で10段階希釈し
た。このウイルス希釈液１ｍｌを蚕用基本人工飼料２ｇ
に滴下し、十分にしみこませたものをカイコが４齢起蚕
になった時に与え、２４時間添食させ、その後の核多角
体病の発症を観察した。特異的鶏卵抗体（卵黄粉末）添
加飼料投与群、対照卵黄粉末添加飼料投与群および無添
加飼料投与群における核多角体病の発症率を表１に示
す。

【００２９】

【表１】

【００３０】ウイルス接種量１×10⁸ 個／ｍｌにおい
て、対照卵黄粉末添加群および無添加群が100 ％の発症
率を示したのに対し、特異的鶏卵抗体添加群では40％に
抑えられた。また、同接種量１×10⁷ 個／ｍｌでは、対
照卵黄粉末添加群および無添加群が40％の発症率を示し
たのに対し、特異的鶏卵抗体添加群では０％に抑制され
た。

【００３１】

【発明の効果】カイコの飼育形態の大規模化が進むにつ
れて、ひとたび感染症が発生すると甚大な被害を受ける
ようになった。カイコの感染症の中でもウイルスによる
ものは特に被害も大きく、これを完全に予防する手段は
現在全くない。抗生物質の開発も進められているが、顕
著な防御効果を見るまでには至っていない。またカイコ
自身の成長に影響を与えるなどの問題点も残っている。
このような現状において本発明により初めて、カイコ感
染症の病原体に対する特異的抗体を用いた受動免疫によ
り、カイコ感染症の防除効果が実証された。

【図面の簡単な説明】

【図１】カイコ核多角体病ウイルスに対する特異的抗体
力価の推移を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金 武祚 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内 (72)発明者 森 肇 京都府京都市北区小山下内河原町27−１ (72)発明者 姫野 道夫 大阪府堺市大野芝町23大野芝宅舎３−58 (72)発明者 林屋 慶三 京都府京都市左京区北白川東伊織町31−１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カイコ感染症の防除に用いられるカイコ
   感染症病原体に対する特異的抗体及びその抗体を配合し
   てなるカイコ感染症防除組成物及び／又はカイコ飼料。
2. 【請求項２】 特異的抗体が、カイコ感染症病原体で過
   免疫された産卵鶏の卵より得られる鶏卵抗体である請求
   項１記載の特異的抗体。
3. 【請求項３】 特異的抗体が、カイコ感染症病原体で過
   免疫された哺乳類の乳汁より得られる乳汁抗体である請
   求項１記載の特異的抗体。
4. 【請求項４】 カイコ感染症の病原体がウイルス性の病
   原体である請求項１、２および３記載の特異的抗体。
5. 【請求項５】 ウイルス性の病原体が、核多角体病ウイ
   ルス・細胞質多角体病ウイルス・軟化病ウイルスから選
   ばれる１種又は２種以上である請求項４記載の特異的抗
   体。