JPH05308989A - インシュリン含有溶液の取得法 - Google Patents
インシュリン含有溶液の取得法Info
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 持続性のインシュリン調製物を得るための、
実質的にプロテアーゼおよび／またはＡ９位アセチル化
インシュリンを含まないインシュリンを得ることを目的
とする。 【構成】 水に混和性の有機溶媒を含む水性、緩衝性溶
出液で、親油性に改変したシリカゲル上で、アセトンま
たはアセトニトリルを含む溶解緩衝液を用いてクロマト
グラフィーを行うことによって、実質的にプロテアーゼ
および／またはＡ９位でアセチル化されたインシュリン
を含まないインシュリンを得ることから成る。
実質的にプロテアーゼおよび／またはＡ９位アセチル化
インシュリンを含まないインシュリンを得ることを目的
とする。 【構成】 水に混和性の有機溶媒を含む水性、緩衝性溶
出液で、親油性に改変したシリカゲル上で、アセトンま
たはアセトニトリルを含む溶解緩衝液を用いてクロマト
グラフィーを行うことによって、実質的にプロテアーゼ
および／またはＡ９位でアセチル化されたインシュリン
を含まないインシュリンを得ることから成る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、実質的にプロテアーゼ
および／またはＡ９位アセチル化インシュリンを含まな
いインシュリンを得る方法に関する。
および／またはＡ９位アセチル化インシュリンを含まな
いインシュリンを得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】親油性修飾を施した（逆相）シリカゲル
でのインシュリンまたはインシュリン誘導体の精製は、
分析的分離法で既知であり、長期にわたって高圧液体ク
ロマトグラフィー（HPLC)において用いられ成功してき
た(WS Welinderら、 J.Chrom.,361,（1986）357〜367)。
分析スケールでは、μｇの範囲の蛋白を改変シリカゲル
を充填したスチール、ガラスまたはプラスチックのカラ
ムに添加し、続いて混合液（一定濃度のまたは濃度を変
えた有機溶媒を含む主に酸性、水性緩衝液）を流して溶
出させる。このタイプの分離では、負荷する蛋白は、実
質的にカラム容積の１ｍｌ当たり３０μｇより少ない。
でのインシュリンまたはインシュリン誘導体の精製は、
分析的分離法で既知であり、長期にわたって高圧液体ク
ロマトグラフィー（HPLC)において用いられ成功してき
た(WS Welinderら、 J.Chrom.,361,（1986）357〜367)。
分析スケールでは、μｇの範囲の蛋白を改変シリカゲル
を充填したスチール、ガラスまたはプラスチックのカラ
ムに添加し、続いて混合液（一定濃度のまたは濃度を変
えた有機溶媒を含む主に酸性、水性緩衝液）を流して溶
出させる。このタイプの分離では、負荷する蛋白は、実
質的にカラム容積の１ｍｌ当たり３０μｇより少ない。
【０００３】以前の化学的変換、例えば強酸エステル切
断または酵素的ペプチド転移反応および結晶化による精
製で得られるインシュリンは、通常同様な特性を有する
付随物質を含んでいる。電荷の適切な差異が存在する場
合は、それらは、特定のｐＨを選んでイオン交換クロマ
トグラフィーによって精製することができる（米国特許
第４,１２９,５６０号）。この方法の欠点は希釈の影
響、およびその結果、重要な物質が比較的長時間に及ぶ
沈殿物の操作中に上清中に失われ、全体的な回収が減少
し、したがって収量が減少するという事実にある。
断または酵素的ペプチド転移反応および結晶化による精
製で得られるインシュリンは、通常同様な特性を有する
付随物質を含んでいる。電荷の適切な差異が存在する場
合は、それらは、特定のｐＨを選んでイオン交換クロマ
トグラフィーによって精製することができる（米国特許
第４,１２９,５６０号）。この方法の欠点は希釈の影
響、およびその結果、重要な物質が比較的長時間に及ぶ
沈殿物の操作中に上清中に失われ、全体的な回収が減少
し、したがって収量が減少するという事実にある。
【０００４】持続性（depot properties）のインシュリ
ン調製物には、しばしばインシュリンの作用時間を延長
させるプロタミンが含まれている。プロタミンは、魚類
の精子から得られる、アルギニンに富む蛋白である。持
続性インシュリン調製物の品質試験では、調製物をしば
らく貯蔵した後、説明のつかない持続性の消失が通常認
められた。そのようなインシュリンの使用は容易にイン
シュリン過剰投与につながり、それは場合によっては、
低血糖ショックに続いて患者の死亡に結び付くので、そ
のようなインシュリン調製物は患者にとって全く不適切
なものである。
ン調製物には、しばしばインシュリンの作用時間を延長
させるプロタミンが含まれている。プロタミンは、魚類
の精子から得られる、アルギニンに富む蛋白である。持
続性インシュリン調製物の品質試験では、調製物をしば
らく貯蔵した後、説明のつかない持続性の消失が通常認
められた。そのようなインシュリンの使用は容易にイン
シュリン過剰投与につながり、それは場合によっては、
低血糖ショックに続いて患者の死亡に結び付くので、そ
のようなインシュリン調製物は患者にとって全く不適切
なものである。
【０００５】このようなインシュリン調製物を詳細に研
究したところ、当該持続性の消失は、痕跡量のプロテア
ーゼによりプロタミンが徐々に分解されて起こることが
示された。さらに、これらの調製物中のプロテアーゼの
大半は、ブタインシュリンをヒトインシュリンエステル
／エーテルとするための酵素的ペプチド転移、またはイ
ンシュリン様前駆物質の開裂のための蛋白分解反応に起
因することが分かった。殆どのプロテアーゼ、例えばト
リプシンは、慣用的に用いられるクロマトグラフィー工
程によって分離除去されるが、残余量のプロテアーゼが
インシュリン調製物中に残留し、持続特性の消失につな
がることは明白である。
究したところ、当該持続性の消失は、痕跡量のプロテア
ーゼによりプロタミンが徐々に分解されて起こることが
示された。さらに、これらの調製物中のプロテアーゼの
大半は、ブタインシュリンをヒトインシュリンエステル
／エーテルとするための酵素的ペプチド転移、またはイ
ンシュリン様前駆物質の開裂のための蛋白分解反応に起
因することが分かった。殆どのプロテアーゼ、例えばト
リプシンは、慣用的に用いられるクロマトグラフィー工
程によって分離除去されるが、残余量のプロテアーゼが
インシュリン調製物中に残留し、持続特性の消失につな
がることは明白である。
【０００６】遺伝子工学によるインシュリンの調製物で
は、インシュリンのＡ９位に位置するセリンも、副産物
として微生物によってアセチル化されており、セリンヒ
ドロキシル基がアセチル化されているインシュリン誘導
体が形成される。このインシュリン誘導体は、したがっ
てこれまでのところ大腸菌（Escherichia coli)を用い
た遺伝子工学によるインシュリン調製物においてのみ認
められる。 このアセチル化インシュリン誘導体のヒトイ
ンシュリンからの完全な分離は、欧州特許出願（公告番
号第４７４,２１３号）に記載された方法を用いた場
合、これまでのところ、ヒトインシュリンの収量の低下
という犠牲を払って初めて達成できる。さらに、この方
法では、アセチル化インシュリンの濃度が５％を越える
場合は、分離を行うことができないことが明白である。
のみならず、この方法を用いて実質的にプロテアーゼを
含まないインシュリンを得ることは現実的に不可能であ
る。
は、インシュリンのＡ９位に位置するセリンも、副産物
として微生物によってアセチル化されており、セリンヒ
ドロキシル基がアセチル化されているインシュリン誘導
体が形成される。このインシュリン誘導体は、したがっ
てこれまでのところ大腸菌（Escherichia coli)を用い
た遺伝子工学によるインシュリン調製物においてのみ認
められる。 このアセチル化インシュリン誘導体のヒトイ
ンシュリンからの完全な分離は、欧州特許出願（公告番
号第４７４,２１３号）に記載された方法を用いた場
合、これまでのところ、ヒトインシュリンの収量の低下
という犠牲を払って初めて達成できる。さらに、この方
法では、アセチル化インシュリンの濃度が５％を越える
場合は、分離を行うことができないことが明白である。
のみならず、この方法を用いて実質的にプロテアーゼを
含まないインシュリンを得ることは現実的に不可能であ
る。
【０００７】今や、水に混合性の有機溶媒を含む水性緩
衝溶出液で、親油性に改変したシリカゲル上でクロマト
グラフィーを行うことにより、プロテアーゼおよび／ま
たはＡ９位アセチル化インシュリンを実質的に含有しな
いインシュリンを得る方法が見いだされた。この方法
は、 １Ａ） プロテアーゼおよび／またはＡ９位アセチル化
インシュリン並びにインシュリンの混合物を緩衝液に溶
かし、 １Ｂ） 双性イオンを含み、場合によってを精製しよう
とするインシュリンの等電点付近にｐＨ調整した、緩衝
溶出液で溶出を行い、得られたインシュリン分画を必要
に応じて濃縮し、続いて得られたインシュリン分画を、 ２Ａ） アセトンまたはアセトニトリルを含む溶解緩衝
液に溶かし、 ２Ｂ） 得られた溶液をカラムに加え、 ２Ｃ） 該カラムを溶解緩衝液で洗浄し、 ２Ｄ） 精製しようとするインシュリンを、双性イオン
を含み、場合によってｐＨを精製しようとするインシュ
リンの等電点付近に調整した、緩衝溶出液で溶出する。
衝溶出液で、親油性に改変したシリカゲル上でクロマト
グラフィーを行うことにより、プロテアーゼおよび／ま
たはＡ９位アセチル化インシュリンを実質的に含有しな
いインシュリンを得る方法が見いだされた。この方法
は、 １Ａ） プロテアーゼおよび／またはＡ９位アセチル化
インシュリン並びにインシュリンの混合物を緩衝液に溶
かし、 １Ｂ） 双性イオンを含み、場合によってを精製しよう
とするインシュリンの等電点付近にｐＨ調整した、緩衝
溶出液で溶出を行い、得られたインシュリン分画を必要
に応じて濃縮し、続いて得られたインシュリン分画を、 ２Ａ） アセトンまたはアセトニトリルを含む溶解緩衝
液に溶かし、 ２Ｂ） 得られた溶液をカラムに加え、 ２Ｃ） 該カラムを溶解緩衝液で洗浄し、 ２Ｄ） 精製しようとするインシュリンを、双性イオン
を含み、場合によってｐＨを精製しようとするインシュ
リンの等電点付近に調整した、緩衝溶出液で溶出する。
【０００８】驚くべきことに、本方法の工程２Ａの溶解
緩衝液にアセトンまたはアセトニトリルが存在すること
によって、インシュリンからのプロテアーゼまたはＡ９
位アセチル化インシュリンの分離が顕著に改善され、し
たがって、プロタミン含有インシュリン製剤について述
べたような問題はもはや起こり得ない。
緩衝液にアセトンまたはアセトニトリルが存在すること
によって、インシュリンからのプロテアーゼまたはＡ９
位アセチル化インシュリンの分離が顕著に改善され、し
たがって、プロタミン含有インシュリン製剤について述
べたような問題はもはや起こり得ない。
【０００９】プロテアーゼおよび／またはＡ９位アセチ
ル化インシュリン並びにインシュリンから成る、精製す
べき混合物は、多数の酵素的な過程、例えばプレプロイ
ンシュリン（preproinsulins)のプレシーケンス(pre-se
quences)および／またはプロシーケンス(prosequences)
の蛋白分解反応による除去、インシュリンのＣ末端もし
くはＮ末端アミノ酸の除去またはブタインシュリンをヒ
トインシュリンもしくはヒトインシュリン誘導体とする
ペプチド転移反応から生じる。さらに、精製すべき混合
物に含まれるＡ９位アセチル化インシュリンは、遺伝子
工学の手法によって発現させた多数のインシュリン構成
物から生じる。
ル化インシュリン並びにインシュリンから成る、精製す
べき混合物は、多数の酵素的な過程、例えばプレプロイ
ンシュリン（preproinsulins)のプレシーケンス(pre-se
quences)および／またはプロシーケンス(prosequences)
の蛋白分解反応による除去、インシュリンのＣ末端もし
くはＮ末端アミノ酸の除去またはブタインシュリンをヒ
トインシュリンもしくはヒトインシュリン誘導体とする
ペプチド転移反応から生じる。さらに、精製すべき混合
物に含まれるＡ９位アセチル化インシュリンは、遺伝子
工学の手法によって発現させた多数のインシュリン構成
物から生じる。
【００１０】本方法において分離除去できるプロテアー
ゼは、例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、
カルボキシペプチダーゼＡ、クロストリパイン（clostr
ipain)またはアクロモバクター(achromobacter)プロテ
アーゼである。 好ましいものはトリプシンである。
ゼは、例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、
カルボキシペプチダーゼＡ、クロストリパイン（clostr
ipain)またはアクロモバクター(achromobacter)プロテ
アーゼである。 好ましいものはトリプシンである。
【００１１】本出願においては、以下の化合物がインシ
ュリンと見做される。すなわち動物もしくはヒト由来イ
ンシュリン（例えばヒトインシュリンまたはブタインシ
ュリン）、インシュリン前駆体（例えばプロインシュリ
ンまたはプレプロインシュリン）、または遺伝的に改変
された微生物によって発現された組み換えインシュリン
もしくはインシュリン誘導体である。さらに、インシュ
リン誘導体では、例えば化学的または酵素的な誘導反応
によって調製されたもの（例：ｄｅｓ−Ｐｈｅ−Ｂ１−
インシュリン、インシュリン−β−ケテンスルホネー
ト、ジアルギニンインシュリン(Ｂ３１, Ｂ３２)、モノ
アルギニンインシュリン、ジフェニルアラニンインシュ
リン(Ｂ３１, Ｂ３２)（米国特許第４,６０１,８５２
号)またはＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒトイン
シュリン（欧州特許出願公告公報第３６８,１８７号)も
用いられる。
ュリンと見做される。すなわち動物もしくはヒト由来イ
ンシュリン（例えばヒトインシュリンまたはブタインシ
ュリン）、インシュリン前駆体（例えばプロインシュリ
ンまたはプレプロインシュリン）、または遺伝的に改変
された微生物によって発現された組み換えインシュリン
もしくはインシュリン誘導体である。さらに、インシュ
リン誘導体では、例えば化学的または酵素的な誘導反応
によって調製されたもの（例：ｄｅｓ−Ｐｈｅ−Ｂ１−
インシュリン、インシュリン−β−ケテンスルホネー
ト、ジアルギニンインシュリン(Ｂ３１, Ｂ３２)、モノ
アルギニンインシュリン、ジフェニルアラニンインシュ
リン(Ｂ３１, Ｂ３２)（米国特許第４,６０１,８５２
号)またはＧｌｙA21−ＡｒｇB31−ＡｒｇB32−ヒトイン
シュリン（欧州特許出願公告公報第３６８,１８７号)も
用いられる。
【００１２】本発明の方法では、下記式Ｉのインシュリ
ンが好ましくは用いられる：
ンが好ましくは用いられる：
【化２】 （式中；Ｒ30は、遺伝的にコード可能なＬ−アミノ酸残
基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、炭素数が５０までの
塩基性特性を有する有機性の基、その末端カルボキシル
基（それが存在する場合は）がフリーの状態で、エステ
ル官能基として、アミド官能基として、ラクトンとして
またはＣＨ2ＯＨに還元されて存在する遺伝的にコード
可能なＬ−アミノ酸であり、ｎは、０から１０までの整
数であり、Ｙは、水素またはＬ−フェニルアラニンであ
り、Ｚは、遺伝的にコード可能なＬ−アミノ酸であり、
ＡおよびＢ鎖は動物またはヒトインシュリンのシーケン
スを有する）。
基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、炭素数が５０までの
塩基性特性を有する有機性の基、その末端カルボキシル
基（それが存在する場合は）がフリーの状態で、エステ
ル官能基として、アミド官能基として、ラクトンとして
またはＣＨ2ＯＨに還元されて存在する遺伝的にコード
可能なＬ−アミノ酸であり、ｎは、０から１０までの整
数であり、Ｙは、水素またはＬ−フェニルアラニンであ
り、Ｚは、遺伝的にコード可能なＬ−アミノ酸であり、
ＡおよびＢ鎖は動物またはヒトインシュリンのシーケン
スを有する）。
【００１３】好ましく用いられるインシュリンは式Ｉを
有するもので、式中、Ｒ30は、Ｌ−アラニンまたはＬ−
スレオニンであり、Ｘは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン
またはＬ−フェニルアラニンから成る群からの一つまた
は二つ以上のＬ−アミノ酸であり、Ｚは、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸で、Ａ１からＡ
２０まで、またはＢ２からＢ２９までは、ヒトインシュ
リン、ブタインシュリンまたはウシインシュリンのアミ
ノ酸シーケンスである。
有するもので、式中、Ｒ30は、Ｌ−アラニンまたはＬ−
スレオニンであり、Ｘは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン
またはＬ−フェニルアラニンから成る群からの一つまた
は二つ以上のＬ−アミノ酸であり、Ｚは、Ｌ−グリシ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
アスパラギン酸またはＬ−グルタミン酸で、Ａ１からＡ
２０まで、またはＢ２からＢ２９までは、ヒトインシュ
リン、ブタインシュリンまたはウシインシュリンのアミ
ノ酸シーケンスである。
【００１４】Ａ１からＡ２０までのヒトインシュリンの
アミノ酸配列は： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Le
u Tyr Gln Leu Glu AsnTyr Cys （配列番号(SEQ ID N
o)：１） Ｂ１からＢ２９までのヒトインシュリンのアミノ酸配列
は： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gl
u Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe T
yr Thr Pro Lys （配列番号：２）
アミノ酸配列は： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Le
u Tyr Gln Leu Glu AsnTyr Cys （配列番号(SEQ ID N
o)：１） Ｂ１からＢ２９までのヒトインシュリンのアミノ酸配列
は： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gl
u Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe T
yr Thr Pro Lys （配列番号：２）
【００１５】さらに、上記のクロマトグラフィー過程の
工程２Ａから２Ｄは、インシュリン及びＡ９位アセチル
化インシュリンを含むインシュリン混合物だけでなく、
インシュリン、Ａ９位アセチル化インシュリンおよびプ
ロテアーゼを含むインシュリン混合物からインシュリン
を得るために、工程１Ａおよび１Ｂを除いてもそれらだ
けで真に適切な方法であることが分かった。
工程２Ａから２Ｄは、インシュリン及びＡ９位アセチル
化インシュリンを含むインシュリン混合物だけでなく、
インシュリン、Ａ９位アセチル化インシュリンおよびプ
ロテアーゼを含むインシュリン混合物からインシュリン
を得るために、工程１Ａおよび１Ｂを除いてもそれらだ
けで真に適切な方法であることが分かった。
【００１６】Ａ９位でアセチル化されていて、さらに本
発明の方法で分離除去されるインシュリンは、例えばＡ
９位アセチル化ヒトインシュリン、またはＲ30、Ｘ、
ｎ、ＹおよびＺが上記に限定された通りである式ＩのＡ
９位アセチル化インシュリンである。
発明の方法で分離除去されるインシュリンは、例えばＡ
９位アセチル化ヒトインシュリン、またはＲ30、Ｘ、
ｎ、ＹおよびＺが上記に限定された通りである式ＩのＡ
９位アセチル化インシュリンである。
【００１７】好ましくは、式Ｉのインシュリン誘導体
は、Ａ９位でアセチル化された式Ｉのインシュリンから
分離される。特にＡ９位アセチル化ヒトインシュリンが
ヒトインシュリンから効果的に分離される。
は、Ａ９位でアセチル化された式Ｉのインシュリンから
分離される。特にＡ９位アセチル化ヒトインシュリンが
ヒトインシュリンから効果的に分離される。
【００１８】インシュリンおよびインシュリン誘導体
は、比較的不純物を含む状態でも、予め精製された（例
えばゲルクロマトグラフィーにより）形でもいずれでも
用いることができる。反復結晶化の後およびゲルクロマ
トグラフィーの後でも、適切に選択したｐＨでは互い
に、かつインシュリンとは異なる電荷を有するが、イン
シュリンと複合体を形成する、非常に類似した分子量を
有するインシュリン様の付随物質がなお夾雑している
（米国特許第４,１２９,５６０号）。このような物質
は、例えばデアミドインシュリン、アルギニンインシュ
リンおよびジアルギニンインシュリン並びにインシュリ
ンエチルエステルである。
は、比較的不純物を含む状態でも、予め精製された（例
えばゲルクロマトグラフィーにより）形でもいずれでも
用いることができる。反復結晶化の後およびゲルクロマ
トグラフィーの後でも、適切に選択したｐＨでは互い
に、かつインシュリンとは異なる電荷を有するが、イン
シュリンと複合体を形成する、非常に類似した分子量を
有するインシュリン様の付随物質がなお夾雑している
（米国特許第４,１２９,５６０号）。このような物質
は、例えばデアミドインシュリン、アルギニンインシュ
リンおよびジアルギニンインシュリン並びにインシュリ
ンエチルエステルである。
【００１９】親油性改変シリカゲルとは、シリカゲルに
対して疎水性マトリクスが付加されたものである。疎水
性マトリクスの例は、３から２０、特に８から１８の炭
素原子を有する鎖の長さをもつアルカンである。さら
に、粒子サイズは、例えば５から６０μｍ、特に１０か
ら５０μｍの範囲内で変えることができる。細孔幅も、
好ましくは５０から３００Å、特に１００から２００Å
の範囲内で変えることができる。親油性改変シリカゲル
物質の例は： −(R)Nucleosil（Macherey ＆ Nagel GmbH ＋ Co.KG,Du
eren, ドイツ) ４５μｍまでの種々の粒子サイズ、細孔幅１００Å、Ｃ
８またはＣ１８改変の球形および非球形物質。 −(R)LiChroprep（E. Merck Co., Darmstadt, ドイツ) ４０μｍまでの種々の粒子サイズ、細孔幅６０−２５０
Å、Ｃ８またはＣ１８改変の非球形および球形物質。 −(R)LiChrospher Select B,（E. Merck Co., Darmstad
t, ドイツ) 粒子サイズが２５μｍまでの球形物質、Ｃ８改変。 −(R)Waters Prep,（Millipore GmbH, Eschborn, ドイ
ツ) Ｃ１８改変、５０−１０５μｍ、非球形、細孔幅１００
Å。 −(R)Zorbax Pro１０（DuPont de Nemours (Germany) G
mbH, Bad Homburg, ドイツ) Ｃ８改変、 １０μｍ、球形、細孔幅１００Å。 −(R)Kromasil（EKA Nobel Co., Nobel Industries, ス
ウェーデン) Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８改変、２０μｍまで、球形、細
孔幅１００、１５０または２００Å。
対して疎水性マトリクスが付加されたものである。疎水
性マトリクスの例は、３から２０、特に８から１８の炭
素原子を有する鎖の長さをもつアルカンである。さら
に、粒子サイズは、例えば５から６０μｍ、特に１０か
ら５０μｍの範囲内で変えることができる。細孔幅も、
好ましくは５０から３００Å、特に１００から２００Å
の範囲内で変えることができる。親油性改変シリカゲル
物質の例は： −(R)Nucleosil（Macherey ＆ Nagel GmbH ＋ Co.KG,Du
eren, ドイツ) ４５μｍまでの種々の粒子サイズ、細孔幅１００Å、Ｃ
８またはＣ１８改変の球形および非球形物質。 −(R)LiChroprep（E. Merck Co., Darmstadt, ドイツ) ４０μｍまでの種々の粒子サイズ、細孔幅６０−２５０
Å、Ｃ８またはＣ１８改変の非球形および球形物質。 −(R)LiChrospher Select B,（E. Merck Co., Darmstad
t, ドイツ) 粒子サイズが２５μｍまでの球形物質、Ｃ８改変。 −(R)Waters Prep,（Millipore GmbH, Eschborn, ドイ
ツ) Ｃ１８改変、５０−１０５μｍ、非球形、細孔幅１００
Å。 −(R)Zorbax Pro１０（DuPont de Nemours (Germany) G
mbH, Bad Homburg, ドイツ) Ｃ８改変、 １０μｍ、球形、細孔幅１００Å。 −(R)Kromasil（EKA Nobel Co., Nobel Industries, ス
ウェーデン) Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８改変、２０μｍまで、球形、細
孔幅１００、１５０または２００Å。
【００２０】双性イオンはプロトンを獲得し、またこれ
を失うことができる化合物である。すなわち酸性溶液中
で陽イオンを形成し、アルカリ溶液中で陰イオンを形成
するもので、例えばα−アミノ酸、ベタインまたはベタ
イン誘導体である。好ましい双性イオンはグリシン、グ
ルタミンまたはベタイン（Ｎ−トリメチル−グリシン）
である。グリシンが特に好ましい。
を失うことができる化合物である。すなわち酸性溶液中
で陽イオンを形成し、アルカリ溶液中で陰イオンを形成
するもので、例えばα−アミノ酸、ベタインまたはベタ
イン誘導体である。好ましい双性イオンはグリシン、グ
ルタミンまたはベタイン（Ｎ−トリメチル−グリシン）
である。グリシンが特に好ましい。
【００２１】インシュリンまたはインシュリン誘導体の
等電点（ＩＥＰ）は、溶解したインシュリンの陽イオン
電荷と陰イオン電荷の総和が等しいかまたはゼロとなる
ｐＨである。例えば、ブタインシュリンの等電点は、ｐ
Ｈ５.３から５.４の範囲にある。“等電点付近”という
語は、精製しようとするインシュリンのＩＥＰのおよそ
１ｐＨ単位大きいかまたは小さい範囲内のｐＨ値を指
す。特に好ましいｐＨ値はＩＥＰから上下０.５ｐＨ単
位内にある。
等電点（ＩＥＰ）は、溶解したインシュリンの陽イオン
電荷と陰イオン電荷の総和が等しいかまたはゼロとなる
ｐＨである。例えば、ブタインシュリンの等電点は、ｐ
Ｈ５.３から５.４の範囲にある。“等電点付近”という
語は、精製しようとするインシュリンのＩＥＰのおよそ
１ｐＨ単位大きいかまたは小さい範囲内のｐＨ値を指
す。特に好ましいｐＨ値はＩＥＰから上下０.５ｐＨ単
位内にある。
【００２２】“実際上プロテアーゼを含まないインシュ
リン”という語は、プロテアーゼ活性が０から４ｍＡＵ
／分、好ましくは０.０１から１ｍＡＵ／分、特に０.０
２から０.０８ｍＡＵ／分である、インシュリンおよび
プロテアーゼ混合物を指す。
リン”という語は、プロテアーゼ活性が０から４ｍＡＵ
／分、好ましくは０.０１から１ｍＡＵ／分、特に０.０
２から０.０８ｍＡＵ／分である、インシュリンおよび
プロテアーゼ混合物を指す。
【００２３】プロテアーゼ活性は、基質カルボベンゾキ
シ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリドアセ
テート（Chromozym-Try；発注番号378488 Boehringer M
annheim）から発色団（４−ニトロアニリド）が除去さ
れるキネティクスを求めることにより決定する。除去反
応は、波長４０５ｎｍで６０分にわたって分光光度計で
測定する。このような条件下では、測定される吸収の増
加は、生成物中のトリプシン活性に直接比例する。吸収
線の勾配の単位は１分当たりのミリ吸収（milliabsorpt
ion)単位（ｍＡＵ／分）である。
シ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリドアセ
テート（Chromozym-Try；発注番号378488 Boehringer M
annheim）から発色団（４−ニトロアニリド）が除去さ
れるキネティクスを求めることにより決定する。除去反
応は、波長４０５ｎｍで６０分にわたって分光光度計で
測定する。このような条件下では、測定される吸収の増
加は、生成物中のトリプシン活性に直接比例する。吸収
線の勾配の単位は１分当たりのミリ吸収（milliabsorpt
ion)単位（ｍＡＵ／分）である。
【００２４】“Ａ９位アセチル化インシュリンを実際上
含まないインシュリン”という語は、Ａ９位アセチル化
インシュリンの含有量が０.５％以下、好ましくは０.２
％以下、特に０.１％以下であるインシュリン調製物を
指す。
含まないインシュリン”という語は、Ａ９位アセチル化
インシュリンの含有量が０.５％以下、好ましくは０.２
％以下、特に０.１％以下であるインシュリン調製物を
指す。
【００２５】溶出液は溶出液のｐＨを一定に保つ緩衝物
質を含んでいる。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、リン酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ
土類金属塩（例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム）、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に溶出液は、水に混合できる有機溶媒、例えばアルコー
ル、ケトン、酢酸メチル、ジオキサンまたはアセトニト
リルを含む。ｎ−もしくはｉｓｏ−プロパノール、メタ
ノール、エタノールのようなアルコール類または酢酸メ
チルが好ましい。
質を含んでいる。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、リン酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ
土類金属塩（例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム）、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に溶出液は、水に混合できる有機溶媒、例えばアルコー
ル、ケトン、酢酸メチル、ジオキサンまたはアセトニト
リルを含む。ｎ−もしくはｉｓｏ−プロパノール、メタ
ノール、エタノールのようなアルコール類または酢酸メ
チルが好ましい。
【００２６】第一回目のクロマトグラフィー工程（工程
１Ａおよび１Ｂ）のための水に混和性の有機溶媒の濃度
は１から７０％、好ましくは１０から５０％、特に好ま
しくは１０から３５％である。緩衝物質の濃度は、溶媒
としての水を基準としておよそ１ｍｍｏｌ／ｌから１４
０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ｌから１２０
ｍｍｏｌ／ｌである。双性イオンの濃度は広範囲にわた
って変えることができる。都合のよい量は、溶媒として
の水を基準として１ｍｍｏｌ／ｌから１４０ｍｍｏｌ／
ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌから１１０ｍｍｏｌ／
ｌである。
１Ａおよび１Ｂ）のための水に混和性の有機溶媒の濃度
は１から７０％、好ましくは１０から５０％、特に好ま
しくは１０から３５％である。緩衝物質の濃度は、溶媒
としての水を基準としておよそ１ｍｍｏｌ／ｌから１４
０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ｌから１２０
ｍｍｏｌ／ｌである。双性イオンの濃度は広範囲にわた
って変えることができる。都合のよい量は、溶媒として
の水を基準として１ｍｍｏｌ／ｌから１４０ｍｍｏｌ／
ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌから１１０ｍｍｏｌ／
ｌである。
【００２７】クロマトグラフィーの間の温度は０℃から
５０℃、好ましくは１５から３０℃、特に好ましくは１
５から２０℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は
実質的に一定である。クロマトグラフィーは、種々の圧
力下で実施することができ、例えば５から４００バー
ル、特に２０から１００バールの圧力下で実施すること
ができる。
５０℃、好ましくは１５から３０℃、特に好ましくは１
５から２０℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は
実質的に一定である。クロマトグラフィーは、種々の圧
力下で実施することができ、例えば５から４００バー
ル、特に２０から１００バールの圧力下で実施すること
ができる。
【００２８】カラムへの負荷並びにインシュリンおよび
インシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的手技に従っ
て実施する。精製しようとするインシュリン溶液をカラ
ムに負荷するには、好ましくは水性−アルコール性また
は完全に水性緩衝液で行う。インシュリン溶液はおよそ
１から１０％、好ましくは３％の蛋白濃度を有する。
インシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的手技に従っ
て実施する。精製しようとするインシュリン溶液をカラ
ムに負荷するには、好ましくは水性−アルコール性また
は完全に水性緩衝液で行う。インシュリン溶液はおよそ
１から１０％、好ましくは３％の蛋白濃度を有する。
【００２９】インシュリンの溶出は、 緩衝物質の濃度を
一定にして（isocratically）または該緩衝液中の水に
混合性の溶媒の比率を変えながら、本発明の方法によっ
て実施する。有機溶媒の比率は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出液容積の関数として、特に好ましくは直線関数と
して増加するように変化させる。
一定にして（isocratically）または該緩衝液中の水に
混合性の溶媒の比率を変えながら、本発明の方法によっ
て実施する。有機溶媒の比率は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出液容積の関数として、特に好ましくは直線関数と
して増加するように変化させる。
【００３０】クロマトグラフィーに続く溶出液からのイ
ンシュリンの濃縮は、亜鉛による沈殿または結晶化によ
って実施する。これについては、該溶液は、必要な場合
には予め真空蒸留により溶媒を実質的に含まない状態と
するか、またはその濃度を水で希釈することによって減
少させることができる。いずれの場合でも、上清中の蛋
白濃度を５０ｍｇ／ｌより少なくするために、沈殿また
は結晶化前の溶媒の濃度は１０％以下とすべきである。
生じたインシュリン沈殿物は、デカントすることによ
り、または遠心分離もしくは濾過により分離でき、さら
に乾燥させることができる。
ンシュリンの濃縮は、亜鉛による沈殿または結晶化によ
って実施する。これについては、該溶液は、必要な場合
には予め真空蒸留により溶媒を実質的に含まない状態と
するか、またはその濃度を水で希釈することによって減
少させることができる。いずれの場合でも、上清中の蛋
白濃度を５０ｍｇ／ｌより少なくするために、沈殿また
は結晶化前の溶媒の濃度は１０％以下とすべきである。
生じたインシュリン沈殿物は、デカントすることによ
り、または遠心分離もしくは濾過により分離でき、さら
に乾燥させることができる。
【００３１】第二回目のクロマトグラフィー工程（工程
２Ａから２Ｂ）では、水に混合性の有機溶媒の濃度は１
から９０％、好ましくは１０から６０％、特に好ましく
は１０から３５％である。緩衝物質の濃度は溶媒として
の水を基準にしておよそ１ｍｍｏｌ／ｌから２ｍｏｌ／
ｌ、好ましくは２５ｍｍｏｌ／ｌから１ｍｏｌ／ｌであ
る。双極イオンの濃度は広範囲にわたって変えることが
できる。都合のよい量は溶媒としての水を基準にして１
０ｍｍｏｌ／ｌから１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０ｍｍ
ｏｌ／ｌから５００ｍｍｏｌ／ｌである。
２Ａから２Ｂ）では、水に混合性の有機溶媒の濃度は１
から９０％、好ましくは１０から６０％、特に好ましく
は１０から３５％である。緩衝物質の濃度は溶媒として
の水を基準にしておよそ１ｍｍｏｌ／ｌから２ｍｏｌ／
ｌ、好ましくは２５ｍｍｏｌ／ｌから１ｍｏｌ／ｌであ
る。双極イオンの濃度は広範囲にわたって変えることが
できる。都合のよい量は溶媒としての水を基準にして１
０ｍｍｏｌ／ｌから１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは２０ｍｍ
ｏｌ／ｌから５００ｍｍｏｌ／ｌである。
【００３２】クロマトグラフィー中の温度は０℃から５
０℃、好ましくは１５から３０℃、特に好ましくは１５
から２０℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は実
質的に一定である。クロマトグラフィーは種々の圧力下
で、例えば５から４００バール、特に２０から１００バ
ールの圧力下で実施することができる。カラムへのロー
ディング、クロマトグラフィー並びにインシュリンおよ
びインシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的技術的方
法によって実施できる。精製しようとするインシュリン
および／またはインシュリン誘導体をカラムに負荷する
には、アセトンまたはアセトニトリルを含有する溶解緩
衝液を用いて行う。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、燐酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ土
類金属の塩（例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム）、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に双性イオンも溶解緩衝液に加えることができる。アセ
トンまたはアセトニトリルの濃度は広範囲で変えること
ができる。アセトンまたはアセトニトリルの量は５容積
％から５０容積％が有利であることが分かった。アセト
ニトリルまたはアセトンの量は１０から４０容積％が好
ましく、特に２５から３５容積％が好ましい。溶解緩衝
液のｐＨはおよそｐＨ１から６で、好ましくはｐＨ２か
ら５、特にｐＨ３から４が好ましい。カラムを溶解緩衝
液で１回から５回、好ましくは１回から３回、特に１回
洗浄する。インシュリン溶液の蛋白濃度は１から１０
％、好ましくは３％である。
０℃、好ましくは１５から３０℃、特に好ましくは１５
から２０℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は実
質的に一定である。クロマトグラフィーは種々の圧力下
で、例えば５から４００バール、特に２０から１００バ
ールの圧力下で実施することができる。カラムへのロー
ディング、クロマトグラフィー並びにインシュリンおよ
びインシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的技術的方
法によって実施できる。精製しようとするインシュリン
および／またはインシュリン誘導体をカラムに負荷する
には、アセトンまたはアセトニトリルを含有する溶解緩
衝液を用いて行う。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、燐酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ土
類金属の塩（例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム）、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に双性イオンも溶解緩衝液に加えることができる。アセ
トンまたはアセトニトリルの濃度は広範囲で変えること
ができる。アセトンまたはアセトニトリルの量は５容積
％から５０容積％が有利であることが分かった。アセト
ニトリルまたはアセトンの量は１０から４０容積％が好
ましく、特に２５から３５容積％が好ましい。溶解緩衝
液のｐＨはおよそｐＨ１から６で、好ましくはｐＨ２か
ら５、特にｐＨ３から４が好ましい。カラムを溶解緩衝
液で１回から５回、好ましくは１回から３回、特に１回
洗浄する。インシュリン溶液の蛋白濃度は１から１０
％、好ましくは３％である。
【００３３】本発明の方法ではインシュリンの溶出は、
緩衝物質が一定濃度でさらに水に混合性の有機溶媒が一
定濃度（isocratically）で行うか、または水に混合性
の有機溶媒の緩衝液に対する比率を変えることによって
行う。有機溶媒の比率の変更は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出容積の関数として、特に好ましくは直線関数とし
て増加するように行う。
緩衝物質が一定濃度でさらに水に混合性の有機溶媒が一
定濃度（isocratically）で行うか、または水に混合性
の有機溶媒の緩衝液に対する比率を変えることによって
行う。有機溶媒の比率の変更は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出容積の関数として、特に好ましくは直線関数とし
て増加するように行う。
【００３４】クロマトグラフィーに続く、溶出液からの
インシュリンの分離は、亜鉛を用いた沈殿または結晶化
により行う。これについては、必要な場合には溶出液か
ら、予め真空蒸留によって実質的に溶媒を除去すること
ができ、また水で希釈することによりその濃度を減少さ
せることもできる。いずれの場合でも、上清中の蛋白濃
度を５０ｍｇ／ｌより少なくするために、沈殿または結
晶化の前に溶媒の濃度は１０％以下であるべきである。
生じた純粋なインシュリン沈殿物は、デカント、遠心沈
殿または濾過により分離でき、さらに乾燥させることが
できる。
インシュリンの分離は、亜鉛を用いた沈殿または結晶化
により行う。これについては、必要な場合には溶出液か
ら、予め真空蒸留によって実質的に溶媒を除去すること
ができ、また水で希釈することによりその濃度を減少さ
せることもできる。いずれの場合でも、上清中の蛋白濃
度を５０ｍｇ／ｌより少なくするために、沈殿または結
晶化の前に溶媒の濃度は１０％以下であるべきである。
生じた純粋なインシュリン沈殿物は、デカント、遠心沈
殿または濾過により分離でき、さらに乾燥させることが
できる。
【００３５】本発明の方法は分析用クロマトグラフィー
のためだけでなく、調製用クロマトグラフィー、特に本
発明の方法が調製用ＨＰＬＣ装置で実施される場合にも
適切である。“調製用クロマトグラフィー”という語
は、単なる分析だけでなく純粋な生成物を得る目的の精
製方法を指す。純粋な生成物の量は狭い範囲に限定され
ず、例えば１ｍｇから５０ｋｇ、好ましくは５０ｍｇか
ら１５ｋｇの範囲で変えることができる。
のためだけでなく、調製用クロマトグラフィー、特に本
発明の方法が調製用ＨＰＬＣ装置で実施される場合にも
適切である。“調製用クロマトグラフィー”という語
は、単なる分析だけでなく純粋な生成物を得る目的の精
製方法を指す。純粋な生成物の量は狭い範囲に限定され
ず、例えば１ｍｇから５０ｋｇ、好ましくは５０ｍｇか
ら１５ｋｇの範囲で変えることができる。
【００３６】
【実施例】本発明の方法を以下の実施例で詳細に説明す
る。特にことわらない限り、百分率は重量％である。実施例１ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５ ５％プロパノール 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５ １：１の水／ｎ−プロパノール 吸着剤：(R)Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００
Å カラム寸法：２ｃｍ×２５ｃｍ 遺伝子工学的に調製し、２.５％のアセチル化ヒトイン
シュリンを含む粗ヒトインシュリンの０.５ｇを２５ｍ
ｌの溶解緩衝液（０.１Ｍ グリシン、０.１ＭＮａＣ
ｌ、アセトン３２重量％含有、ｐＨ３.５）に溶かした
溶液をカラムに負荷した。カラムにヒトインシュリン溶
液を負荷した後、カラム容積量の溶解緩衝液で洗浄し
た。流速９ｍｌ／分で、プロパノール濃度を１４％から
２５％に上昇させながら、個々の蛋白成分を９０分以内
で別々に溶出させた。結晶化または沈殿させ、さらに乾
燥させた後、９８％より高い純度で、用いたインシュリ
ンを基にした収量８６.２％で、ヒトインシュリンを主
分画として得た。Ａ９位アセチル化ヒトインシュリンの
濃度の測定は以下の通りに行った。分析には、(R)Nucle
osil Ｃ１８，１２０Å，５μｍを充填した４ｍｍ×２
５０ｍｍのＨＰＬＣカラム（Machery ＆ Co., Dueren)
を用いた。 緩衝液Ａ：３５ｍＭリン酸ナトリウム ３００ｍＭ塩化ナトリウム ２５％アセトニトリル ７５％水 ｐＨ３.０ 緩衝液Ｂ：３５ｍＭリン酸ナトリウム ５０ｍＭ塩化ナトリウム ６５％アセトニトリル ３５％水 ｐＨ３.０ カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分、２５分以内の緩衝
液Ｂの１２％から２１％の勾配で、アセチル化誘導体
が、ヒトインシュリンピークの後保持時間６分の差異で
カラムから溶出した。この分析方法を用いて、インシュ
リン誘導体を、非常に満足のいく程度までヒトインシュ
リンから分離、同定さらに定量できる。精製後、Ａ９位
アセチル化ヒトインシュリンの濃度は０.１％より少な
かった。
る。特にことわらない限り、百分率は重量％である。実施例１ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５ ５％プロパノール 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５ １：１の水／ｎ−プロパノール 吸着剤：(R)Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００
Å カラム寸法：２ｃｍ×２５ｃｍ 遺伝子工学的に調製し、２.５％のアセチル化ヒトイン
シュリンを含む粗ヒトインシュリンの０.５ｇを２５ｍ
ｌの溶解緩衝液（０.１Ｍ グリシン、０.１ＭＮａＣ
ｌ、アセトン３２重量％含有、ｐＨ３.５）に溶かした
溶液をカラムに負荷した。カラムにヒトインシュリン溶
液を負荷した後、カラム容積量の溶解緩衝液で洗浄し
た。流速９ｍｌ／分で、プロパノール濃度を１４％から
２５％に上昇させながら、個々の蛋白成分を９０分以内
で別々に溶出させた。結晶化または沈殿させ、さらに乾
燥させた後、９８％より高い純度で、用いたインシュリ
ンを基にした収量８６.２％で、ヒトインシュリンを主
分画として得た。Ａ９位アセチル化ヒトインシュリンの
濃度の測定は以下の通りに行った。分析には、(R)Nucle
osil Ｃ１８，１２０Å，５μｍを充填した４ｍｍ×２
５０ｍｍのＨＰＬＣカラム（Machery ＆ Co., Dueren)
を用いた。 緩衝液Ａ：３５ｍＭリン酸ナトリウム ３００ｍＭ塩化ナトリウム ２５％アセトニトリル ７５％水 ｐＨ３.０ 緩衝液Ｂ：３５ｍＭリン酸ナトリウム ５０ｍＭ塩化ナトリウム ６５％アセトニトリル ３５％水 ｐＨ３.０ カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分、２５分以内の緩衝
液Ｂの１２％から２１％の勾配で、アセチル化誘導体
が、ヒトインシュリンピークの後保持時間６分の差異で
カラムから溶出した。この分析方法を用いて、インシュ
リン誘導体を、非常に満足のいく程度までヒトインシュ
リンから分離、同定さらに定量できる。精製後、Ａ９位
アセチル化ヒトインシュリンの濃度は０.１％より少な
かった。
【００３７】実施例２ 次の比較実験では、溶解緩衝液は０.１Ｍグリシン／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ２.８）のみを含むという点を除き、クロマ
トグラフィーは実施例１の通りに行った。収量：５８％
（９８％より高い純度）。Ａ９位アセチル化ヒトインシ
ュリンの濃度は０.２％であった。
Ｃｌ（ｐＨ２.８）のみを含むという点を除き、クロマ
トグラフィーは実施例１の通りに行った。収量：５８％
（９８％より高い純度）。Ａ９位アセチル化ヒトインシ
ュリンの濃度は０.２％であった。
【００３８】実施例３ 緩衝液Ａ：０.１５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１５Ｍグリ
シン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、５％ｎ
−プロパノール 緩衝液Ｂ：０.１５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１５Ｍグリ
シン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１：１
の水／ｎ−プロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００Å(E
KA Nobel社製) カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ トリプシンを用いたブタインシュリンのトランスアミデ
ーション反応からの反応混合物の１０ｇを２００ｍｌの
グリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２.８）に溶かした溶液
をカラムに負荷した。トリプシン活性は１００００ｍＡ
Ｕ／分より高かった。流速４０ｍｌ／分でプロパノール
濃度を１４から３０％に上昇させながら、個々の蛋白成
分を１２０分以内で溶出させた。結晶化または沈殿さ
せ、さらに乾燥させた後、ヒトインシュリン−Ｂ３０ジ
−ｔｅｒｔ−ブチルスレオニンエステル／エーテルが、
９７％より高い純度で、用いたインシュリンを基にした
場合９３％の収量で、主分画として得られた。プロテア
ーゼ活性の測定は以下の通りに行った。この試験では、
基質カルボベンゾキシ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−
ニトロアニリドアセテート（Chromozym-Try; 発注番号3
78488 Boehringer Mannheim)からの発色団の除去キネテ
ィクスを求めた。 除去反応の進行は、分光光度計で波長
４０５ｎｍで６０分に亙って測定した。このような条件
下では、測定される吸収増加は、生成物中のトリプシン
活性に直接比例する。吸収線の勾配を求め（単位：ミリ
吸収単位（milliabsorption units)／分（ｍＡＵ／
分））、これをプロテアーゼ濃度の測定値そのものとし
た。試験は以下のように行った。７.５ｍｇのヒトイン
シュリンを、撹拌しながら３０分以内で１ｍｌの溶解緩
衝液に溶かした。 溶解緩衝液：２００ｍＭ ＴＲＩＳ，ｐＨ８.０，１ｍＭ
ＥＤＴＡ 基質Chromozymを１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶かした。
反応は、２００μｌの基質溶液を１ｍｌのサンプル溶液
に３７℃で添加して開始した。その後直ちに４０５ｎｍ
で分光光度計で測定した。この波長における反応溶液の
吸収を６０分間連続的に記録した。トリプシン活性の確
認のために、吸収線の勾配を求めた。測定されたトリプ
シン活性は２５０ｍＡＵ／分であった。
シン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、５％ｎ
−プロパノール 緩衝液Ｂ：０.１５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１５Ｍグリ
シン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１：１
の水／ｎ−プロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００Å(E
KA Nobel社製) カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ トリプシンを用いたブタインシュリンのトランスアミデ
ーション反応からの反応混合物の１０ｇを２００ｍｌの
グリシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２.８）に溶かした溶液
をカラムに負荷した。トリプシン活性は１００００ｍＡ
Ｕ／分より高かった。流速４０ｍｌ／分でプロパノール
濃度を１４から３０％に上昇させながら、個々の蛋白成
分を１２０分以内で溶出させた。結晶化または沈殿さ
せ、さらに乾燥させた後、ヒトインシュリン−Ｂ３０ジ
−ｔｅｒｔ−ブチルスレオニンエステル／エーテルが、
９７％より高い純度で、用いたインシュリンを基にした
場合９３％の収量で、主分画として得られた。プロテア
ーゼ活性の測定は以下の通りに行った。この試験では、
基質カルボベンゾキシ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−
ニトロアニリドアセテート（Chromozym-Try; 発注番号3
78488 Boehringer Mannheim)からの発色団の除去キネテ
ィクスを求めた。 除去反応の進行は、分光光度計で波長
４０５ｎｍで６０分に亙って測定した。このような条件
下では、測定される吸収増加は、生成物中のトリプシン
活性に直接比例する。吸収線の勾配を求め（単位：ミリ
吸収単位（milliabsorption units)／分（ｍＡＵ／
分））、これをプロテアーゼ濃度の測定値そのものとし
た。試験は以下のように行った。７.５ｍｇのヒトイン
シュリンを、撹拌しながら３０分以内で１ｍｌの溶解緩
衝液に溶かした。 溶解緩衝液：２００ｍＭ ＴＲＩＳ，ｐＨ８.０，１ｍＭ
ＥＤＴＡ 基質Chromozymを１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶かした。
反応は、２００μｌの基質溶液を１ｍｌのサンプル溶液
に３７℃で添加して開始した。その後直ちに４０５ｎｍ
で分光光度計で測定した。この波長における反応溶液の
吸収を６０分間連続的に記録した。トリプシン活性の確
認のために、吸収線の勾配を求めた。測定されたトリプ
シン活性は２５０ｍＡＵ／分であった。
【００３９】実施例４ 条件を以下の通りに変えた他は、実施例３に記載したよ
うにクロマトグラフィーを実施した。 ０.１Ｍグリシン、０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、 カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ ５から１０ｍＡＵ／分のトリプシン活性が測定された。
うにクロマトグラフィーを実施した。 ０.１Ｍグリシン、０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、 カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ ５から１０ｍＡＵ／分のトリプシン活性が測定された。
【００４０】実施例５ カラム寸法を３０ｃｍ×３０ｃｍに変えた他は、実施例
４に記載した通りにクロマトグラフィーを行った。２０
から２５ｍＡＵ／分のトリプシン活性が測定された。
４に記載した通りにクロマトグラフィーを行った。２０
から２５ｍＡＵ／分のトリプシン活性が測定された。
【００４１】実施例６ 緩衝液Ａ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、５％プロパノ
ール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１：１の水／
ｎ−プロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００Å
（EKA Nobel社製） カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ 蛋白含有量７９％のヒトインシュリン−Ｂ３０ジ−ｔｅ
ｒｔ−ブチルスレオニンエステル／エーテルをトリフル
オロ酢酸で切断して得た反応混合物１０ｇの溶液を、実
施例４に記載したようにカラムで精製した。続いて実施
例３のように沈殿を行い、インシュリン含有分画を濃縮
した。その後沈殿を、０.１Ｍグリシン、０.１ＭＮａＣ
ｌおよび３２容積％のアセトン（ｐＨ３.５）の混合物
２００ｍｌに溶かし、この溶液をカラムに負荷した。こ
のヒトインシュリン溶液をカラムに負荷した後、カラム
容積量の溶解緩衝液で洗浄した。続いて緩衝液Ｂの１７
％から１９％の勾配により４５分以内で溶出を行った。
他の条件は全て実施例４と同一であった。トリプシン活
性は、０.０５ｍＡＵ／分より低かった。
ン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、５％プロパノ
ール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン ０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１：１の水／
ｎ−プロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８，１３μｍ，細孔幅１００Å
（EKA Nobel社製） カラム寸法：６ｃｍ×２５ｃｍ 蛋白含有量７９％のヒトインシュリン−Ｂ３０ジ−ｔｅ
ｒｔ−ブチルスレオニンエステル／エーテルをトリフル
オロ酢酸で切断して得た反応混合物１０ｇの溶液を、実
施例４に記載したようにカラムで精製した。続いて実施
例３のように沈殿を行い、インシュリン含有分画を濃縮
した。その後沈殿を、０.１Ｍグリシン、０.１ＭＮａＣ
ｌおよび３２容積％のアセトン（ｐＨ３.５）の混合物
２００ｍｌに溶かし、この溶液をカラムに負荷した。こ
のヒトインシュリン溶液をカラムに負荷した後、カラム
容積量の溶解緩衝液で洗浄した。続いて緩衝液Ｂの１７
％から１９％の勾配により４５分以内で溶出を行った。
他の条件は全て実施例４と同一であった。トリプシン活
性は、０.０５ｍＡＵ／分より低かった。
【００４２】実施例７ 実施例６のようにクロマトグラフィーを行った。カラム
寸法は３０ｃｍ×３０ｃｍであった。トリプシン活性は
０.０５ｍＡＵ／分より低かった。
寸法は３０ｃｍ×３０ｃｍであった。トリプシン活性は
０.０５ｍＡＵ／分より低かった。
【００４３】
シーケンスプロトコール 配列番号(SEQ ID NO)：１ 配列の型：アミノ酸（ＡＡ） 配列の大きさ：２０ＡＡ Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn 1 5 10 15 Tyr Cys 20
【００４４】配列番号：２ 配列の種類：ＡＡ 配列の大きさ：２９ＡＡ Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:26 (72)発明者 クラウデイア・グレーフエ ドイツ連邦共和国デー−6240ケーニヒシユ タイン・アム・タウヌス．ホイホールヴエ ーク４
Claims (9)
- 【請求項１】 １Ａ） プロテアーゼおよび／またはＡ
９位アセチル化インシュリン並びにインシュリンの混合
物を緩衝液に溶かし、 １Ｂ） 双性イオンを含み、場合によってはｐＨを精製
しようとするインシュリンの等電点付近に調整した緩衝
溶出液で溶出を行い、得られたインシュリン分画を必要
に応じて濃縮し、続いて該インシュリン分画を、 ２Ａ） アセトンまたはアセトニトリルを含む溶解緩衝
液に溶かし、 ２Ｂ） 得られた溶液をカラムに加え、 ２Ｃ） 該カラムを溶解緩衝液で洗浄し、 ２Ｄ） 双性イオンを含み、場合によってｐＨを精製し
ようとするインシュリンの等電点付近に調整した緩衝溶
出液で、精製しようとするインシュリンを溶出させる、
水に混和性の有機溶媒を含む水性、緩衝性溶出液で、親
油性に改変したシリカゲル上でクロマトグラフィーを行
うことによって、実質的にプロテアーゼおよび／または
Ａ９位でアセチル化されたインシュリンを含まないイン
シュリンを得る方法。 - 【請求項２】 インシュリン、プロテアーゼおよびＡ９
位アセチル化インシュリンを含む混合物、またはインシ
ュリンおよびＡ９位アセチル化インシュリンを含む混合
物から、実質的にＡ９位アセチル化インシュリンを含ま
ないインシュリンを得るために、工程２Ａから２Ｄを用
いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 溶解緩衝液が５から５０容積％、特に１
０から４０容積％のアセトンを含む、請求項１または２
に記載の方法。 - 【請求項４】 溶解緩衝液のｐＨが２から５、特に３か
ら４である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 次の式Ｉ 【化１】 （式中Ｒ30は、遺伝的にコード可能なＬ−アミノ酸残基
であり、Ｘは、ヒドロキシル基、炭素原子数が５０まで
の塩基的特性をもつ生理学的に許容できる有機性の基、
そのカルボキシル末端（それが存在する場合には）がフ
リーの状態で、エステル官能基として、アミド官能基と
して、ラクトンとして、またはＣＨ2ＯＨに還元されて
存在する、遺伝的にコード可能なＬ−アミノ酸であり、
ｎは、０から１０までの整数であり、Ｙは、水素または
Ｌ−フェニルアラニンであり、Ｚは、遺伝的にコード可
能なＬ−アミノ酸であり、ＡおよびＢ鎖は動物またはヒ
トのインシュリンシーケンスを有する）のインシュリン
が得られる、請求項１から４の一つまたは二つ以上に記
載の方法。 - 【請求項６】 Ｒ30がＬ−アラニンまたはＬ−スレオニ
ンで、ＸがＬ−アルギニン、Ｌ−リジンまたはＬ−フェ
ニルアラニンから成る群からの一つまたは二つ以上のＬ
−アミノ酸で、ＺがＬ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−
セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ
−グルタミン酸で、さらにＡ１からＡ２０までまたはＢ
２からＢ２９までがヒトインシュリン、ブタインシュリ
ンまたはウシインシュリンのシーケンスである、式Ｉの
インシュリン誘導体が得られる、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 ヒトインシュリンが得られる、請求項１
〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 除去されるプロテアーゼがトリプシンで
ある、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 調製用高圧液体クロマトグラフィー装置
を用いる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
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