JPH05310592A - 創傷治療剤及び医薬製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ヒト細胞性フィブロネクチンを含有すること
を特徴とする製剤を提供する。 【構成】 ヒト細胞性フィブロネクチンは細胞株ＨＵＨ
−６ＹＭを用いて、増殖因子としてタンパク性因子を必
要とすることなく、大量に生産されるので、異種タンパ
ク質やウイルスの混入のないヒト細胞性フィブロネクチ
ン製剤が製造できる。このヒト細胞性フィブロネクチン
は角膜治療剤、創傷治癒促進剤などとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、肝芽腫由来変異株ＨＵ
Ｈ−６ＹＭ（微工研菌寄第１２８９０号）より生産され
るヒト細胞性フィブロネクチンを有効成分として、含有
することを特徴とする創傷治療剤及びその医薬製剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】近年、ステロイド剤、抗生物
質などの新しい創傷治療剤が次々と出現してきている
が、これらは場合により創傷治癒遅延を生じたり、ある
いは欠損部に再生した上皮細胞が正常でない等の副作用
を示すものがあった。

【０００３】一般にフィブロネクチンは、最初はｃｏｌ
ｄ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎとして血漿
中に見い出された糖タンパク質で、細胞間の接着、移
動、癌化、創傷治癒など多様な生理活性を有することが
知られている。その種類としては、血漿中に存在する血
漿性フィブロネクチンと主に線維芽細胞が産生し組織中
に存在する細胞性フィブロネクチンの２種類が知られて
いる。

【０００４】現在、フィブロネクチンは、角膜治療剤、
創傷治癒促進剤等の創傷治療剤及び化粧料として開発さ
れつつあるが、細胞性フィブロネクチンの大量生産法が
確立されていなかったために、血漿性フィブロネクチン
だけが用いられてきた。

【０００５】しかし、血液より得られる血漿性フィブロ
ネクチンを大量に調製するためには、その原料の確保及
び均一性、さらにその精製品に対する原料由来の不純
物、例えば、ウイルス等の混入などの問題があり、副作
用等のない優れた薬理作用を示すフィブロネクチンが望
まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、副作用
のない優れた薬理作用を示すフィブロネクチンについて
鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−
６ＹＭ（微工研菌寄第１２８９０号）より生産され、単
離されたヒト細胞性フィブロネクチンが副作用が少なく
かつ優れた薬理作用、例えば、細胞遊走活性及び角膜上
皮欠損治療促進作用等の従来のフィブロネクチンの持つ
薬理作用を有しかつ従来のものより優れた薬理作用を持
つことを見い出し本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明は、ヒト肝芽腫由来変異株Ｈ
ＵＨ−６ＹＭ（微工研菌寄第１２８９０号）より生産さ
れ単離されたヒト細胞性フィブロネクチンを有効成分と
することを特徴とする創傷治療剤及びその医薬製剤に関
する。本発明の創傷治療剤は、例えば細胞遊走活性及び
角膜上皮欠損治療促進作用等の従来のフィブロネクチン
が示すような薬理活性を示し、かつその活性が強く、し
かも副作用が弱い特徴を有している。

【０００８】従って、本発明の創傷治療剤は、例えばす
り傷、切り傷、火傷、熱傷、凍傷、皮膚腫瘍、皮膚乾
燥、皮膚角化症、ひび切れ、あか切れ、皮膚炎、水虫の
ただれ、手術傷、角膜創傷等のほか、痔瘻、褥創等も含
めた各種の創傷の治療剤として、又にきび、歯槽膿漏、
日焼け等の炎症治療剤が包含される。

【０００９】本発明の創傷治療剤は、細胞株ＨＵＨ−６
ＹＭより産生されるヒト細胞性フィブロネクチンとこれ
を有効成分として前述した各種の医薬用途に有効な医薬
製剤とすることができる。該医薬製剤は、通常ヒト細胞
性フィブロネクチン及び安定化剤と共に適当な医薬製剤
担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。

【００１０】該製剤担体としては使用形態に応じた製剤
を調製するのに通常慣用される充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈
剤をいずれも使用できる。

【００１１】製剤組成物形態は、これがヒト細胞性フィ
ブロネクチン及び安定化剤を効果的に含有する状態であ
れば、特に限定は無く、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、
丸剤等の固剤であってもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳
剤等の注射剤形態とするのが好適である。またこれは使
用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品
とするのが好ましく、特に凍結乾燥製剤とするのが好ま
しい。これらはいずれも常法に従い調製できる。

【００１２】上記薬理組成物は配合する安定化剤として
は特に限定はなく、通常の蛋白の安定化剤を使用でき、
例えばアルブミン、アミノ酸、糖類、界面活性剤等が例
示できる。

【００１３】安定化剤としてより具体的には、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミン類、グリシン、ア
ラニン、バリン、システイン等の通常のＬ−型アミノ
酸、グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の
単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリクール等
の糖アルコール類、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖
類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多
糖類、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル
系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリ
ド系等の界面活性剤等が例示できるが、これらに限定さ
れるものではない。

【００１４】これらは一種単独でも二種以上混合しても
用いることができ、アルブミン類と糖類の混合が好まし
い。より好ましくはヒト血清アルブミンとショ糖の組み
合わせが好ましい。

【００１５】これらの添加量は特に制限されるものでは
ないが、ヒト細胞性フィブロネクチン１ｍｇ当たり各々
別個にアルブミン類では約０．０１ｍｇ程度以上、好ま
しくは約０．１〜１００ｍｇ程度の範囲、糖類では約
０．１ｍｇ程度以上、好ましくは約１ｍｇ〜１０００ｍ
ｇ程度の範囲、界面活性剤は約０．０００１ｍｇ程度以
上、好ましくは約０．００１ｍｇ〜０．１ｍｇ程度の範
囲で添加されるのが適当である。

【００１６】尚、上記においては担体として採用し得る
緩衝液としては、特に限定されるものではないが、例え
ば、クエン酸−リン酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸
ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウ
ム−リン酸−ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４
〜８、より好ましくはｐＨ６〜８の各緩衝液を例示する
ことができる。

【００１７】かくして得られる創傷治療剤の投与量は、
該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、これを適用さ
れる患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではない
が、一般には有効成分０．００００１〜１０重量％程度
含有する製剤形態に調製される。例えば、点眼剤の場合
には１０μｇ／ｍｌ程度〜１０ｍｇ／ｍｌ程度、溶液剤
の場合には１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ程度、軟
膏の場合には１０μｇ／ｇ程度〜１００ｍｇ／ｇ程度に
調製されるが、これらに限定されるものではない。

【００１８】ヒト細胞性フィブロネクチンを有効成分と
する医薬製剤の特に好ましい具体例としては下記内容の
凍結乾燥製剤を例示することができる。当該凍結乾燥製
剤の各成分の配合量としては、通常 ヒト細胞性フィブロネクチン ０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ ヒト血清アルブミン ０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ ショ糖 ５〜１００ｍｇ／ｍｌ リン酸バッファー ０．０１〜０．５Ｍ ｐＨ ６〜８ となる範囲に含まれるものが、特に安定性、溶解性、保
存性等の点で優れている。 これらの製剤はこれに含有
される有効成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜約
６０ｇ程度となる範囲で投与するのが望ましい。該投与
は１日１回である必要はなく１日３〜６回に分けること
もできる。より具体的には点眼剤として１日３〜６回、
１回当たり約１０μｌ〜約２００μｌを点眼したり、外
用剤として１日１〜６回、１回当たり約１００ｍｇ〜約
１０ｇを塗布できる。

【００１９】上記各種形態の医薬製剤は、その形態に応
じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は静
脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、液剤
形態の医薬製剤は点眼剤、点鼻剤として目又は鼻腔内へ
局所投与することもできる。

【００２０】本発明治療剤の有効成分であるヒト細胞性
フィブロネクチンは新規物質であり、例えば、伊東等が
開発した方法で製造できる。伊東等はヒト肝芽腫から分
離されたＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５（Ｊａｐａｎｅｓｅ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
Ｂａｎｋ，細胞番号ＪＣＲＢ０４０１）からクローニ
ングを繰り返し、検討を行ったところ、タンパク質無添
加培地で培養が可能で、且つ限界なく継代培養できるヒ
ト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−６ＹＭ（以下、細胞株ＨＵ
Ｈ−６ＹＭという。）を見いだし、これを株化細胞とし
て確立した。

【００２１】本株化細胞はＨＵＨ−６ＹＭとして、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２８９０で微工研に寄託されている。

【００２２】ＨＵＨ−６ＹＭの生物学的性質をまとめる
と以下の通りである。 ヒト肝芽腫由来細胞株ＨＵＨ−６ｃｌｏｎｅ５由来の
変異株である。 アミノ酸、ビタミン類、糖類及び無機塩類から成る基
礎培地で増殖し、限界なく継代培養が可能である。すな
わち増殖因子としてタンパク性因子を必要としない細胞
株である。 ヒト細胞性フィブロネクチンを著量産生する。

【００２３】次に細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを培養し、ヒト
細胞性フィブロネクチンを製造する方法について説明す
る。

【００２４】細胞株ＨＵＨ−６ＹＭの培養は、種培養と
してシャーレで培養する。継代を繰り返し、次の連続培
養で必要な細胞数を確保する。使用する培地としては、
市販されているｅ−ＲＤＦ培地が適しているが、これに
限定されるものではなく、その成分に準じて調製される
培地はどのようなものでも使用可能である。また添加成
分としては、タンパク性因子は特に必要ないが、細胞に
悪影響を与えない限り、添加されていてもかまわない。

【００２５】培養条件は、特に規定されるものではない
が、培養温度は３６〜３７℃で、気相条件は、シャーレ
等による種培養において５％程度のＣＯ₂を含有する空
気が適当である。しかし、連続培養においては特にＣＯ
₂等を調製した空気の必要はない。

【００２６】連続培養の方法は、特に限定されるもので
はないが、一般的な方法であるローラーボトルを用いた
方法で行うことが可能である。この場合、そのローラー
ボトル内の細胞数に応じて培地の交換を適切な時期に行
っていくものである。

【００２７】このような方法で得られた細胞株ＨＵＨ−
６ＹＭの培養上清が、次の精製の原料となる。

【００２８】細胞性フィブロネクチンの精製には、一般
的なタンパク質精製に用いられる方法を用いることがで
きるが、その１例をあげれば次の通りである。

【００２９】まず培養上清に適当なプロテアーゼインヒ
ビターを添加し、次に遠心分離に付し細胞片等の不純物
を除去した後に、限外ロ過法によって濃縮を行い、培養
上清中の細胞性フィブロネクチンを適当な濃度にまで上
げる。これは次の精製を効率化するためである。濃縮さ
れた上清は、ＰＢＳ（−）（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化してゼラチンア
フィニティーカラムに負荷する。その後、ＰＢＳ（−）
に６Ｍ尿素を溶解した緩衝液で溶出させ、その溶出画分
を得る。この画分中での細胞性フィブロネクチンの純度
は、電気泳動法による検定によると９５％以上である
が、さらに純度を高めるためには、一般的なイオン交換
法などの他の方法を用いて高純度化することができる
が、細胞性フィブロネクチンは、通常ＰＢＳ（−）のよ
うな緩衝液中では非常に溶解度が低いため、すべて尿素
存在下で分離操作を行う必要がある。

【００３０】その後、尿素を除去し、ある濃度以上の細
胞性フィブロネクチン溶液を調製するために５％ショ糖
を含むリン酸緩衝液と緩衝液交換を行う。緩衝液で交換
を行う方法としては、一般的な方法である膜透析法や限
外ロ過を用いてダイアフィルトレーション法によって行
うことができる。

【００３１】このようにして得られるヒト細胞性フィブ
ロネクチンは、二量体と単量体の混合物として得られ
る。細胞性フィブロネクチンの構造上の特徴としては、
還元条件下及び非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル泳動の分析によると、その分子量が血漿性フィブ
ロネクチン標品より大きく、また市販の抗細胞性フィブ
ロネクチン抗体と反応する。

【００３２】以下にＨＵＨ−６ＹＭを用いて製造したヒ
ト細胞性フィブロネクチンの諸性質を示す。 分子量 還元及び非還元状態におけるＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により二量体が４７０ｋｄ，単量体が２４
５ｋｄと２２５ｋｄを示す、二量体と単量体の比が２：
１である。 等電点：ｐＨ５〜６ 免疫学的特異性 市販の抗細胞性フィブロネクチン抗体（シグマ社製、Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩ−ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＦＩ
ＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｆ６１４
０）と反応し、抗ヒトフィブロネクチン抗体（宝酒造
製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応する。また製造され
たヒト細胞性フィブロネクチンは、既に報告されている
細胞接着促進活性、ゼラチンビーズ凝集能及び細胞伸展
活性などフィブロネクチンの生物学的作用を有する。

【００３３】以上のように細胞株ＨＵＨ−６ＹＭを用
い、タンパク質無添加培地で、大量の細胞を連続培養す
ることで、非常に有利にヒト細胞性フィブロネクチンを
製造することができる。

【００３４】また、意外なことには、本ＨＵＨ−６ＹＭ
が産生するフィブロネクチンは、細胞性フィブロネクチ
ンであることが明らかとなり、またこの細胞性フィブロ
ネクチンがショ糖溶液に対し高溶解性であることを見い
だした。

【００３５】

【問題を解決するための手段】鋭意研究の結果、ヒト細
胞性フィブロネクチンの大量培養生産方法が確立され
た。そこで、本発明者らは、上記ヒト細胞性フィブロネ
クチンを用いてさまざまな生物学的活性について検討を
行ったところウサギの角膜上皮欠損モデルを用いた角膜
欠損治療促進実験において有効性が認められ、さらにヒ
ト血漿性フィブロネクチンより比活性が高いことが確認
された。

【００３６】さらに、ボイデンチャンバー変法により細
胞遊走活性を測定したところ、上記細胞性フィブロネク
チンは、血漿性フィブロネクチンより高い細胞遊走活性
を有することが確認された。

【００３７】またフィブロネクチンを含有する水溶液の
凍結乾燥において、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭより産生され
るヒト細胞性フィブロネクチンを有効成分とする凍結乾
燥製剤は安定性が高く、特に安定化剤として二糖類及び
ヒトアルブミンを添加しておけば、凍結乾燥後の注射用
蒸留水への溶解時間が短縮され、また不溶物の残存ひい
ては白濁が消失すると共に凍結乾燥に対する上記細胞性
フィブロネクチンの安定性が相乗的に高まることを確認
した。

【００３８】本発明は上記知見に基づき完成されたもの
であり、ヒト細胞性フィブロネクチンを含有することを
特徴とする創傷治療剤及びその医薬製剤に関するもので
ある。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、ヒト細胞性フィブロネク
チン製剤が提供された。本製剤は、血漿性フィブロネク
チンと同様な生物活性作用を有するが、その細胞遊走活
性が血漿フィブロネクチンより高いため、治療に用いる
場合の有効投与量が少ないという利点がある。

【００４０】さらに本発明で用いたヒト細胞性フィブロ
ネクチンは、厳密に管理されたヒト細胞株の培養上清よ
り精製されるため、未知の不純物等の混入の危険も少な
い。

【００４１】以下に参考例及び実施例を上げ、本発明を
具体的に説明する。

【００４２】

【参考例】 【Ｉ．物質の生産】

【００４３】種培養として、細胞株ＨＵＨ−６ＹＭ（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２８９０）をｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬
製）を用いて継代培養した。培養は３７℃で、５％ＣＯ
₂を含む空気で、１ヶ月間行った。

【００４４】培養上清を得るための連続培養は、１７５
０ｃｍ²のローラーボトル（ファルコン社製）１本当た
り１×１０⁸個の細胞を播種し、３７℃、大気下で培養
した。播種後３週間までは、２〜３日間隔で、その後は
毎日ローラーボトル１本当たり５００ｍｌの培地を全量
交換し、得られた培養上清を回収した。連続培養は約３
ヵ月行った。（図１）

【００４５】培養上清は、プロテアーゼインヒビターと
して５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）を添加した後、連続遠心分離し１５００ｇ、流速２
０Ｌ／分（国産製Ｈ６００−Ｓ）により細胞断片等の不
純物を除去し上澄を回収した。

【００４６】次に、分画分子量１００ｋ（フィルトロン
社製、型式ＯＳ１００ＣＯ５）の限外ロ過膜を用いて先
の上澄の１０倍濃縮液を調製した。

【００４７】これを、ＰＢＳ（−）で平衡化したゼラチ
ンセファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製）負荷
し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、平衡化した。続いてＰＢＳ
（−）に６Ｍ尿素を溶解させた緩衝液で溶出を行った。

【００４８】この溶出液中の細胞性フィブロネクチンの
純度は、還元状態下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による検定の結果９５％以上であった。

【００４９】この溶出液を集め、分画分子量１００ｋの
限外ロ過膜（フィルトロン社製、型式ＯＳ−１００ＣＯ
ｌ）を用いて、まず溶出液を濃縮し、続いてダイアフィ
ルトレーション法により、５％ショ糖を含む０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液と溶媒交換を行った。

【００５０】以上のような方法で、ヒト細胞性フィブロ
ネクチン標品が得られた。

【００５１】

【II. 物質の性質】（１）分子量

【００５２】上記、ヒト細胞性フィブロネクチン標品の
分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って、標準タンパク質及びヒト血漿性フィブロネクチン
標品（岩城硝子社製）と還元及び非還元状態下で比較し
た。

【００５３】その結果、本発明のヒト細胞性フィブロネ
クチン標品の分子量は二量体が４７０ｋｄ、単量体が２
４５ｋｄと２２５ｋｄと推定され、ヒト血漿性フィブロ
ネクチンよりも大きな分子量を有することが明らかにな
かった。（図２） （２）免疫学的反応性

【００５４】ヒト血漿性フィブロネクチンには反応せ
ず、細胞性フィブロネクチンのみに反応する抗細胞性フ
ィブロネクチン（シグマ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．
Ｆ−６１４０）を用いてウエスタンブロッティング後の
免疫染色法により反応性の確認を行った。その結果、本
標品はこの特異抗体と反応した。またヒトフィブロネク
チン抗体（宝酒造製、ｃｌｏｎｅ３０−８）とも反応し
た。

【００５５】上記の分子量と免疫学的反応性より、本発
明で得られたフィブロネクチンは、ヒト細胞性フィブロ
ネクチンであると判断された。 （３）水溶性

【００５６】既報によると、細胞性フィブロネクチンは
ｐＨ６から８の緩衝液に対し、非常に溶解性が低いこと
が報告されている。

【００５７】本発明においては、細胞性フィブロネクチ
ンが、ショ糖を含む緩衝液に対し易溶性であることが見
いだされた。

【００５８】ショ糖溶液に対する溶解性は次の表１に示
される。

【００５９】

【表１】

【００６０】

【実施例１】角膜上皮欠損治癒促進作用を測定するため
以下の実験を行った。まず、Ｎ２Ｗラビットの眼球に９
ｍｍ径のトイパンで傷をつけ、角膜上皮を剥離させた。
剥離１８時間後より点眼を開始し、片眼にフィブロネク
チン溶液を、他眼にＰＢＳ（−）を点眼した。フィブロ
ネクチン溶液としては、参考例で得られたヒト細胞性フ
ィブロネクチンをＰＢＳ（−）溶液で希釈して、１２５
μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ及び
１ｍｇ／ｍｌを調製し、対象としてヒト血液から精製さ
れたヒト血漿性フィブロネクチン溶液をＰＢＳ（−）溶
液で希釈して、２５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び３
ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。１回の点眼にはそれぞれ
の溶液を１００μｌ用い、１時間毎に１回点眼し３０時
間後まで点眼を行った。治癒率は、１８時間後と３０時
間後の時点で写真撮影を行い、角膜上皮欠損部の面積を
画像解析装置にて測定した。各々の眼について経過時間
とその時点の角膜上皮欠損面積をプロットし、最小二乗
法により治癒直線の傾きを算出し、その絶対値を治癒速
度（ｍｍ²／ｈ）とした。さらにフィブロネクチン溶液
を点眼した治癒速度を、その片眼のＰＢＳ（−）を点眼
した治癒速度で割った値を１００倍した数値を治癒速度
増加率（％）とした。その結果を図３に示す。

【００６１】以上の結果により、ヒト細胞性フィブロネ
クチンはヒト血漿性フィブロネクチンより少量の投与に
よって有効であることが明らかとなった。さらに角膜上
皮欠損に対するヒト細胞性フィブロネクチンの有効濃度
は１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであった。

【００６２】

【実施例２】ヒト細胞性フィブロネクチンとヒト血漿性
フィブロネクチンの細胞接着活性と細胞遊走活性をラビ
ット角膜上皮細胞を用いて測定した。実験に用いた角膜
上皮細胞は、酵素法により培養系に移し初代培養したも
のを用いた。

【００６３】細胞接着活性は、０．１μｇ／ｍｌ〜１０
０μｇ／ｍｌの濃度になるように、ヒト細胞性及びヒト
血漿性フィブロネクチン溶液を調製し、９６ウェルプレ
ートに各溶液を１ウェル当り１００μｌ加え、３７℃１
時間放置してフィブロネクチンをコートした。プレート
をＰＢＳ（−）で洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
（−）溶液を加え、フィブロネクチンをコートしたウェ
ルのブロッキングを行った。さらにＰＢＳ（−）でプレ
ートを洗浄した後、１ウェル当り１０００個の角膜上皮
細胞を加え、３７℃、１時間放置した。細胞を中性ホル
マリン溶液で固定化した後、クリスタルバイオレット染
色液で染色し、顕微鏡を用いて細胞数を計測した。その
結果を図４に示す。

【００６４】その結果、細胞接着活性はヒト細胞性フィ
ブロネクチンとヒト血漿性フィブロネクチンの間では有
意な差は認められなかった。

【００６５】次にボイデンチャンバー変法によって細胞
遊走活性の測定を行った。まず２４ウェルプレートに０
〜１００μｇ／ｍｌの濃度になるようにＴＣＭ−１９９
培地で希釈したヒト細胞性及び血漿性フィブロネクチン
溶液を１ウェル当り０．５ｍｌずつ入れた。そのウェル
にケモタキシスチャンバーを入れ、細胞浮遊液として
（２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１チャンバーに０．
２ｍｌずつ加えた。そして５％ＣＯ₂存在下の３７℃イ
ンキュベーター内で６時間の培養を行った。ケモタキシ
スチャンバーを取り出し、内側の膜上の細胞を綿棒で剥
がしてＰＢＳ（−）で洗浄した。このチャンバー下面の
細胞を中性ホルマリン溶液で固定化した後、クリスタル
バイオレットで染色した。染色された細胞を１００倍率
の顕微鏡下にて５視野の細胞数を計測し１００倍した値
を遊走細胞数とする。その結果を図５に示す。

【００６６】この結果より、細胞遊走活性は、ヒト血漿
性フィブロネクチンよりヒト細胞性フィブロネクチンの
方が高いことが確認された。

【００６７】実施例１と２の結果より、ヒト細胞性フィ
ブロネクチンがヒト血漿性フィブロネクチンより角膜上
皮欠損治癒促進に対する有効必要量が少ないことは、ヒ
ト細胞性フィブロネクチンが高い細胞遊走活性を有する
ためと考えられる。

【００６８】また、皮膚等の他の組織における上皮欠損
においてもヒト細胞性フィブロネクチンはヒト血漿性フ
ィブロネクチンよりも有効な治癒促進効果が期待でき
る。

【００６９】

【実施例３】 ヒト細胞性フィブロネクチン凍結乾燥製剤の作製と再溶
解性 バイアルに、ヒト細胞性フィブロネクチン１．０ｍｇ／
ｍｌ、ショ糖５０ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）から成るヒト細胞性フィブロネクチン原
液１ｍｌを採り、これにヒト血清アルブミン１．０ｍｇ
／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から成る
ヒト血清アルブミン溶液１ｍｌを添加し、（合計２ｍ
ｌ）、ヒト細胞性フィブロネクチン０．５ｍｇ／ｍｌ、
ショ糖２５ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン０．５ｍｇ
／ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）から成る
ヒト細胞性フィブロネクチン溶液を調製した。次に、こ
のヒト細胞性フィブロネクチン溶液を常法に従い凍結乾
燥し、ヒト細胞性フィブロネクチン凍結乾燥製剤を得
た。このヒト細胞性フィブロネクチン凍結乾燥製剤の外
観は良好（白色塊）であり、蒸留水２ｍｌ添加後のフィ
ブロネクチンの再溶解性も良好であった。

【００７０】下記の表にて他の実施例と凍結乾燥後の外
観及び蒸留水２ｍｌ添加後の再溶解性を示す。

【００７１】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】連続培養中において細胞株ＨＵＨ−６ＹＭが、
培養上清中に産生するヒト細胞性フィブロネクチン濃度
の培養期間に対する変化を示す図である。

【図２】本発明のヒト細胞性フィブロネクチンをＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す図
である。比較対照としては、ヒト血漿性フィブロネクチ
ン標品を用いた。

【図３】角膜上皮欠損治癒促進効果を示す図である。縦
軸に治癒速度増加率を、横軸に点眼溶液の各フィブロネ
クチン濃度を示す。

【図４】角膜上皮細胞接着活性を示す図である。縦軸に
接着細胞数を、横軸にプレートにコーティングしたフィ
ブロネクチン濃度を表す。

【図５】細胞遊走活性を示す図である。縦軸に遊走した
細胞数を、横軸に実験で用いたフィブロネクチン濃度を
示す。

フロントページの続き (72)発明者 坂 本 貴 滋賀県大津市見世２丁目19番15号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−６ＹＭ
   （微工研菌寄第１２８９０号）より生産されるヒト細胞
   性フィブロネクチンを有効成分として含有することを特
   徴とする創傷治療剤。
2. 【請求項２】 請求項１記載の有効成分を含有すること
   を特徴とする角膜治療剤。
3. 【請求項３】 ヒト肝芽腫由来変異株ＨＵＨ−６ＹＭ
   （微工研菌寄第１２８９０号）より生産されるヒト細胞
   性フィブロネクチンを有効成分として含有し、更に安定
   化剤を含むことを特徴とする医薬品製剤。