JPH05312807A - 血中の肺組織障害マーカー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 肺組織障害マーカー及びこのマーカーの測定
方法を提供する。 【構成】 ヒト血中に存在するレクチンとイムノグロブ
リンとの複合体からなる肺組織障害マーカー、及びこの
複合体又はこの複合体中に含まれるレクチンの免疫学的
測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、人血中に存在するレク
チン―イムノグロブリン複合体、およびその複合体なら
びに、複合体中に存するレクチンの測定方法に関する。
さらに詳しくは、血中の肺組織障害マーカーおよびイム
ノグロブリンの抗体または、レクチンの抗体を用い、こ
れらを組み合わせて免疫学的測定系を構成し、好ましく
は反応系で２種類の界面活性剤を共存させることを特徴
とする人血中の肺組織障害マーカーの測定法である。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】間質性
肺炎（ＩＰＦ）をはじめとする肺疾患は、死に至る疾患
が多い。しかしながら、その診断方法は現在の所不十分
な点が多い。例えば、６７ＧａシンチグラムはＴＰＦの
活動期を反映しうるが、それはかならずしも肺疾患特異
的ではなく、また放射性物質を用いるため、生体に害を
及ぼす。また赤沈、circulatingimmune complex、３型
プロコラーゲンペプチド等の血中濃度測定は、炎症を反
映するが、肺特異的とはかならずしも言えない。

【０００３】また、その他の肺疾患、例えばサルコイド
ーシス、肺炎、肺結核、肺腺癌、肺扁平上皮癌等の種々
の肺疾患が知られているが、その診断、治療に用いられ
うる肺疾患マーカーの血中での存在は知られていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らが、鋭意研究
した結果、ＩＰＦ等の肺疾患患者血清中にＢｉｏ―Ｇｅ
ｌ Ａ１５ｍカラム（バイオランドＫ．Ｋ．）を用いた
ゲル濾過において、分子量６０〜２００万ダルトンの物
質が存在することを見い出し、本発明に到達した。

【０００５】即ち本発明は、ヒト血中に存在するレクチ
ンとイムノグロブリンとの複合体、およびその複合体を
構成するレクチンを定量、またはその複合体自信を定量
することにより、肺組織障害を診断するための免疫学的
測定方法ないしそのための測定用キットである。

【０００６】まず本発明は、ヒト血中に存在するレクチ
ンとイムノグロブリンとの複合体、即ちレクチンとイム
ノグロブリンとの複合耐火らなる肺組織障害マーカーで
ある。

【０００７】本発明において、ヒト血中に存在する肺疾
患マーカーたりうるレクチン―イムノグロブリン複合体
として、ＩＰＦ患者血清中に、レクチンとして肺サーフ
ァクタントアポ蛋白Ａ、一方、イムノグロブリンとして
ＩｇＧ、ＩｇＭが見い出された。つづいて同複合体が、
肺腺癌患者血清中にも存在することが発明者によって見
い出された。この複合体が、例えば間質性肺炎や肺腺癌
患者血清中において、なぜ上昇するかについては、まだ
明確ではない。ＳＰ―ＡはＣ型レクチン様構造を有する
ことが明らかになった。Ｃ型レクチンとは、Ｎ末端側に
コラーゲン様構造を有し、Ｃ末端側にglobal head の構
造を有し、このheadにて糖鎖を結合しうる能力を有する
レクチンをいう。

【０００８】上記構造のＮ末端側コラーゲン様構造は、
ＦＣレセプターと結合しうる能力を有する。それゆえに
レクチンは、糖鎖を有する外来の異物の生体からの排除
のために有効な役割をはたすことが期待される。ＳＰ―
Ａは肺局所における異物排除において、かけがえのない
役割をはたすものと思われる。ＳＰ―Ａ／イムノグロブ
リン複合体が、これらの間質性肺炎や肺腺癌疾患患者血
中になぜ、出現するかについて明確な回答はないが、Ｓ
Ｐ―Ａは肺の炎症等において、肺胞のdamageにより血中
に遊離し、血中のイムノグロブリンと結合し、結果とし
て複合体を形成するか、または肺胞においてイムノグロ
ブリンと結合して複合体を形成し、その複合体が血中に
出現するかのいずれかであろう。なお、血中には、遊離
型のＳＰ―Ａは存在しない。

【０００９】本発明によれば、この複合体を、マンノー
スSephare を用いてアフィニティー精製した結果、２―
メルカプトエタノール存在下のＳＤＳ―ＰＡＧを用いた
Western Blottingでは、分子量３．６万および６．２万
にＳＰ―Ａと同一のbandが認められた。一方、antiＩｇ
Ｇ（Heavy chain speif ）およびantiＩｇＭ（μ chain
spedific ）を用いてWestern Blottingを行いμ chai
n、γ chainが本複合体に存在することがたしかめられ
た。

【００１０】本発明においては、特に反応系に非イオ
ン及び陰イオン界面活性剤、分子量１．６〜５．０万
でかつ等電点が１．０〜５．０である蛋白を同時に存在
させることが好ましい。

【００１１】かかる界面活性剤、蛋白を存在させること
により、血液中の肺疾患マーカー蛋白を特に感度よく測
定することが可能になったが、その理由は、次のような
ことが挙げられる。該マーカー蛋白は、羊水中や喀痰中
に存在するＳＰ―Ａと同様にリン脂質と複合体を形成し
ているリポ蛋白と思われる。非イオン・陰イオン界面活
性剤共存のみの場合、血中のリポ蛋白は可溶化は十分と
なり該マーカー蛋白が免疫反応に関与する抗体によって
結合されることになる。しかしながら、非特異吸着をお
さえることができるような蛋白成分が存在しないため、
感度の低下が起こり、そのため、血中で存在濃度が低い
該マーカー蛋白を正しく測定できなくなる。

【００１２】一方、そのような非特異吸着をおさえられ
る蛋白と非イオン界面活性剤のみの存在では、血中のリ
ポ蛋白は可溶化が不十分となり、該マーカー蛋白は、免
疫反応に関与する抗体に認識されず、従って、血中の該
マーカー蛋白を測定できない。しかしながら、非イオン
・陰イオン界面活性剤および特定の蛋白の共存により、
それぞれの長所が生かされ、即ち蛋白による非特異吸着
の低下およびリポ蛋白の可溶化によりそのアポ蛋白は抗
体に効率よく認識され、血中の非常に低い濃度で存在す
る該マーカー蛋白を測定しうることになる。

【００１３】本発明に用いられる、肺サーファクタント
アポ蛋白に対する異なるエピトープを認識する２つの抗
体に関しては、既に特開昭６１―２７７６９９号に開示
されたモノクローナル抗体ＰＣ―６、ＰＥ―１０等が挙
げられる。また測定法に関しては、特開昭６１―２７５
６５４号に述べたが、異なるエピトープを認識する抗体
はポリクローナル抗体でもかまわない。

【００１４】本発明において反応系に同時に存在させる
ことのできる蛋白は分子量が１．６〜５．０万で等電点
が１．０〜５．０の範囲にあるものをいう。

【００１５】本発明におけるかかる蛋白としては、ペプ
シン、オボグリコプロテイン、オロソムコイドやカゼイ
ンやカゼインと無機質の混合物であるスキムミルク等が
挙げられる。分子量１．６万以下の蛋白を用いた場合に
は、非特異吸着が上昇してしまう結果を得ており、また
５．０万以上の分子量では免疫非特異的反応の低減が不
十分かつ特異的免疫反応の低下が見られることにより、
本発明に使用する分子量を１．６〜５．０万と決めた。

【００１６】また等電点に関しても等電点５．０以上の
蛋白を添加した場合、非特異吸着が上昇し、また等電点
１．０より下では特異的反応がおさえられるために本発
明に使用する蛋白の等電点の範囲を１．０〜５．０と決
めた。

【００１７】特に、上記蛋白の中でもスキムミルクが望
ましい。

【００１８】本発明においては、かかる蛋白は免疫反応
溶液中における最終濃度を０．０１〜０．９重量％の範
囲にするのが好ましい。例えばスキムミルクの緩衝液中
の濃度をかかる範囲に調製すると、免疫測定法が高感度
であるための２つの必須条件（すなわち、特異的反応を
維持しながら、非特異反応を低減させる）を満たすこと
が容易となる。スキムミルクは、０．９％より濃い濃度
では水に不溶であり、その懸濁液を用いてブロッキング
するため、ミクロ的にみれば、スキムミルクの大きな不
溶物が抗原を覆うため抗体が近づけなくなり、結果とし
て、抗原抗体反応が大きく阻害されやすくなる。また
０．０１％以下では、十分な非特異吸着の低減効果が得
られにくくなる。

【００１９】また、上記蛋白と免疫反応溶液中に同時に
共存させる本発明に使用する界面活性剤としては、非イ
オン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキル
エーテル類、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエ
ーテル類、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（モノ）
類、ポリオキシエチレンアルキルチオエーテル類があ
り、また、陰イオン界面活性剤としては、高級アルコー
ル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩類、アルキル
ベンゼンスルホン酸塩類、ジナフチルメタンジスルホン
酸塩類、アルキルスルホコハク酸塩類、ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル硫酸エステル類、ポリオキシエチ
レンアルキルフェノール硫酸エステル塩類などが挙げら
れる。

【００２０】非イオン界面活性剤としては、例えば、ト
リトン（Rohm & Haas Co. 製の商品名）のごときポリオ
キシエチレンアルキルフェノールエーテル類が好まし
く、陰イオン界面活性剤としては、ソジウムドデシルサ
ルフェート（ＳＤＳ）のごときアルキルスルホン酸塩類
が好ましい。濃度としては、前者は０．２５〜４重量
％、後者は０．２〜３重量％程度用いるのが特に好まし
い。

【００２１】トリトンは０．２５重量％以上になると、
免疫反応の保護効果があらわれ、４重量％をこえると、
免疫反応を不安定にさせる傾向があらわれる。また、Ｓ
ＤＳは０．２重量％以上で界面活性効果があらわれる。
ＳＤＳが３重量％をこえると、その界面活性効果があま
りにも強力であり、トリトンの濃度を増しても、その免
疫反応保護効果が発揮されにくくなる。

【００２２】本発明においては非イオン及び陰イオン界
面活性剤を併用することが好ましいが、併用する場合の
重量比は陰イオン界面活性剤／非イオン界面活性剤＝
０．２５〜１．５が好ましい。

【００２３】本発明においては、ヒト肺サーファクタン
トアポ蛋白に対する抗体を、または、イムノグロブリン
に対する抗体をそれぞれを１次抗体、２次抗体として用
いる。かかる１次抗体は担体に固定化しておくのが好ま
しいが、固定化の方法は公知の方法を採用でき、担体と
しては固相の、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリ
ル、ポリアクリレート、テフロン等の弗素樹脂、ポリア
セタール、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高
分子、その他紙，ガラス、金属、アガロースおよびこれ
らの組合せ等を用いた、トレイ状、球状、繊維状、棒
状、盤状、容器状、セル、試験管などの種々の形状が挙
げられ、ボール、ビーズ、ギヤ、マイクロプレート等が
好ましく使用される。

【００２４】また、２次抗体は標識化されていることが
好ましいが、かかる２次抗体の標識化の方法や手段、そ
れの検出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公
知の方法や手段、例えば放射性物質または酵素もしくは
蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブド
ウ球菌蛋白Ａとの２次反応により測定することもでき
る。標識剤としては、酵素，蛍光物質，発光物質および
放射性物質が挙げられる。酵素を用いる方法（ＥＩＡ）
ではホースラディッシュパーオキシダーゼ、β―Ｄ―ガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素
が、放射性物質を用いる方法（ＲＩＡ）では ¹²⁵Ｉ、
¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、 ³Ｈ等が、蛍光物質を用いる方法（ＦＩ
Ａ）ではフルオレセンイソチオサイアネート、フィコビ
リプロテイン等、発光物質を用いる方法ではイソルシノ
ール、ルシゲニン等が通常使用されるが、その標識剤の
活性が測定可能であれば、その他のものであってもよ
い。

【００２５】上記の方法の中で、２次抗体に直接酵素が
標識されているものを用いることが望ましい。なぜな
ら、間接的な方法では免疫反応が１step多くなり実用的
に不向きであるからである。

【００２６】標識剤が酵素である場合には、その活性を
測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。
基質としては例えば、ホースラディッシュパーオキシダ
ーゼの基質として、２，２′―アジノジ［３―エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸］アンモニウム酸（ＡＢＴ
Ｓ）―Ｈ₂ Ｏ₂ 、５―アミノサリチル酸―Ｈ₂ Ｏ₂ 、Ｏ
―フェニレンジアミン―Ｈ₂ Ｏ₂ 、４―アミノアンチピ
リン―Ｈ₂ Ｏ₂ 、また、ベンジジン（３，３′，５，
５′―テトラメチルベンジジン等）―Ｈ₂ Ｏ₂ などが、
β―Ｄ―ガラクトシダーゼの基質として、フルオレセイ
ン―ジ―（β―Ｄ―ガラクトピラノシド）、Ｏ―ニトロ
フェノール―β―Ｄ―ガラクトピラノシド、４―メチル
ウンベリフェリル―β―Ｄ―ガラクトピラノシドなど、
アルカリフォスファターゼの基質としてＯ―ニトロフェ
ニルフォスフェート等を挙げることができる。測定のた
めには、これらの試薬以外にも溶解剤，洗浄剤，反応停
止剤等の公知の試薬が使用される。

【００２７】本発明によるヒト血中に存在する肺組織障
害マーカー蛋白の免疫学的測定方法 （１）ヒト血中に存在するレクチンであるＳＰ―Ａとイ
ムノグロブリンとの複合体中のレクチンであるＳＰ―Ａ
の免疫学的測定方法 肺サーファクタントアポ蛋白Ａ（ＳＰ―Ａ）に対するモ
ノクローナル抗体（１次抗体；ＰＣ―６）を適当な不溶
性担体（例えばプラスチック容器）に固定化する（以下
これを“固相抗体”という）。次いで不溶性担体と測定
しようとする試薬または検体試料との非特異的結合を避
けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で不
溶性担体の表面を被覆する。

【００２８】このようにして得られた１次抗体が固定化
された不溶性担体を検体試料と、酵素で標識した抗肺サ
ーファクタントアポ蛋白抗体（２次抗体，ＰＥ―１０）
（標識抗体）を、非イオン・陰イオン界面活性剤と、分
子量１．６〜５．０でかつ等電点が１．０〜５．０なる
蛋白を同時に、免疫反応液、例えば免疫反応用緩衝液に
共存させ、一定時間および一定温度で接触させ反応させ
る。免疫反応温度は０〜５０℃までよいが、比較的高い
温度で用いられる。ただし、低い温度の免疫反応では、
反応時間は長く、比較的高い温度の免疫反応では、免疫
反応時間は短い。実用面から、常温（２０℃）から４５
℃が好んで用いられる。これを適当な洗浄液で洗い、次
いで不溶性担体上に存在する２次抗体に標識された標識
物質の量を測定する。

【００２９】かくしてその値から、ヒト血中のレクチン
（ＳＰ―Ａ）―イクノグロブリン複合体のレクチン（Ｓ
Ｐ―Ａ）の量を算出することができる。

【００３０】（２）ヒト血中に存在するレクチン（ＳＰ
―Ａ）―イムノグロブリン複合体の免疫学的測定方法 肺サーファクタントアポ蛋白に対するモノクローナル抗
体（１次抗体；ＰＣ―６）を適当な不溶性担体（例えば
プラスチック容器）に固定化する（以下これを“固相抗
体”という）。次いで不溶性担体と測定しようとする試
薬または検体試料との非特異的結合を避けるために適当
な物質（例えば牛血清アルブミン）で不溶性担体の表面
を被覆する。

【００３１】このようにして得られた１次抗体が固定化
された不溶性担体を検体試料とを一定時間反応させ、同
複合体を、固相に結合させしめる。次いで、洗浄後酵素
で標識した抗イムノグロブリンを、非イオン・陰イオン
界面活性剤と、分子量１．６〜５．０でかつ等電点が
１．０〜５．０なる蛋白を同時に、免疫反応液、例えば
免疫反応用緩衝液に共存させ、一定時間および一定温度
で接触させ反応させる。免疫反応温度は０〜５０℃まで
よいが、比較的高い温度で用いられる。ただし、低い温
度の免疫反応では、反応時間は長く、比較的高い温度の
免疫反応では、免疫反応時間は短い。実用面から、常温
（２０℃）から４５℃が好んで用いられる。これを適当
な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存在する２次抗
体に標識された標識物質の量を測定する。

【００３２】かくしてその値からヒト血中のレクチン―
イムノグロブリン複合体の量を算出することができる。

【００３３】（３）測定試薬およびキットの構成 本発明のヒト血中の肺疾患マーカー蛋白の測定法に用い
る測定試薬は、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白に対す
る異なるエピトープを認識する２つの抗体試薬、イムノ
グロブリン（ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ）に対する抗体試
薬、ならびに、非イオンおよび陰イオン界面活性剤と分
子量１．６〜５．０万でかつ等電点１．０〜５．０なる
蛋白からなる。

【００３４】なかでも、２つの抗体が上述した不溶性担
体に結合した固相抗体試薬と、標識抗体試薬、および上
述した界面活性剤と蛋白を含有する免疫反応用緩衝液と
からなる測定試薬が好ましい。

【００３５】また、本発明のヒト血中の肺組織障害マー
カー蛋白測定用キットは、上記の測定試薬と、これら測
定試薬を能率よくかつ簡便に利用するための補助剤とし
て、例えば固体状の試薬または液状の検体を溶解させる
ための溶解剤，不溶性担体に非特異的に結合した抗原，
抗体を洗浄するために使用される洗浄剤，および酵素で
標識化した抗体を用いる場合には、酵素活性を測定する
ための基質およびその反応停止剤，その他の免疫学的測
定用のキットとして通常使用されるものが挙げられる。

【００３６】かかるキットにおいて、本発明による非イ
オンおよび陰イオン界面活性剤と分子量１．６〜５．０
万でかつ等電点１．０〜５．０なる蛋白は検体を溶解さ
せるための溶解剤に加えることが望ましい。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、ヒト血中などに存在する
肺組織障害マーカー蛋白を、極めて高感度に測定可能と
なり、従って小量の検体と短い時間で容易に測定でき
る。

【００３８】以上により、肺線癌や他の肺疾患を、血中
の肺疾患マーカー蛋白を測定することにより、その診断
が可能となる。

【００３９】

【実施例】以下、実施例、参考例により、本発明を詳述
する。

【００４０】

【参考例】

肺サーファクタントアポ蛋白Ａ（ＳＰ―Ａ）の構造と糖
結合性 ＳＰ―Ａの構造を図１に示す。trimerとなり、１つのsu
bunit 構造を形成する（図２）。これが６量体になり、
Ｃ型レクチン構造を示す（図３）。

【００４１】

【実施例１】 血清中のＳＰ―Ａ／イムノグロブリン複合体中のＳＰ―
Ａ測定方法 （１）モノクローナル抗体不溶化ビーズをよく洗浄して
から、モノクローナル抗体ＰＣ―６の２０μｇ／mlの濃
度を有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液中に、４℃の温度
で１昼夜放置した。その後、ビーズをＰＢＳ溶液で洗浄
してから、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液
中に、４℃の温度で１昼夜放置してポストコーティング
処理を実施して、モノクローナル抗体不溶化ビーズを得
た。

【００４２】（２）ホースラディッシュ・ペルオキシダ
ーゼ標識モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＥ―１０の１．０mg／mlのＰＢＳ
溶液に、Ｎ―（ｍ―マレイミド安息香酸）―Ｎ―サクシ
ンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０mg／mlの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液５０mlを添加し、２５℃の温度で
３０分間反応させた。次いで、セファデックスＧ―２５
を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクロー
ナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。

【００４３】一方、ホースラディッシュ・ペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）の１．０mg／mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ―サ
クシンイミジル―３―（２―ピリジルチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＯＰ）の１０mg／mlの濃度のエタノール溶液
を添加し、２５℃で３０分間反応させた。次いで、セフ
ァデックスＧ―２５を充填したカラムを用い、０．０１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）でゲル濾過して精製し、ピ
リジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採集し
て、コロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃
縮した。次に、これに０．８５％ＮａＣｌと０．１Ｍジ
チオスレイトールとを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．５）１mlを添加し、２５℃で３０分間攪拌して、
ＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元
した。次いで、セファデックスＧ―２５カラムにかけて
ゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。

【００４４】上記の如くして得られたマレイミド化モノ
クローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジ
オンバックを用いて氷冷下に４mgの蛋白質濃度まで濃縮
し、４℃で１昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４
を充填したカラムでゲル濾過し、ＨＲＰ標識モノクロー
ナル抗体を得た。

【００４５】（３）血清中の該マーカー蛋白（肺疾患マ
ーカー蛋白）の測定 血清検体希釈緩衝液として０．６％ＳＤＳ，２．０％ト
リトンＸ―１００、０．１％スキムミルクを含む混合液
を用い、血清検体の希釈系列を含むこの混合液とＨＲＰ
標識モノクローナル抗体ＰＥ―１０希釈液とを、各々２
００μｍずつ試験管中のモノクローナル抗体ＰＣ―６固
定ボールに加え、免疫反応を行なった（３７℃，２時
間）。次に、試験管の溶液を吸引除去後、生理食塩水で
洗浄してから、３，３′，５，５′―テトラメチルベン
ジジン１％含有メタノール溶液／Ｈ ₂ Ｏ₂ ０．０１５％
を含有する１Ｍリン酸―クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）
の３／７（Ｖ／Ｖ）混合溶液を、各０．４mlずつ各試験
管内に加え、室温で１５分間インキュベートした後、反
応停止剤として１．５ＮＨ₂ ＳＯ₄ 水溶液を２mlずつ加
えて、酵素反応を停止させた。そして分光光度計を用い
てこの溶液の４５０ｎｍの波長の吸収強度を測定した。

【００４６】一方、肺胞蛋白症から精製したアポ蛋白を
標準物質とし、前記と同じ混合液を希釈緩衝液とし、前
記と同様にしてＳＤＳのそれぞれの濃度に対応した検量
線を作成しておいた。そして、対応するＳＤＳ濃度の検
量線を用いて、前記のごとくして得られた４５０ｎｍの
吸収強度から、該マーカー蛋白（肺疾患マーカー蛋白）
の濃度を求めた。

【００４７】なお、血中の複合体量と、肺胞蛋白症の肺
胞洗浄液から精製したアポ蛋白量とは、物質が異なるた
め、unitで表示している。

【００４８】（４）免疫反応における血清検体希釈緩衝
液中の陰イオン／非イオン界面活性剤の比の検討 血清検体希釈緩衝液として、トリトンＸ―１００、１、
２、３、４％にそれぞれＳＤＳが１．７５、１．５、
１．２５、１．０、０．７５％含有する混合液を用い
て、血清検体の希釈系列を含むこの混合液と、ＨＲＰ標
識モノクローナル抗体ＰＥ―１０希釈とを、各々２００
μリットルずつ試験管中のモノクローナル抗体ＰＣ―６
固定ボールに加え、免疫反応を行った（３７℃、９０
分）。以下、実施例１（３）に従って、免疫反応終了後
吸光度を測定し、界面活性剤の陰イオン／非イオン比に
対してプロットした。その結果を図４に示す。

【００４９】図中○―○TritonＸ―１００、１％、●―
●同２％，△―△同３％，▲―▲同４％を用いた時の測
定値を示す。

【００５０】図４から、ＳＤＳ／TritonＸ―１００の至
適重量比は、０．２５〜１．５であることがわかる。

【００５１】

【実施例２】 ヒト血清中のＳＰ―Ａ複合体のキャラクタリゼーション （１）Ｂｉｏ―Ｇｅｌ Ａ１５ｍカラムを用いた血清中
ＳＰ―Ａ複合体の分子量の同定 肺胞タンパク症の血清をＢｉｏ―Ｇｅｌ Ａ１５ｍカラ
ム（１６×８０cm）にアプライし、各１ccを分画した。
それぞれの画分を実施例１にて構築した測定系に供した
（図５（ａ））。一方、精製したヒトＳＰ―Ａを同様に
Ｂｉｏ―ＧｅｌＡ１５ｍカラムにアプライし、同様に実
施例１と測定系に供した（図５（ｂ））。分子量マーカ
ーを同様にアプライした。分子量マーカーは以下の通り
である。

【００５２】 blue dextran（矢印ａ、２００万ダルトン） thyroglobulin （矢印ｂ、６７万ダルトン） ferritin（矢印ｃ、４４万ダルトン） 図５（ａ）から、血中のＳＰ―Ａ複合体の分子量は６０
〜２００万ダルトンであるのに比べ、精製ＳＰ―Ａは、
４４〜６７万ダルトンに分布しており、この両者は、そ
の分子量が明らかに異なることが示された。

【００５３】（２）ＰＥ―１０アフィニティカラムを用
いたＳＰ―Ａ複合体のウェスタンブロンティング 肺胞タンパク症の患者血清を、ＰＥ―１０同定Sepharos
e ４Ｂカラムにアプライし、結合した物質を溶出し、還
元条件下にてＳＤＳ―ＰＡＧＥおよびWesternBlotting
を行った。その結果を図６（Ａ）（Ｂ）にそれぞれ示す
（（Ａ）１０％ゲル、（Ｂ）１５％ゲル）。

【００５４】図６（Ａ）より、Ｐ１は分子量８０ｋＤ
ａ、Ｐ２は分子量５０ｋＤａ、Ｐ３は分子量２８ｋＤａ
であった。図６（Ｂ）よりＰ１は、ＩｇＭμchain （la
ne４）、Ｐ２はＩｇＧγchain （lane３）であることが
わかった。またantiＳＰ―ＡのＰＥ―１０およびantiＳ
Ｐ―Ａ ＩｇＧによるWestern Blotting（lane６、lane
８）により、本複合体にＳＰ―ＡとＩｇＧとＩｇＭが含
有されていることが確認された。

【００５５】（３）精製ＳＰ―ＡのヒトＩｇＧ結合性の
検討 ヒトＩｇＧをプラスチック製マイクロプレートの固相に
しき、精製ＳＰ―ＡのＩｇＧ反応性を検討した。その結
果を図７に示す。

【００５６】図７に示すように、固相ヒトＩｇＧへのＳ
Ｐ―Ａの高い結合性がうかがわれた。なお、ダニ抗原、
抗ダニ抗原は、コントロールのための実験である。

【００５７】

【実施例３】 検体の測定 実施例１によって確立した測定系を用いて、肺胞タンパ
ク症（ＰＡＰ）、間質性肺炎（ＩＰＦ）、サルコイドー
シス（ＳＡ）、肺炎（Ｐｎ）、肺結核（Ｔｂｃ）の患者
について、その血清中の肺組織障害マーカー値を測定し
た。対象として、健常人の血清中のそれも測定した。

【００５８】結果を図８に示す。これらの結果から、明
らかに間質性肺炎、肺胞タンパク症患者血清中で、高値
を示した。

【００５９】一方、サルコイド―シス，肺結核（Ｔｂ
ｃ）では陽性を示さず、本発明のヒト血中の肺疾患マー
カー蛋白測定法は、上記種々の疾患の鑑別診断やそれら
疾患のモニタリングに有用である可能性が示された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＳＰ―Ａの構造である。

【図２】図２は、ＳＰ―Ａのtrimerサブユニット構造で
ある。

【図３】図３は、ＳＰ―ＡのＣ型レクチン構造である。

【図４】図４は、実施例１の（４）で界面活性剤の重量
比を変えて免疫反応を行なったときの測定値を示す。

【図５】図５は、血清ＳＰ―Ａ複合体（Ａ）と、精製Ｓ
Ｐ―Ａ（Ｂ）のゲル濾過パターンを示す（実施例２の
（１））。

【図６】図６は、実施例２の（２）で、血清ＳＰ―Ａ複
合体を、アフィニティ精製後、イムノブロット分析した
結果を示す。

【図７】図７は、実施例２の（３）で、ヒトＩｇＧに対
するＳＰ―Ａの結合性を検討した結果を示す。

【図８】図８は、患者検体（肺胞タンパク症（ＰＡ
Ｐ）、間質性肺炎（ＩＰＦ）、サルコイドーシス（Ｓ
Ａ）、肺炎（Ｐｎ）、結核（Ｔｂｃ））を、本発明の免
疫測定法で測定した結果を示す。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血中に存在するレクチンとイムノグ
   ロブリンの複合体。
2. 【請求項２】 レクチンがＣ型レクチンであることを特
   徴とする請求項１記載の複合体。
3. 【請求項３】 レクチンが、肺サーファクタントアポタ
   ンパクＡ（ＳＰ―Ａ）であることを特徴とする請求項１
   記載の複合体。
4. 【請求項４】 イムノグロブリンが、ＩｇＧであること
   を特徴とする請求項１記載の複合体。
5. 【請求項５】 イムノグロブリンが、ＩｇＭであること
   を特徴とする請求項１記載の複合体。
6. 【請求項６】 ヒト血中に存在するレクチンとイムノグ
   ロブリンとの複合体中のレクチンを特異的に測定する免
   疫学的測定方法。
7. 【請求項７】 レクチンがＣ型レクチンであることを特
   徴とする請求項６記載の測定方法。
8. 【請求項８】 レクチンが、肺サーファクタントアポタ
   ンパクＡ（ＳＰ―Ａ）であることを特徴とする請求項６
   記載の測定方法。
9. 【請求項９】 イムノグロブリンが、ＩｇＧであること
   を特徴とする請求項６記載の測定方法。
10. 【請求項１０】 イムノグロブリンが、ＩｇＭであるこ
    とを特徴とする請求項６記載の測定方法。
11. 【請求項１１】 ヒト血中に存在するレクチンとイムノ
    グロブリン複合体の免疫学的測定方法。
12. 【請求項１２】 免疫反応系に、非イオンおよび陰イオ
    ン界面活性剤を同時に存在させることを特徴とする請求
    項６記載および１１記載の測定方法。
13. 【請求項１３】 陰イオン界面活性剤がアルキルスルホ
    ン酸塩類である請求項１２記載の測定方法。
14. 【請求項１４】 非イオン界面活性剤が、ポリオキシエ
    チレンアルキルフェノールエーテル類である請求項１２
    記載の測定方法。
15. 【請求項１５】 陰イオン界面活性剤が、アルキルスル
    ホン酸塩類で、非イオン界面活性剤がポリオキシエチレ
    ンアルキルフェノールエーテル類である請求項１２記載
    の測定方法。