JPH07309895A - 新規タンパク質、その検出方法及び診断薬 - Google Patents
新規タンパク質、その検出方法及び診断薬Info
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- JPH07309895A JPH07309895A JP13104294A JP13104294A JPH07309895A JP H07309895 A JPH07309895 A JP H07309895A JP 13104294 A JP13104294 A JP 13104294A JP 13104294 A JP13104294 A JP 13104294A JP H07309895 A JPH07309895 A JP H07309895A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来癌マーカーが知られていない腎臓癌、膀
胱癌を包含する泌尿器系癌のマーカーとして利用できる
新規なタンパク質、該タンパク質を検出する方法及び該
タンパク質を検出することができる泌尿器系癌診断薬を
提供すること。 【構成】 泌尿器系癌患者の尿中に存在し、健常人尿中
には検出されず、分子量が約８０ｋＤａであり、５．２
０から６．５０の間に等電点を持ち、抗カテプシンＢモ
ノクローナル抗体ＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８２）及
びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）と抗原抗体反
応するタンパク質、該タンパク質と抗原抗体反応する抗
体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的に検体中
の該タンパク質を検出又は定量する方法及び該タンパク
質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含
む泌尿器系癌診断薬を提供した。
胱癌を包含する泌尿器系癌のマーカーとして利用できる
新規なタンパク質、該タンパク質を検出する方法及び該
タンパク質を検出することができる泌尿器系癌診断薬を
提供すること。 【構成】 泌尿器系癌患者の尿中に存在し、健常人尿中
には検出されず、分子量が約８０ｋＤａであり、５．２
０から６．５０の間に等電点を持ち、抗カテプシンＢモ
ノクローナル抗体ＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８２）及
びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）と抗原抗体反
応するタンパク質、該タンパク質と抗原抗体反応する抗
体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的に検体中
の該タンパク質を検出又は定量する方法及び該タンパク
質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含
む泌尿器系癌診断薬を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、泌尿器系癌の癌マーカ
ーとして利用できる新規タンパク質、その検出方法及び
該タンパク質を検出することができる泌尿器系癌診断薬
に関する。
ーとして利用できる新規タンパク質、その検出方法及び
該タンパク質を検出することができる泌尿器系癌診断薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】泌尿器系癌のうち、腎臓癌、膀胱癌に対
する特異的な癌マーカーは知られていない。膀胱癌の場
合、尿細胞診がスクリーニングに用いられている。前立
腺癌のマーカーとして、血清前立腺由来酸性ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ）の測定が知られている（活性測定、ＥＩ
Ａ、ＲＩＡ）。
する特異的な癌マーカーは知られていない。膀胱癌の場
合、尿細胞診がスクリーニングに用いられている。前立
腺癌のマーカーとして、血清前立腺由来酸性ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ）の測定が知られている（活性測定、ＥＩ
Ａ、ＲＩＡ）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
癌マーカーが知られていない腎臓癌、膀胱癌を包含する
泌尿器系癌のマーカーとして利用できる新規なタンパク
質を提供することである。また、本発明の目的は、該タ
ンパク質を検出する方法を提供することである。さら
に、本発明の目的は、該タンパク質を検出することがで
きる泌尿器系癌診断薬を提供することである。
癌マーカーが知られていない腎臓癌、膀胱癌を包含する
泌尿器系癌のマーカーとして利用できる新規なタンパク
質を提供することである。また、本発明の目的は、該タ
ンパク質を検出する方法を提供することである。さら
に、本発明の目的は、該タンパク質を検出することがで
きる泌尿器系癌診断薬を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、ヒトカ
テプシンＢに対するモノクローナル抗体を作製し、それ
を用いて種々の生物学的検体中の成分を免疫測定してい
たところ、、抗ヒトカテプシンＢ抗体と抗原抗体反応す
るがヒトカテプシンＢではない未知のタンパク質が泌尿
器系癌患者の尿中に特異的に存在することを見出し、該
タンパク質をさらに特徴付け、本発明を完成した。
テプシンＢに対するモノクローナル抗体を作製し、それ
を用いて種々の生物学的検体中の成分を免疫測定してい
たところ、、抗ヒトカテプシンＢ抗体と抗原抗体反応す
るがヒトカテプシンＢではない未知のタンパク質が泌尿
器系癌患者の尿中に特異的に存在することを見出し、該
タンパク質をさらに特徴付け、本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は、泌尿器系癌患者の尿
中に存在し、健常人尿中には検出されず、分子量が約８
０ｋＤａであり、５．２０から６．５０の間に等電点を
持ち、抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ１−１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３６８２）及びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６８５）と抗原抗体反応するタンパク質を提供する。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質と抗原抗体反
応する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的
に検体中の上記本発明のタンパク質を検出又は定量する
方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタン
パク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片
を含む泌尿器系癌診断薬を提供する。
中に存在し、健常人尿中には検出されず、分子量が約８
０ｋＤａであり、５．２０から６．５０の間に等電点を
持ち、抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ１−１
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３６８２）及びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６８５）と抗原抗体反応するタンパク質を提供する。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質と抗原抗体反
応する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的
に検体中の上記本発明のタンパク質を検出又は定量する
方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のタン
パク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片
を含む泌尿器系癌診断薬を提供する。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明のタンパク質は、上述のように、泌
尿器系癌患者の尿中に存在するが、健常人の尿中には検
出されない。従って、本発明のタンパク質は泌尿器系癌
のマーカーとして利用できる。ここで、泌尿器系癌とは
腎臓癌、膀胱癌及び前立腺癌を包含する。
尿器系癌患者の尿中に存在するが、健常人の尿中には検
出されない。従って、本発明のタンパク質は泌尿器系癌
のマーカーとして利用できる。ここで、泌尿器系癌とは
腎臓癌、膀胱癌及び前立腺癌を包含する。
【０００８】本発明のタンパク質の分子量は、後述の実
施例で詳述するウェスタンブロット法により測定した分
子量が約８０ｋＤａである。従って、このタンパク質
は、抗カテプシンＢ抗体と抗原抗体反応するがカテプシ
ンＢとは異なる物質である。また、本発明のタンパク質
は５．２０から６．５０の間に等電点を持つ。
施例で詳述するウェスタンブロット法により測定した分
子量が約８０ｋＤａである。従って、このタンパク質
は、抗カテプシンＢ抗体と抗原抗体反応するがカテプシ
ンＢとは異なる物質である。また、本発明のタンパク質
は５．２０から６．５０の間に等電点を持つ。
【０００９】本発明のタンパク質は、抗カテプシンＢモ
ノクローナル抗体ＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８２）及
びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）と抗原抗体反
応する。抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ１−
１は、ヒトプロカテプシンＢのアミノ酸配列のうち、８
０番から９２番のアミノ酸配列であるＬｅｕ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎの合成ペプチド
をキャリアタンパク質としてのウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）に結合したものを免疫原として用いて得られたモ
ノクローナル抗体であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗体
反応する。抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ２
−２は、ヒトプロカテプシンＢのアミノ酸配列のうち、
２９５番より３０９番目のアミノ酸配列であるＬｅｕ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅの合成ペプチドをキャリアタンパク質として
のＢＳＡに結合したものを免疫原として用いて得られた
モノクローナル抗体であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗
体反応する。また、抗カテプシンＢモノクローナル抗体
ＲＢ１は、遺伝子工学的に作製されたヒトプロカテプシ
ンＢを免疫原として用いて得られたモノクローナル抗体
であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗体反応することか
ら、その対応エピトープはプロカテプシンＢのマチュア
部（成熟部）に存在する。
ノクローナル抗体ＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８２）及
びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）と抗原抗体反
応する。抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ１−
１は、ヒトプロカテプシンＢのアミノ酸配列のうち、８
０番から９２番のアミノ酸配列であるＬｅｕ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎの合成ペプチド
をキャリアタンパク質としてのウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）に結合したものを免疫原として用いて得られたモ
ノクローナル抗体であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗体
反応する。抗カテプシンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ２
−２は、ヒトプロカテプシンＢのアミノ酸配列のうち、
２９５番より３０９番目のアミノ酸配列であるＬｅｕ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅの合成ペプチドをキャリアタンパク質として
のＢＳＡに結合したものを免疫原として用いて得られた
モノクローナル抗体であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗
体反応する。また、抗カテプシンＢモノクローナル抗体
ＲＢ１は、遺伝子工学的に作製されたヒトプロカテプシ
ンＢを免疫原として用いて得られたモノクローナル抗体
であり、ヒトカテプシンＢと抗原抗体反応することか
ら、その対応エピトープはプロカテプシンＢのマチュア
部（成熟部）に存在する。
【００１０】本発明のタンパク質は、上記のような抗ヒ
トカテプシンＢモノクローナル抗体と反応することか
ら、ヒトカテプシンＢと少なくとも部分的に共通のアミ
ノ酸配列を有することは明らかであるが、ヒトカテプシ
ンＢの分子量は約２８ｋＤａであるから、分子量が全く
異なっている。なお、本発明のタンパク質は、ヒトカテ
プシンＢと少なくとも部分的に共通のアミノ酸配列を有
するものであるから、言うまでもなく、抗ヒトカテプシ
ンＢポリクローナル抗体とは抗原抗体反応する。
トカテプシンＢモノクローナル抗体と反応することか
ら、ヒトカテプシンＢと少なくとも部分的に共通のアミ
ノ酸配列を有することは明らかであるが、ヒトカテプシ
ンＢの分子量は約２８ｋＤａであるから、分子量が全く
異なっている。なお、本発明のタンパク質は、ヒトカテ
プシンＢと少なくとも部分的に共通のアミノ酸配列を有
するものであるから、言うまでもなく、抗ヒトカテプシ
ンＢポリクローナル抗体とは抗原抗体反応する。
【００１１】本発明のタンパク質（以下、ｐ８０という
ことがある）は、後述の実施例に詳述するように、尿の
遠心上清をウェスタンブロット法にかけることにより単
離することができる。すなわち、尿の遠心上清を電気泳
動にかけ、そのパターンをニトロセルロースろ紙等の上
に転写し、標識した上記ヒトカテプシンＢモノクローナ
ル抗体を反応させてｐ８０の存在するバンドを特定し、
これをろ紙から常法により溶出して抗原抗体複合物から
ｐ８０を分離することにより単離することができる。
ことがある）は、後述の実施例に詳述するように、尿の
遠心上清をウェスタンブロット法にかけることにより単
離することができる。すなわち、尿の遠心上清を電気泳
動にかけ、そのパターンをニトロセルロースろ紙等の上
に転写し、標識した上記ヒトカテプシンＢモノクローナ
ル抗体を反応させてｐ８０の存在するバンドを特定し、
これをろ紙から常法により溶出して抗原抗体複合物から
ｐ８０を分離することにより単離することができる。
【００１２】ｐ８０は、免疫原として用いることにより
それと抗原抗体反応する抗体を作製するために用いるこ
とができ、このような抗体は後述のように泌尿器系癌の
診断薬としての用途を有する。また、ｐ８０は、競合法
により検体中のｐ８０を検出又は定量するための試薬と
しての用途も有する。
それと抗原抗体反応する抗体を作製するために用いるこ
とができ、このような抗体は後述のように泌尿器系癌の
診断薬としての用途を有する。また、ｐ８０は、競合法
により検体中のｐ８０を検出又は定量するための試薬と
しての用途も有する。
【００１３】上述のように、本発明はまた、上記本発明
のタンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合
性断片を用いて、免疫学的に検体中の本発明のタンパク
質を検出又は定量する方法を提供する。ここで用いられ
る抗体としては、本発明のタンパク質と抗原抗体反応す
るものであればいずれのものでもよく、上記した抗ヒト
カテプシンＢモノクローナル抗体や抗ヒトカテプシンＢ
ポリクローナル抗体を用いることができる。また、本発
明のタンパク質を免疫原として常法により得られるモノ
クローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよ
い。なお、検出は、抗体を用いてもよいが、その抗原結
合性断片、すなわち、ＦａｂフラグメントやＦ（ａ
ｂ’）2 フラグメントを用いることもできる。
のタンパク質と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合
性断片を用いて、免疫学的に検体中の本発明のタンパク
質を検出又は定量する方法を提供する。ここで用いられ
る抗体としては、本発明のタンパク質と抗原抗体反応す
るものであればいずれのものでもよく、上記した抗ヒト
カテプシンＢモノクローナル抗体や抗ヒトカテプシンＢ
ポリクローナル抗体を用いることができる。また、本発
明のタンパク質を免疫原として常法により得られるモノ
クローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよ
い。なお、検出は、抗体を用いてもよいが、その抗原結
合性断片、すなわち、ＦａｂフラグメントやＦ（ａ
ｂ’）2 フラグメントを用いることもできる。
【００１４】抗原抗体反応を利用して検体中の抗原を検
出又は定量する免疫測定方法自体はこの分野において周
知であり、周知のいかなる方法をも採用することができ
る。すなわち、測定様式としては、サンドイッチ法、競
合法、凝集法等を用いることができ、また、標識として
は、酵素標識、放射標識、蛍光標識等を用いることがで
きる。さらに、下記実施例に詳述するような、ウェスタ
ンブロット法を用いることもできる。
出又は定量する免疫測定方法自体はこの分野において周
知であり、周知のいかなる方法をも採用することができ
る。すなわち、測定様式としては、サンドイッチ法、競
合法、凝集法等を用いることができ、また、標識として
は、酵素標識、放射標識、蛍光標識等を用いることがで
きる。さらに、下記実施例に詳述するような、ウェスタ
ンブロット法を用いることもできる。
【００１５】上記方法のうち、簡便で広く用いられてい
るサンドイッチ法について、その好ましい態様をより詳
細に説明するが、あくまでも一例であってこれに限定さ
れるものではない。
るサンドイッチ法について、その好ましい態様をより詳
細に説明するが、あくまでも一例であってこれに限定さ
れるものではない。
【００１６】ｐ８０と抗原抗体反応するモノクローナル
抗体（例えば上記抗ヒトカテプシンＢモノクローナル抗
体）（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチ
ック容器）に固定化する（以下、これを固定抗体とい
う）。
抗体（例えば上記抗ヒトカテプシンＢモノクローナル抗
体）（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチ
ック容器）に固定化する（以下、これを固定抗体とい
う）。
【００１７】次に、不溶性担体と測定しようとする試薬
又は検体との非特異的吸着を避けるために、適当な物質
（例えばＢＳＡ）で不溶化担体の表面を被覆する。この
ようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性担体
を、検体と共にインキュベートする。検体は希釈したも
のであってもよく、その場合、希釈は一般にリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で行う。このインキュベーション
の間に固定化抗体と検体中のｐ８０が結合する（検体中
にもし存在すれば）。次いで、適当な洗浄液で洗浄後、
適当な標識物質（例えば酵素）で標識した、ｐ８０と抗
原抗体反応する第２抗体の溶液を不溶性担体における固
相抗体に結合したｐ８０と一定時間及び温度で接触さ
せ、第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗っ
た後、不溶性担体上の固相抗体とｐ８０を介して結合し
て存在する第２抗体に標識された標識物質の量を測定す
る。かくして、その値によって検体中のｐ８０を検出又
は定量することができる。
又は検体との非特異的吸着を避けるために、適当な物質
（例えばＢＳＡ）で不溶化担体の表面を被覆する。この
ようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性担体
を、検体と共にインキュベートする。検体は希釈したも
のであってもよく、その場合、希釈は一般にリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で行う。このインキュベーション
の間に固定化抗体と検体中のｐ８０が結合する（検体中
にもし存在すれば）。次いで、適当な洗浄液で洗浄後、
適当な標識物質（例えば酵素）で標識した、ｐ８０と抗
原抗体反応する第２抗体の溶液を不溶性担体における固
相抗体に結合したｐ８０と一定時間及び温度で接触さ
せ、第２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗っ
た後、不溶性担体上の固相抗体とｐ８０を介して結合し
て存在する第２抗体に標識された標識物質の量を測定す
る。かくして、その値によって検体中のｐ８０を検出又
は定量することができる。
【００１８】ここで使用する不溶性担体としては、例え
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
エステル、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高
分子物質、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこ
れらの組合せ等がある。形状も、トレイ状、球状等種々
の形状であることができる。また、標識抗体の標識物質
としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等
を使用するのが有利である。
ばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
エステル、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高
分子物質、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこ
れらの組合せ等がある。形状も、トレイ状、球状等種々
の形状であることができる。また、標識抗体の標識物質
としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等
を使用するのが有利である。
【００１９】酵素として、ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが、蛍光
物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート等
が、発光物質としては、イソルシノール、ルシゲニン等
が、そして放射性物質としては125Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、
3Ｈ等を用いることができる。しかし、これらは例示し
たものに限らず、免疫測定法に使用し得るものであれ
ば、他のものでも使用できる。
フォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼが、蛍光
物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート等
が、発光物質としては、イソルシノール、ルシゲニン等
が、そして放射性物質としては125Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、
3Ｈ等を用いることができる。しかし、これらは例示し
たものに限らず、免疫測定法に使用し得るものであれ
ば、他のものでも使用できる。
【００２０】標識酵素としてペルオキシダーゼを用いる
場合は、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ
−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸等を、標
識酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基
質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェイト等を、標識
酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質
として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド等を用いることができる。
場合は、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ
−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸等を、標
識酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は、基
質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェイト等を、標識
酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、基質
として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド等を用いることができる。
【００２１】なお、検体としては尿検体が好ましい。尿
検体は、尿そのままでもよいが、尿の遠心上清又はその
希釈物であることが好ましい。尿検体中のｐ８０を検出
又は定量することにより、泌尿器系癌を診断することが
できる。
検体は、尿そのままでもよいが、尿の遠心上清又はその
希釈物であることが好ましい。尿検体中のｐ８０を検出
又は定量することにより、泌尿器系癌を診断することが
できる。
【００２２】上記した、本発明の方法に用いられる抗体
（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）、その
抗原結合性断片やそれを上記のような標識物質で標識し
たものは、あるいは、それをさらに固相に結合したもの
は、泌尿器系癌の診断薬として用いることができる。該
診断薬は、上記した免疫測定方法に用いることができ、
これを用いて尿検体中にｐ８０が検出されれば、泌尿器
系の癌である可能性が高いと診断できる。
（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体）、その
抗原結合性断片やそれを上記のような標識物質で標識し
たものは、あるいは、それをさらに固相に結合したもの
は、泌尿器系癌の診断薬として用いることができる。該
診断薬は、上記した免疫測定方法に用いることができ、
これを用いて尿検体中にｐ８０が検出されれば、泌尿器
系の癌である可能性が高いと診断できる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２４】実施例１ ウェスタンブロッティング法に
よる尿中ｐ８０の検出 健常人尿及び泌尿器系癌患者尿を３０００ｘｇで２０分
間遠心分離した後、その上清をＳＤＳ電気泳動用バッフ
ァー（１．５％ＳＤＳ，１．５％２−メルカプトエタノ
ール含有トリス−塩酸バッファー、ｐＨ８．９）と２容
対１容で混合し、１００℃で２分間加熱処理した後、Ｓ
ＤＳ電気泳動を行った。電気泳動後、常法に従ってウェ
スタンブロッティング用膜に転写し、ＳＢＭ１−１抗
体、ＳＢＭ２−２抗体、ＲＢ１抗体、抗ヒトカテプシン
Ｂポリクローナル抗体と反応させた後、アルカリフォス
ファターゼ標識２次抗体を反応させ、発色を行った。そ
の結果、分子量約８０ｋＤａのバンドが、泌尿器系癌患
者尿に特異的に検出されたが、健常人尿中には検出され
なかった。下記表１に泌尿器系癌の種類とｐ８０陽性率
との関係を示す。
よる尿中ｐ８０の検出 健常人尿及び泌尿器系癌患者尿を３０００ｘｇで２０分
間遠心分離した後、その上清をＳＤＳ電気泳動用バッフ
ァー（１．５％ＳＤＳ，１．５％２−メルカプトエタノ
ール含有トリス−塩酸バッファー、ｐＨ８．９）と２容
対１容で混合し、１００℃で２分間加熱処理した後、Ｓ
ＤＳ電気泳動を行った。電気泳動後、常法に従ってウェ
スタンブロッティング用膜に転写し、ＳＢＭ１−１抗
体、ＳＢＭ２−２抗体、ＲＢ１抗体、抗ヒトカテプシン
Ｂポリクローナル抗体と反応させた後、アルカリフォス
ファターゼ標識２次抗体を反応させ、発色を行った。そ
の結果、分子量約８０ｋＤａのバンドが、泌尿器系癌患
者尿に特異的に検出されたが、健常人尿中には検出され
なかった。下記表１に泌尿器系癌の種類とｐ８０陽性率
との関係を示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例２ サンドイッチエライザ法による
尿中ｐ８０の検出 下記方法により泌尿器系癌患者及び健常人尿中のｐ８０
を測定し、癌マーカーとしての有用性を検討した。
尿中ｐ８０の検出 下記方法により泌尿器系癌患者及び健常人尿中のｐ８０
を測定し、癌マーカーとしての有用性を検討した。
【００２７】１）尿検体の作製 泌尿器系癌患者及び健常人の尿を３０００ｘｇで２０分
間遠心分離し、その上清をリン酸緩衝液で中性化、ある
いはリン酸緩衝液で２〜５倍に希釈したものを尿検体と
した。
間遠心分離し、その上清をリン酸緩衝液で中性化、ある
いはリン酸緩衝液で２〜５倍に希釈したものを尿検体と
した。
【００２８】２）アッセイプレートの作製 ＳＢＭ１−１抗体をＰＢＳで希釈して２μｇ／ｍｌの濃
度にし、これを９６穴マイクロプレート（住友ベークラ
イト社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、３０℃
で２時間又は４℃で一晩放置し、抗体をプレートに結合
させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ）で洗浄後、ブロックＡｃｅ溶液（大日本製薬
社製）３２０μｌを各ウェルに分注し、４℃で一晩放置
し、ブロッキングを行った。
度にし、これを９６穴マイクロプレート（住友ベークラ
イト社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、３０℃
で２時間又は４℃で一晩放置し、抗体をプレートに結合
させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ）で洗浄後、ブロックＡｃｅ溶液（大日本製薬
社製）３２０μｌを各ウェルに分注し、４℃で一晩放置
し、ブロッキングを行った。
【００２９】３）免疫測定 １）で調製した尿検体を、２）で作製したアッセイプレ
ートのウェルに１００μｌ加え、３７℃で１時間反応さ
せた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、公知の方法（酵素
免疫測定法、石川栄治編、医学書院（東京）、１９８
２）によって、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトカテプ
シンＢポリクローナル抗体（１〜５μｇ／ｍｌの濃度に
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎｎで希釈）を１００μｌ加え、１時
間反応させた。次いで、アッセイプレートをＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎｎで洗浄後、ペルオキシダーゼ基質液１００μ
ｌを加え発色させた。基質液は、０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌにｏ−フェニレンジ
アミン１０ｍｇを溶解させた液に、３０％過酸化水素液
５μｌを添加して調製した。２０分（１０〜３０分の範
囲で選択可能）後、２Ｍ硫酸５０μｌを加えて反応を停
止させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
ートのウェルに１００μｌ加え、３７℃で１時間反応さ
せた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、公知の方法（酵素
免疫測定法、石川栄治編、医学書院（東京）、１９８
２）によって、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトカテプ
シンＢポリクローナル抗体（１〜５μｇ／ｍｌの濃度に
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎｎで希釈）を１００μｌ加え、１時
間反応させた。次いで、アッセイプレートをＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎｎで洗浄後、ペルオキシダーゼ基質液１００μ
ｌを加え発色させた。基質液は、０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌにｏ−フェニレンジ
アミン１０ｍｇを溶解させた液に、３０％過酸化水素液
５μｌを添加して調製した。２０分（１０〜３０分の範
囲で選択可能）後、２Ｍ硫酸５０μｌを加えて反応を停
止させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３０】この方法で健常人尿（５検体）、前立腺癌
患者尿（７検体）、腎臓癌患者尿（８検体）、膀胱癌患
者尿（５検体）を測定した。結果を表２に示す。
患者尿（７検体）、腎臓癌患者尿（８検体）、膀胱癌患
者尿（５検体）を測定した。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】 ＊健常人平均＋２ｘ標準偏差の値を超える検体を陽性と
する
する
【００３２】実施例３ ｐ８０の等電点測定 尿中ｐ８０の等電点をファルマシア社製ファーストシス
テムを用いて決定した。腎臓癌患者尿４μｌをファルマ
シア社製ＩＥＦ用ゲル（ｐＩ５〜８）で約３０分間分離
した後、ファーストシステムのマニュアルに従ってウェ
スタンブロッティング用膜に転写した。転写膜を、抗ヒ
トカテプシンＢポリクローナル抗体と反応させた後、ア
ルカリフォスファターゼ標識２次抗体を反応させ、発色
を行った。その結果、ｐＩ５．２〜６．５にかけて複数
のバンドが検出された。
テムを用いて決定した。腎臓癌患者尿４μｌをファルマ
シア社製ＩＥＦ用ゲル（ｐＩ５〜８）で約３０分間分離
した後、ファーストシステムのマニュアルに従ってウェ
スタンブロッティング用膜に転写した。転写膜を、抗ヒ
トカテプシンＢポリクローナル抗体と反応させた後、ア
ルカリフォスファターゼ標識２次抗体を反応させ、発色
を行った。その結果、ｐＩ５．２〜６．５にかけて複数
のバンドが検出された。
【００３３】この結果より、尿中ｐ８０はｐＩ５．２〜
６．５にかけて複数の等電点を持つことが判明した。
６．５にかけて複数の等電点を持つことが判明した。
【００３４】以上のように、本発明の尿中ｐ８０の検出
方法は、泌尿器系癌患者尿に高い陽性率を示すので、泌
尿器系癌の診断に有用である。
方法は、泌尿器系癌患者尿に高い陽性率を示すので、泌
尿器系癌の診断に有用である。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、泌尿器系癌のマーカーと
して有用な新規タンパク質が提供された。また、その検
出又は定量方法及び上記タンパク質を検出する泌尿器系
癌診断薬が提供された。従って、本発明は、泌尿器系癌
の診断に大いに貢献するものと期待される。
して有用な新規タンパク質が提供された。また、その検
出又は定量方法及び上記タンパク質を検出する泌尿器系
癌診断薬が提供された。従って、本発明は、泌尿器系癌
の診断に大いに貢献するものと期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 泌尿器系癌患者の尿中に存在し、健常人
尿中には検出されず、分子量が約８０ｋＤａであり、
５．２０から６．５０の間に等電点を持ち、抗カテプシ
ンＢモノクローナル抗体ＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３６８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８
２）及びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）と抗原
抗体反応するタンパク質。 - 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質と抗原抗体反
応する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的
に検体中の請求項１記載のタンパク質を検出又は定量す
る方法。 - 【請求項３】 前記抗体は抗ヒトカテプシンＢ抗体であ
る請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１記載のタンパク質と抗原抗体反
応する抗体又はその抗原結合性断片を含む泌尿器系癌診
断薬。 - 【請求項５】 前記抗体は抗ヒトカテプシンＢモノクロ
ーナル抗体である請求項８記載の診断薬。 - 【請求項６】 前記抗体はＳＢＭ１−１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３６８３）、ＳＢＭ２−２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６
８２）及びＲＢ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６８５）であ
る請求項５記載の診断薬。 - 【請求項７】 前記抗体は抗ヒトカテプシンＢポリクロ
ーナル抗体である請求項８記載の診断薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13104294A JPH07309895A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 新規タンパク質、その検出方法及び診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13104294A JPH07309895A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 新規タンパク質、その検出方法及び診断薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07309895A true JPH07309895A (ja) | 1995-11-28 |
Family
ID=15048667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13104294A Pending JPH07309895A (ja) | 1994-05-20 | 1994-05-20 | 新規タンパク質、その検出方法及び診断薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07309895A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051824A1 (en) * | 1997-05-15 | 1998-11-19 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract |
| WO1998055656A1 (en) * | 1997-06-05 | 1998-12-10 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract |
| WO1999002734A1 (en) * | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract |
| WO2002094881A3 (en) * | 2001-05-18 | 2003-11-27 | Krka Tovarna Zdravil D D Novo | Monoclonal antibody neutralising cathepsin b activity and uses thereof |
| WO2007026895A1 (ja) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Toray Industries, Inc. | 尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法 |
| WO2013101611A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular Inc. | Materials and methods for diagnosis of bladder cancer and monitoring recurrence thereof |
-
1994
- 1994-05-20 JP JP13104294A patent/JPH07309895A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051824A1 (en) * | 1997-05-15 | 1998-11-19 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract |
| WO1998055656A1 (en) * | 1997-06-05 | 1998-12-10 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract |
| US6949357B2 (en) | 1997-06-05 | 2005-09-27 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract |
| WO1999002734A1 (en) * | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the urinary tract |
| WO2002094881A3 (en) * | 2001-05-18 | 2003-11-27 | Krka Tovarna Zdravil D D Novo | Monoclonal antibody neutralising cathepsin b activity and uses thereof |
| WO2007026895A1 (ja) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Toray Industries, Inc. | 尿路上皮ガンの検出用キットおよび方法 |
| WO2013101611A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular Inc. | Materials and methods for diagnosis of bladder cancer and monitoring recurrence thereof |
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