JPH05317037A - 酵母ｅｒｄ２遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法 - Google Patents
酵母ｅｒｄ２遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法Info
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- JPH05317037A JPH05317037A JP3311601A JP31160191A JPH05317037A JP H05317037 A JPH05317037 A JP H05317037A JP 3311601 A JP3311601 A JP 3311601A JP 31160191 A JP31160191 A JP 31160191A JP H05317037 A JPH05317037 A JP H05317037A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又
はその類似体をコードする遺伝子を含む発現単位と、Ｅ
ＲＤ２のリガンドとしての小胞体残留シグナル含有小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体、上記２つの発現単位と、該小胞体局在蛋白
質の機能の対象となる基質としてのポリペプチドをコー
ドする外来遺伝子を含む発現単位とを共発現可能な状態
で酵母染色体上に導入して得られる別の形質転換体、並
びに、この形質転換体を培養し共発現させて該ポリペプ
チドを優先的に細胞外に分泌させる、ポリペプチドの製
造方法に関する。 【効果】 上記ポリペプチドの精製を容易にし且つ収率
を高め、全体的にその生産効率を向上させる。
はその類似体をコードする遺伝子を含む発現単位と、Ｅ
ＲＤ２のリガンドとしての小胞体残留シグナル含有小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体、上記２つの発現単位と、該小胞体局在蛋白
質の機能の対象となる基質としてのポリペプチドをコー
ドする外来遺伝子を含む発現単位とを共発現可能な状態
で酵母染色体上に導入して得られる別の形質転換体、並
びに、この形質転換体を培養し共発現させて該ポリペプ
チドを優先的に細胞外に分泌させる、ポリペプチドの製
造方法に関する。 【効果】 上記ポリペプチドの精製を容易にし且つ収率
を高め、全体的にその生産効率を向上させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母由来受容体蛋白質
ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子を含む発現
単位と、該蛋白質のリガンドとしての小胞体残留シグナ
ル含有小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現
単位とを、共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込ん
で得られる形質転換体に関する。本発明はまた、このよ
うな形質転換体にさらに、該小胞体局在蛋白質の機能の
対象となる基質としてのポリペプチドをコードする外来
遺伝子を含む発現単位を導入した別の形質転換体、及
び、この形質転換体を培養し共発現させて該ポリペプチ
ドを優先的に細胞外に分泌させる、ポリペプチドの製造
方法に関する。
ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子を含む発現
単位と、該蛋白質のリガンドとしての小胞体残留シグナ
ル含有小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現
単位とを、共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込ん
で得られる形質転換体に関する。本発明はまた、このよ
うな形質転換体にさらに、該小胞体局在蛋白質の機能の
対象となる基質としてのポリペプチドをコードする外来
遺伝子を含む発現単位を導入した別の形質転換体、及
び、この形質転換体を培養し共発現させて該ポリペプチ
ドを優先的に細胞外に分泌させる、ポリペプチドの製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】真核細胞において分泌蛋白質は、小胞
体、ゴルジ体、さらには分泌顆粒を経て細胞外へと運ば
れていくが、この過程は「bulk flow 」と呼ばれる受動
的な流れとしてとらえられている。一方、小胞体内腔に
局在する蛋白質は、ポリペプチドの合成後、分泌蛋白質
と同様に小胞体にとりこまれた後、「bulk flow 」に乗
るが、これらはゴルジ体から再び小胞体へと運ばれる何
らかの機構により小胞体に残留するものと考えられてい
た。哺乳動物の小胞体内腔に局在する様々な蛋白質の一
次構造が決定され、それらのうちのいくつかの蛋白質、
即ち、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤ
Ｉ）、glucose-regulated protein 78（grp78 、免疫グ
ロブリン重鎖結合蛋白質であるＢｉｐと同一）及びgluc
ose-regulated protein 94（grp94 ）などで、そのＣ末
端にアミノ酸４残基からなる共通配列「ＫＤＥＬ」（酵
母では「ＨＤＥＬ」である）が見いだされ、さらに、酵
母の系でｇｒｐ７８の欠失変異蛋白質は細胞外に分泌さ
れてしまうこと、あるいは、分泌蛋白質であるリゾチー
ムのＣ末端に「ＨＤＥＬ」を付加することによりリゾチ
ームを小胞体内に留めることができることなどから、こ
の配列が蛋白質を小胞体内腔に局在させるための小胞体
残留シグナルとして働くことが示唆された［Munro, S.
とPelham,H.R.B. (1987) Cell 48, 899; Pelham, H.R.
B., Hardwick, K.G. およびLewis, M.J. (1988) EMBO
J. 7, 1757］。即ち、小胞体あるいはゴルジ体に「ＫＤ
ＥＬ」あるいは「ＨＤＥＬ」配列に対する受容体が存在
し、この受容体がＣ末端にこれらの配列をもつ蛋白質の
小胞体への局在化を制御しているものと考えられた。
体、ゴルジ体、さらには分泌顆粒を経て細胞外へと運ば
れていくが、この過程は「bulk flow 」と呼ばれる受動
的な流れとしてとらえられている。一方、小胞体内腔に
局在する蛋白質は、ポリペプチドの合成後、分泌蛋白質
と同様に小胞体にとりこまれた後、「bulk flow 」に乗
るが、これらはゴルジ体から再び小胞体へと運ばれる何
らかの機構により小胞体に残留するものと考えられてい
た。哺乳動物の小胞体内腔に局在する様々な蛋白質の一
次構造が決定され、それらのうちのいくつかの蛋白質、
即ち、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤ
Ｉ）、glucose-regulated protein 78（grp78 、免疫グ
ロブリン重鎖結合蛋白質であるＢｉｐと同一）及びgluc
ose-regulated protein 94（grp94 ）などで、そのＣ末
端にアミノ酸４残基からなる共通配列「ＫＤＥＬ」（酵
母では「ＨＤＥＬ」である）が見いだされ、さらに、酵
母の系でｇｒｐ７８の欠失変異蛋白質は細胞外に分泌さ
れてしまうこと、あるいは、分泌蛋白質であるリゾチー
ムのＣ末端に「ＨＤＥＬ」を付加することによりリゾチ
ームを小胞体内に留めることができることなどから、こ
の配列が蛋白質を小胞体内腔に局在させるための小胞体
残留シグナルとして働くことが示唆された［Munro, S.
とPelham,H.R.B. (1987) Cell 48, 899; Pelham, H.R.
B., Hardwick, K.G. およびLewis, M.J. (1988) EMBO
J. 7, 1757］。即ち、小胞体あるいはゴルジ体に「ＫＤ
ＥＬ」あるいは「ＨＤＥＬ」配列に対する受容体が存在
し、この受容体がＣ末端にこれらの配列をもつ蛋白質の
小胞体への局在化を制御しているものと考えられた。
【０００３】その後、「ＨＤＥＬ」配列をもつ蛋白質が
小胞体に留まらずに分泌経路に入ってしまう酵母変異株
ｅｒｄ２の解析から酵母の小胞体残留シグナル受容体が
同定され、また、哺乳動物でも「ＫＤＥＬ」に対する抗
イディオタイプ抗体を用いた解析により同受容体が同定
された［Semenza, J.C., Hardwick, K.G., Dean,N.お
よび Pelham, H.R.B. (1990) Cell 61, 1349; Vaux,
D., Tooze, J. および Fuller, S. (1990) Nature 34
5, 495 ］。酵母の「ＨＤＥＬ」受容体は、その遺伝子
構造が明らかにされ、一次配列が推定され、その結果分
子量は２６ｋｄであった。一方、抗イディオタイプ抗体
によって同定された哺乳類の「ＫＤＥＬ」受容体は、分
子量が７２ｋｄであり、両者は異なるものである可能性
が示唆された。後に、クロスハイブリダイゼーションに
より酵母の「ＨＤＥＬ」受容体と相同的な蛋白質の遺伝
子が哺乳動物でもクローン化された［Lewis, M.J. とPe
lham,H.R.B. (1990) Nature 348, 162 ］。現在のと
ころ、哺乳動物の細胞では、２つの別種の残留シグナル
受容体が互いに関係をもって機能しているのか、あるい
は互いに独立に機能しているのかは不明である。
小胞体に留まらずに分泌経路に入ってしまう酵母変異株
ｅｒｄ２の解析から酵母の小胞体残留シグナル受容体が
同定され、また、哺乳動物でも「ＫＤＥＬ」に対する抗
イディオタイプ抗体を用いた解析により同受容体が同定
された［Semenza, J.C., Hardwick, K.G., Dean,N.お
よび Pelham, H.R.B. (1990) Cell 61, 1349; Vaux,
D., Tooze, J. および Fuller, S. (1990) Nature 34
5, 495 ］。酵母の「ＨＤＥＬ」受容体は、その遺伝子
構造が明らかにされ、一次配列が推定され、その結果分
子量は２６ｋｄであった。一方、抗イディオタイプ抗体
によって同定された哺乳類の「ＫＤＥＬ」受容体は、分
子量が７２ｋｄであり、両者は異なるものである可能性
が示唆された。後に、クロスハイブリダイゼーションに
より酵母の「ＨＤＥＬ」受容体と相同的な蛋白質の遺伝
子が哺乳動物でもクローン化された［Lewis, M.J. とPe
lham,H.R.B. (1990) Nature 348, 162 ］。現在のと
ころ、哺乳動物の細胞では、２つの別種の残留シグナル
受容体が互いに関係をもって機能しているのか、あるい
は互いに独立に機能しているのかは不明である。
【０００４】また、小胞体残留シグナルとしては、「Ｋ
ＤＥＬ」、「ＨＤＥＬ」のほかに「ＤＤＥＬ」、「ＡＤ
ＥＬ」、「ＳＤＥＬ」、「ＲＤＥＬ」、「ＫＥＥＬ」、
「ＱＥＤＬ」、「ＨＩＥＬ」、「ＨＴＥＬ」、あるいは
「ＫＱＤＬ」なる相同的な配列が知られており、これら
をもつポリペプチドも上記の受容体を介して小胞体に残
留するものと考えられている［Pelham, H.R.B. (1990)
TIBS 15, 483 ］。
ＤＥＬ」、「ＨＤＥＬ」のほかに「ＤＤＥＬ」、「ＡＤ
ＥＬ」、「ＳＤＥＬ」、「ＲＤＥＬ」、「ＫＥＥＬ」、
「ＱＥＤＬ」、「ＨＩＥＬ」、「ＨＴＥＬ」、あるいは
「ＫＱＤＬ」なる相同的な配列が知られており、これら
をもつポリペプチドも上記の受容体を介して小胞体に残
留するものと考えられている［Pelham, H.R.B. (1990)
TIBS 15, 483 ］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】酵母などの細胞で外来
の蛋白質を発現分泌させる際に、その蛋白質の翻訳以降
の過程でフォールディング促進酵素（例えば、ＰＤＩ）
などの様々な蛋白質の機能を共役させることにより、分
泌蛋白質の生産効率を上昇させる系が次第に開発されつ
つある（本出願人による特願平３−１１４０７４号）。
ここで、例えば、このような機能蛋白質が小胞体内腔に
局在するものである場合を考えると、その大量発現に伴
い本来小胞体に留まるべき機能蛋白質がその受容体の受
容能を超えることにより細胞外へと漏れだしてしまうこ
とが予想される。このような系では、もともとの目的と
する、分泌生産させて回収すべき有用蛋白質の精製が不
利となろう。
の蛋白質を発現分泌させる際に、その蛋白質の翻訳以降
の過程でフォールディング促進酵素（例えば、ＰＤＩ）
などの様々な蛋白質の機能を共役させることにより、分
泌蛋白質の生産効率を上昇させる系が次第に開発されつ
つある（本出願人による特願平３−１１４０７４号）。
ここで、例えば、このような機能蛋白質が小胞体内腔に
局在するものである場合を考えると、その大量発現に伴
い本来小胞体に留まるべき機能蛋白質がその受容体の受
容能を超えることにより細胞外へと漏れだしてしまうこ
とが予想される。このような系では、もともとの目的と
する、分泌生産させて回収すべき有用蛋白質の精製が不
利となろう。
【０００６】実際に、ラットの膵外分泌腺細胞では、細
胞外へのＰＤＩの分泌が検出されており、その原因とし
て「ＫＤＥＬ」受容体の残留シグナルに対する受容能の
不足によるＰＤＩの「over flow 」が考えられている
［Yoshimori,T., Semba, T., Takemoto, H., Akagi,
S., Yamamoto, A.およびTashiro, Y. (1990) J. Biol.
Chem. 265, 15984 ］。
胞外へのＰＤＩの分泌が検出されており、その原因とし
て「ＫＤＥＬ」受容体の残留シグナルに対する受容能の
不足によるＰＤＩの「over flow 」が考えられている
［Yoshimori,T., Semba, T., Takemoto, H., Akagi,
S., Yamamoto, A.およびTashiro, Y. (1990) J. Biol.
Chem. 265, 15984 ］。
【０００７】上記問題の解決策の１つとして、Ｃ末端に
小胞体残留シグナルをもつ蛋白質を共発現させる際に、
同時に、このシグナルの受容体を同一細胞内で大量に共
発現させることにより、残留シグナルをもつ蛋白質の細
胞外への分泌を抑えることができると考えられる。ま
た、共発現蛋白質の小胞体への残留効率を上げることに
より、その機能をより効率的に利用することができると
考えられる。
小胞体残留シグナルをもつ蛋白質を共発現させる際に、
同時に、このシグナルの受容体を同一細胞内で大量に共
発現させることにより、残留シグナルをもつ蛋白質の細
胞外への分泌を抑えることができると考えられる。ま
た、共発現蛋白質の小胞体への残留効率を上げることに
より、その機能をより効率的に利用することができると
考えられる。
【０００８】しかしながら、前記受容体の安定な大量発
現系、あるいは、その受容体と小胞体残留シグナルをも
つ蛋白質との共発現系は未だに確立されていなかった。
現系、あるいは、その受容体と小胞体残留シグナルをも
つ蛋白質との共発現系は未だに確立されていなかった。
【０００９】本発明の目的は、小胞体残留シグナルをも
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体を提供することである。
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体を提供することである。
【００１０】本発明の別の目的は、上記２種の発現単位
の他にさらに、前記小胞体局在蛋白質の機能の対象とな
る基質としてのポリペプチドをコードする外来遺伝子を
含む発現単位を、共発現可能な状態で酵母染色体上に組
み込んで得られる形質転換体を提供することである。
の他にさらに、前記小胞体局在蛋白質の機能の対象とな
る基質としてのポリペプチドをコードする外来遺伝子を
含む発現単位を、共発現可能な状態で酵母染色体上に組
み込んで得られる形質転換体を提供することである。
【００１１】本発明のさらに別の目的は、前記形質転換
体を培養し、共発現させて前記ポリペプチドを優先的に
細胞外に分泌させることを包含するポリペプチドの製造
方法を提供することである。
体を培養し、共発現させて前記ポリペプチドを優先的に
細胞外に分泌させることを包含するポリペプチドの製造
方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究した結果、酵母ＥＲＤ２遺伝
子の発現用ベクターを見い出し、本発明を完成させた。
を達成するために鋭意研究した結果、酵母ＥＲＤ２遺伝
子の発現用ベクターを見い出し、本発明を完成させた。
【００１３】即ち、本発明は、小胞体残留シグナルをも
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体を提供する。
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位とを、
共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得られる
形質転換体を提供する。
【００１４】このような形質転換体は、前記小胞体局在
蛋白質の機能の対象となる基質としての有用ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子を含む発現ベクターでその形
質転換細胞を形質転換することにより、有用ポリペプチ
ドのみを優先的に細胞外に分泌させ得る別の形質転換株
を作製するのに有用である。
蛋白質の機能の対象となる基質としての有用ポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子を含む発現ベクターでその形
質転換細胞を形質転換することにより、有用ポリペプチ
ドのみを優先的に細胞外に分泌させ得る別の形質転換株
を作製するのに有用である。
【００１５】本明細書中「小胞体残留シグナルをもつ小
胞体局在蛋白質」とは、in vivo 蛋白質合成後小胞体内
腔に局在することができ、Ｃ末端にアミノ酸配列「ＫＤ
ＥＬ」、「ＨＤＥＬ」、「ＤＤＥＬ」、「ＡＤＥＬ」、
「ＳＤＥＬ」、「ＲＤＥＬ」、「ＫＥＥＬ」、「ＱＥＤ
Ｌ」、「ＨＩＥＬ」、「ＨＴＥＬ」、及び「ＫＱＤＬ」
などの小胞体残留シグナルをもち、且つ酵母由来受容体
蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体と結合し得る蛋白質を指
す。このような蛋白質の具体例としては、プロテインジ
スルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、glucose-regulate
d protein 78（ｇｒｐ ７８）、glucose-regulated pr
otein 94（ｇｒｐ ９４）などが挙げられるが、任意の
ポリペプチドに対して有効な作用を及ぼす働きのあるも
のが最も好ましい。その好適例はプロテインジスルフィ
ドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である。ＰＤＩは、チオール
／ジスルフィド結合の交換反応を触媒し、変性蛋白質の
再構成の速度を促進する酵素として知られている（Sche
in, Bio/Technology 7, 1141-1148, 1989; Freedman, C
ell 57, 1069-1072, 1989 ）。また、前記小胞体局在蛋
白質の中には、本来Ｃ末端に小胞体残留シグナルをもた
ない蛋白質であっても遺伝子工学技術によって前述の小
胞体残留シグナルをもつように改変されたものも包含す
る。
胞体局在蛋白質」とは、in vivo 蛋白質合成後小胞体内
腔に局在することができ、Ｃ末端にアミノ酸配列「ＫＤ
ＥＬ」、「ＨＤＥＬ」、「ＤＤＥＬ」、「ＡＤＥＬ」、
「ＳＤＥＬ」、「ＲＤＥＬ」、「ＫＥＥＬ」、「ＱＥＤ
Ｌ」、「ＨＩＥＬ」、「ＨＴＥＬ」、及び「ＫＱＤＬ」
などの小胞体残留シグナルをもち、且つ酵母由来受容体
蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体と結合し得る蛋白質を指
す。このような蛋白質の具体例としては、プロテインジ
スルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、glucose-regulate
d protein 78（ｇｒｐ ７８）、glucose-regulated pr
otein 94（ｇｒｐ ９４）などが挙げられるが、任意の
ポリペプチドに対して有効な作用を及ぼす働きのあるも
のが最も好ましい。その好適例はプロテインジスルフィ
ドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である。ＰＤＩは、チオール
／ジスルフィド結合の交換反応を触媒し、変性蛋白質の
再構成の速度を促進する酵素として知られている（Sche
in, Bio/Technology 7, 1141-1148, 1989; Freedman, C
ell 57, 1069-1072, 1989 ）。また、前記小胞体局在蛋
白質の中には、本来Ｃ末端に小胞体残留シグナルをもた
ない蛋白質であっても遺伝子工学技術によって前述の小
胞体残留シグナルをもつように改変されたものも包含す
る。
【００１６】「酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２」とは、
小胞体シグナルをもつ任意の小胞体局在蛋白質を受容す
ることができる酵母由来受容体蛋白質又はその類似体を
指す。ＥＲＤ２蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、Seme
nza らの報告した配列が参照されるが［Semenza, J.C.,
Hardwick, K.G., Dean, N. および Pelham, H.R.B.(19
90) Cell 61, 1349］、該蛋白質の機能を損わない範囲
の改変を含むＤＮＡ配列も包含される。そのような改変
体の中には、ＥＲＤ２蛋白質と相同性の高い哺乳動物由
来の「ＫＤＥＬ」受容体をコードするＤＮＡ配列も含ま
れる［Lewis,M.J.と Pelham, H.R.B. (1990) Nature 3
48, 162 ］。
小胞体シグナルをもつ任意の小胞体局在蛋白質を受容す
ることができる酵母由来受容体蛋白質又はその類似体を
指す。ＥＲＤ２蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、Seme
nza らの報告した配列が参照されるが［Semenza, J.C.,
Hardwick, K.G., Dean, N. および Pelham, H.R.B.(19
90) Cell 61, 1349］、該蛋白質の機能を損わない範囲
の改変を含むＤＮＡ配列も包含される。そのような改変
体の中には、ＥＲＤ２蛋白質と相同性の高い哺乳動物由
来の「ＫＤＥＬ」受容体をコードするＤＮＡ配列も含ま
れる［Lewis,M.J.と Pelham, H.R.B. (1990) Nature 3
48, 162 ］。
【００１７】以下に、酵母ＥＲＤ２をコードする遺伝子
を含む発現ベクターの作製手順を説明するが、得られた
ベクターは代表例であり限定的なものではない。
を含む発現ベクターの作製手順を説明するが、得られた
ベクターは代表例であり限定的なものではない。
【００１８】酵母ＥＲＤ２をコードする遺伝子は、酵母
Ｓ２８８Ｃ株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、
polymerase chain reaction (PCR) 法［Mullis, K.B.と
Faloona, F. (1987) Meth. Enzymol. 155, 335 ］によ
り取得し得る。用いたプライマーは、５′−ＴＴＴＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＧＴＴ−
３′および５′−ＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡ
ＣＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡ−３′であり、これらは酵母Ｅ
ＲＤ２遺伝子ＤＮＡ塩基配列［Semenza, J. C.,Hardwic
k, K.G., Dean, N.および Pelham, H.R.B. (1990) Cell
61, 1349］をもとにデザインした。得られたＥＲＤ２
遺伝子をプラスミドベクターBluescriptIISK ＋のXhoI
／BamHI 部位に連結しサブクローン化した（図１）。
Ｓ２８８Ｃ株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型にして、
polymerase chain reaction (PCR) 法［Mullis, K.B.と
Faloona, F. (1987) Meth. Enzymol. 155, 335 ］によ
り取得し得る。用いたプライマーは、５′−ＴＴＴＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＧＴＴ−
３′および５′−ＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＡ
ＣＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡ−３′であり、これらは酵母Ｅ
ＲＤ２遺伝子ＤＮＡ塩基配列［Semenza, J. C.,Hardwic
k, K.G., Dean, N.および Pelham, H.R.B. (1990) Cell
61, 1349］をもとにデザインした。得られたＥＲＤ２
遺伝子をプラスミドベクターBluescriptIISK ＋のXhoI
／BamHI 部位に連結しサブクローン化した（図１）。
【００１９】該遺伝子と組み込むためのベクターは、宿
主内で発現可能であり、且つ、宿主染色体上に組み込ま
れることにより、染色体と同時に複製し得るものであ
る。ベクターは、通常、形質転換された細胞中での表現
型選択を可能にするマーカー配列を保有する。
主内で発現可能であり、且つ、宿主染色体上に組み込ま
れることにより、染色体と同時に複製し得るものであ
る。ベクターは、通常、形質転換された細胞中での表現
型選択を可能にするマーカー配列を保有する。
【００２０】発現ベクターを構築するためのベクターと
しては、例えば、プラスミドｐＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−
ＴＬＹ−３０４が使用される（構築手順は後述の実施例
に示す）。このプラスミドは、ヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）ｃＤＮＡを含み、また、酵母グリセルアルデヒド
−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）プロモーター由来の
改変型プロモーター、酵母アルコール脱水素酵素Ｉ（Ａ
ＤＨＩ）ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子（Ａ
ｍｐr ）及びＴＲＰ１遺伝子を含んでいる。そのため、
このプラスミドをＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ
ＳＡｃＤＮＡを除去し、酵母ＥＲＤ２遺伝子を連結する
ことにより、該遺伝子の発現プラスミド（pIVTRPGAPYER
D2）を得ることができる（図２）。さらに、 pIVTRPGAP
YERD2 をＨｉｎｄIII 及びＸｈｏＩで消化し、ＧＡＰ改
変型プロモーターを除去し、酵母ＡＤＨプロモーターを
連結することにより該遺伝子の発現プラスミド（pIVTRP
ADHYERD2）を得ることができる（図３）。もちろん、本
発明のＥＲＤ２遺伝子を発現させ得る同等の機能を果た
すことができる別の種類のベクターを使用することもで
きる。
しては、例えば、プラスミドｐＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−
ＴＬＹ−３０４が使用される（構築手順は後述の実施例
に示す）。このプラスミドは、ヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）ｃＤＮＡを含み、また、酵母グリセルアルデヒド
−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）プロモーター由来の
改変型プロモーター、酵母アルコール脱水素酵素Ｉ（Ａ
ＤＨＩ）ターミネーター、アンピシリン耐性遺伝子（Ａ
ｍｐr ）及びＴＲＰ１遺伝子を含んでいる。そのため、
このプラスミドをＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｈ
ＳＡｃＤＮＡを除去し、酵母ＥＲＤ２遺伝子を連結する
ことにより、該遺伝子の発現プラスミド（pIVTRPGAPYER
D2）を得ることができる（図２）。さらに、 pIVTRPGAP
YERD2 をＨｉｎｄIII 及びＸｈｏＩで消化し、ＧＡＰ改
変型プロモーターを除去し、酵母ＡＤＨプロモーターを
連結することにより該遺伝子の発現プラスミド（pIVTRP
ADHYERD2）を得ることができる（図３）。もちろん、本
発明のＥＲＤ２遺伝子を発現させ得る同等の機能を果た
すことができる別の種類のベクターを使用することもで
きる。
【００２１】得られた発現ベクター中のプロモーター配
列としては、アルコール脱水素酵素Ｉプロモーターの他
に、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモー
ター［Hitzenman ら、J. Biol. Chem., 255, 2073(198
0)］、他の解糖系酵素類例えばエノラーゼ、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼなどに対するプロモーター［Hessら、J. Adv.
Enzyme Reg., 7, 149(1968); Hollandら、Biochemistr
y, 17, 4900 (1978) ］なども使用され得る。また、タ
ーミネーター配列は酵母適合性のものであればいかなる
ものであってもよい。そのような例としては、上記酵素
に対するターミネーターが挙げられる。
列としては、アルコール脱水素酵素Ｉプロモーターの他
に、例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモー
ター［Hitzenman ら、J. Biol. Chem., 255, 2073(198
0)］、他の解糖系酵素類例えばエノラーゼ、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼなどに対するプロモーター［Hessら、J. Adv.
Enzyme Reg., 7, 149(1968); Hollandら、Biochemistr
y, 17, 4900 (1978) ］なども使用され得る。また、タ
ーミネーター配列は酵母適合性のものであればいかなる
ものであってもよい。そのような例としては、上記酵素
に対するターミネーターが挙げられる。
【００２２】発現ベクターはさらに、例えばｔｒｐ１遺
伝子のような酵母由来の遺伝子を含む。この遺伝子は、
目的の形質転換体を単離する際の表現型選択マーカーと
しての役割をもったり、酵母染色体への組み込みの際に
ＥＲＤ２発現単位の相同的組換えを可能にする役割をも
つ。
伝子のような酵母由来の遺伝子を含む。この遺伝子は、
目的の形質転換体を単離する際の表現型選択マーカーと
しての役割をもったり、酵母染色体への組み込みの際に
ＥＲＤ２発現単位の相同的組換えを可能にする役割をも
つ。
【００２３】発現ベクターはさらに、酵母適合性の複製
起点、リボソーム結合部位、抗生物質耐性遺伝子のよう
なマーカー配列等を含み得る。
起点、リボソーム結合部位、抗生物質耐性遺伝子のよう
なマーカー配列等を含み得る。
【００２４】一方、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子の好適例は、プロテイ
ンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）遺伝子及び、Ｐ
ＤＩ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列との連結
遺伝子である。ＰＤＩ遺伝子及び該連結遺伝子のＤＮＡ
配列に関しては、本出願人による特願平２−２９５０１
７号及び特願平３−１１４０７４号に記載の配列を本明
細書中に参照として含めるものとする。ＰＤＩ発現単位
の構築例については、ＥＲＤ２発現系に関する上述の内
容が適用されるが、具体的には後述の実施例を参照され
たい。
体局在蛋白質をコードする遺伝子の好適例は、プロテイ
ンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）遺伝子及び、Ｐ
ＤＩ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列との連結
遺伝子である。ＰＤＩ遺伝子及び該連結遺伝子のＤＮＡ
配列に関しては、本出願人による特願平２−２９５０１
７号及び特願平３−１１４０７４号に記載の配列を本明
細書中に参照として含めるものとする。ＰＤＩ発現単位
の構築例については、ＥＲＤ２発現系に関する上述の内
容が適用されるが、具体的には後述の実施例を参照され
たい。
【００２５】宿主としての酵母は、本発明の目的が達成
される限りその種類を問わないが、好ましくはSaccharo
myces 属例えばSaccharomyces cerevisiaeである。宿
主に関しては、本発明の範囲外であるが、酵母以外の真
核細胞（例えば、動物細胞）も宿主として使用し得るこ
とは当業者には自明であろう。
される限りその種類を問わないが、好ましくはSaccharo
myces 属例えばSaccharomyces cerevisiaeである。宿
主に関しては、本発明の範囲外であるが、酵母以外の真
核細胞（例えば、動物細胞）も宿主として使用し得るこ
とは当業者には自明であろう。
【００２６】形質転換に際しては、塩化カルシウム処理
法、プロトプラスト（又はスフェロプラスト）−ポリエ
チレングリコール法、電気穿孔法等の慣用技術が使用さ
れ得る。
法、プロトプラスト（又はスフェロプラスト）−ポリエ
チレングリコール法、電気穿孔法等の慣用技術が使用さ
れ得る。
【００２７】本発明の形質転換体は、例えばｔｒｐ１遺
伝子を保有する場合には、得られた菌体をＳＤ（−Ｌｅ
ｕ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）プレー
ト上で培養することによって容易にスクリーニングする
ことが可能である。
伝子を保有する場合には、得られた菌体をＳＤ（−Ｌｅ
ｕ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）プレー
ト上で培養することによって容易にスクリーニングする
ことが可能である。
【００２８】本発明はさらに、小胞体残留シグナルをも
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位と、前
記小胞体局在蛋白質の機能の対象となる基質としてのポ
リペプチドをコードする外来遺伝子を含む発現単位と
を、共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得ら
れる形質転換体を提供する。
つ小胞体局在蛋白質を受容することが可能な酵母由来受
容体蛋白質ＥＲＤ２又はその類似体をコードする遺伝子
を含む発現単位と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞
体局在蛋白質をコードする遺伝子を含む発現単位と、前
記小胞体局在蛋白質の機能の対象となる基質としてのポ
リペプチドをコードする外来遺伝子を含む発現単位と
を、共発現可能な状態で酵母染色体上に組み込んで得ら
れる形質転換体を提供する。
【００２９】前記ＥＲＤ２又はその類似体をコードする
遺伝子を含む発現単位、前記小胞体局在蛋白質をコード
する遺伝子を含む発現単位、宿主酵母、形質転換法につ
いては上述した内容がそのまま適用される。
遺伝子を含む発現単位、前記小胞体局在蛋白質をコード
する遺伝子を含む発現単位、宿主酵母、形質転換法につ
いては上述した内容がそのまま適用される。
【００３０】本明細書中、「ポリペプチド」とは、前記
小胞体局在蛋白質がin vivoで有効に作用する、短鎖又
は長鎖ペプチド性基質あるいは蛋白質性基質を意味す
る。このようなポリペプチドの例には、プロテインジス
ルフィドイソメラーゼの前記触媒作用を受容するあらゆ
る種類のポリペプチドが含まれる。本発明の実施態様に
より、好ましいポリペプチドはヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）である。
小胞体局在蛋白質がin vivoで有効に作用する、短鎖又
は長鎖ペプチド性基質あるいは蛋白質性基質を意味す
る。このようなポリペプチドの例には、プロテインジス
ルフィドイソメラーゼの前記触媒作用を受容するあらゆ
る種類のポリペプチドが含まれる。本発明の実施態様に
より、好ましいポリペプチドはヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）である。
【００３１】本発明の２種類の上述の形質転換体中に保
有されるＥＲＤ２遺伝子及び他の前記遺伝子は、互いに
共発現可能な状態である限り、宿主染色体中の同一ゲノ
ム上にあってもよく又は異なるゲノム上にあってもよ
い。例えば、ＥＲＤ２遺伝子及び他の前記遺伝子を同一
ベクター内か又は好ましくは異なるベクター内に組み込
んだ後、同一宿主細胞内に移入し、相同的組換えにより
宿主染色体中に導入する。また、前記ＥＲＤ２遺伝子又
は他の前記遺伝子を含む発現単位は、共発現が可能な限
り染色体中に複数個存在してもよい。
有されるＥＲＤ２遺伝子及び他の前記遺伝子は、互いに
共発現可能な状態である限り、宿主染色体中の同一ゲノ
ム上にあってもよく又は異なるゲノム上にあってもよ
い。例えば、ＥＲＤ２遺伝子及び他の前記遺伝子を同一
ベクター内か又は好ましくは異なるベクター内に組み込
んだ後、同一宿主細胞内に移入し、相同的組換えにより
宿主染色体中に導入する。また、前記ＥＲＤ２遺伝子又
は他の前記遺伝子を含む発現単位は、共発現が可能な限
り染色体中に複数個存在してもよい。
【００３２】本発明の実施態様により、本発明の形質転
換体には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）高生産性酵母
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株が含まれる。
換体には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）高生産性酵母
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株が含まれる。
【００３３】この酵母株は、酵母ＥＲＤ２遺伝子を含む
発現ベクターを、ＨＳＡ高分泌酵母ＳＮ３５Ａ株のｕｒ
ａ３遺伝子座へヒトＰＤＩ発現単位を導入して得た酵母
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株（特願平３−226107号；後述の実
施例参照）中に移入し、該酵母染色体上のｔｒｐ１部位
に相同的組換えを起こしてＥＲＤ２遺伝子を導入するこ
とによって得られる。このようにして得られた形質転換
酵母ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株は、酵母ＥＲＤ２、ヒ
トＰＤＩ及びＨＳＡを共発現させることが可能であり、
ＥＲＤ２の発現系を導入しない場合と比べ、ＰＤＩの培
地中への分泌は極めて抑制されると同時に、ＨＳＡの発
現分泌量は２４時間培養時に平均で約２６％、また、４
８時間培養時に約１７％増加した（図４および図５）。
発現ベクターを、ＨＳＡ高分泌酵母ＳＮ３５Ａ株のｕｒ
ａ３遺伝子座へヒトＰＤＩ発現単位を導入して得た酵母
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株（特願平３−226107号；後述の実
施例参照）中に移入し、該酵母染色体上のｔｒｐ１部位
に相同的組換えを起こしてＥＲＤ２遺伝子を導入するこ
とによって得られる。このようにして得られた形質転換
酵母ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株は、酵母ＥＲＤ２、ヒ
トＰＤＩ及びＨＳＡを共発現させることが可能であり、
ＥＲＤ２の発現系を導入しない場合と比べ、ＰＤＩの培
地中への分泌は極めて抑制されると同時に、ＨＳＡの発
現分泌量は２４時間培養時に平均で約２６％、また、４
８時間培養時に約１７％増加した（図４および図５）。
【００３４】本発明はさらに、上記の３種類の発現単位
を含む、形質転換体を適切な培地中で培養し共発現させ
て、小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋白質を受容
することが可能な酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又はそ
の類似体と、ＥＲＤ２のリガンドとしての前記小胞体局
在蛋白質とを小胞体内に残留させ、一方、前記小胞体局
在蛋白質の機能の対象となる基質としてのポリペプチド
を優先的に細胞外に分泌させること、並びに前記ポリペ
プチドを回収することを包含するポリペプチドの製造方
法を提供する。
を含む、形質転換体を適切な培地中で培養し共発現させ
て、小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋白質を受容
することが可能な酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又はそ
の類似体と、ＥＲＤ２のリガンドとしての前記小胞体局
在蛋白質とを小胞体内に残留させ、一方、前記小胞体局
在蛋白質の機能の対象となる基質としてのポリペプチド
を優先的に細胞外に分泌させること、並びに前記ポリペ
プチドを回収することを包含するポリペプチドの製造方
法を提供する。
【００３５】本発明の製法では、前記小胞体局在蛋白質
が細胞外に漏出しないように、前記ＥＲＤ２蛋白質又は
その類似体及び前記小胞体局在蛋白質の発現が適切な制
御配列によってコントロールされている。
が細胞外に漏出しないように、前記ＥＲＤ２蛋白質又は
その類似体及び前記小胞体局在蛋白質の発現が適切な制
御配列によってコントロールされている。
【００３６】理論に拘束されるつもりはないが、ＥＲＤ
２の共発現によるＰＤＩの分泌抑制及びＨＳＡの発現分
泌の促進に関しては以下のように考えられる。
２の共発現によるＰＤＩの分泌抑制及びＨＳＡの発現分
泌の促進に関しては以下のように考えられる。
【００３７】ＰＤＩの小胞体への残留機構については、
小胞体に局在すると考えられるＥＲＤ２がＰＤＩのＣ末
端の小胞体残留シグナルの受容体として働くことが考え
られている。ＰＤＩを強力なプロモーターの支配下で発
現させた時（本発明では、改変型ＧＡＰプロモーターを
使用）、細胞内のＰＤＩ量は、小胞体のＥＲＤ２の受容
能を超えてしまい、したがって、ＥＲＤ２の受容限界を
超えた分のＰＤＩが細胞外に「over flow 」することに
なる。実際に、このＰＤＩの「over flow 」は、本出願
人による特願平２−２９５０１７号に記載のヒトＰＤＩ
の酵母における発現の実施例で観察されている。ここ
で、新たにＡＤＨプロモーター支配下に大量のＥＲＤ２
を共発現させることによって、小胞体内のＰＤＩ受容能
が増強された結果、ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株で細胞外に分
泌されていたＰＤＩがＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株にお
いては、細胞内に留められたものと解釈される。
小胞体に局在すると考えられるＥＲＤ２がＰＤＩのＣ末
端の小胞体残留シグナルの受容体として働くことが考え
られている。ＰＤＩを強力なプロモーターの支配下で発
現させた時（本発明では、改変型ＧＡＰプロモーターを
使用）、細胞内のＰＤＩ量は、小胞体のＥＲＤ２の受容
能を超えてしまい、したがって、ＥＲＤ２の受容限界を
超えた分のＰＤＩが細胞外に「over flow 」することに
なる。実際に、このＰＤＩの「over flow 」は、本出願
人による特願平２−２９５０１７号に記載のヒトＰＤＩ
の酵母における発現の実施例で観察されている。ここ
で、新たにＡＤＨプロモーター支配下に大量のＥＲＤ２
を共発現させることによって、小胞体内のＰＤＩ受容能
が増強された結果、ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株で細胞外に分
泌されていたＰＤＩがＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株にお
いては、細胞内に留められたものと解釈される。
【００３８】一方、ＰＤＩの共発現が、ＨＳＡの細胞内
での高次構造形成（Ｓ−Ｓ結合形成）を促し、その結果
として、ＨＳＡの分泌促進効果を示すことは、本出願人
による特願平３−１１４０７４号に記されているが、本
発明では、酵母ＥＲＤ２の共発現の効果が上述のＰＤＩ
の小胞体内への残留効率を上げ、さらにその結果とし
て、ＰＤＩの基質としてのＨＳＡの分泌量の増加がみら
れたものと考えられる。
での高次構造形成（Ｓ−Ｓ結合形成）を促し、その結果
として、ＨＳＡの分泌促進効果を示すことは、本出願人
による特願平３−１１４０７４号に記されているが、本
発明では、酵母ＥＲＤ２の共発現の効果が上述のＰＤＩ
の小胞体内への残留効率を上げ、さらにその結果とし
て、ＰＤＩの基質としてのＨＳＡの分泌量の増加がみら
れたものと考えられる。
【００３９】このことは、逆に、ＰＤＩの示すＨＳＡ分
泌促進効果は、ＰＤＩの細胞外におけるＨＳＡの安定化
によるものではなく、細胞内（小胞体内）でのＨＳＡの
高次構造形成反応（Ｓ−Ｓ結合交換反応）の触媒に起因
することを強く示唆するものである。
泌促進効果は、ＰＤＩの細胞外におけるＨＳＡの安定化
によるものではなく、細胞内（小胞体内）でのＨＳＡの
高次構造形成反応（Ｓ−Ｓ結合交換反応）の触媒に起因
することを強く示唆するものである。
【００４０】このように、酵母ＥＲＤ２の共発現に伴う
ＰＤＩの小胞体内残留の効率化は、大量発現させたＰＤ
Ｉが本来機能するであろう適切な細胞内のコンパートメ
ントにＰＤＩを局在化させることにより、ＰＤＩの機能
を最大限に発揮させうる系を提供するものである。
ＰＤＩの小胞体内残留の効率化は、大量発現させたＰＤ
Ｉが本来機能するであろう適切な細胞内のコンパートメ
ントにＰＤＩを局在化させることにより、ＰＤＩの機能
を最大限に発揮させうる系を提供するものである。
【００４１】より一般的には、ＥＲＤ２が受容しうる小
胞体残留シグナルをもつポリペプチドをＰＤＩと同様に
その基質となる外来のポリペプチドに効率良く効かせる
ために、本発明は大きな利用価値があるものと考えられ
る。
胞体残留シグナルをもつポリペプチドをＰＤＩと同様に
その基質となる外来のポリペプチドに効率良く効かせる
ために、本発明は大きな利用価値があるものと考えられ
る。
【００４２】
【実施例】以下の、実施例により、さらに本発明を説明
するが、本発明は、これらの実施例に限定されるもので
はない。
するが、本発明は、これらの実施例に限定されるもので
はない。
【００４３】酵母ＥＲＤ２遺伝子のクローン化 polymerase chain reaction （ＰＣＲ）法［Mullis, K.
B.とFaloona, F.(1987) Meth. Enzymol. 155, 335 ］に
より以下の手順で酵母ＥＲＤ２遺伝子をクローン化し
た。
B.とFaloona, F.(1987) Meth. Enzymol. 155, 335 ］に
より以下の手順で酵母ＥＲＤ２遺伝子をクローン化し
た。
【００４４】酵母Ｓ２８８Ｃ株の単コロニーを２mlのＹ
ＰＤ培地（２％バクトトリプトン、１％バクトイースト
エキストラクトおよび２％ブドウ糖）に接種し、３０℃
で２４時間培養した。遠心分離により回収した菌体を、
１mlのソルビトール溶液［１Ｍソルビトールおよび５０
mM Ｋ2 ＨＰＯ4 ／ＫＨ2 ＰＯ4 （pH 6.85 ）］で洗浄
後、再び遠心分離にかけて集めた。得られた菌体を、１
mlのソルビトール溶液に再懸濁し、４０μｌのザイモリ
アーゼ溶液（１０mg／ml）および１μｌのβ−メルカプ
トエタノールを加えて３７℃で３０分間保温した。次
に、遠心分離によって菌体を回収し２００μｌの溶液
［５０mM Tris-HCl （pH 7.5）および２０mMEDTA ］に
懸濁し、２００μｌのＮＤＳ緩衝液［0.5M EDTA 、１０
mM Tris-HCl（pH 7.5）、１％ sodium dodecyl sarcosi
nate 、７．５％β−メルカプトエタノールおよび１mg
／mlプロナーゼＫ］を加えて５０℃で１時間加温した。
この溶液をフェノール／クロロホルム溶液で抽出し、得
られた水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH
5.2）および２．５倍容のエタノールを加え、−８０℃
で２０分間冷却後、遠心分離にかけて沈殿を回収した
（エタノール沈殿）。得られた沈殿を４００μｌのＴＥ
緩衝液［１０mM Tris-HCl(pH 8.0) および１mM EDTA］
に溶かし、２４０μｌの２０％ＰＥＧ溶液（２０％ポリ
エチレングリコールおよび２．５M NaCl）を加えて氷上
に１時間放置した。これを遠心分離にかけ、沈殿を回収
し７０％エタノールで洗浄後、４００μｌのＴＥ緩衝液
に再溶解した。得られた溶液を２度フェノール／クロロ
ホルム抽出し、回収した水層からエタノール沈殿により
酵母Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを回収した。
ＰＤ培地（２％バクトトリプトン、１％バクトイースト
エキストラクトおよび２％ブドウ糖）に接種し、３０℃
で２４時間培養した。遠心分離により回収した菌体を、
１mlのソルビトール溶液［１Ｍソルビトールおよび５０
mM Ｋ2 ＨＰＯ4 ／ＫＨ2 ＰＯ4 （pH 6.85 ）］で洗浄
後、再び遠心分離にかけて集めた。得られた菌体を、１
mlのソルビトール溶液に再懸濁し、４０μｌのザイモリ
アーゼ溶液（１０mg／ml）および１μｌのβ−メルカプ
トエタノールを加えて３７℃で３０分間保温した。次
に、遠心分離によって菌体を回収し２００μｌの溶液
［５０mM Tris-HCl （pH 7.5）および２０mMEDTA ］に
懸濁し、２００μｌのＮＤＳ緩衝液［0.5M EDTA 、１０
mM Tris-HCl（pH 7.5）、１％ sodium dodecyl sarcosi
nate 、７．５％β−メルカプトエタノールおよび１mg
／mlプロナーゼＫ］を加えて５０℃で１時間加温した。
この溶液をフェノール／クロロホルム溶液で抽出し、得
られた水層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH
5.2）および２．５倍容のエタノールを加え、−８０℃
で２０分間冷却後、遠心分離にかけて沈殿を回収した
（エタノール沈殿）。得られた沈殿を４００μｌのＴＥ
緩衝液［１０mM Tris-HCl(pH 8.0) および１mM EDTA］
に溶かし、２４０μｌの２０％ＰＥＧ溶液（２０％ポリ
エチレングリコールおよび２．５M NaCl）を加えて氷上
に１時間放置した。これを遠心分離にかけ、沈殿を回収
し７０％エタノールで洗浄後、４００μｌのＴＥ緩衝液
に再溶解した。得られた溶液を２度フェノール／クロロ
ホルム抽出し、回収した水層からエタノール沈殿により
酵母Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを回収した。
【００４５】以上のようにして調製したゲノムＤＮＡを
鋳型にして酵母ＥＲＤ２遺伝子のクローン化を行った。
Ｓ２８８ＣゲノムＤＮＡ１０μｌ（0.02μｇ）、プライ
マーＩ５μｌ（0.25μｇ）、プライマー II ５μｌ（0.
25μｇ）、ＴａｑＩポリメラーゼ（Gene AmpTM DNA Amp
lification Reagent kit、Perkin Elmer Cetus社）0.5
μｌ、１０倍濃縮反応緩衝液（同社同キット）１０μ
ｌ、ｄＮＴＰ混合液（各１．２５mM、同社同キット）お
よびおよび53.5μｌの滅菌水を混合した反応液につい
て、 Perkin Elmer Cetus 社製の DNA Thermal Cycler
を用いてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、ＤＮＡの変
性９４℃１分、アニーリング５０℃２分、ポリメラーゼ
による伸長反応７２℃３分を３０サイクル行った後、７
２℃で７分間反応させるように設定した。また、プライ
マーＩおよび II は以下に示す配列をもつ。
鋳型にして酵母ＥＲＤ２遺伝子のクローン化を行った。
Ｓ２８８ＣゲノムＤＮＡ１０μｌ（0.02μｇ）、プライ
マーＩ５μｌ（0.25μｇ）、プライマー II ５μｌ（0.
25μｇ）、ＴａｑＩポリメラーゼ（Gene AmpTM DNA Amp
lification Reagent kit、Perkin Elmer Cetus社）0.5
μｌ、１０倍濃縮反応緩衝液（同社同キット）１０μ
ｌ、ｄＮＴＰ混合液（各１．２５mM、同社同キット）お
よびおよび53.5μｌの滅菌水を混合した反応液につい
て、 Perkin Elmer Cetus 社製の DNA Thermal Cycler
を用いてＰＣＲ反応を行った。反応条件は、ＤＮＡの変
性９４℃１分、アニーリング５０℃２分、ポリメラーゼ
による伸長反応７２℃３分を３０サイクル行った後、７
２℃で７分間反応させるように設定した。また、プライ
マーＩおよび II は以下に示す配列をもつ。
【００４６】 プライマーＩ： 5′−TTTTTCTCGAGTAAGCAATGAATCCGTT−
3 ′ プライマーII： 5′−AAAAAGGATCCTGCGAACACTATTTAAA−
3 ′ 得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、水
層についてエタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを溶液［１０mM Tris-HCl (pH 8.0)、１００mM
NaCl 、７mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）
および５単位のＢａｍＨＩ（同社）］２０μｌ中で３７
℃２時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にか
け約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダー（Gene C
leanTM、Ｂｉｏ−１０１社）を用いて分離精製した。こ
のようにして回収したＤＮＡ約５０ngおよびＸｈｏＩお
よびＢａｍＨＩで消化した BluescriptII ＳＫ＋約２０
ngを宝酒造社ＤＮＡライゲーションキットＡ液３０μｌ
およびＢ液６μｌと混合し、１６℃で２時間反応させる
ことにより連結させた。得られた組換えプラスミド（ｐ
ＹＥＲＤ２と命名した）（図１）を用いて大腸菌ＸＬＩ
−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。
3 ′ プライマーII： 5′−AAAAAGGATCCTGCGAACACTATTTAAA−
3 ′ 得られた反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、水
層についてエタノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを溶液［１０mM Tris-HCl (pH 8.0)、１００mM
NaCl 、７mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）
および５単位のＢａｍＨＩ（同社）］２０μｌ中で３７
℃２時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にか
け約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダー（Gene C
leanTM、Ｂｉｏ−１０１社）を用いて分離精製した。こ
のようにして回収したＤＮＡ約５０ngおよびＸｈｏＩお
よびＢａｍＨＩで消化した BluescriptII ＳＫ＋約２０
ngを宝酒造社ＤＮＡライゲーションキットＡ液３０μｌ
およびＢ液６μｌと混合し、１６℃で２時間反応させる
ことにより連結させた。得られた組換えプラスミド（ｐ
ＹＥＲＤ２と命名した）（図１）を用いて大腸菌ＸＬＩ
−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。
【００４７】以上のようにしてサブクローン化したＤＮ
Ａ断片をさらに細かくサブクローン化した後、ＤＮＡ塩
基配列を決定した。その結果、得られたＤＮＡ断片は目
的とする酵母ＥＲＤ２の遺伝子を含むことが明らかとな
った。ただし、Semenza らの報告した配列［Semenza,
J.C., Hardwick,K.G., Dean,N. およびPelham, H.R.B.
(1990) Cell 61, 1349］で５２番目のＬｅｕのコドンが
「ＴＴＧ」であるのに対して該クローンでは「ＴＴＡ」
であった。しかしながら、すべてのアミノ酸配列および
その他の塩基配列は一致していた。
Ａ断片をさらに細かくサブクローン化した後、ＤＮＡ塩
基配列を決定した。その結果、得られたＤＮＡ断片は目
的とする酵母ＥＲＤ２の遺伝子を含むことが明らかとな
った。ただし、Semenza らの報告した配列［Semenza,
J.C., Hardwick,K.G., Dean,N. およびPelham, H.R.B.
(1990) Cell 61, 1349］で５２番目のＬｅｕのコドンが
「ＴＴＧ」であるのに対して該クローンでは「ＴＴＡ」
であった。しかしながら、すべてのアミノ酸配列および
その他の塩基配列は一致していた。
【００４８】酵母染色体ｔｒｐ１部位へのＥＲＤ２発現
単位インテグレーション用ベクターの構築 上記プラスミドｐＹＥＲＤ２を用いて以下の手順によ
り、ＥＲＤ２発現単位の酵母染色体へのインテグレーシ
ョン用ベクターを作製した（図１〜３）。
単位インテグレーション用ベクターの構築 上記プラスミドｐＹＥＲＤ２を用いて以下の手順によ
り、ＥＲＤ２発現単位の酵母染色体へのインテグレーシ
ョン用ベクターを作製した（図１〜３）。
【００４９】アルカリ溶菌法［Birnboim, H.C.とDoly,
J. (1979) Nucleic Acids Res. 7,1513］により調製し
たプラスミドベクターｐＲＳ３０４［Sikorski, R.S.と
Hieter,P. (1989) Genetics 122, 1 ］のＤＮＡ 0.5μ
ｇを溶液［１０mM Tris-HCl(pH 8.0)、１００mM NaC
l、７mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）およ
び５単位のＢａｍＨＩ（同社）］３０μｌ中で３７℃２
時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ約
４．３ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを用いて分離
精製した一方、ＡＤＨＩ転写ターミネーターカセットベ
クターｐＵＣ−ＡＴＥ（本出願人による特開平２−1173
84号公報）のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM Tris-HCl
（pH 8.0）、１５０mM NaCl、７mM MgCl2 、５単位の
ＳａｌＩ（宝酒造社）および５単位のＢａｍＨＩ（同
社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、１％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をグラ
スパウダーを用いて分離精製した。このようにして得ら
れた両ＤＮＡ断片それぞれ約５０ngを宝酒造社ＤＮＡラ
イゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μｌと混
合し、１６℃で２時間反応させることにより連結、環状
化させた。この組換えプラスミド（ｐＲＳ３０４−ＡＴ
Ｅと命名した）を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形
質転換した。
J. (1979) Nucleic Acids Res. 7,1513］により調製し
たプラスミドベクターｐＲＳ３０４［Sikorski, R.S.と
Hieter,P. (1989) Genetics 122, 1 ］のＤＮＡ 0.5μ
ｇを溶液［１０mM Tris-HCl(pH 8.0)、１００mM NaC
l、７mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）およ
び５単位のＢａｍＨＩ（同社）］３０μｌ中で３７℃２
時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ約
４．３ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを用いて分離
精製した一方、ＡＤＨＩ転写ターミネーターカセットベ
クターｐＵＣ−ＡＴＥ（本出願人による特開平２−1173
84号公報）のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM Tris-HCl
（pH 8.0）、１５０mM NaCl、７mM MgCl2 、５単位の
ＳａｌＩ（宝酒造社）および５単位のＢａｍＨＩ（同
社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、１％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をグラ
スパウダーを用いて分離精製した。このようにして得ら
れた両ＤＮＡ断片それぞれ約５０ngを宝酒造社ＤＮＡラ
イゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μｌと混
合し、１６℃で２時間反応させることにより連結、環状
化させた。この組換えプラスミド（ｐＲＳ３０４−ＡＴ
Ｅと命名した）を用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形
質転換した。
【００５０】次に、ＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＵＡＳ
１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５（本出願人による特願平３
−188794号）のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM Tris-HC
l (pH 8.0)、１００mM NaCl、７mM MgCl2 、１０単位
のＮｏｔＩ（東洋紡績社）および５単位のＢａｍＨＩ
（宝酒造社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、 0.7
％アガロースゲル電気泳動にかけ約４ｋｂのＤＮＡ断片
をグラスパウダーを用いて分離精製した。一方、ｐＲＳ
３０４−ＡＴＥのＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mMTris-H
Cl (pH 8.0 ）、100mM NaCl、7mM MgCl2 、１０単位の
ＮｏｔＩ（東洋紡績社）および５単位のＢａｍＨＩ（宝
酒造社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、０．７％
アガロースゲル電気泳動にかけ約５ｋｂのＤＮＡ断片を
グラスパウダーを用いて分離精製した。このようにして
回収した両ＤＮＡ断片それぞれ約５０ngを宝酒造社ＤＮ
ＡライゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μｌ
と混合し、１６℃で２時間反応させることにより連結、
環状化させた。得られた組換えプラスミド（ｐＲＧ−Ｕ
ＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０４と命名した）を用いて
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。
１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５（本出願人による特願平３
−188794号）のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM Tris-HC
l (pH 8.0)、１００mM NaCl、７mM MgCl2 、１０単位
のＮｏｔＩ（東洋紡績社）および５単位のＢａｍＨＩ
（宝酒造社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、 0.7
％アガロースゲル電気泳動にかけ約４ｋｂのＤＮＡ断片
をグラスパウダーを用いて分離精製した。一方、ｐＲＳ
３０４−ＡＴＥのＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mMTris-H
Cl (pH 8.0 ）、100mM NaCl、7mM MgCl2 、１０単位の
ＮｏｔＩ（東洋紡績社）および５単位のＢａｍＨＩ（宝
酒造社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、０．７％
アガロースゲル電気泳動にかけ約５ｋｂのＤＮＡ断片を
グラスパウダーを用いて分離精製した。このようにして
回収した両ＤＮＡ断片それぞれ約５０ngを宝酒造社ＤＮ
ＡライゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μｌ
と混合し、１６℃で２時間反応させることにより連結、
環状化させた。得られた組換えプラスミド（ｐＲＧ−Ｕ
ＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０４と命名した）を用いて
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を形質転換した。
【００５１】アルカリ溶菌法により調製した前述のプラ
スミドｐＹＥＲＤ２のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM T
ris-HCl (pH 8.0)、１００mM NaCl 、７mM MgCl2 、５
単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）および５単位のＢａｍＨＩ
（同社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、０．８％
アガロースゲル電気泳動にかけ約０．７ｋｂのＤＮＡ断
片をグラスパウダーを用いて分離精製した。一方、同じ
くアルカリ溶菌法により調製した上述のヒトＨＳＡイン
テグレーションベクターｐＲＧ−Ｕ１−Ｎ７−ＴＬＹ−
３０４ＤＮＡ０．５μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH 8.
0)、100mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒
造社）および５単位のＢａｍＨＩ（同社）］３０μｌ中
で３７℃２時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳
動にかけ約６．３ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを
用いて分離精製した。得られた両ＤＮＡそれぞれ約５０
ｎｇを宝酒造社ＤＮＡライゲーションキットＡ液３０μ
ｌおよびＢ液６μｌと混合し、１６℃で２時間反応させ
ることにより連結させた。得られた組換えプラスミド
（pIVTRPGAPYERD2と命名した）を用いて大腸菌ＨＢ１０
１株を形質転換した。
スミドｐＹＥＲＤ２のＤＮＡ 0.5μｇを溶液［１０mM T
ris-HCl (pH 8.0)、１００mM NaCl 、７mM MgCl2 、５
単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）および５単位のＢａｍＨＩ
（同社）］３０μｌ中で３７℃２時間反応後、０．８％
アガロースゲル電気泳動にかけ約０．７ｋｂのＤＮＡ断
片をグラスパウダーを用いて分離精製した。一方、同じ
くアルカリ溶菌法により調製した上述のヒトＨＳＡイン
テグレーションベクターｐＲＧ−Ｕ１−Ｎ７−ＴＬＹ−
３０４ＤＮＡ０．５μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH 8.
0)、100mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒
造社）および５単位のＢａｍＨＩ（同社）］３０μｌ中
で３７℃２時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳
動にかけ約６．３ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを
用いて分離精製した。得られた両ＤＮＡそれぞれ約５０
ｎｇを宝酒造社ＤＮＡライゲーションキットＡ液３０μ
ｌおよびＢ液６μｌと混合し、１６℃で２時間反応させ
ることにより連結させた。得られた組換えプラスミド
（pIVTRPGAPYERD2と命名した）を用いて大腸菌ＨＢ１０
１株を形質転換した。
【００５２】アルカリ溶菌法により調製した pIVTRPGAP
YERD2 DNA １μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH 8.0)、10
0mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）
および５単位のＨｉｎｄIII （同社）］３０μｌ中で３
７℃４時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動に
かけ約６．８ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを用い
て分離精製した。一方、同じくアルカリ溶菌法により調
製したＨＳＡ発現ベクターｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＨＳＡ−
Ａ（本出願人による特開平２−１１７３８４号公報）Ｄ
ＮＡ１μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、100mM Na
Cl、7mM MgCl2、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）および
５単位のＨｉｎｄIII （同社）］３０μｌ中で３７℃４
時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約
１．４ｋｂのＤＮＡ断片（酵母アルコール脱水素酵素Ｉ
プロモーター）をグラスパウダーを用いて分離精製し
た。得られた両ＤＮＡそれぞれ約５０ｎｇを宝酒造社Ｄ
ＮＡライゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μ
ｌと混合し、１６℃で２時間反応させることにより連結
させた。得られた組換えプラスミド（pIVTRPADHYERD2と
命名した）を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し
た。
YERD2 DNA １μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH 8.0)、10
0mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）
および５単位のＨｉｎｄIII （同社）］３０μｌ中で３
７℃４時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動に
かけ約６．８ｋｂのＤＮＡ断片をグラスパウダーを用い
て分離精製した。一方、同じくアルカリ溶菌法により調
製したＨＳＡ発現ベクターｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ＨＳＡ−
Ａ（本出願人による特開平２−１１７３８４号公報）Ｄ
ＮＡ１μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH8.0) 、100mM Na
Cl、7mM MgCl2、５単位のＸｈｏＩ（宝酒造社）および
５単位のＨｉｎｄIII （同社）］３０μｌ中で３７℃４
時間反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約
１．４ｋｂのＤＮＡ断片（酵母アルコール脱水素酵素Ｉ
プロモーター）をグラスパウダーを用いて分離精製し
た。得られた両ＤＮＡそれぞれ約５０ｎｇを宝酒造社Ｄ
ＮＡライゲーションキットＡ液３０μｌおよびＢ液６μ
ｌと混合し、１６℃で２時間反応させることにより連結
させた。得られた組換えプラスミド（pIVTRPADHYERD2と
命名した）を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し
た。
【００５３】ＳＮ３５Ａ株の作製 ＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１
−３０５（本出願人による特願平３−１８８７９４号）
をＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切断し、消化物を０．７％
アガロース電気泳動することにより、約１０ｋｂの断片
を分離し、Geneclean を用い約１０ｋｂの断片を調製し
た。一方大腸菌染色体由来のＵＡＳ断片とＡＤＨ２のＵ
ＡＳから成るハイブリッドＵＡＳとＡＤＨＩの転写開始
領域から成り立つプロモーターを持つプラスミドｐＳＮ
ＡＤ３ＡＸ（本出願人による特願平３−１３６６５７
号）をＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切断し、１％アガロー
ス電気泳動にかけることにより約０．５ｋｂの断片を分
離しGeneclean を用いこれを調製した。この断片と上記
の約１０ｋｂの断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換さ
せることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＳＮＡＤ
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５を持つ形質転換体を得た。
−３０５（本出願人による特願平３−１８８７９４号）
をＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切断し、消化物を０．７％
アガロース電気泳動することにより、約１０ｋｂの断片
を分離し、Geneclean を用い約１０ｋｂの断片を調製し
た。一方大腸菌染色体由来のＵＡＳ断片とＡＤＨ２のＵ
ＡＳから成るハイブリッドＵＡＳとＡＤＨＩの転写開始
領域から成り立つプロモーターを持つプラスミドｐＳＮ
ＡＤ３ＡＸ（本出願人による特願平３−１３６６５７
号）をＨｉｎｄIII とＸｈｏＩで切断し、１％アガロー
ス電気泳動にかけることにより約０．５ｋｂの断片を分
離しGeneclean を用いこれを調製した。この断片と上記
の約１０ｋｂの断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて
連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換さ
せることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＳＮＡＤ
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５を持つ形質転換体を得た。
【００５４】一方、プラスミドベクターｐＲＳ３０３
（Sikorski & Hieter, 1989 ）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ
で消化し、０．７％アガロース電気泳動により４．３ｋ
ｂの断片を分離しGeneclean を用いこれを調製した。Ａ
ＤＨＩ転写ターミネーターカセットベクターｐＵＣ−Ａ
ＴＥ（本出願人による特開平２−１１７３８４号公報）
をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、１％アガロース電気
泳動にかけることにより約０．４ｋｂの断片を分離しGe
neclean を用いこれを調製した。この断片と上記の約
４．３ｋｂの断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連
結、環状化させて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換さ
せることにより、プラスミドｐＲＳ３０３−ＡＴＥを持
つ形質転換体を得た。
（Sikorski & Hieter, 1989 ）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ
で消化し、０．７％アガロース電気泳動により４．３ｋ
ｂの断片を分離しGeneclean を用いこれを調製した。Ａ
ＤＨＩ転写ターミネーターカセットベクターｐＵＣ−Ａ
ＴＥ（本出願人による特開平２−１１７３８４号公報）
をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、１％アガロース電気
泳動にかけることにより約０．４ｋｂの断片を分離しGe
neclean を用いこれを調製した。この断片と上記の約
４．３ｋｂの断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連
結、環状化させて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換さ
せることにより、プラスミドｐＲＳ３０３−ＡＴＥを持
つ形質転換体を得た。
【００５５】次にＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＳＮＡＤ
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切
断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動することに
より、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を用いこれ
を調製した。ｐＲＳ３０３−ＡＴＥをＮｏｔＩとＢａｍ
ＨＩで切断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動す
ることにより、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を
用いこれを調製した。この断片とｐＲＧ−ＳＮＡＤ３Ａ
Ｘ−ＴＬＹ１−３０５由来の断片とをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
を形質転換させることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐＲ
Ｇ−ＳＮＡＤ３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０３を持つ形質転換
体を得た。
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切
断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動することに
より、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を用いこれ
を調製した。ｐＲＳ３０３−ＡＴＥをＮｏｔＩとＢａｍ
ＨＩで切断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動す
ることにより、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を
用いこれを調製した。この断片とｐＲＧ−ＳＮＡＤ３Ａ
Ｘ−ＴＬＹ１−３０５由来の断片とをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
を形質転換させることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐＲ
Ｇ−ＳＮＡＤ３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０３を持つ形質転換
体を得た。
【００５６】このＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＳＮＡＤ
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５ １０μｇを２０μｌの反応
液中でＳｐｌＩで切断した後、反応液を６５℃、１０分
間の熱処理により酵素を失活させた。ＹＹ３５Ａ株（微
工研菌寄第１２４８０号）をＹＰＤ培地（１％酵母エキ
ス、２％ペプトン、２％グルコース）で１夜培養し、そ
のうちの０．１mlを５mlのＹＰＤ培地に接種した。ＯＤ
600 が１．０に達するまで培養した後、遠心により菌体
を集め、集めた菌体を０．５mlの０．１Ｍ酢酸リチウム
液（０．１Ｍ酢酸リチウム、 10mM Tris-HCl［pH 7.
5］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて１回洗った。再度遠心に
より菌体を集め、７０μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム液に
再懸濁し、３０℃、１時間保温した。
３ＡＸ−ＴＬＹ１−３０５ １０μｇを２０μｌの反応
液中でＳｐｌＩで切断した後、反応液を６５℃、１０分
間の熱処理により酵素を失活させた。ＹＹ３５Ａ株（微
工研菌寄第１２４８０号）をＹＰＤ培地（１％酵母エキ
ス、２％ペプトン、２％グルコース）で１夜培養し、そ
のうちの０．１mlを５mlのＹＰＤ培地に接種した。ＯＤ
600 が１．０に達するまで培養した後、遠心により菌体
を集め、集めた菌体を０．５mlの０．１Ｍ酢酸リチウム
液（０．１Ｍ酢酸リチウム、 10mM Tris-HCl［pH 7.
5］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて１回洗った。再度遠心に
より菌体を集め、７０μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム液に
再懸濁し、３０℃、１時間保温した。
【００５７】ここに上記の熱処理をした反応液２０μｌ
を加え、３０℃、３０分間保温した。次に５００μｌの
ＰＥＧ溶液（４０％ポリエチレングリコール［平均分子
量４，０００］を含む０．１Ｍ酢酸リチウム液）を加
え、ピペットマンを用いてよく混合した後、４５分、３
０℃で保温した。この細胞懸濁液を４２℃、５分熱処理
し、５００μｌ滅菌水を加えた後、遠心により菌体を集
めた。この菌体を１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した
後、ＳＤ（−Ｈｉｓ）寒天培地（２０μｇ／mlアデニン
硫酸塩、２０μｇ／mlアルギニン塩酸塩、２０μｇ／ml
メチオニン、２０μｇ／mlトリプトファン、２０μｇ／
mlウラシル、３０μｇ／mlイソロイシン、３０μｇ／ml
リジン塩酸塩、３０μｇ／mlチロシン、５０μｇ／mlフ
ェニルアラニン、６０μｇ／mlロイシン、１５０μｇ／
mlバリン０．６７％アミノ酸不含イーストニトロゲンベ
ース、２％グルコース、２％寒天）にひろげ、３０℃に
おき５日間培養することによりコロニーを形成させた。
形成されたコロニーのうちの一つを再度ＳＤ（−Ｈｉ
ｓ）寒天培地にひろげることによりＨＳＡ高効率産生
株、ＳＮ３５Ａ株を得た。
を加え、３０℃、３０分間保温した。次に５００μｌの
ＰＥＧ溶液（４０％ポリエチレングリコール［平均分子
量４，０００］を含む０．１Ｍ酢酸リチウム液）を加
え、ピペットマンを用いてよく混合した後、４５分、３
０℃で保温した。この細胞懸濁液を４２℃、５分熱処理
し、５００μｌ滅菌水を加えた後、遠心により菌体を集
めた。この菌体を１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した
後、ＳＤ（−Ｈｉｓ）寒天培地（２０μｇ／mlアデニン
硫酸塩、２０μｇ／mlアルギニン塩酸塩、２０μｇ／ml
メチオニン、２０μｇ／mlトリプトファン、２０μｇ／
mlウラシル、３０μｇ／mlイソロイシン、３０μｇ／ml
リジン塩酸塩、３０μｇ／mlチロシン、５０μｇ／mlフ
ェニルアラニン、６０μｇ／mlロイシン、１５０μｇ／
mlバリン０．６７％アミノ酸不含イーストニトロゲンベ
ース、２％グルコース、２％寒天）にひろげ、３０℃に
おき５日間培養することによりコロニーを形成させた。
形成されたコロニーのうちの一つを再度ＳＤ（−Ｈｉ
ｓ）寒天培地にひろげることによりＨＳＡ高効率産生
株、ＳＮ３５Ａ株を得た。
【００５８】酵母ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株の作製 （その１）ＴＤＨ３プロモーターを用いたヒトＰＤＩ発
現単位の構築 アルカリ溶菌法により調製したｐｈＰＤＩＬｙ１（本出
願人による特願平３−114074号）プラスミドＤＮＡ４μ
ｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HCl （ｐＨ８．０）、６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 および２０単位のＥ
ｃｏＲＩ（ニッポンジーン社）］１００μｌ中で３７℃
で２時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出しエタ
ノール沈殿により消化したＤＮＡを回収した。得られた
ＤＮＡを５０μｌKlenow緩衝液（Kilo-sequence 用Dele
tion Kit、宝酒造社）に溶解し、４単位のKlenow fragm
ent （宝酒造社）を加え３７℃で４５分間反応させるこ
ととによりＥｃｏＲＩ切断部分の平滑化を行なった。次
いでこの溶液からフェノール／クロロホルム抽出および
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮ
Ａを溶液［１０ mM Tris-HCl（pH 8.0）、100mM NaCl、
7mM MgCl2 および１０単位のＢａｍＨＩ（ニッポンジー
ン社）］３０μｌ中で３７℃、２時間消化後、０．８％
アガローゲル電気泳動にかけ、約１．８ｋｂのＤＮＡ断
片をGeneclean で調製した。
現単位の構築 アルカリ溶菌法により調製したｐｈＰＤＩＬｙ１（本出
願人による特願平３−114074号）プラスミドＤＮＡ４μ
ｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HCl （ｐＨ８．０）、６０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 および２０単位のＥ
ｃｏＲＩ（ニッポンジーン社）］１００μｌ中で３７℃
で２時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出しエタ
ノール沈殿により消化したＤＮＡを回収した。得られた
ＤＮＡを５０μｌKlenow緩衝液（Kilo-sequence 用Dele
tion Kit、宝酒造社）に溶解し、４単位のKlenow fragm
ent （宝酒造社）を加え３７℃で４５分間反応させるこ
ととによりＥｃｏＲＩ切断部分の平滑化を行なった。次
いでこの溶液からフェノール／クロロホルム抽出および
エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮ
Ａを溶液［１０ mM Tris-HCl（pH 8.0）、100mM NaCl、
7mM MgCl2 および１０単位のＢａｍＨＩ（ニッポンジー
ン社）］３０μｌ中で３７℃、２時間消化後、０．８％
アガローゲル電気泳動にかけ、約１．８ｋｂのＤＮＡ断
片をGeneclean で調製した。
【００５９】一方、アルカリ溶菌法で調製したｐＲＧ−
ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５プラスミドＤＮＡ
３μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HCl （pH 8.0）、100mM
NaCl、7mM MgCl2 および２４単位のＸｈｏＩ（宝酒造
社）］１００μｌ中で３７℃、２時間消化後、フェノー
ル／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により回収
した。得られたＤＮＡを５０μｌの Klenow 緩衝液に溶
解し、４単位の Klenowfragmentを加え３７℃、４５分
間反応させることによりＸｈｏＩ切断部分の平滑化を行
なった。この溶液について、フェノール／クロロホルム
抽出およびエタノール沈殿を行ないＤＮＡを回収し、続
いてこのＤＮＡを溶液［１０ mM Tris-HCl（pH 8.0）、
100mM NaCl、7mM MgCl2 および１０単位のＢａｍＨＩ
（ニッポンジーン社）］４０μｌ中で３７℃、２時間反
応させた。この溶液からエタノール沈殿により回収した
ＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約８ｋ
ｂのＤＮＡ断片をGeneclean により回収した。
ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５プラスミドＤＮＡ
３μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HCl （pH 8.0）、100mM
NaCl、7mM MgCl2 および２４単位のＸｈｏＩ（宝酒造
社）］１００μｌ中で３７℃、２時間消化後、フェノー
ル／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により回収
した。得られたＤＮＡを５０μｌの Klenow 緩衝液に溶
解し、４単位の Klenowfragmentを加え３７℃、４５分
間反応させることによりＸｈｏＩ切断部分の平滑化を行
なった。この溶液について、フェノール／クロロホルム
抽出およびエタノール沈殿を行ないＤＮＡを回収し、続
いてこのＤＮＡを溶液［１０ mM Tris-HCl（pH 8.0）、
100mM NaCl、7mM MgCl2 および１０単位のＢａｍＨＩ
（ニッポンジーン社）］４０μｌ中で３７℃、２時間反
応させた。この溶液からエタノール沈殿により回収した
ＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約８ｋ
ｂのＤＮＡ断片をGeneclean により回収した。
【００６０】以上のようにして得られたｐｈＰＤＩＬｙ
１由来の１．８ｋｂのＤＮＡ断片約５０ngおよびｐＲＧ
−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５由来の８ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片約５０ngをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混合し、１６℃、１
時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶
液１０μｌを用いて塩化カルシウム法［Mandel, M.とHi
ga, A. (1970) J. Mol. Biol. 53, 154 ］により大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換し、制限酵素解析により目的と
するプラスミド（pIVLEUGAPhPDILy1と命名）を保持する
形質転換体を選択した。
１由来の１．８ｋｂのＤＮＡ断片約５０ngおよびｐＲＧ
−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５由来の８ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片約５０ngをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混合し、１６℃、１
時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶
液１０μｌを用いて塩化カルシウム法［Mandel, M.とHi
ga, A. (1970) J. Mol. Biol. 53, 154 ］により大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換し、制限酵素解析により目的と
するプラスミド（pIVLEUGAPhPDILy1と命名）を保持する
形質転換体を選択した。
【００６１】アルカリ溶菌法により調製した上記 pIVLE
UGAPhPDILy1 プラスミドＤＮＡ２μｇを溶液［１０ｍＭ
Tris-HCl （pH 8.0）、 60mM NaCl、7mM MgCl2 、１０
単位のＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社）および１０単位
のＨｉｎｄIII （同社）］４０μｌ中で３７℃、２時間
反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約２．
５ｋｂのＤＮＡ断片をGeneclean を用いて分離精製し
た。一方、アルカリ溶菌法により調製したｐＪＤＢ−Ａ
ＤＨ−ＨＳＡ−ＡプラスミドＤＮＡ（特開平２−117384
号公報）２μｇを上述の pIVLEUGAPhPDILy1 のＤＮＡと
同様の条件で消化後、やはり０．８％アガロースゲル電
気泳動を行ないGeneclean により約８．５ｋｂのＤＮＡ
断片を分離精製した。このようにして得られた両ＤＮＡ
断片各々約５０ngをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μと混合し、１６℃、１時
間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶液
１０μｌを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換した。目的とするプラスミド（pGAPhP
DILy1 と命名）を保持する形質転換体を選択し以後の構
築に用いた。
UGAPhPDILy1 プラスミドＤＮＡ２μｇを溶液［１０ｍＭ
Tris-HCl （pH 8.0）、 60mM NaCl、7mM MgCl2 、１０
単位のＢａｍＨＩ（ニッポンジーン社）および１０単位
のＨｉｎｄIII （同社）］４０μｌ中で３７℃、２時間
反応後、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約２．
５ｋｂのＤＮＡ断片をGeneclean を用いて分離精製し
た。一方、アルカリ溶菌法により調製したｐＪＤＢ−Ａ
ＤＨ−ＨＳＡ−ＡプラスミドＤＮＡ（特開平２−117384
号公報）２μｇを上述の pIVLEUGAPhPDILy1 のＤＮＡと
同様の条件で消化後、やはり０．８％アガロースゲル電
気泳動を行ないGeneclean により約８．５ｋｂのＤＮＡ
断片を分離精製した。このようにして得られた両ＤＮＡ
断片各々約５０ngをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μと混合し、１６℃、１時
間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶液
１０μｌを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換した。目的とするプラスミド（pGAPhP
DILy1 と命名）を保持する形質転換体を選択し以後の構
築に用いた。
【００６２】（その２）酵母染色体ｕｒａ３遺伝子座へ
ヒトＰＤＩ発現単位を組み込ませるためのベクターの構
築 上記プラスミドpGAPhPDILy1 を用いて以下の手順にした
がって、ヒトＰＤＩ発現単位の酵母染色体への組み込み
用ベクターを作製した。
ヒトＰＤＩ発現単位を組み込ませるためのベクターの構
築 上記プラスミドpGAPhPDILy1 を用いて以下の手順にした
がって、ヒトＰＤＩ発現単位の酵母染色体への組み込み
用ベクターを作製した。
【００６３】プラスミドベクターｐＲＳ３０６（Sikors
kiと Hierter, 1989）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化
し、０．７％アガロース電気泳動により４．３ｋｂの断
片を分離しGeneclean を用いこれを調製した。ＡＤＨ転
写ターミネーターカセットベクターｐＵＣ−ＡＴＥ（特
開平２−117384号公報）をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断
し、１％アガロース電気泳動にかけることにより約０．
４ｋｂの断片を分離しGeneclean を用いこれを調製し
た。この断片と上記の約４．３ｋｂの断片とをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅを形質転換させることにより、プラスミドｐＲＳ
３０６−ＡＴＥを持つ形質転換体を得た。
kiと Hierter, 1989）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化
し、０．７％アガロース電気泳動により４．３ｋｂの断
片を分離しGeneclean を用いこれを調製した。ＡＤＨ転
写ターミネーターカセットベクターｐＵＣ−ＡＴＥ（特
開平２−117384号公報）をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断
し、１％アガロース電気泳動にかけることにより約０．
４ｋｂの断片を分離しGeneclean を用いこれを調製し
た。この断片と上記の約４．３ｋｂの断片とをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅを形質転換させることにより、プラスミドｐＲＳ
３０６−ＡＴＥを持つ形質転換体を得た。
【００６４】次にＨＳＡ発現ベクターｐＲＧ−ＵＡＳ１
−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切
断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動することに
より、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を用いこれ
を調製した。この断片とｐＲＳ３０６−ＡＴＥ由来の約
５ｋｂのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片とをＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅを形質転換させることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐ
ＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０６を持つ形質転
換体を得た。
−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０５をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切
断し、消化物を０．７％アガロース電気泳動することに
より、約４ｋｂの断片を分離し、Geneclean を用いこれ
を調製した。この断片とｐＲＳ３０６−ＡＴＥ由来の約
５ｋｂのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片とをＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結、環状化させ大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅを形質転換させることにより、ＨＳＡ発現ベクターｐ
ＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬＹ１−３０６を持つ形質転
換体を得た。
【００６５】アルカリ溶菌法により調製したＨＳＡイン
テグレーションベクターｐＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬ
Ｙ１−３０６のＤＮＡ １μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-
HCl（pH 8.0）、 60mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＢ
ａｍＨＩ（ニッポンジーン社）および５単位のＨｉｎｄ
III （同社）］３０μｌ中で３７℃、２時間反応後、
０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約８．５ｋｂの
ＤＮＡ断片をグラスパウダーを用いて分離精製した。一
方、アルカリ溶菌法により調製した上記pIVLEUGAPhPDIL
y1プラスミドＤＮＡ ２μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HC
l （pH 8.0）、60mM NaCl 、7mM MgCl2 、５単位のＢａ
ｍＨＩ（ニッポンジーン社）および５単位のＨｉｎｄII
I （同社）］３０μｌ中で３７℃、２時間反応後、０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ約２．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片をGeneclean を用いて分離精製した。これら両Ｄ
ＮＡ断片約５０ngずつをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混合し、１６
℃、１．５時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られ
た組換えプラスミド（pIVURAGAPhPDILy1と命名した）を
用いて大腸菌ＭＶ1190株を形質転換した。
テグレーションベクターｐＲＧ−ＵＡＳ１−Ｎ７−ＴＬ
Ｙ１−３０６のＤＮＡ １μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-
HCl（pH 8.0）、 60mM NaCl、7mM MgCl2 、５単位のＢ
ａｍＨＩ（ニッポンジーン社）および５単位のＨｉｎｄ
III （同社）］３０μｌ中で３７℃、２時間反応後、
０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ約８．５ｋｂの
ＤＮＡ断片をグラスパウダーを用いて分離精製した。一
方、アルカリ溶菌法により調製した上記pIVLEUGAPhPDIL
y1プラスミドＤＮＡ ２μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HC
l （pH 8.0）、60mM NaCl 、7mM MgCl2 、５単位のＢａ
ｍＨＩ（ニッポンジーン社）および５単位のＨｉｎｄII
I （同社）］３０μｌ中で３７℃、２時間反応後、０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ約２．５ｋｂのＤＮ
Ａ断片をGeneclean を用いて分離精製した。これら両Ｄ
ＮＡ断片約５０ngずつをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造社）Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混合し、１６
℃、１．５時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。得られ
た組換えプラスミド（pIVURAGAPhPDILy1と命名した）を
用いて大腸菌ＭＶ1190株を形質転換した。
【００６６】（その３）ＨＳＡ高分泌酵母ＳＮ３５Ａ株
のｕｒａ３遺伝子座へのヒトＰＤＩ発現単位の導入 上記の組み込み用プラスミド pIVURAGAPhPDILy1 を用い
て、以下の手順に従いＨＳＡ高生産株ＳＮ３５Ａ株を形
質転換した。
のｕｒａ３遺伝子座へのヒトＰＤＩ発現単位の導入 上記の組み込み用プラスミド pIVURAGAPhPDILy1 を用い
て、以下の手順に従いＨＳＡ高生産株ＳＮ３５Ａ株を形
質転換した。
【００６７】アルカリ溶菌法により調製した pIVURAGAP
hPDILy1 のＤＮＡ ３０μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HC
l （pH 8.0）、100mM NaCl、7mM MgCl2 および１００単
位のＥｃｏＲＶ（宝酒造社）］４００μｌ中で３７℃一
晩消化した後、フェノール／クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿により回収し１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した。
hPDILy1 のＤＮＡ ３０μｇを溶液［１０ｍＭ Tris-HC
l （pH 8.0）、100mM NaCl、7mM MgCl2 および１００単
位のＥｃｏＲＶ（宝酒造社）］４００μｌ中で３７℃一
晩消化した後、フェノール／クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿により回収し１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した。
【００６８】ＨＳＡ高分泌株ＳＮ３５Ａ株の単コロニー
を５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃で一晩振盪培養し
た。この前培養液１００μｌを新たに１０mlのＹＰＤ培
地に接種し３０℃で振盪培養を行なった。ＯＤ600 が約
０．５に達したところで菌体を遠心分離によって回収し
た。得られた菌体を１mlの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液で
洗浄し遠心分離により集め、５０μｌの０．１Ｍ酢酸リ
チウム溶液に再懸濁し３０℃で１時間保温した。この菌
体７０μｌに上記のＤＮＡ溶液１０μｌを加え３０℃で
３０分間保温後、さらに５００μｌのＰＥＧ溶液を加え
混合し３０℃で４５分間保温した。次いで、４２℃で５
分間加温し５００μｌの滅菌水を加えた後、遠心分離に
よって菌体を集めロイシン、ヒスチジン、アデニン、ウ
ラシルを含まないＳＤ寒天培地（２０μｇ／mlアルギニ
ン塩酸塩、２０μｇ／mlメチオニン、２０μｇ／mlトリ
プトファン、３０μｇ／mlイソロイシン、３０μｇ／ml
リジン塩酸塩、３０μｇ／mlチロシン、５０μｇ／mlフ
ェニルアラニン、１００μｇ／mlアスパラギン酸、同グ
ルタミン酸、１５０μｇ／mlバリン、２００μｇ／mlト
レオニン、３７５μｇ／mlセリン、0.67％バクトイース
トニトロゲンベース、２％ブドウ糖、１．５％寒天）に
まき３０℃で培養した。培養後３日で形質転換体をプレ
ート上のコロニーとして得た。得られた形質転換体をＳ
Ｎ３５Ａ−１ＰＵと命名した。
を５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃で一晩振盪培養し
た。この前培養液１００μｌを新たに１０mlのＹＰＤ培
地に接種し３０℃で振盪培養を行なった。ＯＤ600 が約
０．５に達したところで菌体を遠心分離によって回収し
た。得られた菌体を１mlの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液で
洗浄し遠心分離により集め、５０μｌの０．１Ｍ酢酸リ
チウム溶液に再懸濁し３０℃で１時間保温した。この菌
体７０μｌに上記のＤＮＡ溶液１０μｌを加え３０℃で
３０分間保温後、さらに５００μｌのＰＥＧ溶液を加え
混合し３０℃で４５分間保温した。次いで、４２℃で５
分間加温し５００μｌの滅菌水を加えた後、遠心分離に
よって菌体を集めロイシン、ヒスチジン、アデニン、ウ
ラシルを含まないＳＤ寒天培地（２０μｇ／mlアルギニ
ン塩酸塩、２０μｇ／mlメチオニン、２０μｇ／mlトリ
プトファン、３０μｇ／mlイソロイシン、３０μｇ／ml
リジン塩酸塩、３０μｇ／mlチロシン、５０μｇ／mlフ
ェニルアラニン、１００μｇ／mlアスパラギン酸、同グ
ルタミン酸、１５０μｇ／mlバリン、２００μｇ／mlト
レオニン、３７５μｇ／mlセリン、0.67％バクトイース
トニトロゲンベース、２％ブドウ糖、１．５％寒天）に
まき３０℃で培養した。培養後３日で形質転換体をプレ
ート上のコロニーとして得た。得られた形質転換体をＳ
Ｎ３５Ａ−１ＰＵと命名した。
【００６９】ＨＳＡおよびヒトＰＤＩ共発現酵母ＳＮ３
５Ａ−１ＰＵ株染色体ｔｒｐ１部位へのＥＲＤ２発現単
位の導入 上記のインテグレーションプラスミドｐＩＶＴＲＰＡＤ
ＨＹＥＲＤ２を用いて、以下の手順にしたがってＨＳＡ
およびヒトＰＤＩ共発現株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵを形質転
換した。
５Ａ−１ＰＵ株染色体ｔｒｐ１部位へのＥＲＤ２発現単
位の導入 上記のインテグレーションプラスミドｐＩＶＴＲＰＡＤ
ＨＹＥＲＤ２を用いて、以下の手順にしたがってＨＳＡ
およびヒトＰＤＩ共発現株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵを形質転
換した。
【００７０】ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株の単コロニーを５ml
のＹＰＤ培地に接種し３０℃で一晩振盪培養した。この
前培養液 100μｌをあらたに１０mlのＹＰＤ培地に接種
し３０℃で振盪培養を行なった。濁度（ＯＤ600 ）が約
０．５に達したところで菌体を遠心分離によって回収し
た。得られた菌体を１mlの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液
［０．１Ｍ酢酸リチウム、10mM Tris-HCl (pH 7.5)およ
び1mM EDTA］で洗浄した後遠心分離によって集め、５０
μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液に再懸濁し３０℃で１
時間保温した。この菌体７０μｌに上記のＥＲＤ２発現
単位インテグレーションベクターＤＮＡ（ｐＩＶＴＲＰ
ＡＤＨＹＥＲＤ２）３０μｇを加え３０℃で３０分間保
温した後、さらに５００μｌのＰＥＧ溶液［４０％ポリ
エチレングリコール＃4000、０．１Ｍ酢酸リチウム、10
mM Tris-HCl (pH 7.5)および1mM EDTA］を加え混合し３
０℃で４５分間保温した。次いで、４２℃で５分間加温
し５００μｌの滅菌水を加えた後、遠心分離によって菌
体を集めＳＤ（−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅ、−Ｕｒ
ａ、−Ｔｒｐ）プレート［ＳＤ（−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ、
−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）培地｛0.67％バクトニ
トロゲンベース、２％ブドウ糖、２０μｇ／mlのアルギ
ニン塩酸塩、同メチオニン、３０μｇ／mlのチロシン、
同イソロイシン、同リジン塩酸塩、５０μｇ／mlのフェ
ニルアラニン、１００μｇ／mlのアスパラギン酸、同グ
ルタミン酸、１５０μｇ／mlのバリン、２００μｇ／ml
のトレオニンおよび３７５μｇ／mlのセリン（以上のア
ミノ酸は和光純薬社製）｝および１．５％の寒天］にま
き３０℃で培養してプレート上で得られた形質転換体を
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴと命名した。
のＹＰＤ培地に接種し３０℃で一晩振盪培養した。この
前培養液 100μｌをあらたに１０mlのＹＰＤ培地に接種
し３０℃で振盪培養を行なった。濁度（ＯＤ600 ）が約
０．５に達したところで菌体を遠心分離によって回収し
た。得られた菌体を１mlの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液
［０．１Ｍ酢酸リチウム、10mM Tris-HCl (pH 7.5)およ
び1mM EDTA］で洗浄した後遠心分離によって集め、５０
μｌの０．１Ｍ酢酸リチウム溶液に再懸濁し３０℃で１
時間保温した。この菌体７０μｌに上記のＥＲＤ２発現
単位インテグレーションベクターＤＮＡ（ｐＩＶＴＲＰ
ＡＤＨＹＥＲＤ２）３０μｇを加え３０℃で３０分間保
温した後、さらに５００μｌのＰＥＧ溶液［４０％ポリ
エチレングリコール＃4000、０．１Ｍ酢酸リチウム、10
mM Tris-HCl (pH 7.5)および1mM EDTA］を加え混合し３
０℃で４５分間保温した。次いで、４２℃で５分間加温
し５００μｌの滅菌水を加えた後、遠心分離によって菌
体を集めＳＤ（−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅ、−Ｕｒ
ａ、−Ｔｒｐ）プレート［ＳＤ（−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ、
−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）培地｛0.67％バクトニ
トロゲンベース、２％ブドウ糖、２０μｇ／mlのアルギ
ニン塩酸塩、同メチオニン、３０μｇ／mlのチロシン、
同イソロイシン、同リジン塩酸塩、５０μｇ／mlのフェ
ニルアラニン、１００μｇ／mlのアスパラギン酸、同グ
ルタミン酸、１５０μｇ／mlのバリン、２００μｇ／ml
のトレオニンおよび３７５μｇ／mlのセリン（以上のア
ミノ酸は和光純薬社製）｝および１．５％の寒天］にま
き３０℃で培養してプレート上で得られた形質転換体を
ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴと命名した。
【００７１】ＥＲＤ２の共発現のヒトＰＤＩ細胞内残留
に対する効果およびそれに伴うＨＳＡ発現分泌の増進 上記形質転換体についてヒトＰＤＩの細胞内残留に対す
る効果およびそれに伴うＨＳＡの発現分泌に対する効果
を以下の手順にしたがって調べた。
に対する効果およびそれに伴うＨＳＡ発現分泌の増進 上記形質転換体についてヒトＰＤＩの細胞内残留に対す
る効果およびそれに伴うＨＳＡの発現分泌に対する効果
を以下の手順にしたがって調べた。
【００７２】ＳＤプレート上のＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥ
Ｔ株のコロニー６個を拾いそれぞれ５mlのＳＤ（−Ｈｉ
ｓ、−Ｌｅｕ、−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）培地に
植菌し、３０℃で２４時間前培養を行なった。得られた
前培養液１００μｌを５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃
で培養した。本培養開始から２４時間後、それぞれの培
養液２００μｌを採取し遠心分離にかけ、上清１００μ
ｌをとり、これに等容のエタノールを加えた。氷上に３
時間静置後、遠心分離にかけて得られた沈殿を減圧乾燥
した後、それぞれ８μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩
衝液［62.5mMTris-HCl (pH 6.8) 、２％ＳＤＳ、１０％
グリセリン、0.72Ｍβ−メルカプトエタノールおよび
0.005％ブロモフェノールブルー］に溶かした。得られ
たサンプルを５分間煮沸後、４〜２０％の濃度勾配ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（第一化学社ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレート４
／２０を使用）にかけた。この際、ＨＳＡの定量用の標
準としてSigma 社ＨＳＡ０．５μｇを同時に泳動した。
泳動後のゲルを、染色液（0.15％クマシーブリリアント
ブルー、１０％酢酸および４０％メタノール）に浸し染
色後、脱色液（１０％酢酸および４０％メタノール）で
脱色することにより培地中の蛋白質を視覚化した。さら
に、本培養開始から４８時間後、２４時間培養と同様の
培地のサンプリングを行なった。但し、エタノール沈殿
に供した培地量は５０μｌとした。以上の実験におい
て、コントロールとしてＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株を用い、
培地のサンプリング等は上記と全く同様に行なった。各
株についてのＨＳＡ分泌量はデンシトメーター（IMAGE
ANALYSIS SYSTEM 、テフコ株式会社）で定量化した。そ
の結果、ＥＲＤ２の共発現により、培地中のＰＤＩ量は
大幅に減少し、また、それに伴ってＨＳＡ分泌量は２４
時間培養時で平均約２６％、４８時間培養時で同１７％
増加した（図４、図５）。
Ｔ株のコロニー６個を拾いそれぞれ５mlのＳＤ（−Ｈｉ
ｓ、−Ｌｅｕ、−Ａｄｅ、−Ｕｒａ、−Ｔｒｐ）培地に
植菌し、３０℃で２４時間前培養を行なった。得られた
前培養液１００μｌを５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃
で培養した。本培養開始から２４時間後、それぞれの培
養液２００μｌを採取し遠心分離にかけ、上清１００μ
ｌをとり、これに等容のエタノールを加えた。氷上に３
時間静置後、遠心分離にかけて得られた沈殿を減圧乾燥
した後、それぞれ８μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩
衝液［62.5mMTris-HCl (pH 6.8) 、２％ＳＤＳ、１０％
グリセリン、0.72Ｍβ−メルカプトエタノールおよび
0.005％ブロモフェノールブルー］に溶かした。得られ
たサンプルを５分間煮沸後、４〜２０％の濃度勾配ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（第一化学社ＳＤＳ−ＰＡＧＥプレート４
／２０を使用）にかけた。この際、ＨＳＡの定量用の標
準としてSigma 社ＨＳＡ０．５μｇを同時に泳動した。
泳動後のゲルを、染色液（0.15％クマシーブリリアント
ブルー、１０％酢酸および４０％メタノール）に浸し染
色後、脱色液（１０％酢酸および４０％メタノール）で
脱色することにより培地中の蛋白質を視覚化した。さら
に、本培養開始から４８時間後、２４時間培養と同様の
培地のサンプリングを行なった。但し、エタノール沈殿
に供した培地量は５０μｌとした。以上の実験におい
て、コントロールとしてＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株を用い、
培地のサンプリング等は上記と全く同様に行なった。各
株についてのＨＳＡ分泌量はデンシトメーター（IMAGE
ANALYSIS SYSTEM 、テフコ株式会社）で定量化した。そ
の結果、ＥＲＤ２の共発現により、培地中のＰＤＩ量は
大幅に減少し、また、それに伴ってＨＳＡ分泌量は２４
時間培養時で平均約２６％、４８時間培養時で同１７％
増加した（図４、図５）。
【００７３】
【発明の効果】本発明は、酵母ＥＲＤ２遺伝子を用いる
ことにより、その大量発現系を構築し、また、この系を
ヒトＰＤＩおよびヒト血清アルブミンの発現系に応用す
ることにより、ＰＤＩの分泌を抑え、且つ、ＰＤＩによ
る血清アルブミンの分泌増進効果を上げる手段を初めて
確立したものである。これにより、この方法は、真核細
胞における小胞体局在蛋白質の大量発現系と共役させる
ことにより、その小胞体残留の効率化の手段として用い
ることができ、さらにまた、この共役発現系を小胞体局
在蛋白質の基質となる有用ポリペプチドの生産系に導入
することにより、そのポリペプチドの生産効率を上げる
ことができる。
ことにより、その大量発現系を構築し、また、この系を
ヒトＰＤＩおよびヒト血清アルブミンの発現系に応用す
ることにより、ＰＤＩの分泌を抑え、且つ、ＰＤＩによ
る血清アルブミンの分泌増進効果を上げる手段を初めて
確立したものである。これにより、この方法は、真核細
胞における小胞体局在蛋白質の大量発現系と共役させる
ことにより、その小胞体残留の効率化の手段として用い
ることができ、さらにまた、この共役発現系を小胞体局
在蛋白質の基質となる有用ポリペプチドの生産系に導入
することにより、そのポリペプチドの生産効率を上げる
ことができる。
【図１】この図は、ＹＥＲＤ２のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ
制限断片の作製工程を示す。
制限断片の作製工程を示す。
【図２】この図は、発現プラスミド pIVTRPGAPYERD2 の
構築工程を示す。
構築工程を示す。
【図３】この図は、発現プラスミド pIVTRPADHYERD2 の
構築工程を示す。
構築工程を示す。
【図４】この図は、ヒトＰＤＩおよびヒト血清アルブミ
ンの発現株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵとこれに酵母ＥＲＤ２発
現系を導入した株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴとで発現分
泌されたヒトＰＤＩおよびヒト血清アルブミンのＳＤＳ
電気泳動結果を示す写真である。ここでレーン１はＳＮ
３５Ａ−１ＰＵの培養液上清を、また、レーン２はＳＮ
３５Ａ−１ＰＵＡＥＴの培養液上清を示す。
ンの発現株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵとこれに酵母ＥＲＤ２発
現系を導入した株ＳＮ３５Ａ−１ＰＵＡＥＴとで発現分
泌されたヒトＰＤＩおよびヒト血清アルブミンのＳＤＳ
電気泳動結果を示す写真である。ここでレーン１はＳＮ
３５Ａ−１ＰＵの培養液上清を、また、レーン２はＳＮ
３５Ａ−１ＰＵＡＥＴの培養液上清を示す。
【図５】この図は、ＳＮ３５Ａ−１ＰＵ株およびＳＮ３
５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株におけるヒト血清アルブミンの発
現分泌量を、ＳＤＳ電気泳動ゲルについてデンシトメー
ターで定量化して得られた結果を示す。
５Ａ−１ＰＵＡＥＴ株におけるヒト血清アルブミンの発
現分泌量を、ＳＤＳ電気泳動ゲルについてデンシトメー
ターで定量化して得られた結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/61 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 鈴木 正則 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】 小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋
白質を受容することが可能な酵母由来受容体蛋白質ＥＲ
Ｄ２又はその類似体をコードする遺伝子を含む発現単位
と、前記小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋白質を
コードする遺伝子を含む発現単位とを、共発現可能な状
態で酵母染色体上に組み込んで得られる形質転換体。 - 【請求項２】 前記酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又は
その類似体をコードする遺伝子を含む発現単位が、発現
プラスミド pIVTRPADHYERD2 である請求項１記載の形質
転換体。 - 【請求項３】 前記小胞体残留シグナルをもつ小胞体局
在蛋白質をコードする遺伝子が、プロテインジスルフィ
ドイソメラーゼ遺伝子又は、プロテインジスルフィドイ
ソメラーゼ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列と
の連結遺伝子である請求項１記載の形質転換体。 - 【請求項４】 小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋
白質を受容することが可能な酵母由来受容体ＥＲＤ２又
はその類似体をコードする遺伝子を含む発現単位と、前
記小胞体残留シグナルをもつ小胞体局在蛋白質をコード
する遺伝子を含む発現単位と、前記小胞体局在蛋白質の
機能の対象となる基質としてのポリペプチドをコードす
る外来遺伝子を含む発現単位とを、共発現可能な状態で
酵母染色体上に組み込んで得られる形質転換体。 - 【請求項５】 前記酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又は
その類似体をコードする遺伝子を含む発現単位が、発現
プラスミド pIVTRPADHYERD2 である請求項４記載の形質
転換体。 - 【請求項６】 前記小胞体残留シグナルをもつ小胞体局
在蛋白質をコードする遺伝子が、プロテインジスルフィ
ドイソメラーゼ遺伝子又は、プロテインジスルフィドイ
ソメラーゼ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列と
の連結遺伝子である請求項４記載の形質転換体。 - 【請求項７】 前記ポリペプチドをコードする外来遺伝
子が、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子である請
求項４記載の形質転換体。 - 【請求項８】 前記形質転換体が酵母ＳＮ３５Ａ−１Ｐ
ＵＡＥＴ株である請求項４記載の形質転換体。 - 【請求項９】 請求項４〜８のいずれか一項に記載の形
質転換体を適切な培地中で培養し共発現させて、小胞体
残留シグナルをもつ小胞体局在蛋白質を受容することが
可能な酵母由来受容体蛋白質ＥＲＤ２又は類似体と、Ｅ
ＲＤ２のリガンドとしての前記小胞体局在蛋白質とを小
胞体内に残留させ、一方、前記小胞体局在蛋白質の機能
の対象となる基質としてのポリペプチドを優先的に細胞
外に分泌させること、並びに前記ポリペプチドを回収す
ることを包含するポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3311601A JPH05317037A (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 酵母ｅｒｄ２遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法 |
| EP19920303492 EP0509841A3 (en) | 1991-04-18 | 1992-04-16 | Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system |
| US07/872,673 US5578466A (en) | 1991-04-18 | 1992-04-17 | Recombinant co-expression system of protein disulfide isomerase gene, yeast receptor protein ERD2 gene and a foreign product polypeptide gene, and a process for producing the foreign polypeptide using such system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3311601A JPH05317037A (ja) | 1991-10-30 | 1991-10-30 | 酵母ｅｒｄ２遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317037A true JPH05317037A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=18019216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3311601A Pending JPH05317037A (ja) | 1991-04-18 | 1991-10-30 | 酵母ｅｒｄ２遺伝子とそのリガンドとしての小胞体局在蛋白質をコードする遺伝子とを含む共発現系及びそれを利用する有用ポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05317037A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984001646A1 (fr) * | 1982-10-16 | 1984-04-26 | Fanuc Ltd | Dispositif d'entree et de sortie de donnees |
| JP2003088368A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-25 | Toyota Motor Corp | プレニルアルコールの製造方法 |
| JP2008271976A (ja) * | 1992-06-12 | 2008-11-13 | Merck & Co Inc | サッカロミセスセレビシアエによるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の産生を増加させる方法 |
| US8759046B2 (en) | 2000-12-28 | 2014-06-24 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Process for producing prenyl alcohols |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP3311601A patent/JPH05317037A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984001646A1 (fr) * | 1982-10-16 | 1984-04-26 | Fanuc Ltd | Dispositif d'entree et de sortie de donnees |
| JP2008271976A (ja) * | 1992-06-12 | 2008-11-13 | Merck & Co Inc | サッカロミセスセレビシアエによるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の産生を増加させる方法 |
| US8759046B2 (en) | 2000-12-28 | 2014-06-24 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Process for producing prenyl alcohols |
| JP2003088368A (ja) * | 2001-09-18 | 2003-03-25 | Toyota Motor Corp | プレニルアルコールの製造方法 |
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