JPH05317082A - モノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents
モノクローナル抗体およびその用途Info
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- JPH05317082A JPH05317082A JP4208723A JP20872392A JPH05317082A JP H05317082 A JPH05317082 A JP H05317082A JP 4208723 A JP4208723 A JP 4208723A JP 20872392 A JP20872392 A JP 20872392A JP H05317082 A JPH05317082 A JP H05317082A
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- pancreatic cancer
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 免疫組織染色において７５％以上の陽性率で
ヒト膵臓癌組織に反応することを特徴とするモノクロー
ナル抗体、ならびに該抗体を主成分とするヒト膵臓癌用
検査薬および治療薬。 【効果】 膵臓癌組織と特異的に反応するため、膵臓癌
の診断・治療に有効である。
ヒト膵臓癌組織に反応することを特徴とするモノクロー
ナル抗体、ならびに該抗体を主成分とするヒト膵臓癌用
検査薬および治療薬。 【効果】 膵臓癌組織と特異的に反応するため、膵臓癌
の診断・治療に有効である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト膵臓癌組織と強く反
応し、ヒト膵臓癌診断・治療に有効なモノクローナル抗
体に関するものである。
応し、ヒト膵臓癌診断・治療に有効なモノクローナル抗
体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】わが国の死因の第１位を占める癌に対す
る治療法は年々進歩がみられ、化学療法、放射線療法、
外科療法、そして免疫療法など盛んに施されるに至っ
た。化学療法に関連しては、多くの抗癌剤が生み出され
ており、最近では、腫瘍特異性モノクローナル抗体を用
いて癌を治療しようとする研究も盛んに行われるように
なり、医薬品としてのモノクローナル抗体が開発されつ
つある。また、その治療対象腫瘍部位も血液、肺、肝、
消化器、卵巣、前立腺等広範に渡っている。しかし、そ
の中でも膵臓癌に対してはいままで有効な化療剤もない
まま見過ごされており、奏効率の高い薬剤開発が強く望
まれている。また、ほとんどの化療剤は白血球減少、血
小板減少を始めとする多くの副作用を引き起こすため、
モノクローナル抗体による腫瘍部位選択的な治療法が強
く望まれるところでもある。
る治療法は年々進歩がみられ、化学療法、放射線療法、
外科療法、そして免疫療法など盛んに施されるに至っ
た。化学療法に関連しては、多くの抗癌剤が生み出され
ており、最近では、腫瘍特異性モノクローナル抗体を用
いて癌を治療しようとする研究も盛んに行われるように
なり、医薬品としてのモノクローナル抗体が開発されつ
つある。また、その治療対象腫瘍部位も血液、肺、肝、
消化器、卵巣、前立腺等広範に渡っている。しかし、そ
の中でも膵臓癌に対してはいままで有効な化療剤もない
まま見過ごされており、奏効率の高い薬剤開発が強く望
まれている。また、ほとんどの化療剤は白血球減少、血
小板減少を始めとする多くの副作用を引き起こすため、
モノクローナル抗体による腫瘍部位選択的な治療法が強
く望まれるところでもある。
【０００３】モノクローナル抗体による癌治療法として
は、抗体単独投与で、抗体のもつＦｃ領域に対するレセ
プターを持つマクロファージやリンパ球を腫瘍部位に集
め、癌をたたくという機構、あるいはモノクローナル抗
体に毒性物質、たとえば毒素蛋白質、放射性物質（Ｒ
Ｉ）、抗癌剤などを結合させた免疫毒素複合体などで治
療を行う毒性物質のターゲット療法などが知られてい
る。
は、抗体単独投与で、抗体のもつＦｃ領域に対するレセ
プターを持つマクロファージやリンパ球を腫瘍部位に集
め、癌をたたくという機構、あるいはモノクローナル抗
体に毒性物質、たとえば毒素蛋白質、放射性物質（Ｒ
Ｉ）、抗癌剤などを結合させた免疫毒素複合体などで治
療を行う毒性物質のターゲット療法などが知られてい
る。
【０００４】一方、モノクローナル抗体による診断法と
しては、血中の腫瘍マーカーと特異的に反応することを
利用した体外診断法、組織病理標本において特異的腫瘍
細胞と反応することを利用した病理診断法、そして放射
性物質（ＲＩ）を結合させた抗体を体内に投与し、腫瘍
部への集積から判断する体内診断法（イメージング）等
が挙げられる。なかでも、膵臓癌は血清腫瘍マーカーに
よる体外診断では癌確定診断が難しく、病理診断、さら
にはイメージングによる体内診断が特に有効とされる。
しては、血中の腫瘍マーカーと特異的に反応することを
利用した体外診断法、組織病理標本において特異的腫瘍
細胞と反応することを利用した病理診断法、そして放射
性物質（ＲＩ）を結合させた抗体を体内に投与し、腫瘍
部への集積から判断する体内診断法（イメージング）等
が挙げられる。なかでも、膵臓癌は血清腫瘍マーカーに
よる体外診断では癌確定診断が難しく、病理診断、さら
にはイメージングによる体内診断が特に有効とされる。
【０００５】ところが、現在までのところ膵臓癌に特異
的に反応し、膵臓癌診断・治療に有効なモノクローナル
抗体はほどんど知られておらず、僅かに抗ＣＡ１９−９
抗体、抗Dupan-2 抗体など数種のモノクローナル抗体が
膵臓癌と反応することが知られているが、これらは癌性
糖鎖抗原を認識するもので、体外診断薬としては有効で
あっても、病理診断薬・体内診断薬として、あるいは治
療に有効であるかどうかは疑問視されていた（Herlyn,
M. et al.,J. Nat. Cancer Inst., 82, 1883-1889 (199
0)）。そのため、膵臓癌組織と強く反応し、診断・治療
に有効なモノクローナル抗体の開発が望まれていたのが
実情である。
的に反応し、膵臓癌診断・治療に有効なモノクローナル
抗体はほどんど知られておらず、僅かに抗ＣＡ１９−９
抗体、抗Dupan-2 抗体など数種のモノクローナル抗体が
膵臓癌と反応することが知られているが、これらは癌性
糖鎖抗原を認識するもので、体外診断薬としては有効で
あっても、病理診断薬・体内診断薬として、あるいは治
療に有効であるかどうかは疑問視されていた（Herlyn,
M. et al.,J. Nat. Cancer Inst., 82, 1883-1889 (199
0)）。そのため、膵臓癌組織と強く反応し、診断・治療
に有効なモノクローナル抗体の開発が望まれていたのが
実情である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト膵臓癌
組織と特異的に反応し、しかもヒト膵臓癌診断・治療に
有効なモノクローナル抗体を見出すことを目的とする。
組織と特異的に反応し、しかもヒト膵臓癌診断・治療に
有効なモノクローナル抗体を見出すことを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的は以下の本発明
により達成される。すなわち本発明は、免疫組織染色に
おいて７５％以上の陽性率でヒト膵臓癌組織に反応する
ことを特徴とするモノクローナル抗体を提供し、さらに
病理診断などの膵臓癌体外診断法、ＲＩイメージングな
どによる膵臓癌体内診断法などに用いられるヒト膵臓癌
用検査薬をも提供する。また、本発明のモノクローナル
抗体は、ヒト膵臓癌と特異的に強く反応し、正常組織と
は反応しないため、膵臓癌の治療にも好適である。
により達成される。すなわち本発明は、免疫組織染色に
おいて７５％以上の陽性率でヒト膵臓癌組織に反応する
ことを特徴とするモノクローナル抗体を提供し、さらに
病理診断などの膵臓癌体外診断法、ＲＩイメージングな
どによる膵臓癌体内診断法などに用いられるヒト膵臓癌
用検査薬をも提供する。また、本発明のモノクローナル
抗体は、ヒト膵臓癌と特異的に強く反応し、正常組織と
は反応しないため、膵臓癌の治療にも好適である。
【０００８】本発明で用いるモノクローナル抗体は、免
疫組織染色において７５％以上の陽性率でヒト膵臓癌組
織に反応するモノクローナル抗体であるが、好ましくは
腫瘍細胞表面蛋白質のポリペプチド部分を認識するモノ
クローナル抗体であり、さらにヒト肝癌細胞株で免疫す
ることによって得られるモノクローナル抗体である。本
発明でいう陽性率とは、通常の免疫組織染色において、
個々の膵臓癌患者の腫瘍組織のうち、反応する患者の割
合を表したものであり、本発明では、７５％以上の陽性
率、好ましくは８０％以上の陽性率のモノクローナル抗
体が用いられる。
疫組織染色において７５％以上の陽性率でヒト膵臓癌組
織に反応するモノクローナル抗体であるが、好ましくは
腫瘍細胞表面蛋白質のポリペプチド部分を認識するモノ
クローナル抗体であり、さらにヒト肝癌細胞株で免疫す
ることによって得られるモノクローナル抗体である。本
発明でいう陽性率とは、通常の免疫組織染色において、
個々の膵臓癌患者の腫瘍組織のうち、反応する患者の割
合を表したものであり、本発明では、７５％以上の陽性
率、好ましくは８０％以上の陽性率のモノクローナル抗
体が用いられる。
【０００９】本発明では特に、ヒト肝癌細胞を免疫原と
して得られるＳＦ２５、ＸＦ８、ＡＦ２０(Takahashi,
H. et al.,Cancer Res., 48, 6573-6579 (1988)、Taka
hashi, H. et al., Hepatology, 9, 625-634 (1989))
が好ましく用いられる。これらのモノクローナル抗体
は、公知の細胞融合法に従って得られたモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマに産生させることによって得ら
れる。即ち、ヒト肝癌株化細胞FOCUS(Wilson B., et a
l., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85, 3140-3144(198
8)) をフラスコ内で培養し、これを回収して免疫原と
し、マウスの腹腔に接種して感作させた後、脾臓を摘出
する。その脾臓から脾細胞を調整して、これをミエロー
マ細胞と融合させて、抗体産生能と増殖能とを併せ持っ
たハイブリドーマを取得する。ついで、限界希釈等によ
ってクローン化して、目的とするモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマが得られる。
して得られるＳＦ２５、ＸＦ８、ＡＦ２０(Takahashi,
H. et al.,Cancer Res., 48, 6573-6579 (1988)、Taka
hashi, H. et al., Hepatology, 9, 625-634 (1989))
が好ましく用いられる。これらのモノクローナル抗体
は、公知の細胞融合法に従って得られたモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマに産生させることによって得ら
れる。即ち、ヒト肝癌株化細胞FOCUS(Wilson B., et a
l., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85, 3140-3144(198
8)) をフラスコ内で培養し、これを回収して免疫原と
し、マウスの腹腔に接種して感作させた後、脾臓を摘出
する。その脾臓から脾細胞を調整して、これをミエロー
マ細胞と融合させて、抗体産生能と増殖能とを併せ持っ
たハイブリドーマを取得する。ついで、限界希釈等によ
ってクローン化して、目的とするモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマが得られる。
【００１０】ＳＦ２５、ＸＦ８、ＡＦ２０抗体を用いた
ヒト臓器組織に対する病理学的組織染色法の結果(Takah
ashi, H. et al., Cancer Res., 48, 6573-6579 (198
8)、Takahashi, H. et al., Hepatology, 9, 625-63
4 (1989)) から、これら３種の抗体が認識する抗原は、
正常な肺、肝臓、腸、脾臓、腎臓などには存在せず、癌
化した組織に特異的に存在すること、癌株化細胞に対す
る反応性からも肝臓癌、消化器癌、肺癌と強く反応する
こと、またヒト癌患者腫瘍組織凍結切片の免疫染色から
も確認されたことが知られているが、ヒト膵臓癌患者組
織に対する強い反応性を持つことは知られていなかった
ことであり、本発明者らが初めて見出したことである。
しかも個々の細胞に対するその反応陽性率が高く、また
膵臓癌症例組織との反応比率も極めて高い。さらに上記
の３種のモノクローナル抗体は、細胞表面蛋白質のペプ
チド部分を認識し(Takahashi, H. et al., Cancer Re
s., 48, 6573-6579 (1988)、Takahashi, H. et al.,Hep
atology, 9, 625-634 (1989))、抗原が細胞表面から遊
離することも少ない。
ヒト臓器組織に対する病理学的組織染色法の結果(Takah
ashi, H. et al., Cancer Res., 48, 6573-6579 (198
8)、Takahashi, H. et al., Hepatology, 9, 625-63
4 (1989)) から、これら３種の抗体が認識する抗原は、
正常な肺、肝臓、腸、脾臓、腎臓などには存在せず、癌
化した組織に特異的に存在すること、癌株化細胞に対す
る反応性からも肝臓癌、消化器癌、肺癌と強く反応する
こと、またヒト癌患者腫瘍組織凍結切片の免疫染色から
も確認されたことが知られているが、ヒト膵臓癌患者組
織に対する強い反応性を持つことは知られていなかった
ことであり、本発明者らが初めて見出したことである。
しかも個々の細胞に対するその反応陽性率が高く、また
膵臓癌症例組織との反応比率も極めて高い。さらに上記
の３種のモノクローナル抗体は、細胞表面蛋白質のペプ
チド部分を認識し(Takahashi, H. et al., Cancer Re
s., 48, 6573-6579 (1988)、Takahashi, H. et al.,Hep
atology, 9, 625-634 (1989))、抗原が細胞表面から遊
離することも少ない。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、マウス型
抗体、ヒト型抗体等、種は特に限定しないが、さらに、
遺伝子組み換え技術により得られるアミノ酸配列不変領
域を他種アミノ酸配列に置換えたキメラ型抗体でもよ
い。
抗体、ヒト型抗体等、種は特に限定しないが、さらに、
遺伝子組み換え技術により得られるアミノ酸配列不変領
域を他種アミノ酸配列に置換えたキメラ型抗体でもよ
い。
【００１２】モノクローナル抗体による癌診断法として
は、ＲＩＡ、ＥＩＡ等の免疫化学的測定法による血清腫
瘍マーカー量の変動による体外診断法のほか、病理組織
標本での免疫組織染色による病理診断法などが挙げられ
る。ところが、最近では、モノクローナル抗体を放射性
物質（ＲＩ）で標識して患者に投与し、深部にある腫瘍
へのＲＩ標識抗体集積をγ−カメラで検出診断する方
法、すなわち、体内診断法（ＲＩイメージング）もあ
る。これらに用いられるＲＩとしては、 111Ｉｎ、99m
Ｔｃ等が挙げられ、またこれらＲＩによる抗体の標識法
もＤＴＰＡ等のキレート化合物を付加してなされるキレ
ート法のほか、最近では抗体分子内にキレート部位を形
成させて標識するSchwartz法（S.J.Mather and D.Ellis
on, J. Nucl.Med., 31, 692-97(1990) ）もある。さら
に抗体の形態もその代謝を考慮してＩｇＧあるいはＦａ
ｂ´などが適宜用いられる。
は、ＲＩＡ、ＥＩＡ等の免疫化学的測定法による血清腫
瘍マーカー量の変動による体外診断法のほか、病理組織
標本での免疫組織染色による病理診断法などが挙げられ
る。ところが、最近では、モノクローナル抗体を放射性
物質（ＲＩ）で標識して患者に投与し、深部にある腫瘍
へのＲＩ標識抗体集積をγ−カメラで検出診断する方
法、すなわち、体内診断法（ＲＩイメージング）もあ
る。これらに用いられるＲＩとしては、 111Ｉｎ、99m
Ｔｃ等が挙げられ、またこれらＲＩによる抗体の標識法
もＤＴＰＡ等のキレート化合物を付加してなされるキレ
ート法のほか、最近では抗体分子内にキレート部位を形
成させて標識するSchwartz法（S.J.Mather and D.Ellis
on, J. Nucl.Med., 31, 692-97(1990) ）もある。さら
に抗体の形態もその代謝を考慮してＩｇＧあるいはＦａ
ｂ´などが適宜用いられる。
【００１３】モノクローナル抗体による癌治療法として
は、一つは抗体単独投与により、抗体の持つＦｃ領域に
対するレセプターを持つマクロファージやリンパ球を腫
瘍部位に集め、癌をたたくという免疫療法という言葉で
知られた機構である。この機構では、好ましくはヒト型
ＩｇＧ1 のＦｃ領域を持つキメラ型抗体がよく用いられ
る。
は、一つは抗体単独投与により、抗体の持つＦｃ領域に
対するレセプターを持つマクロファージやリンパ球を腫
瘍部位に集め、癌をたたくという免疫療法という言葉で
知られた機構である。この機構では、好ましくはヒト型
ＩｇＧ1 のＦｃ領域を持つキメラ型抗体がよく用いられ
る。
【００１４】一方、モノクローナル抗体に毒性物質、た
とえば毒素蛋白質、放射性物質(RI)、抗癌剤などを結合
させた免疫毒素複合体などで治療を行う毒性物質のター
ゲット療法も考えられる機構である。この場合には、抗
体の構造としては腫瘍細胞結合部を含めばマウス型抗
体、キメラ型抗体は限定されないが、例えば、ＩｇＧ、
F(ab')2 、Ｆab' あるいはＦab等が挙げられる。また毒
性物質として用いられる毒素蛋白質には、リシン、アブ
リンなどの植物毒素（タイプII）のＡ鎖、ルフィン、モ
モルディン、ＰＡＳ−Ｐなどの植物毒素（タイプＩ）、
シュード・モナス毒素、ジフテリア毒素などの細菌性蛋
白質毒素のＡ鎖等が挙げられ、これらは蛋白質合成を不
可逆的に停止させることにより細胞に対し強力な毒性を
現す。この他毒素蛋白質としては、細胞内に取り込ま
れ、細胞に致命的な障害を与えることができるヒト由来
の酵素、例えば、ヒト膵臓ＲＮａｓｅなども望ましい。
とえば毒素蛋白質、放射性物質(RI)、抗癌剤などを結合
させた免疫毒素複合体などで治療を行う毒性物質のター
ゲット療法も考えられる機構である。この場合には、抗
体の構造としては腫瘍細胞結合部を含めばマウス型抗
体、キメラ型抗体は限定されないが、例えば、ＩｇＧ、
F(ab')2 、Ｆab' あるいはＦab等が挙げられる。また毒
性物質として用いられる毒素蛋白質には、リシン、アブ
リンなどの植物毒素（タイプII）のＡ鎖、ルフィン、モ
モルディン、ＰＡＳ−Ｐなどの植物毒素（タイプＩ）、
シュード・モナス毒素、ジフテリア毒素などの細菌性蛋
白質毒素のＡ鎖等が挙げられ、これらは蛋白質合成を不
可逆的に停止させることにより細胞に対し強力な毒性を
現す。この他毒素蛋白質としては、細胞内に取り込ま
れ、細胞に致命的な障害を与えることができるヒト由来
の酵素、例えば、ヒト膵臓ＲＮａｓｅなども望ましい。
【００１５】一方、毒素蛋白質と抗体との結合で得られ
る免疫毒素複合体の製造には、架橋剤［蛋白質・核酸・
酵素、別冊 No.31 335-343(1987)］が用いられる。この
免疫毒素複合体は腫瘍細胞に結合後、細胞内に速やかに
取り込まれ、毒素がその活性を発揮する部位へ移動し、
腫瘍細胞を壊死させる機構で、この場合にはモノクロー
ナル抗体は結合後細胞内に速やかに取り込まれる性質を
有していることが望ましい。
る免疫毒素複合体の製造には、架橋剤［蛋白質・核酸・
酵素、別冊 No.31 335-343(1987)］が用いられる。この
免疫毒素複合体は腫瘍細胞に結合後、細胞内に速やかに
取り込まれ、毒素がその活性を発揮する部位へ移動し、
腫瘍細胞を壊死させる機構で、この場合にはモノクロー
ナル抗体は結合後細胞内に速やかに取り込まれる性質を
有していることが望ましい。
【００１６】毒性物質としてこの他に放射性物質(RI)、
抗癌剤も考えられるが、これらの場合には抗体は細胞内
に取り込まれる必要はなく、腫瘍細胞近傍まで運ばれれ
ば十分に効果を発揮し得る。しかし、抗癌剤は十分量の
送達が必要で、この場合には抗体に結合させる抗癌剤の
分子数を数十〜数百と多ければ多い程望ましい。これを
満たすために高分子ポリマーに抗癌剤を多分子結合させ
たものを抗体につなげる方法などもある。
抗癌剤も考えられるが、これらの場合には抗体は細胞内
に取り込まれる必要はなく、腫瘍細胞近傍まで運ばれれ
ば十分に効果を発揮し得る。しかし、抗癌剤は十分量の
送達が必要で、この場合には抗体に結合させる抗癌剤の
分子数を数十〜数百と多ければ多い程望ましい。これを
満たすために高分子ポリマーに抗癌剤を多分子結合させ
たものを抗体につなげる方法などもある。
【００１７】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。 実施例１．ヒト患者膵臓癌組織と本モノクローナル抗体との反応
性： 本実施例で用いたモノクローナル抗体は、Takahash
i らによって記載の方法（H. Takahashi et al. Hepato
logy 9, 625(1989）参照）に従って作製されたヒト肝癌
株化細胞FOCUS の表面抗原に対するモノクローナル抗体
ＳＦ２５、ＸＦ８、およびＡＦ２０である。
明する。 実施例１．ヒト患者膵臓癌組織と本モノクローナル抗体との反応
性： 本実施例で用いたモノクローナル抗体は、Takahash
i らによって記載の方法（H. Takahashi et al. Hepato
logy 9, 625(1989）参照）に従って作製されたヒト肝癌
株化細胞FOCUS の表面抗原に対するモノクローナル抗体
ＳＦ２５、ＸＦ８、およびＡＦ２０である。
【００１８】凍結組織切片標本の調製法並びに免疫組織
染色法は次の方法により行った。
染色法は次の方法により行った。
【００１９】新鮮ヒト患者膵臓癌組織を切除後直ちに凍
結し、保存する。こうして得られた組織の凍結切片を作
製し、アセトンにて−20℃、５分間固定操作を行い、そ
の後PBS(-)にて洗浄した。２％ウマ血清を室温で20分間
反応させて洗浄、そして 0.5μg/mlのＳＦ２５、ＸＦ
８、あるいはＡＦ２０の１次抗体を４℃で１晩反応さ
せ、PBS(-)で洗浄後、 400倍希釈のビオチン化２次抗体
を室温で３時間反応させ、PBS(-)で洗浄した。0.3%Ｈ2
Ｏ2 添加メタノールを室温で20分間処理、PBS(-)で洗浄
後 200倍希釈のＡＢＣ(Avidin Biotin Coimplex)試薬を
１時間半反応させ、PBS(-)で洗浄後、酵素基質であるＤ
ＡＢ（3,3'-diaminobenzidine)、過酸化水素水を含む基
質溶液を反応させて染色した。結果を表１に示す。
結し、保存する。こうして得られた組織の凍結切片を作
製し、アセトンにて−20℃、５分間固定操作を行い、そ
の後PBS(-)にて洗浄した。２％ウマ血清を室温で20分間
反応させて洗浄、そして 0.5μg/mlのＳＦ２５、ＸＦ
８、あるいはＡＦ２０の１次抗体を４℃で１晩反応さ
せ、PBS(-)で洗浄後、 400倍希釈のビオチン化２次抗体
を室温で３時間反応させ、PBS(-)で洗浄した。0.3%Ｈ2
Ｏ2 添加メタノールを室温で20分間処理、PBS(-)で洗浄
後 200倍希釈のＡＢＣ(Avidin Biotin Coimplex)試薬を
１時間半反応させ、PBS(-)で洗浄後、酵素基質であるＤ
ＡＢ（3,3'-diaminobenzidine)、過酸化水素水を含む基
質溶液を反応させて染色した。結果を表１に示す。
【００２０】表１に示したようにＳＦ２５、ＸＦ８、Ａ
Ｆ２０の３抗体ともヒト患者膵臓癌組織とは約８０％以
上の高い反応性を示し、免疫組織染色への本抗体使用が
膵臓癌の有効な病理診断法を与えることが示された。。
さらにＲＩ照射による治療を受けた後の組織であっても
よく反応することから、ＲＩ照射での抗原の失活が認め
られないことは今後治療に広く応用可能であることが期
待される。なお表中、分数で表された数値のうち、分母
が組織染色対象全患者数、分子が染色された組織を持つ
患者数を表す。また、カッコ内の数字は陽性率を表す。
Ｆ２０の３抗体ともヒト患者膵臓癌組織とは約８０％以
上の高い反応性を示し、免疫組織染色への本抗体使用が
膵臓癌の有効な病理診断法を与えることが示された。。
さらにＲＩ照射による治療を受けた後の組織であっても
よく反応することから、ＲＩ照射での抗原の失活が認め
られないことは今後治療に広く応用可能であることが期
待される。なお表中、分数で表された数値のうち、分母
が組織染色対象全患者数、分子が染色された組織を持つ
患者数を表す。また、カッコ内の数字は陽性率を表す。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２ヒト膵臓癌由来株化細胞に対する抗体毒素複合体の抗細
胞効果： ３種のヒト膵臓癌由来株化細胞、ＢｘＰＣ−
３、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａを用い、ＡＦ２０抗
体・毒素複合体の抗細胞効果を、次の方法によって行な
った。
胞効果： ３種のヒト膵臓癌由来株化細胞、ＢｘＰＣ−
３、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａを用い、ＡＦ２０抗
体・毒素複合体の抗細胞効果を、次の方法によって行な
った。
【００２３】各種培養細胞を２４穴プレートに５×１０
3 細胞／ml／wellでまき、３７℃、５％ＣＯ2 のもとで
培養し、翌日、段階希釈した２種の抗体毒素複合体（Ａ
Ｆ２０−アブリンＡ鎖複合体（ＡＦ２０−ＡＡ）、およ
びＡＦ２０−リシンＡ鎖複合体（ＡＦ２０−ＲＡ））
を、０．１ml／well添加し、培養した。その翌日、各ウ
エルを培地で２回洗浄し、新しい培地を加えた後、５日
間培養、そしてコールカウンターで細胞数を計測した。
コントロールとしてＰＢＳを添加した細胞数を１００％
として、抗体毒素複合体添加による細胞数５０％の抗体
毒素複合体濃度をＩＣ50値として算出した。
3 細胞／ml／wellでまき、３７℃、５％ＣＯ2 のもとで
培養し、翌日、段階希釈した２種の抗体毒素複合体（Ａ
Ｆ２０−アブリンＡ鎖複合体（ＡＦ２０−ＡＡ）、およ
びＡＦ２０−リシンＡ鎖複合体（ＡＦ２０−ＲＡ））
を、０．１ml／well添加し、培養した。その翌日、各ウ
エルを培地で２回洗浄し、新しい培地を加えた後、５日
間培養、そしてコールカウンターで細胞数を計測した。
コントロールとしてＰＢＳを添加した細胞数を１００％
として、抗体毒素複合体添加による細胞数５０％の抗体
毒素複合体濃度をＩＣ50値として算出した。
【００２４】なお、用いた抗体毒素複合体、ＡＦ２０−
ＡＡおよびＡＦ２０−ＲＡは以下の方法により調製し
た。
ＡＡおよびＡＦ２０−ＲＡは以下の方法により調製し
た。
【００２５】ＡＦ２０−ＡＡの調製： ａ．アブリンＡ鎖 トウアズキ種子を粉にひいたものを石油エーテルにて脱
脂後、水にて直ちに抽出した。この際、酢酸にてｐＨを
４．５に調整した。遠心で上清を集めた後、硫安沈殿
（４０〜７０％）、酸処理セファロース４Ｂ、ＤＥＡＥ
セルロースによるアフィニティークロマトグラフとつな
ぎアブリンを精製した。このアブリンを５％メルカプト
エタノールを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．７）にて室
温、３時間〜一晩還元した後、ｐＨを８．５に調整し、
ＤＥＡＥセルロース・カラムに通液し、よく洗浄する。
その後、０〜０．２Ｍ ＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ８．
５）で溶出させ、次いで、アシアロフェツインカラムを
通し、さらにゲルろ過により精製アブリンＡ鎖を得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色による分析では、このアブリ
ンＡ鎖にはアブリンＢ鎖の混入は認められなかった。
脂後、水にて直ちに抽出した。この際、酢酸にてｐＨを
４．５に調整した。遠心で上清を集めた後、硫安沈殿
（４０〜７０％）、酸処理セファロース４Ｂ、ＤＥＡＥ
セルロースによるアフィニティークロマトグラフとつな
ぎアブリンを精製した。このアブリンを５％メルカプト
エタノールを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．７）にて室
温、３時間〜一晩還元した後、ｐＨを８．５に調整し、
ＤＥＡＥセルロース・カラムに通液し、よく洗浄する。
その後、０〜０．２Ｍ ＮａＣｌの緩衝液（ｐＨ８．
５）で溶出させ、次いで、アシアロフェツインカラムを
通し、さらにゲルろ過により精製アブリンＡ鎖を得た。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色による分析では、このアブリ
ンＡ鎖にはアブリンＢ鎖の混入は認められなかった。
【００２６】ｂ．免疫毒素複合体の調製 ＡＦ２０抗体のアブリンＡ鎖複合体、ＡＦ２０−ＡＡを
架橋剤としてＳＰＤＰを用いて調製した。抗体をＰＢＳ
の溶液の下、ジメチルフォルムアミドに溶解したＳＰＤ
Ｐを抗体とのモル比にして４：１で室温、３０分間反応
させ、ゲル炉過をした。その後、約３倍モルのアブリン
Ａ鎖を中性条件下で添加して室温、一晩反応させ、複合
体を作製した。これを実施例１と同様、ブルーセファロ
ースカラム→ウルトロゲルＡｃＡ４４カラム操作で最終
的に免疫毒素複合体を精製して使用した。こうして得ら
れた免疫毒素複合体は抗体１分子当り１または２個のア
ブリンＡ鎖を含有していた。またＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀
染色による分析では、本複合体試料中には遊離のアブリ
ンＡ鎖は検出されなかった。
架橋剤としてＳＰＤＰを用いて調製した。抗体をＰＢＳ
の溶液の下、ジメチルフォルムアミドに溶解したＳＰＤ
Ｐを抗体とのモル比にして４：１で室温、３０分間反応
させ、ゲル炉過をした。その後、約３倍モルのアブリン
Ａ鎖を中性条件下で添加して室温、一晩反応させ、複合
体を作製した。これを実施例１と同様、ブルーセファロ
ースカラム→ウルトロゲルＡｃＡ４４カラム操作で最終
的に免疫毒素複合体を精製して使用した。こうして得ら
れた免疫毒素複合体は抗体１分子当り１または２個のア
ブリンＡ鎖を含有していた。またＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀
染色による分析では、本複合体試料中には遊離のアブリ
ンＡ鎖は検出されなかった。
【００２７】ＡＦ２０−ＲＡの調製： ａ．リシンＡ鎖 生化学工業（株）より購入したヒママメレクチン（ＲＣ
Ａ−６０）をラクトース・アガロースカラムに結合さ
せ、５％メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（ＭＥ−Ｐ
ＢＳ）でカラムを一晩放置後、ＭＥ−ＰＢＳでリシンＡ
鎖のみを溶出させた。その後、アシアロフェツインカラ
ムを通し、精製リシンＡ鎖を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
銀染色による分析では、この精製リシンＡ鎖にはリシン
Ｂ鎖の混入は認められなかった。
Ａ−６０）をラクトース・アガロースカラムに結合さ
せ、５％メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（ＭＥ−Ｐ
ＢＳ）でカラムを一晩放置後、ＭＥ−ＰＢＳでリシンＡ
鎖のみを溶出させた。その後、アシアロフェツインカラ
ムを通し、精製リシンＡ鎖を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
銀染色による分析では、この精製リシンＡ鎖にはリシン
Ｂ鎖の混入は認められなかった。
【００２８】ｂ．免疫毒素複合体の調製 抗体のリシンＡ鎖複合体、ＡＦ２０−ＲＡを架橋剤とし
てＳＰＤＰを用いて調製した。抗体をＰＢＳの溶液の
下、ジメチルフォルムアミドに溶解したＳＰＤＰを抗体
とのモル比にして４：１で室温、３０分間反応させ、ゲ
ルろ過をした。その後、３倍モルのリシンＡ鎖を中性条
件下で添加して室温、一晩反応させ、複合体を作製し
た。これを“ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ”カラム
（ファルマシア社製）→“ウルトロゲルＡｃＡ４４”カ
ラム（ＩＢＦバイオテクニックス社製）操作で最終的に
免疫毒素複合体を精製して使用した。各々の免疫毒素複
合体は抗体１分子当り１または２個のリシンＡ鎖を含有
していた。またＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色による分析で
は、いずれの免疫毒素複合体にも遊離のリシンＡ鎖は検
出されなかった。
てＳＰＤＰを用いて調製した。抗体をＰＢＳの溶液の
下、ジメチルフォルムアミドに溶解したＳＰＤＰを抗体
とのモル比にして４：１で室温、３０分間反応させ、ゲ
ルろ過をした。その後、３倍モルのリシンＡ鎖を中性条
件下で添加して室温、一晩反応させ、複合体を作製し
た。これを“ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ”カラム
（ファルマシア社製）→“ウルトロゲルＡｃＡ４４”カ
ラム（ＩＢＦバイオテクニックス社製）操作で最終的に
免疫毒素複合体を精製して使用した。各々の免疫毒素複
合体は抗体１分子当り１または２個のリシンＡ鎖を含有
していた。またＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色による分析で
は、いずれの免疫毒素複合体にも遊離のリシンＡ鎖は検
出されなかった。
【００２９】膵臓癌細胞に対する抗体毒素複合体の抗細
胞効果は表２に示す。
胞効果は表２に示す。
【表２】 表２に示されたＩＣ50値の通り、膵癌細胞に対して、抗
体毒素複合体ＡＦ２０−ＡＡ、ＡＦ２０−ＲＡの抗細胞
効果が認められた。
体毒素複合体ＡＦ２０−ＡＡ、ＡＦ２０−ＲＡの抗細胞
効果が認められた。
【００３０】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、膵臓癌
組織と特異的に反応するため、膵臓癌の診断・治療に有
効である。
組織と特異的に反応するため、膵臓癌の診断・治療に有
効である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 免疫組織染色において７５％以上の陽性
率でヒト膵臓癌組織に反応することを特徴とするモノク
ローナル抗体。 - 【請求項２】 腫瘍細胞表面蛋白質のポリペプチド部分
を認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ヒト肝癌細胞株で免疫することによって
得られる請求項１または２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 モノクローナル抗体がＳＦ２５、ＸＦ８
またはＡＦ２０である請求項１〜３記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項５】 請求項１〜４記載のモノクローナル抗体
を主成分とするヒト膵臓癌用検査薬。 - 【請求項６】 請求項１〜４記載のモノクローナル抗体
を有効成分とするヒト膵臓癌用治療薬。 - 【請求項７】 請求項１〜４記載のモノクローナル抗体
に毒素Ａ鎖部分を結合させてなる免疫毒素複合体を有効
成分とするヒト膵臓癌用治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4208723A JPH05317082A (ja) | 1991-08-06 | 1992-08-05 | モノクローナル抗体およびその用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19682491 | 1991-08-06 | ||
| JP27262091 | 1991-10-21 | ||
| JP3-196824 | 1991-10-21 | ||
| JP3-272620 | 1991-10-21 | ||
| JP4208723A JPH05317082A (ja) | 1991-08-06 | 1992-08-05 | モノクローナル抗体およびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317082A true JPH05317082A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=26510006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4208723A Pending JPH05317082A (ja) | 1991-08-06 | 1992-08-05 | モノクローナル抗体およびその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0526888A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05317082A (ja) |
| CA (1) | CA2075343A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008507253A (ja) * | 2004-02-06 | 2008-03-13 | ナイモックス コーポレーション | ヒト化抗体 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1320551A4 (en) | 2000-09-01 | 2006-12-20 | Internat Bioimmune Systems Inc | IDENTIFICATION AND DEVELOPMENT OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST SQUAFTEPITHELIC CARCINOMA |
| JP2004537976A (ja) | 2001-03-15 | 2004-12-24 | インターナショナル バイオイムン システムズ，インコーポレーテッド | 膵癌のモノクローナル抗体治療 |
| CN110317273A (zh) * | 2018-03-30 | 2019-10-11 | 积水医疗株式会社 | 与dupan-2抗原特异性反应的单克隆抗体及其制造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR850552B (ja) * | 1984-03-07 | 1985-07-05 | Du Pont | |
| EP0279669B1 (en) * | 1987-02-19 | 1995-12-27 | Scripps Clinic And Research Foundation | Cell surface marker of human pancreatic carcinoma cells |
| US5212085A (en) * | 1987-12-09 | 1993-05-18 | The General Hospital Corporation | Sf-25 colon adenocarcinoma antigen, and antibodies with recognize this antigen |
| CA1340110C (en) * | 1987-12-09 | 1998-11-03 | Jack R. Wands | Carcinoma-associated antigens, and antibodies which recognize these antigens |
| KR920702229A (ko) * | 1990-06-29 | 1992-09-03 | 마에다 카쯔노스케 | 면역 독소 복합체 |
-
1992
- 1992-08-05 EP EP19920113367 patent/EP0526888A3/en not_active Withdrawn
- 1992-08-05 CA CA002075343A patent/CA2075343A1/en not_active Abandoned
- 1992-08-05 JP JP4208723A patent/JPH05317082A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008507253A (ja) * | 2004-02-06 | 2008-03-13 | ナイモックス コーポレーション | ヒト化抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2075343A1 (en) | 1993-02-07 |
| EP0526888A2 (en) | 1993-02-10 |
| EP0526888A3 (en) | 1993-09-01 |
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