JPH05322893A - 免疫学的測定用ｂｆ分離法 - Google Patents
免疫学的測定用ｂｆ分離法Info
- Publication number
- JPH05322893A JPH05322893A JP13550691A JP13550691A JPH05322893A JP H05322893 A JPH05322893 A JP H05322893A JP 13550691 A JP13550691 A JP 13550691A JP 13550691 A JP13550691 A JP 13550691A JP H05322893 A JPH05322893 A JP H05322893A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- reagent
- antigen
- labeled
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】加えられる標識抗体（あるいは標識抗原）を削
減しても従来と同様の感度が得られて経済化が達成され
ると共に、従来より高感度に測定が可能となる免疫学的
測定用ＢＦ分離法を提供する。 【構成】抗原または抗体に標識した物質Ｅをリガンドと
し、該リガンドに抗体３Ｃを架橋的に結合させ、該結合
体を固相１に結合させて分離する。
減しても従来と同様の感度が得られて経済化が達成され
ると共に、従来より高感度に測定が可能となる免疫学的
測定用ＢＦ分離法を提供する。 【構成】抗原または抗体に標識した物質Ｅをリガンドと
し、該リガンドに抗体３Ｃを架橋的に結合させ、該結合
体を固相１に結合させて分離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトまたは動物の体液
中の各種物質を抗原抗体反応を利用して測定する場合に
使用される免疫学的測定用ＢＦ分離法に関する。
中の各種物質を抗原抗体反応を利用して測定する場合に
使用される免疫学的測定用ＢＦ分離法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液や尿等の体液中に存在するホルモ
ン、癌細胞に由来する物質、病原性微生物に由来する物
質、自己抗体、あるいは病原性微生物に対する抗体等を
検出、測定する場合、抗原に抗体が結合する抗原抗体反
応が利用される。この抗原抗体反応を利用した測定方法
（以下免疫測定法と略す）において、ＢＦ分離（Ｂは抗
体（または抗原）に結合した抗原（または抗体）、Ｆは
非結合であるフリーの抗原（または抗体））が必要な方
法としては、 (1) 酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay…ＥＩＡ） (2) 放射免疫測定法（Radio Immunoassay …ＲＩＡ） (3) 蛍光免疫測定法（Fluoro Immunoassay…ＦＩＡ） (4) 時間分解蛍光免疫測定法（Time Resolved Fluoro I
mmunoassay…ＴＲ−ＦＩＡ）などがある。
ン、癌細胞に由来する物質、病原性微生物に由来する物
質、自己抗体、あるいは病原性微生物に対する抗体等を
検出、測定する場合、抗原に抗体が結合する抗原抗体反
応が利用される。この抗原抗体反応を利用した測定方法
（以下免疫測定法と略す）において、ＢＦ分離（Ｂは抗
体（または抗原）に結合した抗原（または抗体）、Ｆは
非結合であるフリーの抗原（または抗体））が必要な方
法としては、 (1) 酵素免疫測定法（Enzyme Immunoassay…ＥＩＡ） (2) 放射免疫測定法（Radio Immunoassay …ＲＩＡ） (3) 蛍光免疫測定法（Fluoro Immunoassay…ＦＩＡ） (4) 時間分解蛍光免疫測定法（Time Resolved Fluoro I
mmunoassay…ＴＲ−ＦＩＡ）などがある。
【０００３】前記酵素免疫測定法は、図８にサンドイッ
チＥＩＡ法について示すように、まず（Ａ）のように、
固相１（なお、この固相は、図示のような容器状をなす
プレートと称されるもの、あるいはビーズ状をなすも
の、またはチューブ状をなすものがある）の表面に予め
測定すべき抗原（抗体である場合もある）２に対応する
抗体（抗原である場合もある）３を結合しておき、
（Ｂ）に示すように、抗原２と、酵素Ｅで標識した抗体
３Ａを入れると、液４内で図示のような抗体３−抗原２
−抗体３Ａからなるサイドイッチ状の抗原抗体複合体が
形成され、その後液４を洗い流し、（Ｃ）に示すよう
に、抗原２の量に対応している酵素Ｅの量を比色法によ
り測定する方法である。すなわち、固相１に結合してい
る抗体３Ａと反応する抗原２の量は、液４中の抗原２の
含有量に比例することに鑑み、この抗原２の量を酵素Ｅ
の量として測定する方法である。なお、この酵素Ｅの量
の測定は、液４を流出し、固相１を洗浄した後、酵素Ｅ
により発色または脱色する物質（基質）を含む液をプレ
ートに加え、吸光度の変化を測定することにより行な
う。
チＥＩＡ法について示すように、まず（Ａ）のように、
固相１（なお、この固相は、図示のような容器状をなす
プレートと称されるもの、あるいはビーズ状をなすも
の、またはチューブ状をなすものがある）の表面に予め
測定すべき抗原（抗体である場合もある）２に対応する
抗体（抗原である場合もある）３を結合しておき、
（Ｂ）に示すように、抗原２と、酵素Ｅで標識した抗体
３Ａを入れると、液４内で図示のような抗体３−抗原２
−抗体３Ａからなるサイドイッチ状の抗原抗体複合体が
形成され、その後液４を洗い流し、（Ｃ）に示すよう
に、抗原２の量に対応している酵素Ｅの量を比色法によ
り測定する方法である。すなわち、固相１に結合してい
る抗体３Ａと反応する抗原２の量は、液４中の抗原２の
含有量に比例することに鑑み、この抗原２の量を酵素Ｅ
の量として測定する方法である。なお、この酵素Ｅの量
の測定は、液４を流出し、固相１を洗浄した後、酵素Ｅ
により発色または脱色する物質（基質）を含む液をプレ
ートに加え、吸光度の変化を測定することにより行な
う。
【０００４】前記放射免疫測定法は、前記酵素Ｅの代わ
りに、標識物質として放射性元素を用い、抗原の量を、
液流出後の放射性元素の量から測定する方法であり、蛍
光免疫測定法は、酵素Ｅの代わりに蛍光物質を用い、抗
原の量を、液流出後の蛍光物質の光量から測定する方法
である。
りに、標識物質として放射性元素を用い、抗原の量を、
液流出後の放射性元素の量から測定する方法であり、蛍
光免疫測定法は、酵素Ｅの代わりに蛍光物質を用い、抗
原の量を、液流出後の蛍光物質の光量から測定する方法
である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】この従来の測定方法に
は次のような問題点があった。 (1) 抗体３Ａに標識した酵素Ｅによる発色または脱色量
を増やし、測定感度を上昇させるために、大量の抗体３
Ａを加える必要があった。 (2) 加えられる抗体３Ａの全てが抗原２と結合して抗原
抗体複合体を形成できないため、液４中の未反応の抗体
３Ａは洗浄時に標識してある酵素Ｅを活用しないまま、
洗い流され、不経済であった。
は次のような問題点があった。 (1) 抗体３Ａに標識した酵素Ｅによる発色または脱色量
を増やし、測定感度を上昇させるために、大量の抗体３
Ａを加える必要があった。 (2) 加えられる抗体３Ａの全てが抗原２と結合して抗原
抗体複合体を形成できないため、液４中の未反応の抗体
３Ａは洗浄時に標識してある酵素Ｅを活用しないまま、
洗い流され、不経済であった。
【０００６】本発明は、上記問題点に鑑み、加えられる
標識抗体（あるいは標識抗原）を削減しても従来と同様
の感度が得られて経済化が達成されるＢＦ分離法を提供
すると共に、従来より高感度に測定が可能となるＢＦ分
離法を提供することを目的とする。
標識抗体（あるいは標識抗原）を削減しても従来と同様
の感度が得られて経済化が達成されるＢＦ分離法を提供
すると共に、従来より高感度に測定が可能となるＢＦ分
離法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】抗原または抗体に標識し
た物質をリガンドとし、該リガンドに抗体を架橋的に結
合させ、該結合体を固相に結合させて分離することを特
徴とする。
た物質をリガンドとし、該リガンドに抗体を架橋的に結
合させ、該結合体を固相に結合させて分離することを特
徴とする。
【０００８】
【作用】本発明においては、固相に結合し分離される結
合体中の標識物質量が増大するから、検出すべき抗原あ
るいは抗体に対する標識物質量の検出信号が大きくな
る。
合体中の標識物質量が増大するから、検出すべき抗原あ
るいは抗体に対する標識物質量の検出信号が大きくな
る。
【０００９】
【実施例１】本発明を「アビジン−ビオチン系サンドイ
ッチＥＩＡ」に応用し、癌胎児性抗原（以下ＣＥＡと称
す）の測定について検討した。なお、「アビジン−ビオ
チン系サンドイッチＥＩＡ」は、本発明者等が既に開発
し、出願済のＢＦ分離法であり、酵素標識を用いる場
合、図２（Ａ）に示すように、ビオチンＢを結合させた
固相（プレートのウェル）１に、（Ｂ）に示すように、
アビジンＡ、抗原２、ビオチンＢ標識抗体３Ｂおよび酵
素Ｅ標識抗体３Ａを加え、洗浄後、（Ｃ）に示すよう
に、固相１面に残った酵素Ｅの量を吸光度により測定す
る方法である。すなわち、抗原２をサンドイッチのよう
に挟んで結合する２つの抗体３Ｂ、３Ａのうち、一方の
抗体３ＢをビオチンＢで標識しておき、このビオチン標
識抗体３ＢのビオチンＢを、アビジンＡを介して、固相
１に予め結合しているビオチンＢに結合させることによ
り、抗原２と抗体３Ａとの複合体を固相１に固定する方
法である。
ッチＥＩＡ」に応用し、癌胎児性抗原（以下ＣＥＡと称
す）の測定について検討した。なお、「アビジン−ビオ
チン系サンドイッチＥＩＡ」は、本発明者等が既に開発
し、出願済のＢＦ分離法であり、酵素標識を用いる場
合、図２（Ａ）に示すように、ビオチンＢを結合させた
固相（プレートのウェル）１に、（Ｂ）に示すように、
アビジンＡ、抗原２、ビオチンＢ標識抗体３Ｂおよび酵
素Ｅ標識抗体３Ａを加え、洗浄後、（Ｃ）に示すよう
に、固相１面に残った酵素Ｅの量を吸光度により測定す
る方法である。すなわち、抗原２をサンドイッチのよう
に挟んで結合する２つの抗体３Ｂ、３Ａのうち、一方の
抗体３ＢをビオチンＢで標識しておき、このビオチン標
識抗体３ＢのビオチンＢを、アビジンＡを介して、固相
１に予め結合しているビオチンＢに結合させることによ
り、抗原２と抗体３Ａとの複合体を固相１に固定する方
法である。
【００１０】一方本発明を「アビジン−ビオチン系サン
ドイッチＥＩＡ」に応用する場合は、図１（Ａ）〜
（Ｃ）の工程図に示すように、固相１に１つの抗原２に
結合させる標識抗体３Ａの数を多くするため、標識（本
例では酵素）抗体３Ａをリガンド（受容体と反応する構
造を持つ分子）とし、リガンドに対して複数の結合子を
持つ抗体３Ｃによって結合する方法である。このように
すれば、抗原２に結合する標識抗体３Ａの量が多くな
り、測定感度が増大する。この測定に使用したプレー
ト、試薬は下記の通りである。
ドイッチＥＩＡ」に応用する場合は、図１（Ａ）〜
（Ｃ）の工程図に示すように、固相１に１つの抗原２に
結合させる標識抗体３Ａの数を多くするため、標識（本
例では酵素）抗体３Ａをリガンド（受容体と反応する構
造を持つ分子）とし、リガンドに対して複数の結合子を
持つ抗体３Ｃによって結合する方法である。このように
すれば、抗原２に結合する標識抗体３Ａの量が多くな
り、測定感度が増大する。この測定に使用したプレー
ト、試薬は下記の通りである。
【００１１】ビオチン結合プレート…ビオチン化ＢＳＡ
（２０μｇ／ｍｌ）をＥＩＡマイクロプレートに結合し
て作製した。 試薬１（抗原２に相当）…ＣＥＡをウサギ血清中に０、
２．５、５、１０、２５あるいは５０ｎｇ／ｍｌ含ませ
たもの。 試薬２（抗体３Ｂに相当）…ビオチン標識抗ヒトＣＥＡ
抗体をＴｒｉｓ緩衝液中に５μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬３（抗体３Ａに相当）…ペルオキシターゼ標識抗ヒ
トＣＥＡ抗体をウサギ血清中に１０μｇ／ｍｌ含ませた
もの。 試薬４（アビジンＡＶに相当）…ストレプトアビジンを
Ｔｒｉｓ緩衝液中に１０μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬５（発色用基質溶液）…０．５ｍｇ／ｍｌオルトフ
ェニレンジアミン・２ＨＣｌ−０．０１５％Ｈ2Ｏ2 −
０．１１ＭＮａ2ＨＰＯ4−０．０４４Ｍクエン酸（ＰＨ
５．４） 反応停止液…２Ｎ−Ｈ2ＳＯ4 洗浄液…０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｓａｌｉｎ 以上の試薬等を使用し、本発明による方法の効果を証明
するため、前記先願方法によっても測定を行なった。
（２０μｇ／ｍｌ）をＥＩＡマイクロプレートに結合し
て作製した。 試薬１（抗原２に相当）…ＣＥＡをウサギ血清中に０、
２．５、５、１０、２５あるいは５０ｎｇ／ｍｌ含ませ
たもの。 試薬２（抗体３Ｂに相当）…ビオチン標識抗ヒトＣＥＡ
抗体をＴｒｉｓ緩衝液中に５μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬３（抗体３Ａに相当）…ペルオキシターゼ標識抗ヒ
トＣＥＡ抗体をウサギ血清中に１０μｇ／ｍｌ含ませた
もの。 試薬４（アビジンＡＶに相当）…ストレプトアビジンを
Ｔｒｉｓ緩衝液中に１０μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬５（発色用基質溶液）…０．５ｍｇ／ｍｌオルトフ
ェニレンジアミン・２ＨＣｌ−０．０１５％Ｈ2Ｏ2 −
０．１１ＭＮａ2ＨＰＯ4−０．０４４Ｍクエン酸（ＰＨ
５．４） 反応停止液…２Ｎ−Ｈ2ＳＯ4 洗浄液…０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｓａｌｉｎ 以上の試薬等を使用し、本発明による方法の効果を証明
するため、前記先願方法によっても測定を行なった。
【００１２】（先願方法） （１）前記ビオチンＢ結合プレート（図２の１）に、試
薬１（抗原２）、試薬２（抗体３Ｂ）および試薬３（抗
体３Ａ）をそれぞれ５０μｌずつ加え、室温放置により
２時間反応させた。試薬１の濃度は前述の種々の濃度に
変化させた。 （２）次に試薬４（アビジンＡＶ）を５０μｌ加え、室
温放置により１時間反応させた。 （３）次に前記洗浄液により洗浄し、前記試薬５（発色
用基質溶液）を２００μｌ加え、室温放置により１０分
間反応させ、その後、前記反応停止液を１００μｌ加
え、波長４９２ｎｍで吸光度を測定した。
薬１（抗原２）、試薬２（抗体３Ｂ）および試薬３（抗
体３Ａ）をそれぞれ５０μｌずつ加え、室温放置により
２時間反応させた。試薬１の濃度は前述の種々の濃度に
変化させた。 （２）次に試薬４（アビジンＡＶ）を５０μｌ加え、室
温放置により１時間反応させた。 （３）次に前記洗浄液により洗浄し、前記試薬５（発色
用基質溶液）を２００μｌ加え、室温放置により１０分
間反応させ、その後、前記反応停止液を１００μｌ加
え、波長４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【００１３】（本発明による方法）−ＰＡＰ添加による
検量線作製 本実施例の方法は、図１の原理図において、「アビジン
−ビオチン系サンドイッチＥＩＡ」に例をとって説明す
るように、まず（Ａ）のように本実施例においては、上
記試薬以外に下記の試薬６を使用した。 試薬６（抗体３Ｃに相当）…抗ペルオキシターゼ抗体
（以下ＰＡＰと称す）をＴｒｉｓ緩衝液中に５０μｇ／
ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ含ませたもの。
検量線作製 本実施例の方法は、図１の原理図において、「アビジン
−ビオチン系サンドイッチＥＩＡ」に例をとって説明す
るように、まず（Ａ）のように本実施例においては、上
記試薬以外に下記の試薬６を使用した。 試薬６（抗体３Ｃに相当）…抗ペルオキシターゼ抗体
（以下ＰＡＰと称す）をＴｒｉｓ緩衝液中に５０μｇ／
ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ含ませたもの。
【００１４】方法１…前記試薬３（抗体３Ａ）と試薬６
（抗体３Ｃ）とを容量比１：１で混合し、２時間室温で
混合した後、これをＰＡＰ混合溶液とした。そして前記
先願方法における操作において、試薬３の代わりにこの
ＰＡＰ混合溶液１００μｌを加え、他の操作は先願方法
と同様とした。 方法２…前記先願方法の操作（１）を行なった後、操作
（２）において、試薬４（アビジンＡＶ）を５０μｌ加
え、１時間反応させた後、５０μｇ／ｍｌのＰＡＰ（抗
体３Ｃ）を５０μｌ加えて反応させた。その後洗浄し、
試薬５（基質溶液）を２５０μｌ加えた。 方法３…前記方法２において、ＰＡＰの濃度を１００μ
ｇ／ｍｌとし、他の操作は方法２と同様とした。
（抗体３Ｃ）とを容量比１：１で混合し、２時間室温で
混合した後、これをＰＡＰ混合溶液とした。そして前記
先願方法における操作において、試薬３の代わりにこの
ＰＡＰ混合溶液１００μｌを加え、他の操作は先願方法
と同様とした。 方法２…前記先願方法の操作（１）を行なった後、操作
（２）において、試薬４（アビジンＡＶ）を５０μｌ加
え、１時間反応させた後、５０μｇ／ｍｌのＰＡＰ（抗
体３Ｃ）を５０μｌ加えて反応させた。その後洗浄し、
試薬５（基質溶液）を２５０μｌ加えた。 方法３…前記方法２において、ＰＡＰの濃度を１００μ
ｇ／ｍｌとし、他の操作は方法２と同様とした。
【００１５】前記先願方法と方法１〜３により得られた
試料について吸光度測定を行なった結果を図３に示す。
図３の結果から分かるように、先願方法に比較し、本発
明の方法１〜３のいずれにおいても、測定感度が上昇し
た。特に、試薬６（抗体３Ｃ）をアビジンを加えた後に
加える方法２、３の方が測定感度が上がることが判明し
た。また、ＰＡＰの濃度を増加させると、測定感度がや
や増大する。
試料について吸光度測定を行なった結果を図３に示す。
図３の結果から分かるように、先願方法に比較し、本発
明の方法１〜３のいずれにおいても、測定感度が上昇し
た。特に、試薬６（抗体３Ｃ）をアビジンを加えた後に
加える方法２、３の方が測定感度が上がることが判明し
た。また、ＰＡＰの濃度を増加させると、測定感度がや
や増大する。
【００１６】（ＰＡＰの加え方の検討）前記方法２、３
では先願方法より反応時間が１時間余分にかかるため、
反応時間の短縮を目的として加え方の検討を試みた。 方法４…方法２と同じ操作で、アビジン試薬４および抗
体３Ｃの試薬６の濃度を変えて測定を行なった。すなわ
ち、アビジン試薬４の濃度を２０μｇ／ｍｌ（方法２の
場合の２倍濃度）とし、その２５μｌ（方法２の場合の
液量の半分）を試薬１〜３の混合液に加えて１時間反応
させた後、濃度を１００μｇ／ｍｌ（方法２の場合の２
倍濃度）とした抗体３Ｃの試薬６を２５μｌ（方法２の
場合の液量の半分）加えて１時間反応させた。 方法５…方法４において、最初に混合する試薬３（抗体
３Ａ）の濃度を２０μｇ／ｍｌ（方法４の場合の２倍濃
度）として２５μｌ（方法４の場合の液量の半分）と
し、他の操作は方法４の場合と同じにして反応させた。 方法６…アビジン試薬４および抗体３Ｃの試薬６の濃
度、量を方法４と同じにし、これらを試薬１〜３の混合
液に別々に加えるのではなく、同時に加えて１時間反応
させた。 方法７…方法１と同じ操作で、試薬３（抗体３Ａ）の濃
度を２０μｇ／ｍｌ（方法１の場合の２倍濃度）として
その量を２５μｌ（方法１の場合の液量の半分）に変
え、また試薬６（抗体３Ｃ）も１００μｇ／ｍｌ（方法
１の場合の２倍濃度）として２５μｌ（方法１の場合の
液量の半分）に変えて方法１と同じ操作で反応させた。
では先願方法より反応時間が１時間余分にかかるため、
反応時間の短縮を目的として加え方の検討を試みた。 方法４…方法２と同じ操作で、アビジン試薬４および抗
体３Ｃの試薬６の濃度を変えて測定を行なった。すなわ
ち、アビジン試薬４の濃度を２０μｇ／ｍｌ（方法２の
場合の２倍濃度）とし、その２５μｌ（方法２の場合の
液量の半分）を試薬１〜３の混合液に加えて１時間反応
させた後、濃度を１００μｇ／ｍｌ（方法２の場合の２
倍濃度）とした抗体３Ｃの試薬６を２５μｌ（方法２の
場合の液量の半分）加えて１時間反応させた。 方法５…方法４において、最初に混合する試薬３（抗体
３Ａ）の濃度を２０μｇ／ｍｌ（方法４の場合の２倍濃
度）として２５μｌ（方法４の場合の液量の半分）と
し、他の操作は方法４の場合と同じにして反応させた。 方法６…アビジン試薬４および抗体３Ｃの試薬６の濃
度、量を方法４と同じにし、これらを試薬１〜３の混合
液に別々に加えるのではなく、同時に加えて１時間反応
させた。 方法７…方法１と同じ操作で、試薬３（抗体３Ａ）の濃
度を２０μｇ／ｍｌ（方法１の場合の２倍濃度）として
その量を２５μｌ（方法１の場合の液量の半分）に変
え、また試薬６（抗体３Ｃ）も１００μｇ／ｍｌ（方法
１の場合の２倍濃度）として２５μｌ（方法１の場合の
液量の半分）に変えて方法１と同じ操作で反応させた。
【００１７】方法４〜７により得られた試料について吸
光度測定を行なった結果を図４に示す。図４の結果から
分かるように、先願方法に比較し、本発明の方法４〜７
のいずれにおいても、測定感度が上昇した。さらに方法
６、７は前記先願方法と同じ反応時間でありながら、検
量線は方法４、５とほぼ同一の傾向が認められた。
光度測定を行なった結果を図４に示す。図４の結果から
分かるように、先願方法に比較し、本発明の方法４〜７
のいずれにおいても、測定感度が上昇した。さらに方法
６、７は前記先願方法と同じ反応時間でありながら、検
量線は方法４、５とほぼ同一の傾向が認められた。
【００１８】（ＰＡＰの濃度検討）前記方法６と同じ操
作で試薬６のＰＡＰの濃度を１００、２００、４００μ
ｇ／ｍｌと変化させたところ、図５に示すように、ＰＡ
Ｐ濃度が２００μｇ／ｍｌである場合が最の検量線の立
ち上がりが望ましく、先願方法の２倍の感度が確認でき
た。ＰＡＰ濃度が４００μｇ／ｍｌである場合は２００
μｇ／ｍｌの場合と同様の傾向が認められた。
作で試薬６のＰＡＰの濃度を１００、２００、４００μ
ｇ／ｍｌと変化させたところ、図５に示すように、ＰＡ
Ｐ濃度が２００μｇ／ｍｌである場合が最の検量線の立
ち上がりが望ましく、先願方法の２倍の感度が確認でき
た。ＰＡＰ濃度が４００μｇ／ｍｌである場合は２００
μｇ／ｍｌの場合と同様の傾向が認められた。
【００１９】（測定感度の検討）前記方法６の操作で、
ＰＡＰ濃度を２００μｇ／ｍｌとし、試薬１の濃度を
０、０．１、０．２５、０．６２５、１．２５、５．０
ｎｇ／ｍｌとして６重測定を行ない、その平均値より測
定感度の検討を行なった。その結果、図６に示すよう
に、１．２５ｎｇ／ｍｌまでのＣＥＡが測定可能であっ
た。この結果から、おおよそ、最高１．０ｎｇ／ｍｌ程
度までの測定が可能ではないかと思われる。
ＰＡＰ濃度を２００μｇ／ｍｌとし、試薬１の濃度を
０、０．１、０．２５、０．６２５、１．２５、５．０
ｎｇ／ｍｌとして６重測定を行ない、その平均値より測
定感度の検討を行なった。その結果、図６に示すよう
に、１．２５ｎｇ／ｍｌまでのＣＥＡが測定可能であっ
た。この結果から、おおよそ、最高１．０ｎｇ／ｍｌ程
度までの測定が可能ではないかと思われる。
【００２０】
【実施例２】α−フォトプロテイン（ＡＦＰ）の測定に
ついても、本発明を「アビジン−ビオチン系サンドイッ
チＥＩＡ」に応用し、検討を行なった。この測定には、
下記試薬以外は前記と同様の試薬やプレート等を使用し
た。 試薬７（抗原２に相当）…ＡＦＰをウサギ血清中に０、
１０、２０、４０、１００、２５０あるいは５００ｎｇ
／ｍｌ含ませたもの。 試薬８（抗体３Ｂに相当）…ビオチン標識抗ヒトＡＦＰ
抗体をＴｒｉｓ緩衝液中に５μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬９（抗体３Ａに相当）…ペルオキシターゼ標識抗ヒ
トＡＦＰ抗体をウサギ血清に５０μｇ／ｍｌ含ませたも
の。
ついても、本発明を「アビジン−ビオチン系サンドイッ
チＥＩＡ」に応用し、検討を行なった。この測定には、
下記試薬以外は前記と同様の試薬やプレート等を使用し
た。 試薬７（抗原２に相当）…ＡＦＰをウサギ血清中に０、
１０、２０、４０、１００、２５０あるいは５００ｎｇ
／ｍｌ含ませたもの。 試薬８（抗体３Ｂに相当）…ビオチン標識抗ヒトＡＦＰ
抗体をＴｒｉｓ緩衝液中に５μｇ／ｍｌ含ませたもの。 試薬９（抗体３Ａに相当）…ペルオキシターゼ標識抗ヒ
トＡＦＰ抗体をウサギ血清に５０μｇ／ｍｌ含ませたも
の。
【００２１】（先願方法）前記ビオチンＢ結合プレート
（図２の１）に、試薬７（抗原２）を２０μｌ、試薬８
（抗体３Ｂ）および試薬９（抗体３Ａ）をそれぞれ５０
μｌずつ加え、室温放置により２時間反応させた。試薬
１の濃度は前述の種々の濃度に変化させた。その後の処
理は前記実施例１における先願方法と同じである。
（図２の１）に、試薬７（抗原２）を２０μｌ、試薬８
（抗体３Ｂ）および試薬９（抗体３Ａ）をそれぞれ５０
μｌずつ加え、室温放置により２時間反応させた。試薬
１の濃度は前述の種々の濃度に変化させた。その後の処
理は前記実施例１における先願方法と同じである。
【００２２】（本発明の方法） 方法８…先願方法のように、試薬７〜９を混合後、アビ
ジン試薬４の濃度を２０μｇ／ｍｌにして２５ｍｌ加
え、さらにＰＡＰ試薬６の濃度を２００μｇ／ｍｌとし
て２５μｌ加え、１時間反応させた。他の操作は先願方
法と同じである。 方法９…試薬９の濃度を３０μｇ／ｍｌに変え、２時間
反応後、濃度２０μｇ／ｍｌのアビジン試薬４を２０μ
ｌ、濃度２００μｇ／ｍｌのＰＡＰを２５μｌ加えて１
時間反応させた。他の操作は方法８と同じである。
ジン試薬４の濃度を２０μｇ／ｍｌにして２５ｍｌ加
え、さらにＰＡＰ試薬６の濃度を２００μｇ／ｍｌとし
て２５μｌ加え、１時間反応させた。他の操作は先願方
法と同じである。 方法９…試薬９の濃度を３０μｇ／ｍｌに変え、２時間
反応後、濃度２０μｇ／ｍｌのアビジン試薬４を２０μ
ｌ、濃度２００μｇ／ｍｌのＰＡＰを２５μｌ加えて１
時間反応させた。他の操作は方法８と同じである。
【００２３】図７はこのようにして反応させたものにつ
いての吸光度の測定結果を示すものである。図７に示す
ように、本発明による方法８、９によれば、先願方法に
比較して、感度が約２倍に増大していることが分かる。
また、方法９は方法８に比較して試薬９の濃度が約半分
程度であるが、ほぼ同一傾向の検量線が作製された。こ
のことにより、本発明の方法によれば、標識抗体３Ａの
量を削減できる反面、感度を増大させることが確認でき
た。
いての吸光度の測定結果を示すものである。図７に示す
ように、本発明による方法８、９によれば、先願方法に
比較して、感度が約２倍に増大していることが分かる。
また、方法９は方法８に比較して試薬９の濃度が約半分
程度であるが、ほぼ同一傾向の検量線が作製された。こ
のことにより、本発明の方法によれば、標識抗体３Ａの
量を削減できる反面、感度を増大させることが確認でき
た。
【００２４】以上の説明は、アビジン−ビオチン反応を
利用したＢＦ分離法について説明したが、本発明は従来
法である抗体あるいは抗原を固定しておく図８に示した
方法にも適用できる。本発明において、リガンドである
標識した物質としては、蛋白質およびその類似物質ない
し誘導体、あるいは他の有機化合物およびその類似物質
ないし誘導体が含まれる。
利用したＢＦ分離法について説明したが、本発明は従来
法である抗体あるいは抗原を固定しておく図８に示した
方法にも適用できる。本発明において、リガンドである
標識した物質としては、蛋白質およびその類似物質ない
し誘導体、あるいは他の有機化合物およびその類似物質
ないし誘導体が含まれる。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、標識した物質をリガン
ドとしてこのリガンドに対して抗体を架橋的に結合した
ので、感度を増大させることができ、かつ標識抗体また
は標識抗原量を削減でき、経済化が達成できる。
ドとしてこのリガンドに対して抗体を架橋的に結合した
ので、感度を増大させることができ、かつ標識抗体また
は標識抗原量を削減でき、経済化が達成できる。
【図１】本発明によるＢＦ分離法の一例を示す原理図で
ある。
ある。
【図２】本発明との比較に供した先願方法の原理図であ
る。
る。
【図３】本発明の実施例１の検量線図である。
【図４】前記実施例１におけるＰＡＰの加え方の検討結
果を示す検量線図である。
果を示す検量線図である。
【図５】前記実施例１におけるＰＡＰの濃度の検討結果
を示す検量線図である。
を示す検量線図である。
【図６】前記実施例１における測定感度の検討結果を示
す検量線図である。
す検量線図である。
【図７】本発明の実施例２の検量線図である。
【図８】従来の測定方法の原理図である。
１ 固相 ２ 抗原 ３、３Ａ〜３Ｃ 抗体 ＡＶ アビジン Ｂ ビオチン Ｅ 酵素
Claims (1)
- 【請求項１】抗原または抗体に標識した物質をリガンド
とし、該リガンドに抗体を架橋的に結合させ、該結合体
を固相に結合させて分離することを特徴とする免疫学的
測定用ＢＦ分離法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13550691A JPH05322893A (ja) | 1991-05-11 | 1991-05-11 | 免疫学的測定用ｂｆ分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13550691A JPH05322893A (ja) | 1991-05-11 | 1991-05-11 | 免疫学的測定用ｂｆ分離法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05322893A true JPH05322893A (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=15153355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13550691A Pending JPH05322893A (ja) | 1991-05-11 | 1991-05-11 | 免疫学的測定用ｂｆ分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05322893A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0813064A1 (en) * | 1996-06-10 | 1997-12-17 | Bayer Corporation | Method for amplification of the response signal in a sandwich immunoassay |
-
1991
- 1991-05-11 JP JP13550691A patent/JPH05322893A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0813064A1 (en) * | 1996-06-10 | 1997-12-17 | Bayer Corporation | Method for amplification of the response signal in a sandwich immunoassay |
| AU714613B2 (en) * | 1996-06-10 | 2000-01-06 | Bayer Corporation | Method for amplification of the response signal in a sandwich immunoassay |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4546462B2 (ja) | ポイントオブケア検査用メンブレンストリップバイオセンサーシステム | |
| FI92110B (fi) | Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen | |
| US6184042B1 (en) | Method for reducing hook effect in an immunoassay | |
| US6514770B1 (en) | Immunoassay | |
| JP3364537B2 (ja) | 非競合結合検定方法 | |
| EP1255111A1 (en) | Immunochromato device and method for measuring samples using the same | |
| JPH03502244A (ja) | 試験方法およびそのための試薬キツト | |
| IE920778A1 (en) | Method for specific binding assays using a releasable ligand | |
| EP3295174B1 (en) | Method for re-using test probe and reagents in an immunoassay | |
| JPS62100660A (ja) | 高分子のイムノアツセイ法 | |
| US20090246795A1 (en) | Immunoassay device and method | |
| JPH0476628B2 (ja) | ||
| US5077197A (en) | Use of charge transfer complexes in assay | |
| Goryacheva | Rapid immunotests for clinical, food and environmental applications | |
| EP0253270A2 (en) | Method for diagnostic immunoassay by solid phase separation | |
| Tirgil et al. | CARBON NANOTUBES MODIFIED ELISA SYSTEM DEVELOPMENT FOR IMPROVED DETECTION OF BIOMARKERS | |
| JP2688943B2 (ja) | 試料中の物質の測定方法 | |
| AU2001294469B2 (en) | Assay method and kit therefor | |
| Rubenstein | New Homogeneous Assay Methods for the Determination of Proteins | |
| JPH0348766A (ja) | 免疫学的測定法 | |
| JP3723826B2 (ja) | 抗体を利用した測定方法 | |
| Poulsen | Wash-LOCI–A Semi-Heterogeneous Version of the LOCI Technology Allowing Removal of | |
| Schweitzer et al. | Electrochemiluminescence: A Technology Evaluation and Assay Reformatting of the Stat6/P578 Protein–Peptide Interaction | |
| JPH05223815A (ja) | 免疫グロブリンｇの微量測定法 | |
| JPH0458155A (ja) | 免疫学的測定用ｂｆ分離法 |