JPH0533033B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0533033B2 JPH0533033B2 JP2226112A JP22611290A JPH0533033B2 JP H0533033 B2 JPH0533033 B2 JP H0533033B2 JP 2226112 A JP2226112 A JP 2226112A JP 22611290 A JP22611290 A JP 22611290A JP H0533033 B2 JPH0533033 B2 JP H0533033B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- amylase
- mutant
- gene
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はα−アミラーゼの遺伝子を部位特異的
変異法（ポイントミユーテーシヨン）を用いて変
異せしめたα−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を遺
伝子工学的手法を用いて発現せしめて得た糖転移
活性が増強された変異α−アミラーゼ及び該アミ
ラーゼを使用するオリゴ糖の製造方法に関する。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来より、低重合度のマルトオリゴ糖の製造方
法はすでに知られているが、例えば重合度７以上
の特定重合度のマルトオリゴ糖分を得るためには
非常に困難が伴つていた。 すなわち、従来の方法においては、デンプンを
酵素等により加水分解するものであり、該加水分
解においては広範囲の重合度のマルトオリゴ糖が
生成してしまうため、例えば重合度７以上の特定
重合度のマルトオリゴ糖を得ようとする場合にお
いては、加水分解において得られた広範囲の重合
度を有するマルトオリゴ糖混合物を精製しなけれ
ばならず、現状においては、特定の重合度のマル
トオリゴ糖のみを分別する精製方法は知られてお
らず、いくつかの精製方法を併用しなければなら
ないため、手間と労力を要し、この点が重合度７
以上の特定重合度のマルトオリゴ糖の量産化の障
害となつていた。 〔課題を解決するための手段〕 そこで本発明者等は、特定重合度のマルトオリ
ゴ糖を効率良く製造するための手段について鋭意
研究を進めたところ、α−アミラーゼ遺伝子を部
位特異的変異法を用いて変異させた変異α−アミ
ラーゼ遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により
糖転移活性が著しく増強された変異α−アミラー
ゼを取得し、該変異α−アミラーゼを用いること
により、簡単な精製法で重合度７以上の特定重合
度のマルトオリゴ糖を効率良く製造できることを
見い出し本発明を完成するに至つたものである。 すなわち本発明は、 (1) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩
基配列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの
変異遺伝子。 (2) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸を
ロイシンに置換せしめた糖転移活性が増強され
た変異α−アミラーゼ。 (3) マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行う
ことを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ
糖の製造方法。 に関するものである。 以下本発明を詳述する。 本発明の変異α−アミラーゼは、例えば、酵母
サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼを変異させたものであり、第１図に該酵母
のα−アミラーゼの遺伝子の塩基配列及び構造遺
伝子部分に相応するアミノ酸配列を示している。 本発明の変異α−アミラーゼ（Sfamy）はもと
のα−アミラーゼの84番目のトリプトフアン残基
（下線で表示）をロイシンに置換させたものであ
る。 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
また、野生型α−アミラーゼ遺伝子についても同
様な発現ベクターを構築し、これをpSA5Nと命
名し、形質転換体KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵素標品はSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バ
ンドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一で
あり、その抗原性も天然型と一致することが天然
型酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテ
インＡを用いたウエスタンイムノブロツテイング
で確認された。したがつて以上の様な操作で変異
α−アミラーゼが完全に精製された。 ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの変異酵素SfamyW84Lを2.5mMの塩化カルシ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）400μ中
で、30℃で反応させ、一定時間おき100μずつ
取り出し、30μの氷酢酸で反応を停止させ、
100℃で５分間加熱することで酵素を失活させ、
そして試料を濃縮乾固した。次にこれを5μの
蒸留水に溶解し、その2.5μを25cm×40cmのペー
パークロマトグラフイー濾紙（3MM、ワツトマ
ン）にスポツトし、展開溶媒（酢酸エチル：メタ
ノール：水＝37：40：23）を入れた耐圧性容器内
で55℃、２時間の展開を２回繰り返した。そのの
ち濾紙を乾燥させ、これに200単位のRhizopusグ
ルコアミラーゼを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
10mlを噴霧し、密閉容器内で55℃、30分間保温し
た。次に濾紙上でグルコアミラーゼ処理されたス
ポツトの検出を硝酸銀発色法を用いて行つた。硝
酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後の濾紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウ
ム液、定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すこと
で行つた。基質と酵素反応生成物の定量はペーパ
ークロマトグラム上での硝酸銀発色の強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。そ
の結果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、
G6からG9が、G7からG10，G11，G12が生じること
が明らかと生つた。基質G7を用いた酵素反応を
例にとると、反応８分後に基質の40％がG10，
G11，G12の混合物に変換された。他の基質に関
してもほぼ同等の変換率が示された。一方、天然
型酵素を同じ条件で基質と反応させても、変異酵
素で見られた糖転移産物はまつたく検出されなか
つた。次に３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と
３×10-7ＭのSfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩
衝液（PH5.5）中で30℃、10分間反応させ、これ
に1.5mlの氷酢酸を加えた後、100℃で５分間加熱
し、減圧下で0.2mlにまで濃縮した。そしてこれ
を50℃にまで加温したBio−gelP4カラム（φ2×
150cm）（バイオラド）に添加し、蒸留水で溶出
し、各溶出画分５mlを0.1mlまで減圧濃縮後、こ
れらに含まれるオリゴ糖の分析を前述ペーパーク
ロマトグラフイーと発色定量法を用いて行つた。
その結果この酵素反応では各基質の50％が分解お
よび転移され、これら反応産物より前述のゲル瀘
過法により糖転移産物を基質および低分子分解産
物より単離精製できることが明らかとなつた。 なお、本発明の変異α−アミラーゼは、加水分
解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたもの
となつており、出発基質の重合度により、各々特
徴的な産物を産生する。 例えば、マルトヘプタオース（G7）を基質と
する場合には、一部は低分子に分解されるが、大
部分はG10，G11，G12に変換される。マルトペン
タオース（G5）を基質とする場合には糖転移産
物G7，G8が産生され、また、マルトヘキサオー
ス（G6）からはG9を産生することができる。 得られた反応混合物からは、ゲル濾過法等によ
り分離、精製することにより、用いた基質から特
定な鎖長だけ増したマルトオリゴ糖をそれぞれ得
ることができる。 上記の糖分転移酵素反応の条件としては、例え
ば温度30℃、PH5.5程度が最適であり、また反応
時間は、基質の重合度濃度及び酵素濃度により
各々異なるが通常は15分で十分である。 〔発明の効果〕 本発明の変異α−アミラーゼを用いれば、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を高収
率でかつ簡単な操作で製造することが可能であ
り、従来のオリゴ糖の精製の煩雑さを伴うデンプ
ンの加水分解法に比べて極めて有利であり、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を工業
的規模で量産化しようとする場合において好適な
ものである。 実施例 １ 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
この形質転換体（KK4：pSA5W84L）は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11667
号として寄託されている。また、野生型α−アミ
ラーゼ遺伝子についても同様な発現ベクターを構
築し、これをpSA5Nと命名し、形質転換体
KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵標品はSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バン
ドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一であ
り、その抗原性も天然型と一致することが天然型
酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテイ
ンＡを用いたウエスタンイムノブロツテイングで
確認された。したがつて以上の様な操作で変異α
−アミラーゼが完全に精製された。 実施例 ２ ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの実施例１で得られた変異酵素SfamyW84Lを
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）400μ中で、30℃で反応させ、一定
時間おき100μずつ取り出し、30μの氷酢酸で
反応を停止させ、100℃で５分間加熱することで
酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次
にこれを5μの蒸留水に溶解し、その2.5μを25
cm×40cmのペーパークロマトグラフイー濾紙
（3MM、ワツトマン）にスポツトし、展開溶媒
（酢酸エチル：メタノール：水＝37：40：23）を
入れた耐圧性容器内で55℃、２時間の展開を２回
くり返した。そののち濾紙を乾燥させ、これに
200単位のRhizopusグルコアミラーゼを含む
50mM酢酸緩衝液（PH5.5）10mlを噴霧し、密閉
容器内で55℃、30分間保温した。次に濾紙上でグ
ルコアミラーゼ処理されたスポツトの検出を硝酸
銀発色法を用いて行つた。硝酸銀発色はグルコア
ミラーゼ処理後の濾紙を硝酸銀のアセトン溶液、
アルコール性水酸化ナトリウム液、定着液の順序
で浸漬、乾燥を繰り返すことで行つた。基質と酵
素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポツトの発色の強度をデンシト
メーターを用いて測定することで求めた。その結
果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、G6
からG9が、G7からG10，G11，G12が生じることが
明らかとなつた。基質G7を用いた酵素反応を例
にとると、反応８分後に基質の40％が分解および
転移され、基質減少量の60％がG10，G11，G12の
混合物に変換された。他の基質に関してもほぼ同
等の変換率が示された。一方、天然型酵素を同じ
条件で基質と反応させても、変異酵素で見られた
糖転移産物はまつたく検出されなかつた。次に３
×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7Ｍの
SfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
中で30℃、10分間反応させ、これに1.5mlの氷酢
酸を加えた後、100℃で５分間加熱し、減圧下で
0.2mlにまで濃縮した。そしてこれを50℃に加温
したBio−gelP4カラム（φ2×150cm）（バイオラ
ド）に添加し、蒸留水で溶出し、各溶出画分５ml
を0.1mlまで減圧濃縮後、これらに含まれるオリ
ゴ糖の分析を前述ペーパークロマトグラフイーと
発色定量法を用いて行い、その結果この酵素反応
では各基質の50％が分解および転移され、これら
反応産物より前述のゲル濾過法により糖転移産物
を基質および低分子分解産物より単離精製できる
ことが明らかとなつたその使用した基質と得られ
た各糖転移産物の収量（収率）を下記第１表に示
す。 【表】
変異法（ポイントミユーテーシヨン）を用いて変
異せしめたα−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を遺
伝子工学的手法を用いて発現せしめて得た糖転移
活性が増強された変異α−アミラーゼ及び該アミ
ラーゼを使用するオリゴ糖の製造方法に関する。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来より、低重合度のマルトオリゴ糖の製造方
法はすでに知られているが、例えば重合度７以上
の特定重合度のマルトオリゴ糖分を得るためには
非常に困難が伴つていた。 すなわち、従来の方法においては、デンプンを
酵素等により加水分解するものであり、該加水分
解においては広範囲の重合度のマルトオリゴ糖が
生成してしまうため、例えば重合度７以上の特定
重合度のマルトオリゴ糖を得ようとする場合にお
いては、加水分解において得られた広範囲の重合
度を有するマルトオリゴ糖混合物を精製しなけれ
ばならず、現状においては、特定の重合度のマル
トオリゴ糖のみを分別する精製方法は知られてお
らず、いくつかの精製方法を併用しなければなら
ないため、手間と労力を要し、この点が重合度７
以上の特定重合度のマルトオリゴ糖の量産化の障
害となつていた。 〔課題を解決するための手段〕 そこで本発明者等は、特定重合度のマルトオリ
ゴ糖を効率良く製造するための手段について鋭意
研究を進めたところ、α−アミラーゼ遺伝子を部
位特異的変異法を用いて変異させた変異α−アミ
ラーゼ遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により
糖転移活性が著しく増強された変異α−アミラー
ゼを取得し、該変異α−アミラーゼを用いること
により、簡単な精製法で重合度７以上の特定重合
度のマルトオリゴ糖を効率良く製造できることを
見い出し本発明を完成するに至つたものである。 すなわち本発明は、 (1) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩
基配列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの
変異遺伝子。 (2) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸を
ロイシンに置換せしめた糖転移活性が増強され
た変異α−アミラーゼ。 (3) マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行う
ことを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ
糖の製造方法。 に関するものである。 以下本発明を詳述する。 本発明の変異α−アミラーゼは、例えば、酵母
サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼを変異させたものであり、第１図に該酵母
のα−アミラーゼの遺伝子の塩基配列及び構造遺
伝子部分に相応するアミノ酸配列を示している。 本発明の変異α−アミラーゼ（Sfamy）はもと
のα−アミラーゼの84番目のトリプトフアン残基
（下線で表示）をロイシンに置換させたものであ
る。 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
また、野生型α−アミラーゼ遺伝子についても同
様な発現ベクターを構築し、これをpSA5Nと命
名し、形質転換体KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵素標品はSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バ
ンドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一で
あり、その抗原性も天然型と一致することが天然
型酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテ
インＡを用いたウエスタンイムノブロツテイング
で確認された。したがつて以上の様な操作で変異
α−アミラーゼが完全に精製された。 ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの変異酵素SfamyW84Lを2.5mMの塩化カルシ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）400μ中
で、30℃で反応させ、一定時間おき100μずつ
取り出し、30μの氷酢酸で反応を停止させ、
100℃で５分間加熱することで酵素を失活させ、
そして試料を濃縮乾固した。次にこれを5μの
蒸留水に溶解し、その2.5μを25cm×40cmのペー
パークロマトグラフイー濾紙（3MM、ワツトマ
ン）にスポツトし、展開溶媒（酢酸エチル：メタ
ノール：水＝37：40：23）を入れた耐圧性容器内
で55℃、２時間の展開を２回繰り返した。そのの
ち濾紙を乾燥させ、これに200単位のRhizopusグ
ルコアミラーゼを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
10mlを噴霧し、密閉容器内で55℃、30分間保温し
た。次に濾紙上でグルコアミラーゼ処理されたス
ポツトの検出を硝酸銀発色法を用いて行つた。硝
酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後の濾紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウ
ム液、定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すこと
で行つた。基質と酵素反応生成物の定量はペーパ
ークロマトグラム上での硝酸銀発色の強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。そ
の結果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、
G6からG9が、G7からG10，G11，G12が生じること
が明らかと生つた。基質G7を用いた酵素反応を
例にとると、反応８分後に基質の40％がG10，
G11，G12の混合物に変換された。他の基質に関
してもほぼ同等の変換率が示された。一方、天然
型酵素を同じ条件で基質と反応させても、変異酵
素で見られた糖転移産物はまつたく検出されなか
つた。次に３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と
３×10-7ＭのSfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩
衝液（PH5.5）中で30℃、10分間反応させ、これ
に1.5mlの氷酢酸を加えた後、100℃で５分間加熱
し、減圧下で0.2mlにまで濃縮した。そしてこれ
を50℃にまで加温したBio−gelP4カラム（φ2×
150cm）（バイオラド）に添加し、蒸留水で溶出
し、各溶出画分５mlを0.1mlまで減圧濃縮後、こ
れらに含まれるオリゴ糖の分析を前述ペーパーク
ロマトグラフイーと発色定量法を用いて行つた。
その結果この酵素反応では各基質の50％が分解お
よび転移され、これら反応産物より前述のゲル瀘
過法により糖転移産物を基質および低分子分解産
物より単離精製できることが明らかとなつた。 なお、本発明の変異α−アミラーゼは、加水分
解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたもの
となつており、出発基質の重合度により、各々特
徴的な産物を産生する。 例えば、マルトヘプタオース（G7）を基質と
する場合には、一部は低分子に分解されるが、大
部分はG10，G11，G12に変換される。マルトペン
タオース（G5）を基質とする場合には糖転移産
物G7，G8が産生され、また、マルトヘキサオー
ス（G6）からはG9を産生することができる。 得られた反応混合物からは、ゲル濾過法等によ
り分離、精製することにより、用いた基質から特
定な鎖長だけ増したマルトオリゴ糖をそれぞれ得
ることができる。 上記の糖分転移酵素反応の条件としては、例え
ば温度30℃、PH5.5程度が最適であり、また反応
時間は、基質の重合度濃度及び酵素濃度により
各々異なるが通常は15分で十分である。 〔発明の効果〕 本発明の変異α−アミラーゼを用いれば、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を高収
率でかつ簡単な操作で製造することが可能であ
り、従来のオリゴ糖の精製の煩雑さを伴うデンプ
ンの加水分解法に比べて極めて有利であり、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を工業
的規模で量産化しようとする場合において好適な
ものである。 実施例 １ 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
この形質転換体（KK4：pSA5W84L）は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11667
号として寄託されている。また、野生型α−アミ
ラーゼ遺伝子についても同様な発現ベクターを構
築し、これをpSA5Nと命名し、形質転換体
KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵標品はSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バン
ドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一であ
り、その抗原性も天然型と一致することが天然型
酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテイ
ンＡを用いたウエスタンイムノブロツテイングで
確認された。したがつて以上の様な操作で変異α
−アミラーゼが完全に精製された。 実施例 ２ ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの実施例１で得られた変異酵素SfamyW84Lを
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）400μ中で、30℃で反応させ、一定
時間おき100μずつ取り出し、30μの氷酢酸で
反応を停止させ、100℃で５分間加熱することで
酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次
にこれを5μの蒸留水に溶解し、その2.5μを25
cm×40cmのペーパークロマトグラフイー濾紙
（3MM、ワツトマン）にスポツトし、展開溶媒
（酢酸エチル：メタノール：水＝37：40：23）を
入れた耐圧性容器内で55℃、２時間の展開を２回
くり返した。そののち濾紙を乾燥させ、これに
200単位のRhizopusグルコアミラーゼを含む
50mM酢酸緩衝液（PH5.5）10mlを噴霧し、密閉
容器内で55℃、30分間保温した。次に濾紙上でグ
ルコアミラーゼ処理されたスポツトの検出を硝酸
銀発色法を用いて行つた。硝酸銀発色はグルコア
ミラーゼ処理後の濾紙を硝酸銀のアセトン溶液、
アルコール性水酸化ナトリウム液、定着液の順序
で浸漬、乾燥を繰り返すことで行つた。基質と酵
素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポツトの発色の強度をデンシト
メーターを用いて測定することで求めた。その結
果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、G6
からG9が、G7からG10，G11，G12が生じることが
明らかとなつた。基質G7を用いた酵素反応を例
にとると、反応８分後に基質の40％が分解および
転移され、基質減少量の60％がG10，G11，G12の
混合物に変換された。他の基質に関してもほぼ同
等の変換率が示された。一方、天然型酵素を同じ
条件で基質と反応させても、変異酵素で見られた
糖転移産物はまつたく検出されなかつた。次に３
×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7Ｍの
SfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
中で30℃、10分間反応させ、これに1.5mlの氷酢
酸を加えた後、100℃で５分間加熱し、減圧下で
0.2mlにまで濃縮した。そしてこれを50℃に加温
したBio−gelP4カラム（φ2×150cm）（バイオラ
ド）に添加し、蒸留水で溶出し、各溶出画分５ml
を0.1mlまで減圧濃縮後、これらに含まれるオリ
ゴ糖の分析を前述ペーパークロマトグラフイーと
発色定量法を用いて行い、その結果この酵素反応
では各基質の50％が分解および転移され、これら
反応産物より前述のゲル濾過法により糖転移産物
を基質および低分子分解産物より単離精製できる
ことが明らかとなつたその使用した基質と得られ
た各糖転移産物の収量（収率）を下記第１表に示
す。 【表】
第１図はサツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharomycopsis fibuligera）のα−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列及び該酵素のアミノ酸配列
を表す。
（Saccharomycopsis fibuligera）のα−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列及び該酵素のアミノ酸配列
を表す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩基配
列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの変異遺
伝子。 ２ サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸をロイ
シンに置換せしめた糖転移活性が増強された変異
αアミラーゼ。 ３ マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行うこ
とを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ糖の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2226112A JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2226112A JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04108386A JPH04108386A (ja) | 1992-04-09 |
| JPH0533033B2 true JPH0533033B2 (ja) | 1993-05-18 |
Family
ID=16840027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2226112A Granted JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04108386A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740938B2 (ja) * | 1993-03-04 | 1995-05-10 | 工業技術院長 | 変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法 |
| US9263957B2 (en) | 2012-03-26 | 2016-02-16 | Sharp Kabushiki Kaisha | Switching power supply circuit and LED illumination device |
| CN108251317B (zh) * | 2018-03-30 | 2020-03-10 | 陕西枫丹百丽生物科技有限公司 | 一株扣囊复膜孢酵母及其应用 |
-
1990
- 1990-08-28 JP JP2226112A patent/JPH04108386A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04108386A (ja) | 1992-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR960014703B1 (ko) | 세팔로스포린 아세틸히드롤라아제 유전자 및 이 유전자에 의해 코딩된 단백질 | |
| Zielinski et al. | Characterization and regulation of the Pseudomonas aeruginosa algC gene encoding phosphomannomutase | |
| CN108026535B (zh) | 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 | |
| CN111534493B (zh) | 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体、基因及应用 | |
| KR100312456B1 (ko) | 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자 | |
| CN112301012A (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法 | |
| JP2729628B2 (ja) | 巨大菌からのグルコース・デヒドロゲナーゼの調製方法 | |
| Miles et al. | Subgenes expressing single lipoyl domains of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli | |
| CN118995672B (zh) | 一种提高α-琼胶酶热稳定性的突变体及其应用 | |
| CN112852702A (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌催化高浓度乳糖合成塔格糖的方法 | |
| US5635378A (en) | Variant-type carbohydrate hydrolase, variant gene of the enzyme and method for producing oligosaccharide using the enzyme | |
| JPH04108386A (ja) | 変異α―アミラーゼ | |
| JPH07108225B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 | |
| JPS62262994A (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 | |
| CN112646831A (zh) | 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用 | |
| JP2591713B2 (ja) | アシネトバクター・カルコアセチカスからの酵素ムタロターゼの製造のためのｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子および方法 | |
| CN120758539B (zh) | 一种重组质粒、构建方法及其在提高发菜伪枝藻素合成能力中的应用 | |
| JP3012919B2 (ja) | アミノアシラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性を有する耐熱性酵素、及びそれをコードする遺伝子 | |
| JPS63287484A (ja) | クレアチンアミジノヒドラーゼ、新規プラスミド及び微生物、酵素の製法及びクレアチニン含量の測定法 | |
| CN116218805B (zh) | Irx10-ct蛋白在从头合成木聚糖中的应用 | |
| JPH07213287A (ja) | 耐熱性ブランチングエンザイム遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性ブランチングエンザイム。 | |
| JP2961245B2 (ja) | 耐熱性アシルペプチド加水分解酵素、及びそれをコードする遺伝子 | |
| JPS61132178A (ja) | 変異バチルス・ズブチリス | |
| JP2728784B2 (ja) | 酢酸菌，該酢酸菌由来プラスミド及び該プラスミドから構築されるシャトルベクター | |
| CN120310776A (zh) | 一种热稳定性显著提高的溶葡萄球菌酶突变体及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |