JPH0533033B2 - - Google Patents
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Classifications
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はα−アミラーゼの遺伝子を部位特異的
変異法（ポイントミユーテーシヨン）を用いて変
異せしめたα−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を遺
伝子工学的手法を用いて発現せしめて得た糖転移
活性が増強された変異α−アミラーゼ及び該アミ
ラーゼを使用するオリゴ糖の製造方法に関する。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来より、低重合度のマルトオリゴ糖の製造方
法はすでに知られているが、例えば重合度７以上
の特定重合度のマルトオリゴ糖分を得るためには
非常に困難が伴つていた。 すなわち、従来の方法においては、デンプンを
酵素等により加水分解するものであり、該加水分
解においては広範囲の重合度のマルトオリゴ糖が
生成してしまうため、例えば重合度７以上の特定
重合度のマルトオリゴ糖を得ようとする場合にお
いては、加水分解において得られた広範囲の重合
度を有するマルトオリゴ糖混合物を精製しなけれ
ばならず、現状においては、特定の重合度のマル
トオリゴ糖のみを分別する精製方法は知られてお
らず、いくつかの精製方法を併用しなければなら
ないため、手間と労力を要し、この点が重合度７
以上の特定重合度のマルトオリゴ糖の量産化の障
害となつていた。 〔課題を解決するための手段〕 そこで本発明者等は、特定重合度のマルトオリ
ゴ糖を効率良く製造するための手段について鋭意
研究を進めたところ、α−アミラーゼ遺伝子を部
位特異的変異法を用いて変異させた変異α−アミ
ラーゼ遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により
糖転移活性が著しく増強された変異α−アミラー
ゼを取得し、該変異α−アミラーゼを用いること
により、簡単な精製法で重合度７以上の特定重合
度のマルトオリゴ糖を効率良く製造できることを
見い出し本発明を完成するに至つたものである。 すなわち本発明は、 (1) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩
基配列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの
変異遺伝子。 (2) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸を
ロイシンに置換せしめた糖転移活性が増強され
た変異α−アミラーゼ。 (3) マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行う
ことを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ
糖の製造方法。 に関するものである。 以下本発明を詳述する。 本発明の変異α−アミラーゼは、例えば、酵母
サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼを変異させたものであり、第１図に該酵母
のα−アミラーゼの遺伝子の塩基配列及び構造遺
伝子部分に相応するアミノ酸配列を示している。 本発明の変異α−アミラーゼ（Sfamy）はもと
のα−アミラーゼの84番目のトリプトフアン残基
（下線で表示）をロイシンに置換させたものであ
る。 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
また、野生型α−アミラーゼ遺伝子についても同
様な発現ベクターを構築し、これをpSA5Nと命
名し、形質転換体KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵素標品はSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バ
ンドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一で
あり、その抗原性も天然型と一致することが天然
型酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテ
インＡを用いたウエスタンイムノブロツテイング
で確認された。したがつて以上の様な操作で変異
α−アミラーゼが完全に精製された。 ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの変異酵素SfamyW84Lを2.5mMの塩化カルシ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）400μ中
で、30℃で反応させ、一定時間おき100μずつ
取り出し、30μの氷酢酸で反応を停止させ、
100℃で５分間加熱することで酵素を失活させ、
そして試料を濃縮乾固した。次にこれを5μの
蒸留水に溶解し、その2.5μを25cm×40cmのペー
パークロマトグラフイー濾紙（3MM、ワツトマ
ン）にスポツトし、展開溶媒（酢酸エチル：メタ
ノール：水＝37：40：23）を入れた耐圧性容器内
で55℃、２時間の展開を２回繰り返した。そのの
ち濾紙を乾燥させ、これに200単位のRhizopusグ
ルコアミラーゼを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
10mlを噴霧し、密閉容器内で55℃、30分間保温し
た。次に濾紙上でグルコアミラーゼ処理されたス
ポツトの検出を硝酸銀発色法を用いて行つた。硝
酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後の濾紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウ
ム液、定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すこと
で行つた。基質と酵素反応生成物の定量はペーパ
ークロマトグラム上での硝酸銀発色の強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。そ
の結果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、
G6からG9が、G7からG10，G11，G12が生じること
が明らかと生つた。基質G7を用いた酵素反応を
例にとると、反応８分後に基質の40％がG10，
G11，G12の混合物に変換された。他の基質に関
してもほぼ同等の変換率が示された。一方、天然
型酵素を同じ条件で基質と反応させても、変異酵
素で見られた糖転移産物はまつたく検出されなか
つた。次に３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と
３×10-7ＭのSfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩
衝液（PH5.5）中で30℃、10分間反応させ、これ
に1.5mlの氷酢酸を加えた後、100℃で５分間加熱
し、減圧下で0.2mlにまで濃縮した。そしてこれ
を50℃にまで加温したBio−gelP4カラム（φ2×
150cm）（バイオラド）に添加し、蒸留水で溶出
し、各溶出画分５mlを0.1mlまで減圧濃縮後、こ
れらに含まれるオリゴ糖の分析を前述ペーパーク
ロマトグラフイーと発色定量法を用いて行つた。
その結果この酵素反応では各基質の50％が分解お
よび転移され、これら反応産物より前述のゲル瀘
過法により糖転移産物を基質および低分子分解産
物より単離精製できることが明らかとなつた。 なお、本発明の変異α−アミラーゼは、加水分
解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたもの
となつており、出発基質の重合度により、各々特
徴的な産物を産生する。 例えば、マルトヘプタオース（G7）を基質と
する場合には、一部は低分子に分解されるが、大
部分はG10，G11，G12に変換される。マルトペン
タオース（G5）を基質とする場合には糖転移産
物G7，G8が産生され、また、マルトヘキサオー
ス（G6）からはG9を産生することができる。 得られた反応混合物からは、ゲル濾過法等によ
り分離、精製することにより、用いた基質から特
定な鎖長だけ増したマルトオリゴ糖をそれぞれ得
ることができる。 上記の糖分転移酵素反応の条件としては、例え
ば温度30℃、PH5.5程度が最適であり、また反応
時間は、基質の重合度濃度及び酵素濃度により
各々異なるが通常は15分で十分である。 〔発明の効果〕 本発明の変異α−アミラーゼを用いれば、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を高収
率でかつ簡単な操作で製造することが可能であ
り、従来のオリゴ糖の精製の煩雑さを伴うデンプ
ンの加水分解法に比べて極めて有利であり、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を工業
的規模で量産化しようとする場合において好適な
ものである。 実施例 １ 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
この形質転換体（KK4：pSA5W84L）は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11667
号として寄託されている。また、野生型α−アミ
ラーゼ遺伝子についても同様な発現ベクターを構
築し、これをpSA5Nと命名し、形質転換体
KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵標品はSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バン
ドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一であ
り、その抗原性も天然型と一致することが天然型
酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテイ
ンＡを用いたウエスタンイムノブロツテイングで
確認された。したがつて以上の様な操作で変異α
−アミラーゼが完全に精製された。 実施例 ２ ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの実施例１で得られた変異酵素SfamyW84Lを
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）400μ中で、30℃で反応させ、一定
時間おき100μずつ取り出し、30μの氷酢酸で
反応を停止させ、100℃で５分間加熱することで
酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次
にこれを5μの蒸留水に溶解し、その2.5μを25
cm×40cmのペーパークロマトグラフイー濾紙
（3MM、ワツトマン）にスポツトし、展開溶媒
（酢酸エチル：メタノール：水＝37：40：23）を
入れた耐圧性容器内で55℃、２時間の展開を２回
くり返した。そののち濾紙を乾燥させ、これに
200単位のRhizopusグルコアミラーゼを含む
50mM酢酸緩衝液（PH5.5）10mlを噴霧し、密閉
容器内で55℃、30分間保温した。次に濾紙上でグ
ルコアミラーゼ処理されたスポツトの検出を硝酸
銀発色法を用いて行つた。硝酸銀発色はグルコア
ミラーゼ処理後の濾紙を硝酸銀のアセトン溶液、
アルコール性水酸化ナトリウム液、定着液の順序
で浸漬、乾燥を繰り返すことで行つた。基質と酵
素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポツトの発色の強度をデンシト
メーターを用いて測定することで求めた。その結
果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、G6
からG9が、G7からG10，G11，G12が生じることが
明らかとなつた。基質G7を用いた酵素反応を例
にとると、反応８分後に基質の40％が分解および
転移され、基質減少量の60％がG10，G11，G12の
混合物に変換された。他の基質に関してもほぼ同
等の変換率が示された。一方、天然型酵素を同じ
条件で基質と反応させても、変異酵素で見られた
糖転移産物はまつたく検出されなかつた。次に３
×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7Ｍの
SfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
中で30℃、10分間反応させ、これに1.5mlの氷酢
酸を加えた後、100℃で５分間加熱し、減圧下で
0.2mlにまで濃縮した。そしてこれを50℃に加温
したBio−gelP4カラム（φ2×150cm）（バイオラ
ド）に添加し、蒸留水で溶出し、各溶出画分５ml
を0.1mlまで減圧濃縮後、これらに含まれるオリ
ゴ糖の分析を前述ペーパークロマトグラフイーと
発色定量法を用いて行い、その結果この酵素反応
では各基質の50％が分解および転移され、これら
反応産物より前述のゲル濾過法により糖転移産物
を基質および低分子分解産物より単離精製できる
ことが明らかとなつたその使用した基質と得られ
た各糖転移産物の収量（収率）を下記第１表に示
す。 【表】
変異法（ポイントミユーテーシヨン）を用いて変
異せしめたα−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を遺
伝子工学的手法を用いて発現せしめて得た糖転移
活性が増強された変異α−アミラーゼ及び該アミ
ラーゼを使用するオリゴ糖の製造方法に関する。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕 従来より、低重合度のマルトオリゴ糖の製造方
法はすでに知られているが、例えば重合度７以上
の特定重合度のマルトオリゴ糖分を得るためには
非常に困難が伴つていた。 すなわち、従来の方法においては、デンプンを
酵素等により加水分解するものであり、該加水分
解においては広範囲の重合度のマルトオリゴ糖が
生成してしまうため、例えば重合度７以上の特定
重合度のマルトオリゴ糖を得ようとする場合にお
いては、加水分解において得られた広範囲の重合
度を有するマルトオリゴ糖混合物を精製しなけれ
ばならず、現状においては、特定の重合度のマル
トオリゴ糖のみを分別する精製方法は知られてお
らず、いくつかの精製方法を併用しなければなら
ないため、手間と労力を要し、この点が重合度７
以上の特定重合度のマルトオリゴ糖の量産化の障
害となつていた。 〔課題を解決するための手段〕 そこで本発明者等は、特定重合度のマルトオリ
ゴ糖を効率良く製造するための手段について鋭意
研究を進めたところ、α−アミラーゼ遺伝子を部
位特異的変異法を用いて変異させた変異α−アミ
ラーゼ遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により
糖転移活性が著しく増強された変異α−アミラー
ゼを取得し、該変異α−アミラーゼを用いること
により、簡単な精製法で重合度７以上の特定重合
度のマルトオリゴ糖を効率良く製造できることを
見い出し本発明を完成するに至つたものである。 すなわち本発明は、 (1) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩
基配列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの
変異遺伝子。 (2) サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−ア
ミラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸を
ロイシンに置換せしめた糖転移活性が増強され
た変異α−アミラーゼ。 (3) マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行う
ことを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ
糖の製造方法。 に関するものである。 以下本発明を詳述する。 本発明の変異α−アミラーゼは、例えば、酵母
サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼを変異させたものであり、第１図に該酵母
のα−アミラーゼの遺伝子の塩基配列及び構造遺
伝子部分に相応するアミノ酸配列を示している。 本発明の変異α−アミラーゼ（Sfamy）はもと
のα−アミラーゼの84番目のトリプトフアン残基
（下線で表示）をロイシンに置換させたものであ
る。 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
また、野生型α−アミラーゼ遺伝子についても同
様な発現ベクターを構築し、これをpSA5Nと命
名し、形質転換体KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵素標品はSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バ
ンドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一で
あり、その抗原性も天然型と一致することが天然
型酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテ
インＡを用いたウエスタンイムノブロツテイング
で確認された。したがつて以上の様な操作で変異
α−アミラーゼが完全に精製された。 ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの変異酵素SfamyW84Lを2.5mMの塩化カルシ
ウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）400μ中
で、30℃で反応させ、一定時間おき100μずつ
取り出し、30μの氷酢酸で反応を停止させ、
100℃で５分間加熱することで酵素を失活させ、
そして試料を濃縮乾固した。次にこれを5μの
蒸留水に溶解し、その2.5μを25cm×40cmのペー
パークロマトグラフイー濾紙（3MM、ワツトマ
ン）にスポツトし、展開溶媒（酢酸エチル：メタ
ノール：水＝37：40：23）を入れた耐圧性容器内
で55℃、２時間の展開を２回繰り返した。そのの
ち濾紙を乾燥させ、これに200単位のRhizopusグ
ルコアミラーゼを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
10mlを噴霧し、密閉容器内で55℃、30分間保温し
た。次に濾紙上でグルコアミラーゼ処理されたス
ポツトの検出を硝酸銀発色法を用いて行つた。硝
酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後の濾紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウ
ム液、定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すこと
で行つた。基質と酵素反応生成物の定量はペーパ
ークロマトグラム上での硝酸銀発色の強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。そ
の結果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、
G6からG9が、G7からG10，G11，G12が生じること
が明らかと生つた。基質G7を用いた酵素反応を
例にとると、反応８分後に基質の40％がG10，
G11，G12の混合物に変換された。他の基質に関
してもほぼ同等の変換率が示された。一方、天然
型酵素を同じ条件で基質と反応させても、変異酵
素で見られた糖転移産物はまつたく検出されなか
つた。次に３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と
３×10-7ＭのSfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩
衝液（PH5.5）中で30℃、10分間反応させ、これ
に1.5mlの氷酢酸を加えた後、100℃で５分間加熱
し、減圧下で0.2mlにまで濃縮した。そしてこれ
を50℃にまで加温したBio−gelP4カラム（φ2×
150cm）（バイオラド）に添加し、蒸留水で溶出
し、各溶出画分５mlを0.1mlまで減圧濃縮後、こ
れらに含まれるオリゴ糖の分析を前述ペーパーク
ロマトグラフイーと発色定量法を用いて行つた。
その結果この酵素反応では各基質の50％が分解お
よび転移され、これら反応産物より前述のゲル瀘
過法により糖転移産物を基質および低分子分解産
物より単離精製できることが明らかとなつた。 なお、本発明の変異α−アミラーゼは、加水分
解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたもの
となつており、出発基質の重合度により、各々特
徴的な産物を産生する。 例えば、マルトヘプタオース（G7）を基質と
する場合には、一部は低分子に分解されるが、大
部分はG10，G11，G12に変換される。マルトペン
タオース（G5）を基質とする場合には糖転移産
物G7，G8が産生され、また、マルトヘキサオー
ス（G6）からはG9を産生することができる。 得られた反応混合物からは、ゲル濾過法等によ
り分離、精製することにより、用いた基質から特
定な鎖長だけ増したマルトオリゴ糖をそれぞれ得
ることができる。 上記の糖分転移酵素反応の条件としては、例え
ば温度30℃、PH5.5程度が最適であり、また反応
時間は、基質の重合度濃度及び酵素濃度により
各々異なるが通常は15分で十分である。 〔発明の効果〕 本発明の変異α−アミラーゼを用いれば、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を高収
率でかつ簡単な操作で製造することが可能であ
り、従来のオリゴ糖の精製の煩雑さを伴うデンプ
ンの加水分解法に比べて極めて有利であり、重合
度７以上の特定の重合度のマルトオリゴ糖を工業
的規模で量産化しようとする場合において好適な
ものである。 実施例 １ 本発明の変異α−アミラーゼを調整するために
まずα−アミラーゼ遺伝子の採取を行つた。サツ
カロミコプスイス・フイブリゲラ（Saccharo−
mycopsis fibuligera）の染色体DNAを制限酵素
Sau3Aで部分消化し、５キロベース（kb）より
長いDNA断片をシヨ糖密度勾配遠心で回収し、
このDNA断片をロイシン生合成遺伝子を選択マ
ーカーとしてもつクローニングベクターpYI1の
BamHI部位に挿入連結した。この組換え体プラ
スミドDNAでロイシン要求性のパン酵母サツカ
ロマイセス・セレビズイエ（Saccharomyces
cerevisiae）KK4株を形質転換した。S.
cerevisiaeの形質転換は以下の様に行つた。YPD
液体培地（１％酵母エキス、１％バクトペプト
ン、１％グルコース）でKK4株を30℃一夜培養
し、この菌液３mlを100mlのYPDに接種し、30℃
で数時間培養した。対数増殖期（Klett値が180〜
200）に達した時に遠心分離機で集菌し、40mlの
TE液（1mMのEDTAを含む10mMトリス−塩酸
緩衝液（PH8.0）で洗浄し、菌体を６mlのTE液に
懸濁させた。この２mlをＬ字型試験管に移し、こ
れに２mlの0.2M酢酸リチウム液を加え、30℃で
１時間振盪した。さらに、0.7mlのグリセロール
を加え、これに90μgの組換え体プラスミドDNA
を加え攪拌し、30℃で30分間保温した。これに
4.5mlの70％ポリエチレングリコール＃4000を加
え混和し、30℃で１時間保温した。ついで42℃で
５分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、10.5
mlの水と混和した。これから遠心分離機で集菌
し、再度10.5mlの水で菌体を洗浄し、集菌したの
ち、最終的に7.5mlの水に懸濁した。この形質転
換細胞を含む懸濁液0.5mlを2.5mlの0.7％ソフト寒
天にまぜ、可溶性デンプンを唯一の炭素源として
含みロイシンを含まない固体合成選択培地にま
き、30℃で数日間培養し、コロニーのまわりにク
リアーゾーンを形成する形質転換パン酵母を単離
した。この酵母細菌よりプラスミドDNAを回収
し、組換えプラスミドDNA中に含まれるα−ア
ミラーゼ遺伝子を採取した。 変異遺伝子作成はKunkel法を用いた。最初に
サツカロミコプシス・フイブリゲラα−アミラー
ゼ遺伝子をM13フアージmp18にサブクローニン
グした。その方法は以下の様である。α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むEcoRI−PstIDNA断片
（2.5kb）をM13フアージmp18のマルチクローニ
ングサイトに挿入連結した。この組換DNA分子
（0.01μg）をあらかじめ塩化マグネシウム、塩化
カルシウム処理でDNA受容率が高められた大腸
菌（E.coli）XL1−Bleu株のコンピテントセル
（100μ）と０℃で混和し、氷中に20分間保つ
た。ついで43℃で130秒間熱シヨツクをかけ、す
ぐに氷冷したのち、500μのLB液体培地（１％
バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食
塩、0.1％グルコース）を加え37℃で１時間培養
した。これを指示菌（XL1−Bleu）と共にＸ−
galの入つたLB固体培地にまき、37℃で一夜培養
した。指示菌の層上にできたプラークより白色プ
ラークを選び、竹ぐしを用い、これら白色プラー
クに含まれるフアージ粒子をTE溶液に懸濁し、
４℃保存すると共に、その一部を大腸菌XL1−
Bleu株に感染させ、２mlのLB培地で37℃、７時
間培養し、その後、遠心分離により菌体のみを回
収した。この菌体よりアルカリ溶菌法により複製
型（RF）DNAを単離し、制限酵素EcoRIとPstI
で消化後、アガロース電気泳動にかけ、目的とす
るα−アミラーゼ遺伝子（2.5kb）がサブクロー
ニングされたRF DNAを同定した。 次に、４℃保存してあつたα−アミラーゼ遺伝
子を含むM13フアージ粒子を選択し、ウラシル−
DNAグリコシラーゼ（ung）の欠損株CJ236に感
染させ、40mlのLB液体培地で37℃、６時間培養
したのち、培養液の遠心上清より、フアージ粒子
をポリエチレングリコール＃6000沈澱として回収
し、これを200μのTE溶液に溶解した。このフ
アージ粒子溶液を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）飽和フエノール溶液で抽出し、ウラシル−
１本鎖DNA（マイナス鎖）をエタノール沈澱とし
て回収した。そしてウラシル−１本鎖DNA
（0.3μg）を含むTE溶液10μに変異導入のための
合成オリゴヌクレオチドを1.7ng加え、65℃で５
分間加熱徐冷することにより、両分子をアニーリ
ングさせた。これに４単位のT4DNAリガーゼと
2.5単位のT4DNAポリメラーゼを加え、１本鎖部
分（プラス鎖）を修復し、２本鎖DNA（Ｕ−RG
DNA）を形成させた。このDNAをung+の大腸
菌（MV1190）に取り込ませると、ウラシルの含
まれた側のDNAはnugにより分解され、変異の
導入された側のDNAから複製されたフアージ粒
子あるいはRF DNAが得られる。具体的には前
述した形質転換法を用い、Ｕ−RFDNAを
MV1190株で導入し、指示菌（MV1190）と供に
LB固体培地上にまき、37℃で一夜保温した。翌
日でてきたプラークよりフアージ粒子をTE溶液
に移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４
クローンを各々別々に２mlのLB液体培地中で
MV1190株に感染させ、37℃で７時間培養した。
この培養液を遠心し、その上清より前述の方法で
フアージ粒子をポリエチレングリコール沈澱とし
て回収し、１本鎖DNA（マイナス鎖）の単離を行
つた。そして、その塩基配列を確認し、変異が正
しくはいつたフアージクローンを選択した。 先に用いたサツカロミコプスイス・フイブリゲ
ラα−アミラーゼの84番目トリプトフアン（遺伝
子番号：TGG）をロイシン（遺伝子暗号：
TTG）に変換させるためのオリゴヌクレオチド
の配列は5′末端からAT GGT TAC ＴＧ
ATG AAG AAであり、○印の付したチミン塩
基のみが構造遺伝子と異なつている。なお構造遺
伝子ではこれがグアニン塩基（329番）となつて
いる。合成はシアノエチルホスホアミダイト法を
用いるDNA合成機で行つた。変異遺伝子の塩基
配列の決定はダイデオキシ法を用いた。まず構造
遺伝子のマイナス鎖に相補性を示し全構造遺伝子
部分をカバーできる17量体のオリゴヌクレオチド
10種（P1からP10）を合成した。このうち変異さ
せた部位（329番目）の5′末端側に位置し、267番
目から284番目に相当するオリゴヌクレオチドP3
（2.5ng）を先に単離した１本鎖DNA（マイナス
鎖）1μgと加温徐冷でアニールさせた。これに
5μCiの［α−32Ｐ］dCTPと市販のシークエンス
イングキツトに含まれるDNAポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド、ダイデオキシヌクレオチド
を加え、37℃で加温することにより、プラス鎖の
伸長反応、ラベル化反応、ターミネーシヨン反応
を行わせた。この試料を100℃２分間保温後、氷
水中急冷し、これを8.3Mの尿素を含む８％アク
リルアミドゲル（厚さ0.2mm、長さ50cm）に添加
し、TBE液（1mMのEDTAを含む45mMトリス
−ホウ酸緩衝液PH8.3）で２時間電気泳動した。
電気泳動後、ゲルを濾紙に移しとり乾燥させ、こ
れを用いて−80℃で３時間Ｘ線フイルムを感光さ
せ、オートラジオグラムを得た。そしてそこに表
れたバンドを順次読みとることにより塩基配列の
決定を行つた。この操作で329番目のグアニン塩
基がチミン塩基に変異したフアージクローンが得
られた。これに関して、さらに他の合成オリゴヌ
クレオチド９種を用い、α−アミラーゼの全構造
遺伝子の塩基配列確認を行い、329番目以外には
まつたく変異が存在していないことを明らかに
し、このフアージクローンをM13 SfamyW84L
と命名した。 酵母用の発現ベクターの構築は以下の様にして
行つた。まず前述したフアージクローンM13
Sfamy W84Lを大腸菌MV1190株に感染させ、先
に述べたと同様の方法で菌体内より２本鎖RF
DNAを単離し、これを制限酵素EcoRI、PstI処
理し、アガロース電気泳動にかけ、変異したα−
アミラーゼ遺伝子を含む2.5kbDNA断片0.1μgを
得た。この断片中にはα−アミラーゼの発現に必
要なプロモーター、ターミネーター領域がもとも
と含まれているので、これを同じ２種の制限酵素
で切り開いた酵母−大腸菌シヤトルベクター
YEp351（0.1μg）のマルチクローニングサイトに
挿入連結した。この組換えプラスミドで大腸菌
XL1−Bleu株を前述の方法で形質転換し、得ら
れた形質転換体の菌体内よりプラスミドDNA
（20μg）を単離し、その0.2μgを用い、制限酵素処
理、電気泳動でマルチクローニングサイトに目的
の2.5kbDNA断片が挿入されている事を確認し、
この組換えプラスミドをpSA5W84Lと命名した。
pSA5W84Lを3μg用い、前述の方法でパン酵母
（S.cerevisiae）KK4株を形質転換し、ベクター
のロイシン生合成遺伝子を選択マーカーとして、
形質転換体（KK4：pSA5W84L）を単離した。
この形質転換体（KK4：pSA5W84L）は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11667
号として寄託されている。また、野生型α−アミ
ラーゼ遺伝子についても同様な発現ベクターを構
築し、これをpSA5Nと命名し、形質転換体
KK4：pSA5Nを単離した。 変異α−アミラーゼの発現分泌と酵素の精製は
以下の様にして行つた。形質転換体KK4：
pSA5W84Lを前述のYPD液体培地（１）に接
種し、30℃で５日間振盪培養した。その後培養上
清を遠心分離により得て、これに20gの陰イオン
交換樹脂、DE52−セルロース（ワツトマン）を
加え、１時間４℃で攪拌した。樹脂を沈降させた
のち上清を捨て、残つた樹脂を500mlの2.5mMの
塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄し、これをガラスカラムにつめ、1M
NaClを用いた直線勾配でタンパク質を溶出分画
した。各分画の酵素活性はヨウ素デンプン反応で
測定した。この活性画分16mlをYM30膜（アミコ
ン）を用いた限外瀘過で0.2mlに濃縮し、これを
同緩衝液で平衡化したSuperose12（Pharmacia）
（φ10×800mm）に添加しゲル瀘過した。次にグリ
コーゲンを用いたアフイニテイクロマトグラフイ
ーを以下の様に行つた。ゲル瀘過で得た活性画分
２mlに1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.7）を加えPH
を6.5とした。これに40％になるまでエタノール
を加え、遠心分離で不溶性沈澱を除いたのち、氷
中に保ち、これに１mgのグリコーゲンを含む水溶
液（50μ）を加え０℃で２時間攪拌し、グリコ
ーゲンに酵素を吸着させた。そして2600×ｇで０
℃、５分間遠心し、グリコーゲンと酵素の複合体
を沈澱させ、これを０℃に冷やしたエタノールを
40％含む50mMトリス−塩酸緩衝液（PH6.5）で
２回洗浄した。さらにこの複合体を0.5mlの
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）に溶解し、同酢酸緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムMono Ｑ HR5／５
（Pharmacia）に添加し、同緩衝液で十分カラム
を洗浄し、グリコーゲンを完全に除去したのち、
1M NaClを用いた直線勾配で酵素を溶出し、活
性画分（１ml）を得た。この変異酵標品はSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一蛋白バン
ドを示し、その泳動位置は天然型酵素と同一であ
り、その抗原性も天然型と一致することが天然型
酵素に対するマウス腹水抗体と125−プロテイ
ンＡを用いたウエスタンイムノブロツテイングで
確認された。したがつて以上の様な操作で変異α
−アミラーゼが完全に精製された。 実施例 ２ ３×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7
Ｍの実施例１で得られた変異酵素SfamyW84Lを
2.5mMの塩化カルシウムを含む50mM酢酸緩衝
液（PH5.5）400μ中で、30℃で反応させ、一定
時間おき100μずつ取り出し、30μの氷酢酸で
反応を停止させ、100℃で５分間加熱することで
酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次
にこれを5μの蒸留水に溶解し、その2.5μを25
cm×40cmのペーパークロマトグラフイー濾紙
（3MM、ワツトマン）にスポツトし、展開溶媒
（酢酸エチル：メタノール：水＝37：40：23）を
入れた耐圧性容器内で55℃、２時間の展開を２回
くり返した。そののち濾紙を乾燥させ、これに
200単位のRhizopusグルコアミラーゼを含む
50mM酢酸緩衝液（PH5.5）10mlを噴霧し、密閉
容器内で55℃、30分間保温した。次に濾紙上でグ
ルコアミラーゼ処理されたスポツトの検出を硝酸
銀発色法を用いて行つた。硝酸銀発色はグルコア
ミラーゼ処理後の濾紙を硝酸銀のアセトン溶液、
アルコール性水酸化ナトリウム液、定着液の順序
で浸漬、乾燥を繰り返すことで行つた。基質と酵
素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポツトの発色の強度をデンシト
メーターを用いて測定することで求めた。その結
果、基質G5から糖転移産物としてG7とG8が、G6
からG9が、G7からG10，G11，G12が生じることが
明らかとなつた。基質G7を用いた酵素反応を例
にとると、反応８分後に基質の40％が分解および
転移され、基質減少量の60％がG10，G11，G12の
混合物に変換された。他の基質に関してもほぼ同
等の変換率が示された。一方、天然型酵素を同じ
条件で基質と反応させても、変異酵素で見られた
糖転移産物はまつたく検出されなかつた。次に３
×10-3Ｍの基質（G5，G6，G7）と３×10-7Ｍの
SfamyW84Lを５mlの50mM酢酸緩衝液（PH5.5）
中で30℃、10分間反応させ、これに1.5mlの氷酢
酸を加えた後、100℃で５分間加熱し、減圧下で
0.2mlにまで濃縮した。そしてこれを50℃に加温
したBio−gelP4カラム（φ2×150cm）（バイオラ
ド）に添加し、蒸留水で溶出し、各溶出画分５ml
を0.1mlまで減圧濃縮後、これらに含まれるオリ
ゴ糖の分析を前述ペーパークロマトグラフイーと
発色定量法を用いて行い、その結果この酵素反応
では各基質の50％が分解および転移され、これら
反応産物より前述のゲル濾過法により糖転移産物
を基質および低分子分解産物より単離精製できる
ことが明らかとなつたその使用した基質と得られ
た各糖転移産物の収量（収率）を下記第１表に示
す。 【表】
第１図はサツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharomycopsis fibuligera）のα−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列及び該酵素のアミノ酸配列
を表す。
（Saccharomycopsis fibuligera）のα−アミラ
ーゼ遺伝子の塩基配列及び該酵素のアミノ酸配列
を表す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼ遺伝子の構造遺伝子部分329番目の塩基配
列をＴに変異せしめた該α−アミラーゼの変異遺
伝子。 ２ サツカロミコプスイス・フイブリゲラ
（Saccharo−mycopsis fibuligera）のα−アミ
ラーゼのアミノ酸配列の84番目のアミノ酸をロイ
シンに置換せしめた糖転移活性が増強された変異
αアミラーゼ。 ３ マルトオリゴ糖を基質とし、請求項２記載の
変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行うこ
とを特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ糖の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2226112A JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2226112A JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04108386A JPH04108386A (ja) | 1992-04-09 |
| JPH0533033B2 true JPH0533033B2 (ja) | 1993-05-18 |
Family
ID=16840027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2226112A Granted JPH04108386A (ja) | 1990-08-28 | 1990-08-28 | 変異α―アミラーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04108386A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740938B2 (ja) * | 1993-03-04 | 1995-05-10 | 工業技術院長 | 変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法 |
| JP5770364B2 (ja) | 2012-03-26 | 2015-08-26 | シャープ株式会社 | スイッチング電源回路、及びｌｅｄ照明装置 |
| CN108251317B (zh) * | 2018-03-30 | 2020-03-10 | 陕西枫丹百丽生物科技有限公司 | 一株扣囊复膜孢酵母及其应用 |
-
1990
- 1990-08-28 JP JP2226112A patent/JPH04108386A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04108386A (ja) | 1992-04-09 |
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