JPS61132178A - 変異バチルス・ズブチリス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一般にサイクロデキストリン　グルカノトランスフェラ
ーゼ生産菌として、バチルス属やクレプンラ属の細菌な
どが用いられてきた。しかし、その生産は微量で、かつ
不安定であり、また培地中Ｋｔまれるきよう雑物が多く
、サイクロデキストリン　グルカノトランスフェラーゼ
の分離精製が困難であった。本発明者らは、バチルス・
マセランスのサイクロデキストリン　グルカノトランス
フェラーゼ構造遺伝子をバチルス・ズブーチリス内でり
Ｉ】−７化することに成功し、この変異株を培養したと
ころ、安定に短時間でサイクロデキストリン　グルカノ
トランスフェラーゼを生産させることができたものであ
る。本発明は、サイクロデキストリン　グルカノトラン
スフェラーゼを生産するバチルス串ズデチリスである。

本発明に用いるサイクロデキストリン　グルカノトラン
ス７エラーｆを生産するバチルス−ズブチリスは次のよ
うにして創製することができる。

サイクロデキストリン　グルカノトランスフェラーゼ遺
伝子の調製は次のようにする。

バチルス・マセランスＩＡＭ１２４３株はサイクロデキ
ストリ／　グルカノトランスフェラーゼを菌体外に分泌
する細菌として知られている。本薗体から５ａｉｔｏ　
、　Ｍｉｕｒａ法（５ａｉｔｏ　、　Ｈ，ａｎｄ　Ｍｉ
ｕｒａ　、　Ｋ　、　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ａｃｔａ　、
　７２　、６１９　、　（１９６４））により染色体Ｄ
ＮＡを調製する。これを制限酵素５ａｕ３Ａ１で部分分
解し、分解物からンヨ糖密度勾配超遠心法により約２Ｋ
ｂ以上の染色体ＤＮＮ唐金分離する。

別に、ファージλＤ６９ＤＮＡを制限酵素Ｂ　ａ　ｍＨ
ｌで切断し、これに先の染色体ＤＮＡ断片を混合し、更
にＴ４ＤＮＡすが一ゼを添加して、連結処理をする。

・この処理液を用いてイン　ビトロ　パツケイジフグ法
（Ｈｏｒｎ　、　Ｂ　、　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏ１９ｇｙ　、　６８　。

２９９、（１９７９））Ｋよりλフアージ粒子を形成し
、このλフアージ粒子をエシェリヒア・コリＳＭ３２の
培養菌懸濁液に添加してサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ生産能を保有する特殊形質導入ファ
ージを得る。得られた特殊形質導入ファージ粒子より、
サイクロデキストリン　グルカノトランスフェラーゼ遺
伝子を含むλファージＤＮＡｔ−調製する。このＤＮＡ
を制限酵素５ａｕ３ＡＩで部分分解し、ゲラスミＰｐＵ
Ｂ１１０の制限酵素ＢａｍＨＩ切断部分にＴａ２）が−
ゼを用いて結合し、・・イブリッド　プラスミー混合物
を得る。この混合物を用いてバチルス拳ズブチリスへプ
ロトプラスト形質導入法（Ｃｈａｎｇ＋　Ｓ、　ａｎｄ
ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、。

Ｍｏｌ　、　Ｇｅｎ　、　Ｇｅｎｅｔ　、１幻ｉ、１１
１．（１９７９））により形質転換する。形質転換株の
中からカナマイノン耐性（ｌＯμｇ／ｍｌ）かつサイク
ロデキストリングルカノトランスフェラーゼ活性のある
株を選択する。この菌株を培養し、培養菌体からゲラス
ミｖ　９ＤＳ　１０を得た。

シラスミｒｐＤｓ１０のフィシカルマツプ（制限酵素切
断地図）は第４図に示した通りであり、白ぬきの部分は
ベクターｐＵＢ１１０由来、黒塗りの部分は染色体切断
部分で、このクローン化された断片の大きさは約２．２
Ｋｂである。ここに得られる形質転換体はサイクロデキ
ストリン　グルカノトランスフェラーゼを菌体外に安定
によく分泌する優れた変異バチルス・ズブチリスである
。本菌はバチルス・ズブチリスＮＡμ−Ｐｒ）ＳＩＯ（
ＦＬＦＬＭ　Ｐ−７１！；υとして微工研に寄託されて
いる。

この変異バチルス・ズブチリスはサイクロデキストリン
　グルカノトランスフェラーゼの生産性において全く新
規であり、サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼの工業生産上極めて有用である。

次に本発明の実施例及び試験例を示す。

実ｍ　例　変異バチルス・ズブチリスの創製バチルス・
マセランスＩＡＭ１２４３＆をフスマ培Ｊｌｋ（６％７
２？抽出ｉ、０．５％マルト　エキストラクト、０．５
％イースト　エキストラクト、０．５％Ｉリペデトン、
０．０５％塩化力ルクウム）で４８時間培養し、遠心分
離にて集菌、洗浄して得られた菌体から５ａｉｔｏ　＋
　Ｍｉｕｒａの方法（５ａｉｔｏ、Ｈ，ａｎｄＭｉｕｒ
ａ、に、　、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ、７２　、６１９　。

（１９６４））によって染色体ＤＮＡを分離し、これを
トリス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素５ａｕ
３ＡＩ（宝酒造社製品）を添加して、３７℃で部分分解
した後、分解物からショ糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ
以上の染色体断片を分離、取得した。

用いた７アージベクターλＤ６９（東京大学医科学研究
所より分譲）の概略開裂地図は第１図に示した通りであ
り、このファージλＤ６９は３８．８Ｋｂで制限酵素Ｂ
ａｍＨＩによって１箇所切断されるものである。

ＢａｍＨＩで１箇所切断したλＤ６９と前記のバチルス
・マセランスＩＡＭ１２４３株から得られた約２Ｋｂ以
上の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ　ＩＪが−ゼを添
加して連結処理した（　Ｗｅｉｓｓ、Ｂ、＋５ａｂｌｏ
ｎ、Ａ、Ｊ、。

Ｌｉｖｅ、Ｔ、Ｒ，、Ｆａｒｅｅｄ、Ｇ、Ｃ，ａｎｄＲ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｊ　。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４３，４５４３．（１９６８
））。処理液を。

イン　ビトロ　パ・ノケイジング　キット（宝酒造社製
品）に添加してイン　ビトロ　パッケイジフグ法（Ｈｏ
ｒｎ　、　Ｂ、　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　、　６旦、　２９９゜（１９７９））によ
り当該ＤＮＡをファージ粒子に導入した。このファージ
粒子をエシェリヒア・コリ５Ｍ３２の菌体懸濁液に添加
し、１チ可溶性澱粉。

１．２％の寒天を含むλ培地（バクトトリプト７１０　
ｔ　、　ＮａＣｌ２．５Ｐを水！ｔに溶解）に添加して
３７℃で培養し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧し
て、ヨウ素反応を起こさなかったファージをサイクロデ
キストリン　グルカノトランスフェラーゼ生産ファージ
として分離することができた。

得られたサイクロデキストリ／　グルカノトランスフェ
ラーゼ生産ファージを単離し、これをエシェリヒア・コ
リ５Ｍ３２とともにλ培地で３７°Ｃで培養した。培養
液を遠心分離して宿主菌体を除き。

ポリエチレングリコールを加えてファージ粒子を凝集さ
せたのち、遠心分離によってファー２粒子を集め、新規
なファージを得た。このファージをλＣＤと名づけた。

このファージ粒子を、５０チホルムアミドを含むファー
ジ懸濁用緩衝液に対して透析し、λＣＤファージＤＮＡ
を得た。ファージλＣＤＤＮＡは４９．８Ｋｂノ大キサ
で、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断地図）を第２
図に示す。ここで白ぬきの部分はベクターλＤ６９由来
で、黒塗りの部分は染色体断片部分である。各略記号は
すべて制限酵素である。

このファージλＣＤＤＮＡをｊ２Ｐでラベルし、バチル
ス・マセランス■ＡＭ１２４３株染色体ＤＮＡ１エシェ
リヒア・コリＳＭ３２株染色体ＤＮＡおよびα−アミラ
ーゼ高生産株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）　ＮＡ６４染色体ＤＮＡのそれぞ
れのＥｃｏＲＩ分解物とサザンハイプリダイゼーション
（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ　。

Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、９８，５０３．　
（１９７５））を行ったところ、エシェリヒア・コリ、
バチルス・ズブチリス染色体ＤＮＡとは全くハイブリダ
イズしなかったが、バチルス・マセランスＩＡＭ１２４
３株の染色体ＤＮＡとは２箇所で特異的にハイブリダイ
ズしており、クローン化した遺伝子はバチルス・マセラ
ンスＩＡＭ１２４３株由来であることが確かめられた。

ここに得られたλＣＤファージＤＮＡを）リス塩酸・Ｅ
ＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素５ａｕ３ＡＩ　（宝酒
造社製品）を添加し、３７℃で部分分解した。分解物か
らショ糖密度勾配超遠心法で約２Ｋｂ以上の染色体断片
を分離し、取得し、プラスミドｐＵＢ１１０を用いて再
クローン化を図った。

再クローン化に用いたプラスミドｐＵＢ１１０の概略開
裂地図は第３図に示すが、このプラスミドｐＵＢ１１０
は４．５　Ｋｂで去ナマイシン耐性（Ｋｍ’　）を有し
、制限酵素ＢａｍＨＩによって１箇所切断されるもので
ある。

Ｂ　ａ　ｍＨＩで１箇所切断したｐＵＢｌｌｏと前記の
λＣＤ７アージから得らｎた約２Ｋｂ以上の染色体断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを添加して連結処理し
た。この処理液を用いてバチルス・ズブチリスＮＡ６４
株を宿主とするプロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ
＋Ｓ、、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、Ｍｏ１．ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、、１６８゜１１１、（１９７９））を行い、当
該プラスミドを導入した。

得られた形質転換処理菌体を選択培地である可溶性澱粉
１チ、カナマイシン１００μｔ／ａｔ、　寒天０．８％
を含むＤＭ３培地（５チバクトヵザミノ酸１００ａｔ、
１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐｉ−１７，３）　５００ｒ
ａｌ　、　３．５チリン酸水素二カリウム５０ａｔ、　
１．５％リン酸二水素カリウム５０ｎｔ／、１０％酵母
エキｘ５０ｘｌ、２０％グルコース２５ｓｒＡ’、ＩＭ
塩化マグネシウム２０ｍ／、２％牛血清アルブミン５ｍ
／を混合）に添加して３７°Ｃで培養し、カナマイシン
耐性株を得た。このカナマイツノ耐性株をカナマイン７
１０μ？／ａｔ、１％可溶性澱粉を含むＬＧ培地（バク
トドリプ）　７１（１，酵母エキス５ｉＰ、Ｎａ（Ｊ５
５’、グルコース２りをｌｔの水に溶解）にて３７°Ｃ
で２４時間培養し、培養液中のサイクロデキストリンの
有無をペーパークロマトクラフィーおよび高速液体クロ
マトグラフィーによって調べた。

ペーパークロマトグラフィーは培養液をｎ−ブタノール
／ｎ−プロパツール／水（３１５／４　）の溶媒系で６
０’α　２回上昇展開を行ったのち、　　９０％ア七ト
ンのヨウ素溶液にペーパークロマトグラムを浸してサイ
クロデキストリンの呈色を検索し、発色したものをサイ
クロデキストリン　グルカノトランスフェラーゼ分泌味
として分離することができた。

得られたサイクロデキストリン　グルカノトランスフェ
ラーゼ生産菌株を単離し、これをカナマイシン１０μ２
／−を含むＬＧ培地で３７℃で培養し、培養液を遠心分
離して集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽出法（
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ　。

Ｊ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、、７．１５１
３　、　（１９７９）　）によってプラスミドを分離、
探索して新規なプラスミドを得た。このプラスミドをプ
ラスミドｐＤｓ１０と名づけだ。

プラスミドｐＤｓ１０は６．７Ｋｂの大きさで、そのフ
ィジカルマツプ（制限酵素切断地図）を第４図に示す。

ここで白ぬきの部分はベクターｐＵＢ１１０由来で、黒
塗りの部分は染色体断片部分であり、各略記号はすべて
制限酵素である。

試験例１　サイクロデキストリン　グルカノトランスフ
ェラーゼの生産 バチルス・ズブチリスＮＡ６４−ｐＤｓ１０　ｔ−カナ
マイシン１０μ？／ｌｌを含むＬＧ培地を用い、５００
ｍ１容の坂ロフラスコに１００ｘ１分注し、３７℃で３
０時時間表う培養した。その間培養物を１ｄずつ採取し
て、培地中のサイクロデキストリン　グルカノトランス
フェラーゼの活性を測定した。

第５図は、サイクロデキストリン　グルカノトランスフ
ェラーゼ活性の経時的変化を示すものである。ここでＡ
は菌の生育、Ｂはサイクロデキストリン　グルカノトラ
ンスフェラーゼ活性を示している。

第５図から明らかなように、サイクロデキストリン　グ
ルカノトランスフェラーゼ活性は培養後１２時間で最高
値に達する。

【図面の簡単な説明】

第１図はファージλＤ６９のフィジカルマツプ（制限酵
素切断地図）、第２図はファージλＣＤのフィジカルマ
ツプ％第３図はプラスミドｐＵＢ１１０のフィンカルマ
ツプ、第４図はｐＤｓｌｏのフィンカルマツプをそれぞ
れ示している。 第５図仕試験例におけるサイクロデキス）　ＩＪングル
カノトランスフエラ−ゼ活性の経時変化および菌の生育
を示すグラフである。 特許出願人　農林水産省食品総合研究所長ＢａｍＨＩ 第４図 ８ｇ　Ｌｒｌ 手続（甫正占岨発） 昭和６０年１月■０日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. サイクロデキストリン　グルカノトランスフェラーゼを
   生産するバチルス・ズブチリス