JPH05331202A

JPH05331202A - 高分子量のプルランおよびその製造方法

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Publication number: JPH05331202A
Application number: JP4304794A
Authority: JP
Inventors: Linda Thorne; リンダ・ソーン; Thomas Dr Pollok; トーマス・ポロック; Richard W Armentrout; リチャード・ダブリュー・アーメントロート
Original assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Shin Etsu Bio Inc
Current assignee: Shin Etsu Chemical Co Ltd; Shin Etsu Bio Inc
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1993-12-14
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: CA2080658A1; DE69224259D1; JP3071583B2; EP0538049A1; US6387666B1; EP0812919A1; DE69230896D1; US6010899A; DE538049T1; CA2080658C; EP0538049B1; US5268460A; EP0812919B1; DE69224259T2; DE69230896T2

Abstract

(57)【要約】【目的】高分子量で色素産生が少ないプルランの生産
方法を提供する。【構成】自然のソースから，オーレオバシデイウム・
プルランスの少なくとも一つの野生株を採取し、ｂ）微生物が酵母様細胞を多く含むような発酵条件を該
採取株に付与し、さらに、このようにして生じた酵母様
細胞を分離し、ｃ）分離した酵母様細胞からコロニーをつくり、ｄ）酵母様細胞を含み、他の細胞と比較して着色の少な
いコロニーを工程ｃ）から肉眼的検査で選別し、ｅ）選別コロニーの色素産生を調べ、ｆ）深部培養で最少量の色素を産生する分離株を選別す
ることより成る培養を行うときに最少量の色素を産生す
るオーレオバシデイウム・プルランスの純化培養株を得
ることとした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高分子量のプルランお
よびその製造方法に関する

【０００２】

【従来の技術】プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）は、様々
な応用性を有する、粘性、水溶性の中性多糖類である。
その利用には、透明フィルム、食品用酸素遮断性無味無
臭コーテイング、粘性制御剤、建材用接着剤、繊維およ
びシアンエチルプルランの構造をもつ絶縁体が含まれ
る。このポリマーの純度および分子量は、その最終利用
にとって重要な特性である。

【０００３】プルランは、菌類オーレオバシディウム
プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕ
ｌａｎｓ、本書では以下Ａ．プルランスという）が分泌
する菌体外多糖類である（Ｂ．Ｂｅｒｎｉｅｒ，１９５
８年，ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４：１９５−２０４；Ｈ．Ｂｅ
ｎｄｅｒら、１９５９年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ
ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ３６：３０９−３
１６頁）。天然に分離された他のいくつかの同様な分離
株もまたプルランを分泌する［微生物由来多糖類とポリ
サッカラーゼ（Ｒ．Ｃ．Ｗ．Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｇ．
Ｗ．Ｇｏｏｄａｙ、Ｄ．Ｃ．Ｅｌｌｗｏｏｄ編集：Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ刊、１９７９年）中のＢ．
Ｊ．Ｃａｔｌｅｙによる総説参照］。

【０００４】Ａ．プルランスは、一属一種のもとにアメ
リカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に含
まれている。この菌類は、通常、山林の腐葉土、天然の
水、工業廃水、塗装表面、プラスチック、材木、皮革お
よびキャンバスから分離され、さらにある種の患者から
日和見病原体として分離される。

【０００５】Ａ．プルランスは多形性菌類である。三つ
の異なる形状が主なもので、伸長分枝糸状体、大型の厚
膜胞子および小型の酵母菌様単細胞がそれである。これ
ら三つの形状の各々は、単一コロニーの部分として液体
培地と固形寒天表面の両方に認められる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】Ａ．プルランスの望ま
しくない特性は、メラニン様化合物であって、黒緑色か
ら黒色の黒っぽい色素を産生するということである。こ
の色素はプルランの回収中に共沈により、プルランに混
入する。この色素のために、プルランを利用する前に、
プルランを活性炭による多工程の脱色処理に付し、その
後色素除去のため濾過しなければならない。これは明ら
かにコストを増し、プルランからの最終製品製造を複雑
にさせる（米国特許第３，９５９，００９号および４，
００４，９７７号参照。）

【０００７】Ａ．プルランスのもう一つの望ましくない
特性は、発酵中のこの微生物の深部増殖が進行するにつ
れ、培地の粘性は、蓄積された菌体外プルランの平均分
子量の低下により減少するということである［Ｂ．Ｊ．
Ｃａｔｌｅｙ、１９７０年、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
１０：１９０−１９３頁；Ｄ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎ，
Ｂ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｓ．Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ，
Ｊ．ＭａｙｅｒおよびＳ．Ｓｏｕｓａ、１９８７年、素
材バイオテクノロジーシンポジウム抄録（Ｍａｔｅｒｉ
ａｌｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｙｍｐｏｓｉ
ｕｍＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ），Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ，
Ｎａｔｉｃｋ：１４９−１７３頁］。

【０００８】米国特許第３，９１２，５９１号は、最初
の培養条件、すなわちｐＨ、リン酸塩濃度、炭素源、接
種量および採取時期が、このポリマーの平均分子量およ
びプルラン収量に影響することを開示している。この特
許はさらに、開始ｐＨを７以上に上げるとプルランの平
均分子量が減少することを開示している。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、色素産生
量の少ない、Ａ．プルランスの新規な純化株を見出し
た。さらに、本発明者らは、上記新規な純化株の分離
法、使用のために殆どまたは全く脱色を必要としない十
分に色素非含有性のプルラン産生法および８ｘ１０⁵以
上の平均分子量を有するプルランの製造方法、ならび
に、これらの製造方法によって生産されるプルランに想
到した。

【００１０】より具体的には、本発明者らは、Ａ．プル
ランスの特徴である色素産生は、主に糸状体型および厚
膜胞子に付随していることに想到した。本発明者らは、
さらに、例えば寄託機関または自然のソースから得られ
たＡ．プルランスの野生株を処理してその酵母様細胞分
画を増やし、この酵母様細胞を非−酵母様細胞から分離
できることを発見した。それから分離した酵母様細胞を
増殖させ、さらに着色の程度を基にして、コロニーを肉
眼的に分離することができる。この分離コロニーを、所
望する場合にはさらに純化し、検査を行い、発酵に付す
ときに色素産生量の最も少ない株をさらに分離すること
ができる。また、色素産生量の最も少ない株を決定する
だけでなく、プルランの最大産生量を有する株を決定す
ることができるよう、上記分離コロニーのプルラン収量
を測定することが望ましい。

【００１１】本発明に従えば、Ａ．プルランスを発酵条
件に置き、発酵培地が特有の低ｐＨで安定した後、この
発酵培地のｐＨをおよそ７に中和することにより、非常
に大きな分子量のプルランを得ることができる。製造方
法の別の具体例によれば、Ａ．プルランスを発酵条件に
置き、さらに蓄積プルラン中の一切のプルラン分解酵素
を不活性化するために十分な温度で十分な時間、この蓄
積プルランを熱処理することによって、非常に高分子の
プルランを得ることができる。

【００１２】これらの方法により、平均分子量がおよそ
４×１０⁶を越える、新規なプルラン生成物を得ること
ができ、しかも収量の減少を伴わない。製造用培養体と
して、本発明の純化株を使用すると、高分子量で色素産
生が最少のプルランを得ることができる。本発明のプル
ランは高い粘性を示し、特にフィルム、ファイバーの分
野での使用、さらに種々の素材に対する流動学的制御剤
としての利用に適している。

【００１３】カリフォルニア州サンディエゴ郡内の様々
な場所にある、いろいろな種の木から葉を集めた。各植
物からの葉を一枚、２５℃で３日間滅菌水に浸して、
Ａ．プルランスの酵母様細胞に富む培養体を調製した。
それからこの培養体の０. １ｍｌないし１０ｍｌを、コ
ーンシロップ１％（ｗ／ｖ）およびクロラムフェニコー
ル１０ｇ／ｍｌを含むｐＨ４のＰ２最少塩類培地１０ｍ
ｌに移した。２５℃で２日間震盪した後、この濁った培
地を２０分間静置して、糸状体および凝集物を沈殿させ
た。「Ｐ２最少塩類」培地は、最終容積１リットル当た
り、２ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、１ｇの（ＮＨ₄）₂ＨＰ
Ｏ₄、０. ５ｇのＮａＣｌ、０. ０５ｇのＭｇＳＯ₄−
７Ｈ₂Ｏ、ＦｅＳＯ₄、ＭｎＳＯ₄、ＺｎＳＯ₄をそれ
ぞれ０. ０１ｇおよび脱イオン水を含んでいる。この培
地のｐＨを、６Ｎ塩酸でｐＨ４に調製して加圧滅菌し冷
却した。

【００１４】静置によって、上層の部分的に透明な、酵
母様細胞に富む層を得た。およそ１０ｍｌのこの層を、
ｐＨ５に調製したＰ２最少塩類培地、コーンシロップ１
％（ｗ／ｖ）およびクロラムフェニコール１０ｇ／ｍｌ
を含む寒天プレートに広げた。コーンシロップを１０−
５０ｇ／ｌ（乾燥重量／容積）加えた（コーンシロップ
は、既製品を利用できる。例えば、ＣＰＣノースアメリ
カ社製のコーン製品、商品名グローブ（Ｇｌｏｂｅ）１
６３２（固形分８２．５％、ボーメ度４３．２、ＤＥ値
６３−６６）；ＨｕｂｉｎｇｅｒｏｆＫｅｏｋｕｋ
社（アイオワ）製の固形分８１％、ボーメ度４３、ＤＥ
値６３を例示できる。寒天は１５ｇ／ｌ（固形寒天培
地）の濃度で含まれている。

【００１５】４日後独立したコロニーを再びプレーティ
ングして、純化し、イソプロピルアルコール沈殿多糖類
の分泌および培養の着色について震盪フラスコで調べ
た。各植物からの１分離物を、多糖類産生量および低着
色度を基に今後の研究のために選別した。分離株は、Ａ
Ｐの接頭文字で始まる数字で示し、表１にそれぞれが由
来した植物の場所と名称と共に挙げた。

【００１６】

【表１】

【００１７】以下の株は、特許出願手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、ＡＴＣ
Ｃ（アメリカンタイプカルチャーコレクション，１２３
０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、ＭＤ２０８５２、ＵＳＡ）に１９９１年９月３０
日に寄託され、同日に生育していることが確認された。ＡＴＣＣ番号ＡＰ１１オーレオバシデイウム・プルランス７４１００ＡＰ２４オーレオバシデイウム・プルランス７４１０１ＡＰ２７オーレオバシデイウム・プルランス７４１０２ＡＰ４１オーレオバシデイウム・プルランス７４１０３ＡＰ４２オーレオバシデイウム・プルランス７４１０４ＡＰ３０オーレオバシデイウム・プルランス７４１０５比較のために使用した以前の株は、表２に挙げたような
公的菌株保存機関から得た。

【００１８】

【表２】

【００１９】１）Ｋ．ＫａｔｏおよびＭ．Ｓｈｉｏｓ
ａｋａ：１９７５年１０月、プルランの製造方法、米国
特許第３９１２５９１号２）Ｂ．Ｊ．Ｃａｔｌｅｙ：１９７９年、Ａ．プルラ
ンスによるプルランの合成、６９−８４ページ、微生物
由来多糖類とポリサッカラーゼ（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰ
ｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄＰｏｌｙｓａ
ｃｃｈａｒａｓｅｓ）、Ｒ．Ｃ．Ｗ．Ｂｅｒｋｌｅｙ、
Ｇ．Ｗ．Ｇｏｏｄａｙ、Ｄ．Ｃ．Ｅｌｌｗｏｏｄ編、Ａ
ｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ刊、Ｌｏｎｄｏｎ３）Ｄ．Ｌ．Ｋａｐｌａｎ、Ｂ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、
Ｓ．Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ、Ｊ．Ｍａｙｅｒ、Ｓ．Ｓ
ｏｕｓａ：１９８７年、バイオポリマーの分子量分布の
制御：プルランとキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１４
９−１７３ページ、素材生物工学シンポジウム抄録（Ｍ
ａｔｅｒｉａｌｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｙ
ｍｐｏｓｉｕｍＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）、Ｄ．Ｌ．
Ｋａｐｌａｎ編、Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ、Ｎａｔｉｃｋ．４）Ｊ．Ｅ．Ｚａｊｉｃ、Ａ．ＬｅＤｕｙ：１９７３
年、プルラリア・プルランス産生多糖類の凝集性および
化学特性（Ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔａｎｄｃｈｅｍｉ
ｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｐｏｌｙｓ
ａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＰｕｌｌｕｌａｒｉａ
ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．２５：６２８−６３５頁５）Ｓ．Ｕｅｄａ、Ｋ．Ｆｕｊｉｔａ、Ｋ．Ｋｏｍａ
ｔｓｕ、Ｚ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ１９６３プルラリ
ア属の産生する多糖類Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１１：２１１−２１５頁６）Ｔ．Ｄ．Ｌｅａｔｈｅｒｓ１９８６年オーレ
オバシデイウム・プルランスの色素変異株は極めて高い
特異活性を有するキシラナーゼを過剰産生する。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５
２：１０２６−１０３０頁

【００２０】表１に挙げた株のうち、ＡＰ１１、ＡＰ２
６、ＡＰ２７、ＡＰ３０、ＡＰ３１、ＡＰ３２、ＡＰ３
３、ＡＰ３４、ＡＰ３５およびＡＰ３６は、天然分離株
であった。表１に挙げたすべての株は、例えばＰ２培地
（上述）またはＰ１培地のような最少塩類および糖を含
む寒天プレート上で培養したとき、外観は同様であっ
た。Ｐ１培地は、脱イオン水１ｌ当たり、２ｇの酵母エ
キス（Ｄｉｆｃｏ）、０. ５ｇの（ＮＨ₂）ＳＯ₄、１
ｇのＮａＣｌ、０. ２ｇのＭｇＳＯ₄、３ｇのＫ₂ＨＰ
Ｏ₄、並びにＦｅＳＯ₄、ＭｎＳＯ₄およびＺｎＳＯ₄
をそれぞれ０. ０１ｇと塩酸（ｐＨを６. ０とする）を
含んでいる。糖は、蔗糖またはコーンシロップのいずれ
かで、最終濃度が１−５％（乾燥重量ｇ／１００ｍｌ）
で、寒天は培地１リットル当たり１５ｇであった。３−
５日後、コロニーは光沢を有し、灰色がかった白色から
かすかに桃色で、様々な程度の糸状化を示した。株ＡＰ
３１、ＡＰ３２、ＡＰ３３、ＡＰ３４、ＡＰ３５および
ＡＰ３６は、低収量、濃い着色性およびＩＰＡ沈殿性多
糖類１ｇ当たりの低粘性ゆえに、その後の研究から除外
した。除外した株は、その時生育していた株：ＡＰ１
１、ＡＰ２４、ＡＰ２７およびＡＰ３０と比較した。特
にＡＰ３１は、濃厚着色化およびグラム当たりのより低
い粘性を示した。ＡＰ３２およびＡＰ３５は、共に低収
量およびグラム当たりの低粘性を示した。ＡＰ３３およ
びＡＰ３６は、共に低着色化およびグラム当たりの低粘
性を示した。ＡＰ３４は低着色化を示した。

【００２１】ＡＰ２およびＡＰ７を除いて、それ以前の
株（ＡＰ１−９）およびここに記載する新規な分離株
（ＡＰ１１−４２）のコロニーは、Ｐ１またはＰ２含有
寒天プレートに生育させたときは、一般的な外観は同様
であった。図１および２は、それまでの分離株ＡＰ１お
よびＡＰ２のそれぞれのコロニー形態を示す顕微鏡写真
である。図３、４、５、６および７は、それぞれ、本発
明の株ＡＰ１１、ＡＰ２７、ＡＰ３０、ＡＰ４１および
ＡＰ４２のコロニー形態を示す顕微鏡写真である。２８
℃で３日間培養後、コロニーの色は灰色がかった白色ま
たは明るいベージュ色から淡い桃色またはサーモンピン
クで、コロニーの直径は１から３ｍｍまでいろいろであ
った。隔膜を有する分枝糸状体は、各コロニーの中央か
ら光沢の有る隆起した半球形の酵母細胞ゾーンの端を越
えて伸びており、さらに寒天内にも伸びていた。糸状体
の密集状態および放射半径は、菌の間で異なっていた。
例えば、新規な株ＡＰ２７は、野生株の内で着色がもっ
とも少なく、さらに糸状体形成も最も少なかった。コロ
ニーは、およそ１０日間またはプレートが乾燥するまで
拡張し続けた。２８℃でおよそ４日間増殖後、糸状体の
あるものは、時間の経過とともに黒色化するようにみえ
る、オリーブ色の色素を蓄積し始めた。室内蛍光灯で点
灯−消灯のサイクルに曝すと、着色が同心円として発達
した。株ＡＰ２およびＡＰ７は、非常に濃く着色した。
最終的にすべての株の糸状体ゾーンには、少なくともい
くらかの黒っぽい色素が蓄積し、時には区域化されてい
るようであった。新規な株は、ＡＰ９（Ｙ１２９７４）
とほとんど同じであった。これは、フロリダシーグラス
（Ｆｌｏｒｉｄａｓｅａｇｒａｓｓ）から分離され
た（Ｔ．Ｔ．Ｌｅａｔｈｅｒｓ、１９８６年オーレオ
バシデイウム・プルランスの色変異株は非常に高い特異
活性を有するキシラナーゼを産生する。：Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１０２６−
１０３０頁）。ＡＰ２７は、色素を産生しないように見
え、専ら酵母形で増殖した。しかし、株ＡＰ１１は、Ａ
Ｐ２７と同じ植物から分離されたが、より多くの色素を
産生した。

【００２２】Ａ．プルランスは、寒天プレートまたは深
部液内培養では多形性であるので、補助器具のない観察
では、この菌類の積極的同定は困難である。新規分離株
の顕微鏡観察により、それ以前の株に見られた細胞と同
じ三つの支配的なタイプが明らかとなった。すなわち、
発芽酵母様細胞、枝分かれ糸状体および酵母形のおよそ
二倍の大きさの着色細胞である厚膜胞子である。深部液
内培養では、新規分離株は、株ＡＰ１、ＡＰ３、ＡＰ
４、ＡＰ５およびＡＰ９と同じようであったが、着色度
のより高い株ＡＰ２およびＡＰ７とは異なっていた。後
者では、培養液は黒くなり、イソプロピルアルコール
（ＩＰＡ）での沈殿後プルランは黒っぽいオリーブ色で
あった。より着色度の少ない培養は、黄色、オリーブグ
レーおよびその組み合わせの種々の濃淡の色合いを示
し、灰色がかった白色のプルランを生じた。ある株に対
して、その濃淡および色は、培養条件（窒素源およびそ
の濃度、炭素源およびその濃度、燐酸塩濃度、開始ｐ
Ｈ、曝気、接種源およびその量、微量無機物並びに温
度）に基づいて変化させることができる。これらの指標
は容易に変更でき、特定の株について得られる色および
濃淡を最少にできる。以下の実施例では、意義のある色
の比較を行うために、これらの可変指標を一定にした。
分離株ＡＰ２７は、培養液中に最少の色素を産生し、Ｉ
ＰＡ沈殿プルランは白色であった。

【００２３】野生株のいくつかを臭化エチジウムで処理
した。詳細には、株ＡＰ２４は、株ＡＰ１−９と比べて
よりコロニーの着色度が少なくみえる野生分離株、株Ａ
Ｐ１１から得られた。株ＡＰ１１を、５％（ｗ／ｖ）蔗
糖含有Ｐ１培地１０ｍｌに、およそ４−５×１０⁶の密
集度で増殖させた。臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍｌの
濃度で２５％エタノール水（ｖ／ｖ）に溶解したものの
３０μｌ）を加え、およそ２５℃で３−４時間振盪を続
けた。この間に細胞数は３倍になった。処理細胞を遠心
沈殿（５０００×ｇ、５分）し、脱イオン水で洗浄、再
び遠心沈殿し、蔗糖を１５％（ｖ／ｖ）のグリセロール
に置き換え、さらに酵母エキスと（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を
含まないＰ１培地の３０ｍｌに懸濁させた。この細胞を
４℃で４日間置き、それから選択培地に撒いた。処理細
胞のサンプルを同じ溶液でおよそ１０⁴に希釈し、酵母
エキスの代わりに０. ２％（ｗ／ｖ）のファルマメディ
ア（Ｐｈａｒａｍｅｄｉａ、綿実エキス、Ｔｒａｄｅ
ｒ’ｓＣｏ．社製）、さらに０. ０２５％（ｗ／ｖ）
の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄と０. ２％（ｗ／ｖ）のグルコー
スを加え、ｐＨを７としたＰ１培地を含む寒天プレート
に撒いた。ファルマメディアの含有により色素形成が増
進する。３−６日後に、いくつかの形態学的に異なるコ
ロニーをプレートから拾い、再び画線接種して純化し
た。変異形質は、異なる着色度を有するコロニーの他
に、より多くの糸状体を有するものおよびより多くの酵
母様細胞を有するものを含んでいた。株ＡＰ２４は、酵
母様細胞を主に有し、さらに色素が少ない変異株とし
て、その後の研究のために選んだ。

【００２４】上記の方法を変形したものを株ＡＰ４２を
分離するために用いた。株ＡＰ３０を上記のように臭化
エチジウムで処理した。それから処理細胞を、シルバニ
ア８ワット殺菌灯（Ｇ８Ｔ５）から１０ｃｍの距離で１
５秒間、低照射量の紫外線に曝した。この照射量は、２
０％以上５０％以下のＡ．プルランスの生存率をもたら
す。処理細胞を、酵母エキスに代わる０. ５％（ｗ／
ｖ）ファルマメディアおよび１％蔗糖を含有し、ｐＨ７
としたＰ１培地を含む寒天プレート上に撒いた。２５℃
で３−５日培養後に、より色素の少ないコロニーを拾
い、再び画線接種して純化した。

【００２５】１２５ｍｌの邪魔板付きエルレンマイヤー
フラスコ中の１５ｍｌの５％コーンシロップ含有Ｐ２液
体培地に純化７株を接種した。これら７株のうち、２株
は２５℃で４日間振盪培養後、無着色のままであった。
フラスコを倒立させて培養が流れる速度を観察して判定
するならば、２株のうちＡＰ４２が最も粘性が高かっ
た。株ＡＰ４１は、まず株ＡＰ２４を１％（ｗ／ｖ）蔗
糖含有Ｐ２培地で、およそ１０⁸細胞／ｍｌの後期増殖
期まで増殖させて誘導した。この細胞を遠心沈殿し、さ
らにＰ２最少塩類液（窒素源を含み、炭素源を含まず）
に再浮遊させることによって二度洗浄した。およそ１０
⁵の細胞を、窒素を含まず２. ５％（ｗ／ｖ）蔗糖を含
むＰ２最少塩類寒天プレートに撒いた。このプレート
を、シルバニア８ワット殺菌灯（Ｇ８Ｔ５）の紫外線に
１０ｃｍの距離から９０秒間曝し、２５℃で１８時間暗
所に置いた。このプレートに硫酸アンモニウムを最終濃
度０.１％（ｗ／ｖ）に加え、さらに４０時間培養を続
けた。このプレートの表面に酵母エクストラクト０. ２
％（ｗ／ｖ）を含む５ｍｌの１．５％（ｗ／ｖ）の寒天
を上塗りし、０. １％（ｗ／ｖ）カザミノ酸が加えられ
た。数日後Ａ．プルランスのコロニーが、数個生じた。
そのうちの一つ、株ＡＰ４１は、親株ＡＰ２４と比べて
非着色性で、さらに外観がより酵母様コロニー的であっ
たので、これを保存した。

【００２６】このようにして得た株を、それらの制限酵
素処理ＤＮＡパターンについて調べた。またこれらの株
のプルラン産生について調べ、さらに得られたプルラン
を粘性との相関性によって分子量について、また多糖類
組成について分析した。

【００２７】また、本発明者らは、比較的高収量の高分
子量のプルランを提供するＡ．プルランスの新規な培養
方法を発見した。本発明の培養方法に従えば、およそ４
×１０⁶以上の分子量のプルランを得ることができる。
特に、本発明者らは、Ａ．プルランスの深部培養中に通
常みられる、発酵培地中に蓄積されたプルランの分子量
減少を避けるための方法を発見した。特に、本発明の方
法により、１×１０⁶、２×１０⁶、４×１０⁶、時に
は６×１０⁶のプルランを得ることができる。また、本
発明の方法によって、分子量９×１０⁶ものプルランを
得ることが可能である。さらに、本発明の株を用いるこ
とによって、実質的に非着色性の高分子量プルランを得
ることができる。本明細書で用いられているように、
「実質的に非着色性のプルラン」とは、発酵培地から採
取されたとき、その後の利用のために脱色処理を必要と
しないプルランを意味する。脱離処理とは、簡単な洗浄
は含まない。

【００２８】当該方法の第一は、正常なｐＨ低下が安定
する発酵段階で、発酵培地のｐＨを、中性に調節するこ
とから成る。本発明を実施するとき、発酵は、当該技術
分野において既知の通常の方法で開始される。本発明者
らは、初めの立ち上がり期間後典型的にはおよそ２４−
３６時間後、培地のｐＨは、およそ３. ５−４. ０で安
定し、培地のｐＨはこの数値のまま発酵が進行すること
を知った。本発明の方法では、ｐＨがこの値で安定した
後、適切な塩基でｐＨを中性に調整する。適切な塩基に
は、ｐＨを中性値に調整するために有効で、さらに培養
または生成物に悪影響を与えない一切の塩基化合物が含
まれる。例えば、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウ
ム水溶液等を用いることができる。ｐＨを調整後、発酵
は通常の方法で終了まで行われる。しかし、通常の粘性
減少およびそれに伴う生成物の分子量減少は認められな
かった。したがって、この本発明の方法を用いれば、生
成プルランを採取するとき、この生成物の分子量は、ｐ
Ｈ調整操作が行われない場合よりも実質的に高くなる。
ｐＨ調整の特定の時期は、用いられる当該発酵条件によ
り変化するが、慣用的な方法で容易に求めることができ
る。本発明者らは、このｐＨが正常な値（すなわち３.
５−４. ０）で安定した後できるだけ早くｐＨ調整を実
施することが最良であることを見いだした。しかし、ｐ
Ｈ調整は発酵が進行している別の時期に行うこともでき
る。例えば、培地粘性をモニターし、生成物の分子量
（培地粘性により示唆される）が所望の値になる時に調
整を行うことができる。同様に、生成物サンプルを採取
し、生成物の分子サイズの迅速な表示のためにそのサイ
ズを求めることができる。

【００２９】発酵中に認められる分子量減少を避けるた
めの新規な方法の第二は、蓄積されたプルランを高温で
の処理に付すことである。発酵培地は、酵素、アルファ
アミラーゼを含むが、これはプルランを構成するサブユ
ニットの分割をもたらすことが知られている（Ｔ．Ｄ．
Ｌｅａｔｈｅｒｓ、１９８７年、宿主アミラーゼとプル
ラン産生、素材生物工学シンポジウム抄録、Ｄ．Ｌ．Ｋ
ａｐｌａｎ編、ＵＳＡｒｍｙ、ＮａｔｉｃｋＲｅｓｅ
ａｒｃｈ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＥｎｇｉｎ
ｅｒｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒ、１７５−１８５頁；Ｇ．
Ｃａｒｏｌａｎ、Ｇ．Ｊ．Ｂａｔｌｅｙ、Ｆ．Ｊ．Ｍｃ
Ｄｏｕｇａｌ１９８３年プルランの四糖類単位の所
在、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ１１
４：２３７−２４３頁参照）。これは、発酵培地に蓄積
し、高分子量プルランを獲得する能力を制限するように
働くので、結果としてプルランの分子量減少をもたら
す。しかし、本発明者らは、蓄積高分子量プルランは、
発酵進行中に採取でき、この発酵培地を外から熱処理で
きることを見いだした。この熱処理は、分離されたプル
ランに付着している酵素を不活化するために働き、した
がって、高分子量生成物の保存に役立つ。この熱処理は
微生物を死滅させ、発酵の停止を招くことになるので、
培地中のプルランには利用できないことは理解できよ
う。

【００３０】用いられる温度は、十分に高温でなければ
ならず、さらに加熱時間は、この酵素を不活化するに十
分長くなければならない。これらのパラメーターは、用
いられる特定の培養方法、すなわち、菌株、培地等に依
存する。しかし、それは簡単なスクリーニングにより容
易に求めることができる。本発明者らは、一般には、温
度はおよそ７０−１２０℃、好ましくは、およそ８０−
１００℃の範囲に有り、処理時間はおよそ３０−１５０
分、好ましくはおよそ３０−６０分が適切であることを
見いだした。熱不活化は、生成物収量および品質に関し
て（例えば分子量および着色）、発酵が終了したと判断
されるとき、または炭素源が枯渇したときに実施され
る。

【００３１】

【実施例】以下の実施例は本発明の株の分析、それらか
ら得られる生成プルランおよび本発明の方法を記述する
ものである。実施例１本発明株のＤＮＡ制限酵素パターン細胞を、１％（ｗ／ｖ）蔗糖含有Ｐ２培地で増殖中期ま
で一晩培養し、遠心沈殿（５０００×ｇ、５分）で濃縮
し、さらに１０⁹細胞／ｍｌの濃度で、１Ｍのソルビト
ール、２５ｍＭのＥＤＴＡおよび２５ｍＭのジチオスレ
イトール（ｐＨ７. ０）中に再浮遊させた。二度目の遠
心沈殿の後、２. ５×１０⁸の細胞を３７℃で１５分
間、１Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＥＤＴＡおよび
２. ５ｍｇの溶解酵素（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａ
ｒｚｉａｎｕｍから調製、Ｓｉｇｍａ）を含む溶液の
０.５ｍｌに再浮遊させてプロトプラストを調製した。
三度目の遠心沈殿の後、１％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸
ナトリウムを含む、０. ７５ｍｌの１０×ＴＥ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）
にプロトプラストを再浮遊させて溶解し、その後直ちに
０. ５ｍｌのフェノール：クロロホルム（１：１、水で
飽和）と混合し、核溶解による変成を抑えた。２分間１
００００×ｇでこの乳濁液を遠心沈殿後、粘稠な上層を
１容のエタノールで４℃で沈殿させ、２５℃、１０００
０×ｇで１０分間遠心沈殿した。沈殿物を１００ｍｇの
リボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む０. ５ｍｌの
１×ＴＥに２５℃で１５分間再浮遊させ、その後フェノ
ール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿、最後
に０. １１ｍｌの１×ＴＥに再浮遊させた。このＤＮＡ
は、ゲル電気泳動で認められるように高分子であった。
ＤＮＡサンプルを、ＥｃｏＲＩ（Ｓｉｇｍａ）で５０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭの
ＮａＣｌおよび０. １ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン
（Ｓｉｇｍａ）中で（ｐＨ８）完全に消化した。トリス
アセテート緩衝液を用いて１％（ｗ／ｖ）アガロースゲ
ルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した（Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ１９８２年分子クローニング：実験室操作法、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）。

【００３２】本発明者らは、肉眼による識別を確立し、
図８および９に示したようにＤＮＡの反復配列から生じ
る制限酵素断片のパターンに従い、新規なＡ．プルラン
ス分離株をそれまでの株から識別した。サッカロマイセ
ス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）については、サッカロマイセスセレビ
シエのＤＮＡ（Ｐ．Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ、Ａ．Ｓｔｏ
ｔｚ、Ｃ．Ｓｃｈｅｒｆ、１９９１年、１６９−１８２
頁、Ｃ．Ｇｕｔｈｒｉｅ、Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ編、Ｇｕｉ
ｄｅｔｏｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ刊、ＳａｎＤｉｅｇｏ）を参照すること
ができる。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）および他の真核
生物については、反復ＤＮＡの比較的濃いバンドが、淡
い特異的制限酵素断片のバックグラウンドの上に明瞭に
見える（Ｂ．Ｂ．Ｍａｇｅｅ、Ｔ．Ｍ．Ｄ’Ｓｏｕｚ
ａ、Ｐ．Ｔ．Ｍａｇｅｅ、１９８７年、カンジダ種リボ
ソームＤＮＡ反復配列の制限酵素断片の長さの多様性に
よる株および種の同定、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６
９：１６３９−１６４３頁．Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ、
Ｄ．Ｓ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、１９８７、カンジダ種の疫学
および分類学へのＤＮＡタイピング法の応用、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：６７５−６７９
頁）。図８のレーンａおよびｋは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼ処理ファージラムダＤＮＡであり、
レーンｂからではＡ、プルランスＤＮＡのＥｃｏＲＩエ
ンドヌクレアーゼ処理サンプルである。レーンｂは株Ａ
Ｐ１であり、ｃはＡＰ２、ｄはＡＰ３、ｅはＡＰ４、ｆ
はＡＰ７、ｇはＡＰ９、ｈはＡＰ１１で、ｉはＡＰ３
０、そしてｊはサッカロマイセス・セレビシエである。
図９では、レーンａは株ＡＰ１であり、ｂはＡＰ１１、
ｃはＡＰ２４、ｄはＡＰ３０、ｅはＡＰ３１、ｆはＡＰ
３３、ｇはＡＰ３４、ｈはＡＰ３５、ｉＡＰ３２、ｊは
ＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼ処理ファージラムダ
ＤＮＡである。レーンａからｉのサンプルは、ＥｃｏＲ
Ｉエンドヌクレアーゼで処理されている。

【００３３】サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断により生
じた５本のバンドは、目立っており、予想したリボーム
ＤＮＡの２. ７９、２. ４６、２. ０２、０. ６６およ
び０. ５９ｋｂの切断片に対応した（図８、レーン
ｊ）。別の予想した０. ３５および０. ２２ｋｂのバン
ドは、ゲルの底に流れ出た。図８では、それまでの株Ａ
Ｐ１，ＡＰ２，ＡＰ３，ＡＰ４，ＡＰ７，ＡＰ９と本発
明者らの新規な株ＡＰ１１および３０とを比較した。バ
ンドの大半は、相対的に同じ位置にあるようにみえ、す
べての株はおそらく近縁であることを示していた。しか
しながら、数本のバンドは特異的であった。ＡＰ１のバ
ンドパターンはＡＰ４に類似しており、株ＡＰ２はＡＰ
７に類似しており、ＡＰ１１はＡＰ３０に類似してい
た。同様に、図９で、他の新規な株をＡＰ１１およびＡ
Ｐ３０と比較した。二つのパターンが明らかであった。
一つは株ＡＰ１１、２４、３０、３３、３４、３５およ
び３６に見られ、別のパターンは株ＡＰ３１、ＡＰ３２
のものであった。これら二つのグループのメンバーは、
物質的に近縁であることが明らかとなった。株ＡＰ３１
とＡＰ３２は、ＡＰ３０からおよそ４０フィートしか離
れていない別の植物種から分離されていた。

【００３４】実施例２プルラン収量、その固有粘性お
よび組成寒天プレート上の増殖各株について、細胞のサンプルを−７０℃のフリーザー
から出し、「Ｐ１ｓ」寒天プレート上に撒いた。「Ｐ１
ｓ」は、最終容積１リットル当たり、１５ｇのデイフコ
（Ｄｉｆｃｏ）寒天、２ｇのデイフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵
母エキストラクト、３ｇのＫ₂ＨＰＯ₄、０. ５ｇの
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１ｇのＮａＣｌ、０. ２ｇのＭｇ
ＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ並びに０. ０１ｇのＦｅＳＯ₄、Ｍｎ
ＳＯ₄およびＺｎＳＯ₄を含んでいた。この培地はＨＣ
ｌでｐＨ６. ０に調整してオートクレーブし、およそ５
０℃に冷ました。最後に蔗糖（別にオートクレーブして
ある）を１０ｇ／ｌの濃度で添加した。プレートは、室
温（およそ２２−２４℃）で２−４日間培養した。液体培地での増殖株ＡＰ１およびＡＰ２４の単一コロニーまたは１ループ
分の細胞を「Ｐ２ｃ」液体培地の３０ｍｌに加えた。こ
の培地は、最終容積１リットル当たり、２ｇのＫ₂ＨＰ
Ｏ₄、１ｇの（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄、０. ５ｇのＮａＣ
ｌ、０. ０５ｇのＭｇＳＯ₄−７Ｈ₂Ｏ並びに０. ０１
ｇのＦｅＳＯ₄、ＭｎＳＯ₄およびＺｎＳＯ₄を含み、
６ＮのＨＣｌでｐＨ７. ０に調整し、その後オートクレ
ーブして冷ました。最後にコーンシロップを５０ｇ／ｌ
（乾燥重量／容積）に加えた。株ＡＰ２４を用いた予備
テストでは、蔗糖の代わりにコーンシロップを使用した
とき、多糖類の収量はより高かった。株ＡＰ３０につい
ては、蔗糖をコーンシロップに置き換えた点を除いて、
上記の培地を用いた。予備テストでは、コーンシロップ
の代わりに蔗糖を用いたとき、株ＡＰ３０が産生する多
糖類の分子サイズはより大きかった。濃度がおよそ１−
５×１０⁷細胞／ｍｌになるまで、この培養体を、およ
そ２３−２７℃で２０−３０時間振盪した。細胞濃度を
顕微鏡下で求め、４×１０⁸の細胞を、３枚の邪魔板付
き１０００ｍｌ容量のエルレンマイヤー振盪フラスコ中
の４００ｍｌの培地に接種用として用いた。これらの培
養体を２３−２７℃で６４時間、３／４インチの水平回
転半径を有するラブリン（Ｌａｂｌｉｎｅ）シェーカー
で２００ｒｐｍで振盪した。

【００３５】多糖類の分離三つの培養体の各々を、等容量の脱イオン水で希釈し、
その後８０００×ｇで８分間、細胞を取り除くために遠
心沈殿した。上清を新しい管に移し、もう一度遠心沈殿
した。遠心沈殿した培養を、各々およそ４０ｇずつに小
分けした（サンプルは再水和を促進させるために小分け
して処理した。）。二度遠心沈殿した上清中の細胞外多
糖類を、室温で１容のイソプロピルアルコール（ＩＰ
Ａ）で沈殿させた。この凝塊多糖類を圧縮して、ＩＰＡ
の大部分を取り除き、その後、重量が一定となるまで８
０℃でおよそ１６時間オーブンで乾燥させて残余分を除
去した。株ＡＰ１およびＡＰ３０からの乾燥凝塊は淡褐
色で、ＡＰ２４からのそれは白色であった。沈殿物は室
温で使用まで保存した。各サンプルにつき五つの乾燥凝
塊の重量を測定して、各培養の多糖類の収量を求めた。
物理的および化学的分析のために、乾燥し重量を測定し
た多糖類のサンプルを、０. ０１％（ｗ／ｖ）のアジ化
ナトリウムを含む脱イオン水に、撹拌しながら最終濃度
１. ０ｇ／１００ｍｌの濃度に室温で溶解した。また、
林原製の市販プルラン（ＰＦ−１０、ロット番号９０２
０１およびＰＦ−２０、ロット番号９０５１７）のサン
プルも８０℃で２時間乾燥し、その後アジ化ナトリウム
（０. ０１％）と共に５. ０ｇ／ｍｌの濃度で溶解し
た。表３は、新規株の細胞外多糖類の収量は、それまで
のＡＰ１のそれと同じであることを示している。

【００３６】

【表３】

【００３７】分子サイズの決定ブルックフィールドＤＶ−１１粘度計上のＵＬアダプタ
ー（低粘性溶液のために）を用いて、種々の剪断率で各
サンプルのいろいろな希釈について、センチポイズ（ｃ
ｐ）単位による粘性を測定した。剪断率１秒^-1での粘性
（η）を、直線的減衰を用いてデータの数学的「最適制
御（ｂｅｓｔｆｉｔ）」から決定した。この粘性値
は、また相対粘性（η_R）としても利用された。ここで
η_R＝η／η₀、ここでＨ₂ Ｏについて、η₀＝１であ
る。Ｃの関数としてＣ^-1ｌｎη_Rのグラフを、ｇ／ｄｌ
として表わしたＣを用いて調製した。この直線に数学的
に「最適制御」されるものから、その固有粘性［η］を
ｙ切片として選んだ。平均分子量サイズ（Ｍ_W）は、等
式、［η］＝（０. ０００２５８）Ｍ_W０. ６４６から
計算した（Ｇ．Ｓ．Ｂｕｌｉｇａ、Ｄ．Ａ．Ｂｒａｎ
ｔ、１９８７年、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕ
ｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ、９：７１−７６頁）。下の表４は、
新規株はそれまでの株ＡＰ１よりも高い分子量の細胞外
多糖類を蓄積することを示している。

【００３８】

【表４】

【００３９】固有粘性および分子量との関係さらに、対応する分子サイズを小角レーザー光散乱によ
り決定した。図１０は、固有粘性の対数対７０００から
２×１０⁶のサイズのＭ_Wの対数の図表で、発明者らの
データー（白抜き三角）並びにバリガ（Ｂｕｌｉｇａ）
およびブラント（Ｂｒａｎｔ）（白抜き四角）（Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．９：７１−７６
頁、１９８７年）およびカトウら（Ｋａｔｏ）（白抜き
円）（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２１：１６２３−１６
３３頁、１９８３年）の刊行物に記載された結果が示さ
れている。刊行物に記載されたカトウの結果は二つの直
線関係を示している。低分子量プルランは、等式［η］
＝０. １３３Ｍ_W ^0.5（ｍｌ／ｇ）に従い、一方大きな
分子量プルランは、等式［η］＝１. ９１×１０^-2Ｍ_W
^0.67（ｍｌ／ｇ）に従う。ブラントの関係は、［η］＝
２. ５８×１０^-2Ｍ_W ^0.646（ｍｌ／ｇ）である。肉眼
的な検査で描いた曲線は、等式［η｝＝０. １２Ｍ^0.5
＋０. ００００８Ｍを与える。また、粘性は、株ＡＰ
１、ＡＰ２４、ＡＰ３０および林原製市販プルラン（Ｐ
Ｆ−２０、ロット００２２８）についてより高い多糖類
濃度の範囲にわたって決定された。粘性はブルックフィ
ールド粘度計で、２０℃剪断率６. ５／秒で測定した。
結果は表５に記載されているが、新規な株は、これまで
の株ＡＰ１より高い分子量をもつ細胞外多糖類成分を蓄
積することを示している。

【００４０】

【表５】

【００４１】その他の分子量分析各株について少量の細胞サンプルを−７０℃のフリーザ
ーから取り出し、Ｐ１寒天プレート（１％蔗糖）に撒
き、２８℃で５日間培養した。１「ループ分」の細胞を
２. ５ｍｌのＰ２液体培地（５％蔗糖）に加え、一晩振
盪して種培養体を調製した。等しい細胞数でおよそ０.
２ｍｌのサンプル細胞を、１５ｍｌのＰ２培地（５％蔗
糖）を含む各複製フラスコに加え、２５℃で６６時間振
盪した。各サンプルを１容の脱イオン水で希釈し、遠心
沈殿して、清澄化した培地からＩＰＡで沈殿させて多糖
類を回収した。このサンプルを圧して液体を吸い取り、
過剰な液体を取り除いた。３０ｍｌの脱イオン水に再び
溶解し、その後さらに溶解を速めるために１００℃１時
間オーブンに置いた。図１１のマトリックスによって示
されるように、株ＡＰ２、ＡＰ１１、ＡＰ２７およびＡ
Ｐ３０の培養からのプルランサンプルについての固有の
粘性は、その他のプルランサンプルより非常に大きかっ
た。図１１では、文字は以下のように株を表している：
ＡはＡＰ１；ＢはＡＰ９；ＣはＡＰ４；ＤはＡＰ２；Ｅ
はＡＰ３１；ＦはＡＰ３２；ＧはＡＰ１１；ＨはＡＰ２
６；ＩはＡＰ２７；ＪはＡＰ３０；ＫはＡＰ３３；Ｌは
ＡＰ３４；ＭはＡＰ３５；ＮはＡＰ３６。

【００４２】プルラナーゼに対する感受性または抵抗性再び水和させた多糖類の各サンプルを、処理前および後
に重量を測定することによって、酵素プルラナーゼ［エ
ンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）由来Ｅ．Ｃ．３．２．１．
４１］に対する感受性または抵抗性について分析した。
各株について六つの同様な１％（ｗ／ｖ）の３. ０ｇの
サンプルを調製し、以下のものを加えた：０. ６ｍｌの
Ｈ2 Ｏ、０. ９ｍｌの０. ５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５. ２）および６０μｌの３. ２Ｍ（ＮＨ₄）₂
ＳＯ₄（ｐＨ６. ２）緩衝液、場合によって１. ６単位
のプルラナーゼ（１単位は、ｐＨ５. ０、２５℃でプル
ランから１分間に１. ０μｍｏｌのマルトトリオースを
遊離させる）。酵素反応は４５℃で３時間行った。各サ
ンプルにつき０. ５６ｍｌを、この後で述べる薄層クロ
マトグラフィーのために−２０℃で保存した。残りの４
ｍｌを１容のＩＰＡで沈殿させ、その後５０００×ｇで
５分遠心沈殿した。未処理コントロールについては、沈
殿物を乾燥し重量を測定した。酵素処理サンプルについ
ては、非常に少量の沈殿物を、サンプル当たり０. ５ｍ
ｌに溶かした（殆ど瞬間的に溶解した）。その後３本を
１組としたサンプルを一つに集めた。一つに集めた各サ
ンプルを５０００×ｇで５分遠心沈殿して、不溶の細胞
破片を取り除いた。上清を、再び１容のＩＰＡで沈殿さ
せて、酵素処理後の残存多糖類の量を求めた（ＡＰ３０
のサンプルについては、細胞破片の量が非常に多く、プ
ルラナーゼ耐性の計算前にＩＰＡ沈殿物から差し引く必
要があった。）。プルラナーゼ耐性成分の割合は、酵素
処理後の多糖類の重量を、酵素未処理の多糖類の重量で
割ったものである。表６は、新規株によって産生される
細胞外多糖類は、少なくとも９８％プルラナーゼ感受性
であることを示している。

【００４３】

【表６】

【００４４】マルトトリオースのクロマトグラフィーに
よる検出マルトトリオースの存在を定性的に示すために、プルラ
ナーゼの分解産物を薄層クロマトグラフィーで分離し
た。薄層クロマトグラフィープレートは、Ｅ．Ｍｅｒｃ
ｋ社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）のＡｒｔ．１３１４５Ｋ
ｉｅｓｅｌｇｅｌ６０ＣＦ２４５（プリカットチャンネ
ル付き１０×２０ｃｍ）であった。それらを使用直前
に、０. ５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄および２５％（ｖ／ｖ）
メタノールの混合物に静かに一晩浸した後、風乾し、１
００℃で６０分焼いた。最後に、サンプルを塗布する前
に室温まで冷ました。以前に凍結しておいたサンプルを
融解した。片手式ヘァードライヤーからの熱風を送りな
がら、１μｌの毛細管ピペットで直接１μｌのサンプル
をＴＬＣプレートに加えた。サンプルの側にグルコー
ス、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラ
オースの既知混合物を加えた。ランニングバッファー
は、２０ｍｌのＩＰＡ、２０ｍｌのアセトン、９.９１
ｍｌのＨ2 Ｏおよび０. ０９ｍｌの８５％乳酸溶液であ
った（１１Ｍである、８５％ストック溶液を基にする
と、これは、最終濃度０. １Ｍの乳酸を与える。）。ク
ロマトグラフィーは、密閉ガラス容器中でおよそ４時間
行われた。その後ＴＬＣプレートを風乾し、以下のよう
に調製した染色液を吹き付けた：８０ｍｇのナフトレゾ
ルシンを、０. ８ｍｌの濃硫酸を含む４０ｍｌエタノー
ルに加え、暗所に保存。燐酸塩処理および乳酸濃度は、
グルコースのオリゴ糖の最適分離にとり重要であった
（Ｓ．Ａ．Ｈａｎｓｅｎ、１９７５年、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１０７：２２
４−２２６頁）。クロマトグラムは、新規な株により蓄
積される細胞外多糖類は、プルランについて予想された
ように、プルラナーゼ酵素によりマルトースサブユニッ
トに分解されることを示した。

【００４５】多糖類の構造のＮＭＲ分析¹ Ｈ−ＮＭＲおよび¹³Ｃ−ＮＭＲは、株ＡＰ２４および
３０から調製した多糖類は、株ＡＰ１並びに市販サンプ
ルＰＦ−１０およびＰＦ−２０からのそれと同じ構造を
有することを示した。

【００４６】酸加水分解産物の液体クロマトグラフィー溶解多糖類サンプルの各々を、１３０℃、３時間６％Ｈ
₂ＳＯ₄で加水分解し、単糖類を生じた。不溶物を取り
除くために遠心沈殿した後、サンプルを液体クロマトグ
ラフィーで分離した。ピーク領域から計算して、グルコ
ースとしての分画は、ＡＰ１について８８％、ＡＰ２４
について８１％、ＡＰ３０について９０％およびＰＦ−
２０について９３％であった。

【００４７】酸性多糖類の測定各株について１％（ｗ／ｖ）液３ｇの３サンプルを、
０. １Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）に再浮遊させた１
％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニ
ウム）の等容量と共に室温で１時間培養した。それから
サンプルを室温で５０００×ｇ、５分間遠心沈殿し、酸
性多糖類沈殿物を沈降させた。沈殿物を乾燥させ、重量
を測定した。遠心上清を１容のＩＰＡで沈殿させ、乾燥
させ、重量を測定して、酸性多糖類の割合を計算した。
表７は、サンプルの混入酸性多糖類は２％以下であるこ
とを示している。

【００４８】

【表７】

【００４９】実施例３本発明の株のプルラン産生Ａ．高分子量プルランの産生およそ６×１０⁶から９×１０⁶の間の分子量をもつプ
ルランが、以下の方法を用いて得られた：発酵は、培地
としてＰ２を用い、５リットルの発酵槽で行い、最初の
蔗糖濃度は５０ｇ／ｌであった。発酵温度は２７℃であ
った。発酵は４８時間で終了させた。発酵の初めの２４
時間、培地を３００ｒｐｍで撹拌し、後の２４時間は、
培地を６００ｒｐｍで撹拌した。発酵層内に１. ０容の
空気／分の速度で通気した。初めのｐＨは、６. ８から
７. ０であった。発酵と同じ培地による前培養の二つの
培養体を本培養の接種に用いた。この接種分にはおよそ
０. ６ｇ／ｌの細胞が含まれていた。発酵培地のｐＨ
は、発酵中自然に減少するに任せた。発酵開始後およそ
１２から１８時間以内に、培地のｐＨは安定し、発酵終
了まで実質的に同じ値を維持した。プルラン収量は、ま
ず初めに細胞を除去し、それからイソプロピルアルコー
ルにより清澄培地中の多糖類を沈殿させて、その後乾燥
させ、重量を量ることによって求めた。固有粘性［η］
は、ウベローデ粘度計を用いて測定し、分子量は下記の
等式により計算した。Ｍ_W＝（［η］／０. ０００２５８）ｅｘｐ1.548 特定の株についての発酵のパラメーターおよびそれらか
ら得られた結果は、分子量を含めて表８に述べる。

【００５０】

【表８】

【００５１】Ｂ．培地ｐＨ調整によるプルラン分子量の
安定化株ＡＰ１およびＡＰ３０を別々に、邪魔板付きエルレン
マイヤーフラスコで２５℃で振盪培養した。各々の培地
は、コーンシロップを５％（ｗ／ｖ）添加Ｐ２塩類培地
（ｐＨ７）であった。３６、４８、６０および７２時間
の発酵後、２５ｍｌのサンプルを各培養から取り出し、
新しいフラスコに移し、ＮａＯＨでｐＨを７. ０に調整
した。取り出したサンプルの培養を続け、最後のサンプ
ルを７２時間で集めるまで、１２時間毎に同じようにｐ
Ｈを調整した。生成物の固有粘性を以下の表に示した。
培養の前または終わりにｐＨを７. ０に移すことによ
り、固有粘性が増大した。Ａ．プルランス培養中に、ｐ
Ｈは、徐々におよそ３−４に低下する。したがって、こ
れらの結果は、ｐＨを中性に調整することは、大きな分
子量のプルランを蓄積させることを示している。

【００５２】

【表９】

【００５３】Ｃ．Ａ．プルランスのプルラン分解酵素活
性の熱による不活化実験１Ａ．プルランスの液体培養を、０. ５％コーンシロップ
を含むＰ２最少塩類培地で、振盪させながら２８℃で４
日間増殖させた。１００００ｘｇで１０分間遠心沈殿し
て細胞を除去した。酵素を含む上清を二つに分けた。片
方にリン酸ナトリウムを加え、最終濃度０. １Ｍ、ｐＨ
７. ０とし、他方に酢酸ナトリウムを加え、最終濃度
０. １Ｍ、ｐＨ３. ７とした。その後、各調製物を、沸
騰水槽中でいろいろな時間加熱した。１０分間冷却後、
５ｍｌの熱処理酵素を、１％（ｗ／ｖ）高分子量プルラ
ンの１５ｍｌと混合した。種々の時間に、６ｒｐｍでＵ
Ｌスピンドルを用いてブルックフィールドＬＶＴＤＶ−
ＩＩ粘度計で、サンプルの粘性を調べた。

【００５４】

【表１０】

【００５５】実験２０. ５％（ｗ／ｖ）コーンシロップ含有Ｐ２培地で９６
時間、株ＡＰ３０を増殖させて、酵素含有抽出物を調製
した。１００００×ｇ５分間遠心沈殿して細胞を除去
し、その後上清をいくつかに分け−７０℃で凍結した。
１サンプルを氷上で融解し、それから種々の温度で、種
々の時間熱処理した。処理抽出物（１ｍｌ）を、２. ５
％（ｗ／ｖ）デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）馬鈴薯澱粉の１ｍ
ｌとｐＨ３. ７または７. ０で混合した。澱粉の加水分
解を、時間経過による３２０ｎｍの吸収減少を求めるこ
とにより測定した。これは、Ｍ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｌｅ、
Ｖ．Ｊ．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｍ．Ｊ．Ｂｉｂｂ［（１９９０
年）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５：２９５−３０２頁］のアル
ファアミラーゼ活性測定法の変法である。表１１に結果
を示すが、この表は、熱処理停止後吸収に変化がみられ
ないことから明らかなように、８０℃で１時間の熱処理
後、この酵素は失活したことを示している。

【００５６】

【表１１】

【図面の簡単な説明】

【図１】菌株ＡＰ１のコロニー形態を示す拡大図であ
る。

【図２】菌株ＡＰ２のコロニー形態を示す拡大図であ
る。

【図３】菌株ＡＰ１１のコロニー形態を示す拡大図であ
る。

【図４】菌株ＡＰ２７のコロニー形態を示す大図であ
る。

【図５】菌株ＡＰ３０のコロニー形態を示す大図であ
る。

【図６】菌株ＡＰ４１のコロニー形態を示す拡大図であ
る。

【図７】菌株ＡＰ４２のコロニー形態を示す拡大図であ
る。

【図８】制限酵素処理ＤＮＡのゲル泳動の結果を示す図
である。

【図９】制限酵素処理ＤＮＡのゲル泳動の結果を示す図
である。

【図１０】粘性と平均分子量の変動を示すグラフであ
る。

【図１１】粘性と収量の変動を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リンダ・ソーンアメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイートビー‐102 シンエツバイオインコーポレイティッド内 (72)発明者トーマス・ポロックアメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイートビー‐102 シンエツバイオインコーポレイティッド内 (72)発明者リチャード・ダブリュー・アーメントロートアメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイートビー‐102 シンエツバイオインコーポレイティッド内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）自然のソースから，オーレオバシデイ
ウム・プルランスの少なくとも一つの野生株を採取し、ｂ）微生物が酵母様細胞を多く含むような発酵条件を該
採取株に付与し、さらに、このようにして生じた酵母様
細胞を分離し、ｃ）分離した酵母様細胞からコロニーをつくり、ｄ）酵母様細胞を含み、他の細胞と比較して着色の少な
いコロニーを工程ｃ）から肉眼的検査で選別し、ｅ）選別コロニーの色素産生を調べ、ｆ）深部培養で最少量の色素を産生する分離株を選別す
ることより成る培養を行うときに最少量の色素を産生す
るオーレオバシデイウム・プルランスの純化培養株を得
る方法。
【請求項２】工程ｃ）の前に臭化エチジウムでコロニ
ーを処理する請求項１記載の方法。
【請求項３】請求項１記載の方法により得られたオー
レオバシデイウム・プルランスの純化培養株。
【請求項４】請求項２記載の方法により得られたオー
レオバシデイウム・プルランスの純化培養株。
【請求項５】請求項３の純化培養株に発酵培地中で発
酵条件を付与し、さらに該培地からプルランを採取する
工程から成るプルラン製造方法。
【請求項６】請求項４の純化培養株に発酵培地中で発
酵条件を付与し、さらに該培地からプルランを採取する
工程から成るプルラン製造方法。
【請求項７】発酵培地のｐＨが安定した後で、該発酵
培地のｐＨがおよそ７．０に調整される請求項５または
６記載の方法。
【請求項８】発酵中に生成プルランを採取し、培地か
ら移し、さらにその中のプルランの分子量を減少させる
酵素を失活させるために十分な時間および温度で熱処理
する請求項５または６記載の方法。
【請求項９】少なくともおよそ８×１０⁵の平均分子
量を有する、実質的に無着色のプルラン。
【請求項１０】平均分子量が少なくともおよそ１×１
０⁶である請求項９記載のプルラン。
【請求項１１】平均分子量が少なくともおよそ２×１
０⁶である請求項９記載のプルラン。
【請求項１２】平均分子量が少なくともおよそ４×１
０⁶である請求項９記載のプルラン。
【請求項１３】平均分子量が少なくともおよそ６×１
０⁶である請求項９記載のプルラン。
【請求項１４】平均分子量が少なくともおよそ６×１
０⁶から９×１０⁶である請求項９記載のプルラン。
【請求項１５】請求項５または６記載の方法により得
られる少なくともおよそ４×１０⁶の平均分子量を有す
るプルラン。
【請求項１６】形状が繊維である請求項９記載のプル
ラン。
【請求項１７】形状が繊維である請求項１５記載のプ
ルラン。
【請求項１８】形状がフィルムである請求項９または
１０のプルラン。
【請求項１９】オーレオバシデイウム・プルランス
ＡＴＣＣ７４１００、オーレオバシデイウム・プルラン
スＡＴＣＣ７４１０１、オーレオバシデイウム・プル
ランスＡＴＣＣ７４１０２、オーレオバシデイウム・
プルランスＡＴＣＣ７４１０３、オーレオバシデイウム
・プルランスＡＴＣＣ７４１０４およびオーレオバシ
デイウム・プルランスＡＴＣＣ７４１０５並びにそれ
らの変異株から成る群から分離された微生物分離培養体
であって、該培養体がそれ自身を再生することができ、
さらに、好気的条件下で、資化性炭素源、窒素および無
機物を含有する液体増殖培地で培養するとき、分離可能
な量のプルランを産生することができることを特徴とす
る実質的に純化された微生物分離培養体。
【請求項２０】オーレオバシデイウム・プルランス
ＡＴＣＣ７４１００、オーレオバシデイウム・プルラン
スＡＴＣＣ７４１０１およびオーレオバシデイウム・
プルランスＡＴＣＣ７４１０５並びにそれらの変異株
から成る群から分離された微生物分離培養体であって、
該培養体がそれ自身を再生することができ、さらに、好
気的条件下で、資化性炭素源、窒素および無機物を含有
する液体増殖培地で培養するとき、分離可能な量のプル
ランを産生することができ、さらにまた、図９のレーン
ｂ、ｃおよびｄのＤＮＡ制限酵素パターンを有すること
を特徴とする実質的に純化された微生物分離培養体。