JPH027631B2

JPH027631B2 -

Info

Publication number: JPH027631B2
Application number: JP8371088A
Authority: JP
Inventors: Kyoshi Sato; Kazukyo Inoe; Hiroshi Korenaga; Shunichiro Ooga; Toshihiko Kumada; Shizuo Kadoya
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1988-04-05
Publication date: 1990-02-20
Also published as: JPS63273471A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はAT−25菌に関するものである。本発明者は、微生物生産物の中に抗血栓作用を
有するものを探索した結果、分離番号AT−25で
ある菌の培養濾液及びその菌体抽出液が優れた抗
血栓作用を示すことを見出した。その後研究を重
ねた結果、本発明者は、その活性本体を分離精製
することに成功し、硫酸化多糖体を主構成成分と
する新規物質であることを確認した。従来硫酸化
多糖体としては動物由来のヘパリンがよく知られ
ているが、微生物によつて直接に硫酸化多糖体が
産生される事実は極めて稀であり、本発明者の文
献調査では次の報告が見られるのみである。すな
わち、ダービイ（Darby）らのClostridium
welchiiの夾膜成分としてデルマタン硫酸様高分
子の存在に関する報告（J.Bacteriology、103、
159（1970））またはステバー（Steber）らの
Halococcus morrhuae菌の細胞壁成分としてグ
ルコース、マンノース、ガラクトースから成る硫
酸化多糖体の報告（Archives of Microbiology
105、173（1975））の二例に限られる。しかし、
これら既報の生産菌および産生物質は、本発明に
系わるAT−25菌およびDF−4639とは、後述の
如く明らかに異なるものである。硫酸化多糖体
DF−4639を生産するにはDF−4639生産菌を培養
すればよいが、最も代表的な方法は、AT−25菌
またはその変異株をその菌が成育し得る培地中で
培養し、培養液または菌体から分離精製すること
である。 AT−25菌は、本発明者が土壌試料から新たに
分離した菌であり、分類学的に検討した結果新菌
種であると推定し、暫定的にミクロコツカス属
（Micrococcus sp.）AT−25と名付け、微工研菌
寄第5255号として、またアルスロバクター属
（Arthrobacter sp.）AT−25として微工研条菌
寄第1357号として微生物工業技術研究所に寄託保
存されている。以下本菌をAT−25菌と略記する
ことがある。 AT−25菌の菌学的性質は次の通りである。 (a) 形態球状乃至短桿状（培養後期に球状）、径0.5
〜0.7×0.7〜1.5μｍ、多形性あり、運動性
なし、胞子形成なし、グラム染色陽性、
抗酸性なし (b) 各培地における成育状態肉汁寒天平板培養点状または円形状に中程度の発育で、光沢
ある山吹茶色を示すが、拡散性はなし。肉汁寒天斜面培養糸状に成育する他は、の平板培養の場合
と同様であつた。肉汁寒天液体培養菌膜形成はなく、全体に濁りおよび沈査あ
り。肉汁ゼラチン穿刺培養（22℃培養）穿刺線に沿つて成育し、かぶ状に液化す
る。リトマスミルク培地リトマスをやや赤変する。また長期培養
（14日以上）では凝固も見られる。 (c) 生理学的諸性質硝酸塩の還元陰性、脱窒反応陰性、
MR反応陰性、VP反応陰性、イン
ドールの生成なし、硫化水素の生成な
し、デンプンの加水分解能なし、クエン
酸の利用能なし、無機窒素源の利用能あ
り、水不溶性の色素生成あり、ウレアー
ゼ作用なし、オキシターゼ作用なし、
カタラーゼ作用あり、生育の範囲 PH6.0
〜8.5（最適７〜８）、温度10〜37℃（最適27〜
30℃）、好気性、OF反応陰性、下記15
種の糖類からの酸およびガスの生成はなし。Ｌ−アラビノースＤ−ガラクトースＤ−キシロース表芽糖Ｄ−グルコースシヨ糖Ｄ−マンノース乳糖Ｄ−フラクトーストレハロースＤ−ソルビツトＤ−マンニツトグリセリンイノシツトデンプン (d) その他の諸性質フオスフアターゼ作用なし、アルギニンの分解能なし、塩化ナトリウム7.5％中では成育するが10
％中では成育せず、ノボビオシンおよびリゾチームに対する最
小発育阻止濃度は共に3.1μｇ／ml、グアニンおよびシトシン含量（GC含量）
72.9％、菌体内色素（黄色）産生、細胞壁成分にジアミノピメリン酸（DAP）
あり。以上の菌学的性質を、バージイのマニユアル
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology、8th Ed.R.E.Buchaman and N.
E.Gibbons（Williams and Wilkins Co.、1974））
の記載に照すと、本菌はグラム陽性の短桿菌で運
動性がなく、カタラーゼ陽性、オキシターゼ陰
性、抗酸性がなく胞子形成が見られない、耐塩性
はあるが、食塩10％以上含有すれば成育しえな
い、絶対好気性であり、OF試験においても非醗
酵的である。VP反応、アルギニン分解能および
フオスフアターゼ活性は陰性であるなどの諸性質
から、アルスロバクター属に属せしめるのが最も
妥当である。次に硫酸化多糖体DF−4639を得るための基本
的な方法についてのべる。すなわち、DF−4639
を取得するために用いた菌の培養液および菌体内
にDF−4639が蓄積すればよいわけで、それには
用いた菌が成育しうる培地であればすべて使用可
能であり、用いた菌が資化しうる炭素源、窒素源
の他に無機塩やビタミン類を単独に、あるいは適
当な割合に組合せて用いることができる。炭素源
としてはブドウ糖、グリセリンなど、窒素源とし
ては酵母エキス、肉エキス、ペプトン、大豆粉、
コーンステイープリカーや燐酸水素アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩
が用いられ、そのほかに無機塩としてマグネシウ
ム、カリウム、鉄、マンガンなどの金属塩の適当
量の添加が可能である。また、DF−4639は硫酸
化多糖体であるので、硫酸ナトリウムや硫酸アン
モニウムの如き硫酸塩類を適当量加えることは極
めて有意義である。培養温度や培地のPHは使用し
た菌が成育しうる範囲であればよいが、温度は25
〜37℃、PHは6.5〜8.5の間で培養するのが好まし
い。培養は好気的条件で行うのがよく、例えば振
盪培養法もしくは培養槽内で通気撹拌培養を行な
えばよい。培養時間は24時間以上であればよい
が、50〜200時間が好ましい。培養が終了すれば、培養物を遠心分離機にかけ
て菌体と濾液とに分け、濾液については大略以下
に述べる如く処理する。なお、菌体については、
その量が少ない場合は無視し得るが、多量の場合
は後述する方法に従い別に処理する。すなわち、濾液に第４級アンモニウム塩、例え
ばセチルピリジニウムクロライド（CPC）の溶
液を加えて撹拌し、生じる沈澱を高速遠心機にか
けて分離して集める。得られた沈澱に適当な濃度
の電解質溶液、例えば10％エタノール含有の３モ
ル食塩水を加えて撹拌溶解せしめる。エタノール
を新たな沈澱が生じなくなる迄加え、生じた沈澱
を集め、エタノールそしてアセトンで洗つた後乾
燥すれば、粗粉末が得られる。ここに得られた粗
粉末を再び水に溶解し、稀塩酸を加えてPHを約
1.0とした後低温（約５℃）で遠心分離して不溶
物を除去する。上清を集め、希苛性ソーダ液で中
和しこれに第４級アンモニウム塩、例えばセチル
トリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）
水溶液を加えて生じる沈澱を遠心分離して集め
る。得られた沈澱を１モル食塩水中に加えて核酸
などの夾雑物を充分に撹拌可溶化した後、遠心分
離して不溶分を集める。この不溶物を10％エタノ
ール含有の３モル食塩水に加えて約50℃に加温し
つつ溶解する。この溶解にエタノールを加えて沈
澱させ、生じた沈澱を集めてエタノール、ついで
アセトンで洗つた後、再び水に室温で撹拌しなが
ら溶解させ約５℃で遠心分離して微量の不溶物を
除去する。溶液に新たな沈澱が生じなくなる迄エ
タノールを加え、生じた沈澱を集め、順次エタノ
ール、アセトンおよびエーテルで洗つた後、約70
℃で減圧乾燥すればDF−4639が白色粉末として
得られる。一方、菌体からDF−4639を得るには菌体の水
懸濁液にトルエンなどを加えて室温に放置して菌
体を自己融解させ、菌体内成分を水に移行させ
る。この懸濁液にエタノールを40％になる迄加
え、沈澱する蛋白、核酸などを菌体残渣と共に濾
過して除き、濾液を濃縮してエタノールを留去す
る。これにCPC溶液を加えて生じる沈澱を集め、
以下培養濾液の場合と同様に処理する。上述の方法によればDF−4639は、硫酸化多糖
体のナトリウム塩として得られ、以下の物理化学
的諸性質を有する。 (a) 元素分析値、糖および蛋白含量５ロツトの値および平均値を第１表に示し
た。

【表】 (b) グルコース、ガラクトース、硫酸基および燐
含量モル比 DF−4639を１規定硫酸中、100℃５時間加水
分解した後炭酸バリウムで中和し、Dowex
50W（Ｈ型）にかけて得られる流出液を用いて、
Khimらの方法（J.Am.Chem.Soc.、74、2090
（1952）を適用してグルコースとガラクトース
を分離定量した。また、硫酸基および燐のモル
比はＳおよびＰの含量（％）から算出した。第
２表にグルコースを1.0モルとした場合の各成
分のモル比の一例を示した。

【表】 (c) アミノ酸およびアミノ糖の含量モル比 DF−4639を３規定塩酸中、100℃16時間加水
分解し、塩酸を留去してアミノ酸分析計にかけ
て定量した結果の一例をグルタミン酸を1.0モ
ルとして第３表に示した。

【表】 (d) 旋光度［α］²⁵ _D−36±1°（Ｃ＝1.0、水） (e) 分子量 23000（デキストランを標準物質とするゲル濾
過法における主ピーク） (f) 紫外部吸収２mg／ml水溶液において220〜340nｍに極大
吸収は認められない。 (g) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠）図１に示す通り、1240、840（肩）および810
cm^-1に硫酸化多糖特有の吸収を示す。 DF−4639の生物学的諸性質を次に示す。 (a) 試験管内生物活性

【表】 (b) ラツトにおける線溶誘導活性ラツトを用い、検体投与（静注）前後のユー
グロブリン溶解時間（ELT）を経時的に測定
し、次式により線溶活性増加率（％）として表
現した。

【表】 (c) 急性毒性 LD₅₀1500mg／Kg以上（マウス、静注）以上のごとく、DF−4639は試験管内およびラ
ツトを用いた実験において、ヘパリンと同等もし
くはそれ以上の線溶誘導活性を示すことが確認さ
れた。しかもDF−4639においては、好ましくな
い抗凝固活性がヘパリンに比し著しく弱いという
特徴を有している。さらには赤血球凝集促進作用
も認められず、急性毒性値も1500mg／Kg以上（静
注）であり、副作用が非常に少なく、抗血栓薬と
して有望である。また、本発明者らは、DF−
4639にはリポプロテインリパーゼ活性化作用、抗
癌作用および感染防御作用などの有用な作用のあ
ることを動物実験で知見している。次に製造実施例を挙げて説明するが、％は特に
記載があるものを除きｗ／ｖ％である。実施例１グルコース２％、ペプトン0.5％、コーンステ
イープリカー0.5％、酵母エキス0.3％、食塩0.5％
および炭酸カルシウム0.3％よりなる液体培地100
mlを含む500mlの振盪フラスコに予め寒天斜面培
地に成育したAT−25菌の１白金耳を接種し、30
℃において３日間振盪培養して種培養液を得た。
次にグリセリン２％、硫安0.5％、燐酸−カリウ
ム0.1％、硫酸ナトリウム0.05％、酵母エキス0.2
％よりなる培地20を30容のジヤーフアーメン
ターに加え120℃で20分間滅菌したのち、PHを7.5
に調整する。これに種培養液600mlを接種して温
度30℃、通気量毎分10、撹拌毎分250回転の条
件で159時間培養した。得られた培養液を遠心分
離して少量の菌体を除去し、上澄液18に10％セ
チルピリジニウムクロライド水溶液500mlを加え、
一昼夜放置後、沈澱を遠心分離した。これを3M
食塩−10％（ｖ／ｖ）エタノール溶液600mlに加
え、充分に撹拌して溶解させた後、エタノール
1.6を加えて生じた沈澱をグラスフイルターを
用いて濾別した。この沈澱をエタノール、次いで
アセトンで洗い、乾燥して粗粉末37.0ｇを得た。
これを500mlの水に溶解し、０℃において1N塩酸
で約PH1.0として生ずる沈澱を遠心分解して除き、
上清を中和後、10％セチルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド水溶液500mlを加え、生じた沈澱を
遠心分離した。沈澱を1M食塩水で充分洗つた後、
3M食塩−10％（ｖ／ｖ）エタノール溶液150mlを
加え、充分に撹拌して溶解せしめ、エタノール
450mlを加えて一夜放置後、遠心分離して沈澱物
を集めた。これをエタノールで洗浄後、再び水
150mlに溶解せしめ、グラスフイルターで濾過し、
少量の残渣を水50mlで洗浄した。濾液および洗液
を合し、撹拌しながらエタノール２中に注ぎ、
白色沈澱を生成せしめた。この沈澱をグラスフイ
ルターで濾別し、エタノール、アセトン及びエー
テルで順次洗浄し、55℃で５時間減圧乾燥し、白
色粉末のDF−4639を13.9ｇ得た。本物質は、前
記の物性を示すものであり、トロンビン活性の50
％阻害濃度は0.7μｇ／mlであつた。実施例２グリセリン２％、可溶性でん粉１％、肉エキス
１％、ペプトン１％および食塩0.2％よりなる培
地20を30容のジヤーフアーメンターに加え
て、120℃、20分間滅菌し、実施例１と同様にし
て65時間培養を行つた。培養終了後、培養液を遠
心分離して、菌体と上清に分けた。上清に10％セ
チルピリジニウムクロライド水溶液150mlを加え、
以下実施例１に従つて分離精製して、DF−4639
の白色粉末3.2ｇを得た。一方、菌体は1200mlの
水と300mlのトルエン混合液中に懸濁し、時々撹
拌しながら、室温下３日間放置した。トルエンを
減圧留去後、エタノールを約40％（ｖ／ｖ）にな
る迄加え、沈殿して来る蛋白および核酸などを菌
体と共に濾過して除いた。得られた濾液を約１
迄に減圧下濃縮後、10％食塩水30mlおよび10％セ
チルピリジニウムクロライド水溶液100mlを加え
て生じた沈殿を遠心分離した。以下、実施例１に
従つて分離精製し、白色粉末のDF−4639を2.4ｇ
得た。

【図面の簡単な説明】

図１は赤外線吸収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】

１硫酸化多糖体DF−4639生産能を有するアル
スロバクター属 sp.AT−25。