JPH0533688B2 - - Google Patents

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JPH0533688B2
JPH0533688B2 JP59221978A JP22197884A JPH0533688B2 JP H0533688 B2 JPH0533688 B2 JP H0533688B2 JP 59221978 A JP59221978 A JP 59221978A JP 22197884 A JP22197884 A JP 22197884A JP H0533688 B2 JPH0533688 B2 JP H0533688B2
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JP
Japan
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lipopolysaccharide
blood
immobilized
fiber
gram
Prior art date
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JP59221978A
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JPS61100522A (ja
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Masatomo Kodama
Tooru Tani
Shiro Saikai
Jiro Suzuki
Kazuo Teramoto
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Toray Industries Inc
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Toray Industries Inc
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
（発明の技術分野） 本発明は、抗腫瘍作用の強い血液製剤の製造法
に関する。 （従来技術とその問題点） 先進国における死亡原因の第一は癌によるもの
であるが、現在のところ、細菌感染症に対する抗
生物質のような強力な制癌剤は見い出されていな
い。 哺乳動物（人を含む、以下同じ）をBCG（弱毒
性結核菌）、コリネバクテリウム グラヌロサム
（orynebacterium granulosum）あるいはザイモ
サン（Zymosan）のごとき物質で代表される免
疫刺激剤を投与したのち、エンドトキシンあるい
はポリＩ：Ｃ（poli Ｉ：Ｃ）などを投与すると、
該哺乳動物の血液中にTNF（腫瘍壊死因子）の生
ずることが知られている［E.A.Carswell et al，
プロシーデイングズ オブ ザ ナシヨナル ア
カデミー オブ サイアンシーズ オブ USA
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）vol.72，(9)pp3666−
3670（1975）］。 該TNFを誘導するための物質としては、エン
ドトキシンが最も強力であるが、毒性も強いた
め、該哺乳動物はTNFを産生しながら、死亡す
る。 この方法で作られたTNFを含む血液にはエン
ドトキシンが含まれるため、このままでは他の動
物に投与できない。したがつて、この血液中の
TNFを利用するためには、この血液からエンド
トキシンを除かねばならないが、そのためには多
大の労力を要する。 （問題点を解決するための手段） TNF様物質を作る際、エンドトキシンを不溶
性担体に固定化してエンドトキシンが血液中に流
れでないようにしたものを、エンドトキシンの代
わりに用いる。 （発明の構成） 本発明は、 哺乳動物に弱毒性結核菌で代表される免疫刺激
剤を投与したのち、該哺乳動物の血液を、不溶性
担体に固定化したグラム陰性菌細胞壁リポ多糖体
で処理することによる抗腫瘍性血液製剤の製造方
法 を提供するものである。 （発明の構成） 本発明でいう、グラム陰性菌細胞壁リポ多糖体
（以下リポ多糖体と略称する）とは、リン菌
（Neisseria gonorrhoeae）で代表されるグラム
陰性球菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、
ウシ流産菌（Brucella abortus）、百日咳菌
（Bordetella pertussis）などで代表されるグラム
陰性好気性桿菌、大腸菌（Escherichia coli）、
腸チフス菌（Salmonella typhi）、シゲラ ダイ
セントリー（Shigella dysenteriae）、肺炎桿菌
（Klebsiella pneumoniae）、霊菌（Serratia
marcescens）、変形菌（Proteus vulgaris）、腸
炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、コレ
ラ菌（Vibrio cholerae）などで代表されるグラ
ム陰性通性嫌気性桿菌等のグラム陰性菌の細胞壁
の外層に局在する脂質・多糖類の複合体、脂質・
多糖類とタンパク質の複合体、および、リピツド
Ａを意味する。該リポ多糖体は、グラム陰性菌か
ら既知の方法により抽出することができる。その
方法の代表例として、フエノール水で抽出する方
法［Van Otto Westphal et al.，ツアイトシユ
リフト フユール ナトールフオルシユング コ
ーテス ラーデス ドウ ラ ソシエテ ドウ
ビオロジー（Z.Naturforsch.，Comp.Rend.Soc.
Biol.，）128 ５（1938）］、ブタノールで抽出する
方法［D.Morrison and Leive，ジヤーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.
Chem.）250 2911（1975）］、および、エチレンジ
アミン−Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラ酢酸水で抽出
する方法［L.Lieve et al，J.Biol.Chem.243
6384（1968）］などをあげることができる。また、
これらのリポ多糖体をおだやかに酸処理すること
により、リピツドＡを作ることができる［本間
他、内毒素−その構造と活性、p.47−61（1983）
医歯薬出版］。 本発明でいう不溶性担体とは、実質上不溶性
で、かつ、リポ多糖体を固定することのできる担
体を意味する。該不溶性担体の形状は球状、繊維
状、膜状のいずれでもよいが、リポ多糖体を高密
度で固定化できるためには表面積の大きい形状が
好ましい。とりわけ、繊維の形状は血液との接触
効率が良く、また、血液からの分離の際の被捕捉
性が良いので好ましい。 また該不溶性担体は結晶性ポリプロピレン、ポ
リエチレンなどで代表されるポリα−オレフイン
で補強されていれば、機械的性質が向上するの
で、さらに好ましい。 また、該不溶性担体の表面積はあまり小さすぎ
ると、固定化密度が低くなるが、あまり大きすぎ
ても、固定化リポ多糖体を充填したカラムの通液
性は悪くなるので、該不溶性担体の表面積は0.01
以上50m2／ｇ以下、より好ましくは、0.05以上10
m2／ｇ以下がよい。 本発明でいう不溶性担体の一例をあげると、(1)
ポリスチレンまたはスチレン・ジビニルベンゼン
共重合体に、アミノ基、カルボキシル基、活性ハ
ロゲン基、オキシラン基、活性エステル基または
イソシアン酸基等のリポ多糖体と結合しうる官能
基を芳香核置換基として導入したもの、(2)(1)のポ
リスチレンの代りにメチレン架橋またはスルホン
架橋したポリスチレンを用いたもの、(3)アクリル
酸・メチレンビスアクリルアミド共重合体、(4)ブ
ロムシアノ化アガロースなどがあるが、これらの
なかでも、ビニルポリマを幹ポリマとする担体
が、耐酸性や対アルカリ性などに富むので、特に
好ましく用いられる 本発明で用いるリポ多糖体を結合せる不溶性担
体（以下固定化リポ多糖体と略称する）は、リポ
多糖体を不溶性担体結合表面上に化学的に結合せ
しめたものであるが、その固定化密度が低すぎる
と、血液の活性化が小さすぎて抗腫瘍活性の低い
血液しか得られない。従つて、該固定化リポ多糖
体中のリポ多糖体密度は0.01mg／ｇ以上、より好
ましくは1.0mg／ｇ以上であることが望ましい。 本発明で用いる免疫刺激剤としては、コリネバ
クテリウム パーバム（Corynebacterium
parvum）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、
ノカルデイア（Nocardia）、BCG（Bacillus
Calmette Guerin）、結核菌メタノール不溶画分
（MER）、ワツクス Ｄ（Wax Ｄ）、結核菌全細
胞壁成分（WCW）、結核菌細胞壁基本成分
（CWS）、水溶性アジユバンド（WSA）などのマ
イコバクテリア（Mycobacteria）およびその菌
体成分、リン菌（Neisseria gonorrhoeae）、緑
膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ウシ流産菌
（Brucella abortus）、百日咳菌（Bordetella
pertussis）、大腸菌（Escherichia coli）、腸チフ
ス菌（Salmonella typhi）、シゲラ ダイセント
リー（Shigella dysenteriae）、肺炎桿菌
（Klebsiella pneumoniae）、霊菌（Serratia
marcescens）、変形菌（Proteus vulgaris）、腸
炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、コレ
ラ菌（Vibrio cholerae）等のグラム陰性の細菌、
ブドウ球菌（Staphylococcus）、連鎖球菌
（Streptococcus）等のグラム陽性の細菌、ピシバ
ニール（Picibanil）、ワクシニア ビールス
（vaccina viruses）等のウイルス，インターフエ
ロン、ポリＩ：Ｃ（poliI：Ｃ）、ポリＡ：Ｕ
（poliA：Ｕ）などがあるが、とりわけ、BCGが
よい。 固定化リポ多糖体の調製は、不溶性担体をリポ
多糖体の溶液と混合するか、あるいは、さらにこ
の混合物にジシクロヘキシルカルボジイミド等の
ペプチド合成用縮合剤を添加することによつて達
成される。 本発明における血液と固定化リポ多糖体との接
触は、補体の失活や血球の損傷の起らない生理的
条件下で行なわれるのが好ましい。その接触時間
には特に制限はないが、通常10〜180分間行なわ
れる。 抗腫瘍血液製剤の具体的製法は、まず、哺乳動
物に免疫刺激剤を投与し、その１〜３週間後に(1)
固定化リポ多糖体をつめたカラムで全血体外循環
（以下DHPと略称する）したのち、該動物から採
血する方法、(2)該哺乳動物から血液を採取し、そ
の血液を固定化リポ多糖体と接触させる方法、お
よび、(3)血清または血液を血漿をえるため上記
(1)、(2)でえられた血液を遠心分離する方法があ
る。勿論さらに抗腫瘍性成分を精製濃縮すること
も可能である。 抗腫瘍血液製剤の具体的使用例をあげると、同
種または異種の担癌哺乳動物に静脈または直接腫
瘍内に投与することにより、該哺乳動物の癌の治
療を行なう方法がある。 （発明の効果） エンドトキシンを用いたときは血液提供動物は
死亡したが、固定化リポ多糖体を用いることによ
り、死亡しなくなつた。 以下に実施例を示す。 実施例 １ ポリプロピレン（三井“ノーブレン”J3HG）
50部を島成分とし、ポリスチレン（“スタイロン”
666）46部、ポリプロピレン（住友“ノーブレン”
WF−727−Ｆ）４部の混合物を海成分とする海
島型複合繊維（島数16、単系繊度2.6デニール、
引張強度2.9ｇ／ｄ、伸度50％、フイラメント数
42）50ｇを、Ｎ−メチロール−α−クロルアセト
アミド50ｇ、ニトロベンゼン400ｇ、およびパラ
ホルムアルデヒド0.85ｇからなる混合溶液中に浸
し、20℃で１時間反応させた。繊維を反応液から
取り出し、０℃の氷水5l中に投じて、反応停止さ
せたのち、水で洗浄し、次に、繊維に付着してい
るニトロベンゼンをメタノールで抽出除去した。
この繊維（繊維Ａ）を50℃で真空乾燥して、クロ
ルアセトアミドメチル化繊維71ｇ（繊維Ａ）を得
た。 繊維A40ｇを15℃のエチレンジアミン中に浸
し、15〜20℃の温度で24時間反応させて、エチレ
ンジアミノアセトアミドメチル化繊維（繊維Ｂ）
を得た。この繊維は1.8ミリモル／ｇのエチレン
ジアミノ基を持ち、また、PH7.4における含水率
は乾燥繊維1.0ｇ当り1.0ｇであり、この状態にお
ける単糸の直径は40〜44μmであつた。 （固定化リポ多糖体の調製） 上記繊維B32ｇを300mlの水中に一昼夜膨潤さ
せたのち、Escherichia coli 055：B5のリポ多糖
体（トリクロル酢酸抽出法、デイフコ・ラボラト
リーズ社製造）の0.4mg／ml水溶液500mlと混合
し、次に1N−塩酸および1N−水酸化ナトリウム
でPHを4.5〜6.0に保ちながら、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
5.0ｇを少しずつ加え、溶解した。この混合物を
室温で２日間振とうしたのち、繊維を取り出し、
1lの沸騰水を中に30分間浸漬する操作を３回行な
つたのち、0.07モルのリン酸緩衝液（PH7.4）で
洗浄液のPHが7.4になるまで洗浄して、リポ多糖
体固定化繊維（固定化リポ多糖体）を得た。上記
固定化母液および洗浄液中のリポ多糖体の濃度を
フエノール・硫酸法（試料溶液１ml＋５％フエノ
ール水１ml＋濃硫酸５ml；485mμ）で求めた。固
定化リポ多糖体中のリポ多糖体固定化量は5.0
mg／ｇであつた。 この固定化リポ多糖体0.6ｇを200mlの局方生理
的食塩水で洗浄後、50mlの局方生理的食塩水に浸
し、38℃で３時間暖めたのち、その生理的食塩水
のエンドトキシンの存在量をリムラス・プレゲル
法で求めたところ、１ナノグラム／ml以下であつ
た。 （抗腫瘍性血液製剤の調製） 家兎（日本白色種；体重2.4〜3.0Kg）９匹に２
mgのBCG（日本BCG協会製；生菌数約4.7×107
個）を生理食塩水１mlに溶し、耳静脈から投与し
た。その３日後にVX−２腫瘍細胞１×105個
（１mlPBS緩衝液）に左大腿四頭菌内に接種し
た。それから14日後に上記固定化リポ多糖体0.6
ｇをつめた内容積10mlのポリプロピレン製カラム
を用いて、DHP（ソムノペンチル麻酔下、右大腿
動脈−耳静脈シヤント、血流量10ml／min.，ヘ
パリン500単位／Kg）を60分間行なつた。 比較群として４匹の家兎に繊維B0.6ｇをつめ
たカラムを用いてDHPを施した。 比較群では30日以内に全数死亡したのに対し、
固定化リポ多糖体のカラムでDHPを施した群で
は90日後も全数生存し、その腫瘍径（大腿筋幅）
を無処置群（BCG接種なし）に比し大幅な縮小
傾向を認た。 上記固定化リポ多糖体のカラムでDHPを施し
た群の中の２匹についてDHPの前後（ ）で採
血を行ない、その血清についてインターフエロン
様様ウイルス作用の力価（RK−13／水泡口内炎
ウイルス（VSV）…ザ ナシヨナル インステ
イチユーツ オブ ヘルス（NIH）のスタンダ
ードと比較）を測定したところ、DHPの前では
共に０であつたのに対し、DHPの後では495単位
と161単位の活性を認めた。 実施例 ２ 実施例１と同様にして作つたBCG感作担癌家
兎２匹に、上記固定化リポ多糖体のカラムで実施
例１と同様にDHPを施した。DHP前後に採血
し、それから得た血清の腫瘍細胞に対する細胞障
害性および血清に含まれるエンドトキシン濃度
［トキシカラーキツト；生化学工業(株)製］を調べ、
下記の結果を得た。
【表】 但し、表中腫瘍細胞に対する細胞障害性の数字
は夫々の細胞を１週間培養した後の細胞増殖を対
照の半分にする試料の血清の希釈倍率である。 〔エンドトキシン濃度〕
【表】 上記結果から抗腫瘍性血液製剤は異種哺乳動物
の癌細胞に対して明らかな細胞障害性を示すこと
がわかる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ 哺乳動物に弱毒性結核菌で代表される免疫刺
    激剤を投与したのち、該哺乳動物の血液を、不溶
    性担体に固定化したグラム陰性菌細胞壁リポ多糖
    体で処理することによる抗腫瘍性血液製剤の製造
    方法。
JP59221978A 1984-10-24 1984-10-24 抗腫瘍性血液製剤の製造法 Granted JPS61100522A (ja)

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JPS61100522A JPS61100522A (ja) 1986-05-19
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