JPH0472808B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は抗腫瘍作用の強い血清に関する。

（従来技術とその問題点） 先進国における死亡原因の第一は癌によるもの
であるが、現在のところ、感染症に対する抗生物
質のような強力な制癌剤は見い出されていない。

グラム陰性菌細胞壁由来のリポ多糖体は菌体内
毒素、エンドトキシンあるいはパイロジエンとも
呼称されている物質であつて、発熱作用、シユワ
ルツマン活性、致死毒性などの有害な作用を示す
ことで知られているが、一方、悪性腫瘍に対する
抗腫癌効果を示す物質としても知られている。

悪性腫瘍に対する特効薬のない現在、抗腫瘍作
用を有する物質は注目に値するが、該リポ多糖体
の場合は、その致死量と最小有効抗腫瘍作用量と
が近いため、安全に使用しえない。

（発明の目的） 本発明はかかるリポ多糖体の抗腫瘍作用を利用
して、強力な抗腫瘍作用を持ち、かつ、毒性のな
い物質を作るものである。

（発明の構成） (1) 新鮮血清または血漿をグラム陰性菌細胞壁由
来のリポ多糖体を結合せる不溶性担体と接触さ
せた後、濃縮して得た抗腫瘍性血清または血
漿。

（構成の説明） 本発明でいう、グラム陰性菌細胞壁由来のリポ
多糖体（以下リポ多糖体という）とは、Neisser
ia gonorrhoeaeで代表されるグラム陰性球菌、
Pseudomonas aeruginosa、Burcella abortus、
Bordetella Pertussisなどで代表されるグラム陰
性好気性桿菌、Escherichia coli、Salmonella
typhi、Shigella dysenteriae、Klebsiella
pneumoniae、Serratia marcescens、Proteus
vulgaris、Yersinia enterocolitica、Vibrio
choleraeなどで代表されるグラム陰性通性嫌気性
桿菌等のグラム陰性菌の細胞壁の外層に局在する
脂質・多糖類の複合体、および、脂質・多糖類と
少量のタンパク質の複合体を意味する。該リポ多
糖体は、グラム陰性菌から既知の方法により抽出
することができる。その方法の代表例として、フ
エノール水で抽出する方法［Van Otto
Westphal et al.，Z.Naturforsch.，Comp.Rend.
Soc.Biol.，128 ５（1938）］、ブタノールで抽出
する方法［D.C.Morrison and L.Leive.，J.Biol.
Chem.250 2911（1975）］、および、エチレンジア
ミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸水で抽出する
方法［L.Leive他．J.Biol.Chem.，243 6384
（1968）］などをあげることができる。該リポ多糖
体のタンパク含量は、固定化の容易さの点から、
0.1〜50％とりわけ１〜20％であることが好まし
い。該リポ多糖体は会合性があるので、その分子
量は測定の方法および条件により異なり、通常、
数千〜数百万として観察される。

本発明でいう不溶性担体とは、実質上不溶性
で、かつ、リポ多糖体を固定することのできる担
体を意味する。該不溶性担体の形状は球状、繊維
状、膜状のいずれでも良いが、リポ多糖体を高密
度で固定化できるためには表面積の大きい形状が
好ましい。血清からの分離の際の被捕捉性の良さ
や表面積の大きさの点から繊維の形状が最良であ
る。

本発明に用いる不溶性担体の一例をあげると、 (1) ポリスチレンまたはスチレン・ジビニルベン
ゼン共重合体に、アミノ基、カルボキシル基、
活性ハロゲン基、オキシラン基、活性エステル
基またはイソシアン酸基等のリポ多糖体と結合
しうる官能基を芳香族置換基として導入したも
の、 (2) (1)のポリスチレンの代りにメチレン架橋また
はスルホン架橋したポリスチレンを用いたも
の、 (3) Ｎ−（N′−ジメチルアミノプロピル）アクリ
ルアミド・メチレンビスアクリルアミド共重合
体、 (4) ジエチルアミノエチル化セルロースなどがあ
るが、これらの中でも、ビニルポリマを幹ポリ
マとする担体が、耐酸性や耐アルカリ性などに
富むので、特に好ましく用いられる。

本発明で用いるリポ多糖体を結合せる不溶性担
体（以下固定化リポ多糖体と略称する）は、リポ
多糖体を不溶性担体表面上に化学的に結合せしめ
たものであつて、固定化リポ多糖体中のリポ多糖
体の密度が低すぎると、血清の活性化が小さいた
め、活性の低い抗腫瘍血清しか得られない。従つ
て、該固定化リポ多糖体のリポ多糖体密度は0.1
mg／ｇ以上、より好ましくは1.0mg／ｇ以上であ
ることがのぞましい。固定化リポ多糖体の調製
は、不溶性担体をリポ多糖体の溶液と混合する
か、あるいは、さらに、この混合物にペプチド合
成用縮合剤を添加することにより達成される。

本発明で用いる新鮮血清または血漿とはタンパ
ク質濃度６〜９ｇ／dlで、かつ、溶血補体価
（CH50）が10U／ml以上である哺乳動物の血清ま
たは血漿を意味する。ここで、溶血補体価
（CH50）1U／mlとは7.5mlの反応液中に存在する
ヒツジ赤血球５×10⁸コの50％を溶血させるに必
要な補体量を意味し、通常人の血清では30〜
45U／ml、モルモツトの血清では200U／ml前後
である。

本発明における新鮮血清と固定化リポ多糖体と
の接触は、補体の失活やcold activationの起こ
らない25〜45℃の温度で行なわれるのが好まし
く、接触時間には特に制限はないが、通常10〜
180分間行なわれる。また、血清の濃縮は分画分
子量が54〜２万の半透膜を用いて、加圧または常
圧下で行なわれる。新鮮血清と固定化リポ多糖体
の混合比はリポ多糖体１mgに対し、通常１〜50ml
の血清を用いる。血清が少なすぎると担体に吸着
される血清の割合が多くなりすぎ、血清が多すぎ
ると血清の活性化の割合が少なすぎる。もちろん
血清の活性化が大きければ濃縮せずにそのまま用
いても抗腫瘍効果はあるが、何ら活性を損うこと
なく濃縮することが可能であり、しかも効果はよ
り確実である。

血清の濃縮の程度は用いる血清と固定化リポ多
糖体の量比、リポ多糖体の固定化密度により異な
るが、通常、タンパク濃度が10ｇ／dl以上、より
好ましくは20ｇ／dl以上になるまで濃縮される。
血漿の場合はヘパリン化した後、血清と同様に処
理される。全血液の使用も可能である。

本発明の抗腫瘍性血清または血漿は人の癌の治
療のほか、哺乳動物の癌治療の薬剤として用いら
れる。その使用方法は、静脈、腹腔内、筋肉内、
皮下、皮内投与のほか、腫瘍内への直接投与で行
なわれる。

（発明の作用機構） 本発明の抗腫瘍血清または血漿は、固定化リポ
多糖体により、補体または補体同様の易熱性タン
パク質が活性化を受け、腫瘍を出血壊死させる因
子に変化するか、または、他の成分をして該因子
に変化せしめるものと考えられる。

（発明の効果） 本発明の抗腫瘍血清はリポ多糖体同様の抗腫瘍
性を示すとともに、致死作用を示さず、濃縮した
ことにより、投与量および回数を少なくすること
ができ、かつ、より大きな抗腫瘍効果が得られ、
さらに、少量で効果があり腫瘍内に投与できる特
徴を有する。

実施例 １ ポリプロピレン（三井“ノープレン”J3HG）
50部を島成分とし、ポリスチレン（“スタイロン”
666）46部、ポリプロピレン（住友“ノープレン”
WF−727−Ｆ）４部の混合物を海成分とする海
島型複合繊維（島数16、単繊維繊度２，６−デニ
ール、引張強度2.9ｇ／ｄ、伸度50％、フイラメ
ント数42）50ｇを、Ｎ−メチロール−α−クロル
アセトアミド50ｇ、ニトロベンゼン400ｇ、98％
硫酸400ｇおよびパラホルムアルデヒド0.85ｇか
らなる混合溶液中に浸漬し、20℃で１時間反応さ
せた。繊維を反応液から取り出し、０℃に氷水５
中に投じて反応停止させた後、水で洗浄し、次
に、繊維に付着しているニトロベンゼンをメタノ
ールで抽出除去した。この繊維を50℃で真空乾燥
して、クロルアセトアミドメチル化繊維71ｇを得
た。次に、この繊維40ｇを15℃のエチレンジアミ
ン中に浸し、15〜20℃の温度で24時間反応させ
て、エチレンジアミノアセトアミドメチル化繊維
を得た。この繊維は1.8ミリモル／ｇのエチレン
ジアミノ基を有し、１級アミノ基と２級アミノ基
を持つが、３級および４級アミノ基を持たない。
また、PH7.4における含水率は乾燥繊維1.0ｇ当
り．０ｇであり、この状態における単糸の直径は
40〜44μmであつた。

上記アミノ基含有ポリスチレン繊維32ｇを300
mlの水中に一昼夜膨潤させたのち、Escherichia
Coli055：B5のリポ多糖体（トリクロル酢酸抽出
法、デイフコ・ラポラトリーズ社製造）の0.4
mg／ml水溶液500mlと混合、次に、1N−塩酸およ
び1N−水酸化ナトリウムでPHを4.5〜6.0に保ちな
がら、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド5.0ｇを少しずつ加え、
溶解した。この混合物を室温で２日間振とうした
のち、繊維を取り出し、１の沸騰水中に30分間
浸漬する操作を３回行なつたのち、0.07モルリン
酸緩衝液（PH7.4）で洗液のPHが7.4になるまで洗
浄して、リポ多糖体固定化繊維を得た。上記固定
化母液および洗液中のリポ多糖体の濃度をフエノ
ール・硫酸法（試験料１mlと５％フエノール水１
mlの混合液に濃硫酸５mlを加え、485mμの吸光度
を測定する。）で求めた。この場合、２回目以降
の洗液については50倍に濃縮したのち、定量に供
した。

上記リポ多糖体固定量は5.0mg／ｇであつた。
このリポ多糖体固定化繊維0.6ｇを200mlの局方生
理的食塩水で洗浄後、50mlの生理的食塩水に浸
し、38℃で３時間温めたのち、その生理的食塩水
中のリポ多糖体の存在量をリムラス・プレゲル法
で求めたところ、１ナノグラム／ml以下であつ
た。

実施例 ２ BALB／Ｃマウスにメチルコランスレンを接
腫させることにより誘発させた繊維肉腫MC−B1
の腫瘍細胞を５×10⁵個とり、BALB／Ｃマウス
の背部皮下に接腫することにより担癌マウスを調
整した。腫瘍は接腫後５日後に2.1mm、10日後に
6.3mm、12日後に8.9mmの直径になつた。

新鮮ヒト血清200mlに実施例１で調整したリポ
多糖体固定化繊維2.0ｇ（リポ多糖体10mg）37℃
で180分間浸漬したのち、この血清をセルロース
半透膜チユーブ（Visking Company製、品番
20／32、分画分子量１〜２万、膜厚0.020mm）内
に入れ、チユーブの外側にポリエチレングリコー
ル（分子量２万）粉末をふりかけて、血清量が四
分の一になるまで濃縮した。この濃縮血清0.6ml
ずつを上記担癌マウスに、癌細胞接腫後11日目
（腫瘍直径７mm）と13日目に尾静脈から投与した
ところ、14匹中６匹に腫瘍内の出血が認められ、
内５匹に腫瘍の完全消失が認められた。

コントロールとして、56℃で30分間処理したヒ
ト血清100mlについて上記と全く同じ実験を行な
つたが、腫瘍内の出血、壊死は全く認められず、
完全治癒例もなかつた。

実施例 ３ 実施例１の未反応複合繊維の代りに、ポリスチ
レン粉末（直径0.05〜1.0mm）25ｇを実施例１と
同様に反応させ、クロルアセトアミドメチル化ポ
リスチレン粉末52ｇを得た。この粉末40ｇを15℃
のエチレンジアミンに浸し、15〜20℃の温度で24
時間反応させて、エチレンジアミノアセトアミド
メチル化ポリスチレンビーズ（エチレンジアミノ
基3.6ミリモル／ｇ）を得た。この粉末40ｇを300
mlの水中に一昼夜浸して膨潤させたのち、
Escherichia Coli055：B5のリポ多糖体（トリク
ロル酢酸抽出法、デイフコ・ラボラトリーズ社製
造）の0.4mg／ml水溶液500mlと混合、次に、1N
−塩酸および1N−水酸化ナトリウムでPHを4.5〜
6.0に保ちながら、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド5.0ｇを少し
ずつ加え、溶解した。この混合物を室温で２日間
振とうしたのち、遠心分離（3000rpm、30分間）
によつて粉末を取り出し、１の水で３回洗浄・
遠心分離する操作をくり返した。さらに、１の
沸騰水中で30分間浸漬したのち、遠心分離する操
作を３回行なつた。0.07モルのリン酸緩衝液（PH
7.4）で洗液のPHが7.4になるまで洗液して、リポ
多糖体固定化粉末を得た。上記固定化母液および
洗液中のリポ多糖体の濃度をフエノール・硫酸法
（試料１mlと５％フエノール水１mlの混合液に濃
硫酸５mlを加え、485mμの吸光度を測定する。）
で求めた。

上記リポ多糖体固定化量は0.5mg／ｇであつた。
このリポ多糖体固定化粉末0.6ｇを200mlの局方生
理的食塩水で洗浄後、50mlの生理的食塩水に浸
し、38℃で３時間温めたのち、その生理的食塩水
中のリポ多糖体の存在量をリムラス・プレゲル法
で求めたところ、１ナノグラム／ml以下であつ
た。

実施例 ４ 実施例３で調整したリポ多糖体固定化粉末20ｇ
を新鮮ヒト血清200mlと混ぜ、37℃で180分間振と
うしたのち、遠心分離（300rpm、30分間）し、
上澄を取り出し、実施例１と同様に４倍に濃縮し
た。この血清0.6mlずつを実施例１で得た担癌マ
ウスに、癌細胞接種後11日目と13日目に尾静脈か
ら投与したところ、14匹中５匹に腫瘍内の出血が
認められ、内３匹に腫瘍の完全消失が認められ
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 新鮮血清または血漿をグラム陰性菌細胞壁由
   来のリポ多糖体を結合せる不溶性担体と接触させ
   た後、濃縮して得た抗腫瘍性血清または血漿。