JPH0533712B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、ステロール類と脂肪酸とのエステル
の新しい製造方法に関する。 従来の技術 ステロールと脂肪酸とのエステルは、従来よ
り、例えばコレステリツク液晶（特開昭52−
24992号公報参照）や医薬化粧用親水性基材（特
開昭52−41215号公報、特開昭52−79030号公報参
照）等として、各種分野で広く用いられている。 従来かかるステロール脂肪酸エステルは、専ら
有機合成法により製造されてきている。しかしな
がら一般に有機合成法では苛酷な反応条件が採用
され、しかも副反応等が惹起する弊害は避けられ
ず、反応及び引続く目的物の単離精製に繁雑な操
作、工程等を必要とする。特にステロール類の水
酸基はセカンダリーであり、しかもこれはステロ
イド骨格に近接しているために、通常の脂肪族セ
カンダリーアルコールと比較しても反応性が低下
しており、そのためにこれに脂肪酸を反応させ、
脂肪酸エステルを製造する場合、酸触媒を用いて
高温で長時間反応させるか、脂肪酸を一旦酸無水
物、酸ハライド等に変換させた後、エステル化反
応を行なう必要がある。またステロイド骨格の４
位に２個のメチル基を持ち、３位に水酸基を持つ
トリメチルステロール等を原料とする場合、該化
合物はその４位の２個のメチル基の立体障害のた
めに更に反応性は低く、酸ハライドとしなければ
脂肪酸とのエステル化反応は困難である。しかる
に各種用途に有用なものとして所望されるステロ
ールエステルは、一般に長鎖脂肪酸のエステルで
あり、かかるエステル合成のために原料とする長
鎖脂肪酸のハライドは、その入手が一般に困難で
あり、通常繁雑な工程を要して別途合成せねばな
らず、非常に高価なものとなる不利がある。加え
てかかる脂肪酸のハライドは、概して湿気により
分解し易く不安定であり、しかも反応時に刺激
性、腐蝕性の生成物を副生するおそれがあり、特
殊な反応装置等を要する不利もある。 発明が解決しようとする問題点 本発明者らは上記苛酷な反応条件を要し、高価
で且つ不安定な反応試薬等を必要とする有機合成
によることなく、所望のステロール脂肪酸エステ
ルをより温和な条件下に有利に収率よく製造でき
る方法を提供することを目的として鋭意研究を重
ねてきた。その結果、特定の酵素を利用して上記
目的に合致する新しいステロールエステル類の製
造技術を開発するに成功し、ここに本発明を完成
するに至つた。 問題点を解決するための手段 即ち本発明はリパーゼもしくはコレステロール
エステラーゼを用いて、分子内にステロイド骨格
及び水酸基を有する化合物と脂肪酸とを接触反応
させることを特徴とするステロール脂肪酸エステ
ルの製造方法に係わる。 本発明方法によれば、酵素作用を利用すること
によつて、従来の有機合成法に見られるごとき苛
酷な反応条件を採用したり、繁雑な操作等を要し
て原料を別途合成したり、特殊な反応装置等を必
要とすることなく、非常に温和な条件下、通常温
常圧下に、容易にしかも収率よく目的とするステ
ロール脂肪酸エステルを製造でき、その反応系か
らの分離精製等も容易に行ない得る。更に本発明
方法では、従来反応性に劣つており収率よく製造
することが困難であつたエステルも容易に高収率
で製造可能である。 本発明方法においては、酵素としてリパーゼも
しくはコレステロールエステラーゼを用いること
が重要である。ここでリパーゼとは、グリセライ
ドをグリセリンと脂肪酸に加水分解する反応を触
媒する酵素であり、コレステロールエステラーゼ
とは、コレステリンと脂肪酸とのエステル結合を
加水分解する酵素である。本発明者らは、上記リ
パーゼ及びコレステロールエステルが各種ステロ
ール類と脂肪酸とのエステル合成反応を触媒する
ことを始めて見出し、この反応を利用してステロ
ール脂肪酸エステル、容易に収率よく且つ工業的
規模で合成するに成功したものである。 本発明に用いられる上記リパーゼ及びコレステ
ロールエステラーゼは、その起源に特に制限はな
く、各種微生物、動物、植物起源のいずれでもよ
い。リパーゼの起源微生物としては、例えばアク
ロモバクター イオフアーガス
（Achromobacter iofurgus）、アクロモバクター
リポリテイカム（Achromobacter
lipolyticum）、クロモバクテリウム ビスコサム
（Chromobacterium viscosum）、コリネバクテ
リウム アクネス（Corynebacterium acnes）、
シユードモナスエアルギノーサ（Pseudomonas
aeruginosa）、シユードモナス フルオレスセン
ス（Pseudomonas fluorescens）、シユードモナ
ス フラギ（Pseudomonas fragi）、スタフイロ
コツカス アウレウス（Staphylococcus
aureus）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus
niger）、キヤンデイダ シリンドラシア
（Candida cylindracea）、フミコーラ ランギノ
ーサ（Humicoa lanuginosa）、ペニシリウム
カセイコラム（Penicillium caseicolum）、ペニ
シリウム クルストサム（Penicillium
crustosum）、ペニシリウム シクロビウム
（Penicillium cyclopium）、ペニシリウム ロキ
ユフオーテイ（Penicillium roqueforti）、トルロ
プシス エノビ（Torulopsis ernobil）、バシラ
ス ズブチルス（Bacillus subtilis）、アルカリ
ゲネスsp（Alcaligenes sp）、サーモマイセス イ
バダネンシス（Thermomyces lbadanensis）等
のアクロモバクター属、クロモバクテリウム属、
コリネバクテリウム属、シユードモナス属、スタ
フイロコツカス属、アスペルギルス属、キヤンデ
イダ属、フミコーラ属、ペニシリウム属、トルロ
プシス属、バシラス属、アルカリゲネス属、サー
モマイセス属等に属する各種微生物例示できる。 またコレステロールエステラーゼの起源として
は、哺乳動物の各種組織、例えば膵蔵、肝蔵、
脳、副腎、睾丸、卵巣等の他、微生物としてはシ
ユードモナス属、例えばシユードモナス エアル
ギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、シユード
モナス フルオレスセンス（Pseudomonas
fluorescens）、シユードモナス ノブエスピー、
シユードモナス デイスモリテイカ等、アクロモ
バクター属、例えばアクロモバクター デリカチ
ユラス（Achromobacter delicatulus）等、フザ
リウム属、ノカルジア属、ストレプトミセス属、
キヤンデイダ属、例えばキヤンデイダ リポリテ
イカ、キヤンデイダ トロピカリス、キヤンデイ
ダ インターメデイア、キヤンデイダ シリンド
ラシア等をそれぞれ例示できる。 上記各酵素の大部分は、精製された酵素として
市販されており、本発明ではこれらの市販品をそ
のまま用いることができるが、特に精製された市
販品を用いる必要はなく、例えば目的とする酵素
の生産能を有する微生物菌体そのもの、その培養
液、該培養液を処理して得られる粗酵素液や酵素
を含む組成物等を利用することもでき、また上記
各酵素を常法に従い適当な担体等に固定化した固
定化酵素を用いることもできる。 本発明において上記リパーゼ又はコレステロー
ルエステラーゼを用いて合成される一方の原料と
してのステロール類とは、分子内にステロイド骨
格と水酸基とを有する化合物をいう。ここでステ
ロイド骨格とは、式 で表わされる骨格であり、水酸基は上記骨格に直
接結合しているが一般的である。本発明に用いら
れる上記ステロール類の具体例としては、例えば
コレステロール、７−デバイドロコレステロー
ル、β−コレスタノール、コプロスタノール、ラ
ストテロール、チモステロール、チモステノー
ル、デスモステロール、ブラシカステロール、エ
ルゴステロール、カンペステロール、β−シトス
テロール、γ−シトステロール、α−スピナステ
ロール、ステイグマステロール等、トリメチルス
テロールとしてラノステロール、ジヒドロラノス
テロール、アグノステロール、ジヒドロアグノス
テロール及び之等の混合物としての羊毛ロウより
分離精製して得られるイソコレステロール、シク
ロアルテノール等を例示できる。 本発明において他方の原料とする脂肪酸は、炭
素数が２〜32の飽和もしくは不飽和の脂肪酸のい
ずれでもよく、之等は直鎖でも分岐鎖でもよい。 飽和の直鎖脂肪酸としては、例ば酢酸、酪酸、
カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン
酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セ
ロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、ｎ−ドトリ
アコンタン酸等の炭素数が偶数である飽和直鎖脂
肪酸、及び例えばプロピオン酸、ｎ−吉草酸、エ
ナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデ
カン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナ
デカン酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ペ
ンタコサン酸、ヘプタコサン酸等の炭素数が奇数
である飽和直鎖脂肪酸を例示できる。 飽和の分岐鎖脂肪酸としては、例えばイソ酪
酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプ
リン酸、イソラウリン酸、11−メチル−ドデカン
酸、イソミリスチン酸、13−メチル−テトラデカ
ン酸、イソパルミチン酸、15−メチル−ヘキサデ
カン酸、イソステアリン酸、17−メチル−オクタ
デカン酸、イソアラキン酸、19−メチル−エイコ
サン酸、αエチル−ヘキサン酸、α−ヘキシルデ
カン酸、α−ヘプチルウンデカン酸、２−デシル
テトラデカン酸、２−ウンデシルテトラデカン
酸、２−デシルペンタデカン酸、２−ウンデシル
ペンタデカン酸、式 で表わされるフアインオキソコール180酸〔日産
化学社製〕等を例示できる。また上記飽和の奇数
分岐鎖脂肪酸には、例えば６−メチル−オクタン
酸、８−メチル−デカン酸、10−メチル−ドデカ
ン酸、12−メチル−テトラデカン酸、14−メチル
−ヘキサデカン酸、16−メチル−オクタデカン
酸、18−メチル−エイコサン酸、20−メチル−ド
コサン酸、22−メチル−テトラコサン酸、24−メ
チル−ヘキサコサン酸、26−メチル−オクタコサ
ン酸等の末端がイソブチル基であるアンチイソ系
の脂肪酸が包含される。 不飽和の脂肪酸としては、例えばトウハク酸、
カプロレイン酸、リンデル酸、ラウロレイン酸、
ツヅ酸、フイセトレイン酸、ミリストレイン酸、
パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン
酸、エライジン酸、バクセン酸、カドレイン酸、
シス−11−エイコセン酸、セトレイン酸、エルカ
酸、セラコレイン酸、17−ヘキサコセン酸、６，
９，12，15−ヘキサデカテトラエン酸、リノール
酸、リノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−
エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，12，15
−オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、アラ
キドン酸、５，８，11，14，17−エイコサペンタ
エン酸、７，10，13，16，19−ドコサペンタエン
酸、４，７，10，13，16，19−ドコサヘキサエン
酸等を例示できる。 また本発明に用いられる脂肪酸は、分子内に水
酸基を有するオキシ脂肪酸であつてもよい。この
オキシ脂肪酸としては、例えばα−ヒドロキシラ
ウリル酸、α−ヒドロキシミリスチン酸、α−ヒ
ドロキシパルミチン酸、α−ヒドロキシステアリ
ン酸、ω−ヒドロキシラウリル酸、α−ヒドロキ
シアラキン酸、９−ヒドロキシ−12−オクタデセ
ン酸、リシノール酸、α−ヒドロキシベヘニン
酸、９−ヒドロキシ−トランス−10，12−オクタ
デカジエン酸、カモレン酸、イプロリル酸、９，
10−ジヒドロキシステアリン酸、12−ヒドロキシ
ステアリン酸等を例示できる。 更に上記脂肪酸は、例えばシユウ酸、マロン
酸、コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、ピメ
リン酸、セベリン酸、アゼライン酸、セバシン
酸、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸等のポリカルボン酸であつ
てもよい。 上記脂肪酸は、その一種を単独で本発明の反応
に利用してもよく、上記例示の同一群又は異なる
群に属する二種以上を混合して本発明に用いるこ
ともできる。二種以上を併用する場合には、脂肪
酸原料として、例えば飽和の直鎖及び分岐脂肪酸
並びにオキシ脂肪酸の混合物であるラノリン脂肪
酸等を有利に用いることができる。 本発明反応は、上記ステロール類と脂肪酸とを
基質として、之等をリパーゼ又はコレステロール
エステラーゼの存在下に接触させることにより進
行する。上記接触は、両基質と水酸基の水溶液と
を単に混合するのみで行なうことができ、従つて
反応系は通常水系であるが、他の適当な有機溶
媒、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オ
クタン、イソオクタン、クロヘキサン、ｎ−デカ
ン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン、ｎ−ヘ
キサデカン、ポリブテン、ジイソブレン、流動パ
ラフイン、スクワラン、スクワレン、プリスタン
等の炭化水素系溶媒を用いた有機溶媒系とするこ
ともできる。かかる有機溶媒の利用によれば、反
応系の物理的性状が改善され、上記接触がより良
好となる場合があり、また得られるエステル類や
用いた酵素の反応系からの分離回収がより効率よ
く行える場合がある。また上記混合は反応系をよ
り均一なものとするため通常攪拌により行なわれ
るのが望ましい。反応条件は、用いられる酵素の
失活がないかこれが最小限に抑制される条件であ
ればよく、通常酵素の最適PH及び最適温度条件が
採用される。一般に上記温度としては、約10〜60
℃の範囲が好適であるが、耐熱性リパーゼ等を用
いる場合には、該酵素に応じてより高温を採用す
ることもできる。PHは、用いる酵素に応じてアル
カリ性、中性及び酸性のいずれかが採用され、こ
のPHを調節するために適当な酸やアルカリ、例え
ば塩酸、硫酸等や水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム等及び例えばリン酸緩衝液等の適当な緩衝液
を、必要に応じて、反応系内に添加することもで
きる。 また上記反応系内には、両基質と酵素との接触
性を高めるために、例えば「ツイーン80」（花王
アトラス社製）、「トリトンＸ−100」（ローム ア
ンド ハース社製）等の非イオン系界面活性剤等
の酵素阻害のない適当な界面活性剤等を加えるこ
とももできる。更に用いる酵素の賦活因子として
知られている例えばカゼイン、アルブミン、カル
シウムイオン、胆汁酸及びその塩等を添加するこ
ともできる。 反応系内に存在させる酵素及び両基質の比率
は、それらの種類、反応条件等に応じて適宜選択
され特に制限はないが、通常酵素は原料ステロー
ル１ｇ当り、リパーゼについては、約１〜10万単
位、好ましくは5000〜５万単位程度、コレステロ
ールエステラーゼについては約１〜10万単位、好
ましくは500〜５万単位程度とするのがよい。両
基質の使用比率も任意に決定でき、いずれを過剰
としてもよく特に制限はないが、通常ステロール
に対して脂肪酸を約１〜20倍モル量、好ましくは
約３〜６倍モル量用いるのがよい。反応は水媒系
でも有機溶媒系でも行なうことができるが、反応
系内には、原料ステロール１ｇに対して少なくと
も約0.1ml、通常約１ml以上の水が存在すること
が好ましい。一般に水媒系ではステロールに対し
て水を約５〜500倍重量用いるのがよく、これに
より反応は有利に進行する。また有機溶媒系を採
用する場合、溶媒の使用量は、該溶媒の種類によ
つても若干異なるが、例えばイソオクタンでは、
通常イソオクタン／水が約0.001〜100重量比、好
ましくは0.01〜10重量比となる範囲で使用され、
この場合も全溶媒（有機溶媒＋水）の使用量はス
テロールに対して約５〜500倍重量とするのが望
ましい。他の有機溶媒も上記イソオクタンと略々
同様の範囲で用いることができる。 本発明反応は、反応条件、用いられる酵素の種
類、使用量、基質の種類、使用比率等により異な
るが、通常約30分〜120時間で終了する。 本発明では上記反応終了後、目的物を常法に従
い反応系より分離し、必要により精製する。反応
系からの目的物の単離精製操作としては、例えば
反応液をエーテル等の適当な溶剤を用いて抽出
し、未反応の脂肪酸原料をアルカリ脱酸により除
去し、溶剤層を脱水乾燥した後、溶剤を除去する
方法を例示できる。かくして得られる粗ステロー
ル脂肪酸エステルの精製は、常法に従い例えばカ
ラムクロマトグラフイー等により行ない得る。 かくして得られるステロール脂肪酸エステル、
は、この種ステロール脂肪酸エステルが従来利用
されている各種の広範な用途に利用できる。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実験例
及び実施例を挙げる。 尚、各例において酵素量の表示は、以下に示す
方法により求められた国際単位を用いた。 ＜リパーゼの活性測定＞ ポリビニルアルコールの溶液（「ポバール
＃117」（倉敷レーヨン社製）18ｇと「ポバール
＃205」（同上社製）２ｇとを水800mlに懸濁し、
75〜80℃に加温攪拌して完全に溶かした後、冷却
し、これに水を加えて1000mlとしたもの）75ml
に、オリーブ油22.9ｇをホモジナイザーにて乳化
して調製したオリーブ油乳化液５mlと0.1Mリン
酸緩衝液４mlとの混液に、試料酵素液１mlを加
え、マグネチツクスタラーで500rpmで攪拌しつ
つ37℃で20分間反応させ、次いでこれにエチルア
ルコール40mlを注加して、0.05M水酸化カリウム
溶液で遊離脂肪酸を滴定する。この条件で１分間
に1μモル当量の脂肪酸を遊離する酵素量を１国
際単位(U)とする。 ＜コレステロールエステラーゼの活性測定＞ コレステロールエステラーゼの１単位（1U）
とは、子牛血清を基質として37℃で１分間に1μ
モルのコレステロールを遊離させる活性であり、
以下の反応液、酵素溶液を用いて遊離コレステロ
ールコレステロールオキシダーゼで酸化し、生成
する過酸化水素をパーオキシダーゼで比色定量す
ることにより求められる。 反応液組成 Γ0.2Mリン酸緩衝液（PH6.5） 0.6ml Γパーオキシダーゼ（シグマケミカル社製、タイ
プNo.Ｐ−8250） 0.3ml Γ0.35％４−アミノアンチピリン水溶液 0.3ml Γ0.2w／ｗ％フエノール水溶液 0.3ml Γコレステロールオキシダーゼ水溶液〔東洋醸造
社製、プロダクトNo.Ｔ−04を0.1Mリン酸緩衝
液（PH7.0、0.05w／ｖ％のトリトンＸ−100を
含む）で10U／mlとする〕 0.6ml Γ子牛血清〔グランド アイランド バイオロジ
カル（USA）社製〕 0.3ml Γ蒸留水 0.3ml 試料酵素溶液としては、酵素を10mMリン酸緩
衝液（PH7.5、0.1％アルブミンを含む）に溶かし
て約1U／mlに調製して用いる。上記反応液３ml
を比色用セルに入れ、37℃で10分間インキユベー
トし、0.05mlの試料酵素溶液を加え、静かに転倒
混合し、493nmで経時測定を行ない、吸収の増加
率（△As／分）を測定する。同じことを試料酵
素溶液の代りに、希釈用緩衝液を用いて行ない増
加率（ΔAb／分）を求める。上記吸収増加率の
差（ΔA／分＝ΔAs−ΔAb）が0.05以下の時は、
これが0.05以上になるまで試料酵素溶液の濃度を
高くして操作を繰返す。酵素活性（Ｕ／mg）は、
次式により算出される。 酵素活性（Ｕ／mg）＝ ΔA／分／12.0×0.5×3.05／0.05×１／酵素濃度（
mg／ml） また目的エステルの合成率は、次の方法により
算出した。即ち、反応終了後、反応液を酸性と
し、ジエチルエーテルにて４回抽出し、水洗後、
脱水乾燥してジエチルエーテルを留去し、全脂質
分を得、これに既知量の内部標準物質（ｎ−ドト
リアコンタン）を加えて定量用試料とする。この
試料をクロマツド（石英ロツドにシリカゲルを溶
着したもの、ヤトロン社製、クロマロツドＳ）
にチヤージし、展開して、イアトロスキヤンTH
−10（ヤトロン社製、FID水素炎イオン化方式）
検出器にかけて、合成されたエステルの量を求
め、これを反応器の仕込み量より算出される理論
合成エステル量で除して合成率とする。但し実験
例10〜13及び実施例２及び３における合成率は、
以下の方法により求めた。即ち、反応終了後、反
応液を水−有機溶媒２相系とし、有機溶媒相を分
離後、その濃度を適当に調整し、クロマロツドに
脂質分として20〜40μg程度チヤージし、目的エ
ステルと未反応基質が分離する適当な条件（例え
ばヘキサン／エーテル／蟻酸＝56／14／0.3）で
展開し、その後数分間乾燥し、展開溶媒を除去し
たクロマロツドをイアトロスキヤンTH−10検出
器にかけて、反応液中の脂質成分のピーク面積を
求め、該面積をもとにして、目的エステルの合成
率（％）を次式により算出した。 合成率＝〔目的エステルピーク面積／（第１成分ピー
ク面積＋目的エステルピーク面積）〕×100 但し第１成分とは、反応基質としては仕込んだ
両基質の内の小モル数の成分を意味する。 各実験例では、特に断わらない限り、反応液の
攪拌混合は、20mm×300cpmの試験管振盪培養機
（いわしや生物科学社製、RMR−Ｓ−20）にて
行なつた。また実験例１〜８では、酵素としてキ
ヤンデイダ シリンドラシア（Candida
cylindracea）由来のリパーゼ（「リパーゼMY」
名糖産業社製）用いた。他の例では各例毎に示
す。 実験例 １ この例は、エステル合成率と基質量の関係を明
らかにするものであり、ステロール類としてコレ
ステロールを用い、その一定量（0.1ｇ）に対し
て脂肪酸としてのオレイン酸を種々変化させさせ
た量で用い、一定濃度のリパーゼ水溶液0.5ml
（500U）の存在下に、両者を、37℃で18時間攪拌
混合して反応させた。結果を下記第１表に示す。

【表】 上記第１表より、コレステロール１重量に対し
てオレイン酸を約１〜６倍重量用いることによ
り、ほぼ80％以上の合成率をもつて目的とするコ
レステロールのオレイン酸エステルを合成できる
ことが判る。またオレイン酸を２〜６倍重量（３
〜９倍モル）を用いる場合に速やかに、最も高い
合成率をもつて目的エステルが合成できることが
判る。 実験例 ２ この例は、反応系の水量が目的エステルの合成
率にいかなる影響を与えるかを調べるために行な
つたものである。実験は、コレステロール0.1ｇ
及びオレイン酸0.22ｇを用いて、これにリパーゼ
0.5ml（500U）を作用させる時、水0.5ml、1.0ml、
2.0ml、4.0ml及び6.0mlを添加してそれぞれ反応
（条件は実施例１に同じ。）させることにより行な
つた。各反応による合成率を求めた結果を下記第
２表に示す。

【表】 上記第２表より、水の添加量は約１〜３ml（コ
レステロールに対して約10〜30重量倍）とするの
が好ましいことが判る。 実験例 ３ この例は、反応系を有機溶媒系とした場合のエ
ステル合成率を求めたものである。実験は、実験
例２において水の代りに、水で飽和させたイソオ
クタン、ｎ−オクタン又はｎ−ヘキサンのそれぞ
れ所定量を用いて、同様にした。結果を下記第３
表に示す。

【表】 第３表より、上記系ではイソオクタンが最も酵
素の失活が少ないことが判る。該イソオクタン
は、0.5〜３mlの添加により目的とするエステル
の合成率を顕著に向上できた。 実験例 ４ この例は、水とイソオクタンとの系での目的エ
ステルの合成率を調べたものであり、実験例２に
示した反応系にイソオクタン2.0mlを加え、これ
に更に水の所定量を添加して、同条件下に反応を
繰返した。結果を下記第４表に示す。

【表】

【表】 実験例 ５ この例は実験例４と同様にイソオクタンとの混
合溶媒系での反応において水の量を2.0mlに固定
し、イソオクタンの添加量を化させたときの目的
エステルの合成率の変化を調べたものである。条
件は実験例４に同じである。結果を下記第５表に
示す。

【表】 第５表より、水２mlとイソオクタン0.5〜3.0ml
（ステロールの５〜30倍）との併用が合成率を顕
著に向上させることが判る。 実験例 ６ この例は、脂肪酸が固体の場合に有機溶媒を用
いた系での反応と水系での反応とを対比したもの
である。条件は実験例１と同様とした。但し有機
溶媒系の反応の場合は、反応液に更にｎ−オクタ
ン2.0ml及び水7.5mlを加え、水系の反応の場合は
水2.0mlを加えた。固体の脂肪酸としてはパルミ
チン酸及びステアリン酸を用いた。結果を第６表
に示す。第６表には参考のため常温液状のオレイ
ン酸を用いた場合の結果を併記する。

【表】 上記第６表より、特にステアリン酸の場合に
は、有機溶媒の使用が合成率向上に顕著な効果を
発揮することが判る。 実験例 ７ この例は、コレステロール0.1ｇ、オレイン酸
0.22ｇ、２−オクタン2.0ml及び水8.0mlの反応液
系内に、種々の濃度のリパーゼ溶液0.5mlを加え、
酵素の濃度とエステル合成率との関係を求めたも
のである。反応条件は実験例１と同じ（37℃、20
mm×300cpm、18時間）である。結果を第１図に
示す。第１図は、縦軸にエステル合成率（％）
を、横軸に酵素単位（国際単位、Ｕ）をとり、各
酵素単位で酵素を利用した時の合成率をプロツト
したものである。 第１図より、コレステロール１ｇに対して、約
5000Uの酵素があれば、反応は速やかに進行し、
高収率で目的エステルの合成が行ない得ることが
判る。 実験例 ８ この例は、実験例７において、18時間の反応で
約30〜40％の合成率示す酵素量（約100U）のリ
パーゼを用いた場合、作用時間を更に延長してそ
の反応時間とエステル合成率との関連を求めたも
のである。 結果を下記第７表に示す。

【表】 第７表より、酵素を100Uを用いる場合でも、
反応時間を120時間に延長すると、目的エステル
の合成率を約80％にできることが判る。 実験例 ９ 第８表に示すステロール類（使用量0.1ｇ）、脂
肪酸及び酵素のそれぞれ所定量を用い、同表に示
す反応系（水及び有機溶媒）を採用して、実験例
１と同様にして目的エステルを合成し、その合成
率を調べた。結果を第８表に併記する。 但し、第８表中ステロール類、脂肪酸、酵素及
び有機溶媒における記号は次ものを示す。 ＜ステロール類＞ Ａ−１……コレステロール、 Ａ−２……β−シトステロール Ａ−３……ステイグマステロール Ａ−４……β−コレスタノール Ａ−５……エルゴステロール Ａ−６……イソコレステロール ＜脂肪酸＞ Ｂ−１……オレイン酸 Ｂ−２……パルミチン酸 Ｂ−３……ステアリン酸 Ｂ−４……リノール酸 Ｂ−５……α−ヒドロキシパルミチン酸 Ｂ−６……ラノリン脂肪酸 ＜酵 素＞ Ｅ−１……リパーゼMY（名糖産業社製、キヤン
デイダ シリンドラシア由来、280U／mg） Ｅ−２……リパーゼＴ−01（東洋醸造社製、クロ
モバクテリウム ビスコサム由来、
280U／mg） Ｅ−３……リパーゼ「アマノ」Ａ（天野製薬社製、
アスペリギルス属由来、4U／mg） Ｅ−４……リパーゼ「アマノ」Ｐ（同社製、シユ
ードモナス属由来、30U／mg） Ｅ−５……コレステロールエステラーゼＴ−18
（東洋醸造社製、105U／mg） Ｅ−６……コレステロールエステラーゼ（キヤン
デイダ シリンドラシア由来、20U／mg蛋
白、生化学工業社製） ＜有機溶媒＞ Ｓ−１……ｎ−オクタン Ｓ−２……イソオクタン

【表】 実験例 10 コレステロール0.1ｇに対して、37℃にて、第
９表に示す脂肪酸（対ステロール３モル）及び酵
素（1000U）をそれぞれ用い、イソオクタン／
0.05Mリン酸バツフア（PH７）＝３ml／７mlの反
応系を採用して同表に示す反応時間での目的エス
テルの合成率を調べた。その結果を第９表に併記
する。但し、第９表中の酵素における記号は、第
８表と同じであり、脂肪酸における記号は第８表
と同じであるか又は次のものを示す。 ＜脂肪酸＞ Ｂ−７……プロピオン酸 Ｂ−８……カプリン酸 Ｂ−９……リグノセリン酸 Ｂ−10……コハク酸 Ｂ−11……セバシン酸

【表】 実験例 11 コレステロール0.1ｇ、オレイン酸0.22ｇ、リ
パーゼMY1000U、イソオクタン／0.05Mリン酸
バツフア（PH７）＝２ml／８mlよりなる反応系を
採用し、37℃にて反応を行ない合成率の経時変化
を調べた。 その結果を第10表に併記する。

【表】 実験例 12 この例は、コレステロール0.1ｇ、オレイン酸
0.22ｇ、リパーゼMY500U及び有機溶媒／0.05M
リン酸バツフア（PH7.0）＝２ml／８mlからなる反
応系を用いて37℃で６時間反応させて有機溶媒の
種類によるコレステロールオレイン酸エステル合
成率の変化を調べたものである。 有機溶媒としては、以下のものを用いた。 Ｓ−２……イソオクタン Ｓ−３……シクロヘキサン Ｓ−４……ｎ−ヘキサデカン Ｓ−５……「アイピーソルベント1016」（出光石
油化学(株)社製、C₈：63％、、C₉：30％を主
成分とするイソパラフイン系有機溶媒混合
物 Ｓ−６……「アイソパーＥ」（エクソン化学社製、
C₈：25〜35％、C₉：75〜60％を主成分と
するイソパラフイン系有機溶媒混合物 結果を下記第11表に示す。

【表】 実施例 １ コレステロール10ｇ、オレイン酸22ｇ、イソオ
クタン50ml、リパーゼMY（名糖産業社製）水溶
液200ml（50000U）を含む反応液を、200rpmの
速度で攪拌しながら、37℃で18時間反応させた。
この反応液にエーテルを加え、重曹水で洗浄しな
がら水層を除去し、この処理を数回繰返した後、
エーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥し
た。次いでエーテルを留去し、白色半透明の粗コ
レステロールオレイン酸エステルを得た。この粗
コレステロールオレイン酸エステルの純度は96.3
％であり、収量は16.0ｇ（収率95.0％）であつ
た。 上記で得た粗生成物６ｇをシリカゲルカラムク
ロマトグラフイー（ワコーゲルC200、和光純薬
社製、160ｇ）にチヤージし、ベンゼン2000mlで
溶出して、コレステロールオレイン酸エステル
5.3ｇを得た。このものの赤外線吸収スペクトル
（IR）、融点、薄層クロマトグラフイー（TLC）
上での発色、Rf値は、標準品のコレステロール
オレイン酸エステルのそれと完全に一致した。 実施例 ２ コレステロール１ｇ、イソステアリン酸（エメ
リーインダストリイー社製）2.2ｇ、リパーゼ
MY0.333ｇ（10000U）、イソオクタン30ml及び
0.05Mリン酸バツフア80mlを含む反応液を、
200rpmの速度で攪拌しながら、37℃で45時間に
亘つて、反応させた。この反応液を反応途中で逐
次サンプリングして、目的エステルの合成率を調
べたところ、３時間で28.5％、23時間で85.9％及
び45時間で91.0％であつた。 反応開始45時間で、反応を停止させ、メタノー
ル水溶液抽出を行ない、抽出液よりイソオクタン
層を留去して、未反応コレステロール0.09ｇ、未
反応イソステアリン酸1.53ｇ及び目的とするイソ
ステアリン酸エステル1.54ｇを得た。 得られたイソステアリン酸エステルは、TLC
にて単一スポツトを与え、イアトロスキヤン分析
では純度100％であつた。 実験例 13 第12表に示す酵素、ステロール類及び脂肪酸の
所定量を用い、イソオクタン／0.05Mリン酸バツ
フア（Hz７）＝３ml／８mlの系で所定時間反応を
行なつた。結果を反応時間と共に第12表に併記す
る。 尚、第12表における略号は、前記したものであ
るか又は次のものを示す。 ＜酵 素＞ Ｅ−７……コレステロールエステラーゼ（シユー
ドモナス属由来、100U／mg、フナコシ薬
品社製） Ｅ−８……リパーゼOF（キヤンデイダ シリンド
ラシア由来、360U／mg、名糖産業社製） ＜脂肪酸＞ Ｂ−12……イソステアリン酸（エメリーインダス
トリーズ社製） Ｂ−13……リノレン酸（東京化成工業社製）

【表】 実施例 ３ ジヒドロコレステロール10ｇ、オレイン酸11
ｇ、リパーゼMY333mg （10000U）及びシクロヘキサン５mlの混合物
を200cpmで64時間攪拌して反応させた。反応開
始後40時間後の合成率は73.1％であり、64時間後
のそれは83.1％であつた。 上記反応後、反応混合物をメタノール水溶液で
抽出して未反応のジヒドロコレステロール及びオ
レイン酸を除去し、シクロヘキサン層からシクロ
ヘキサンを留去して目的とするジヒドロコレステ
ロールオレイン酸エステルの12.40ｇを得た。 以下に示す各実施例は、下記酵素、ステロール
及び脂肪酸（略号で表記））のそれぞれを組合せ
用い前記各実施例と同様にして所望ステロール脂
肪酸エステルを合成した例であり、使用酵素活性
は次の通り表示するものとする。 即ちリパーゼ1IUとは測定条件下１分間に1μM
の脂肪酸を遊離する酵素量である。尚、SP−382
（耐熱性、キヤンデイダアンタークチカ由来、約
２％の水を含むアクリル樹脂に固定されたもの、
ノボインダストリー社製）はバツチエステル交換
単位（BIU、1BIUはトリオレインと等モルパル
ミチン酸を基質として60℃で１分間に1μMのパ
ルミチン酸をトリオレイン中に取込む（エステル
交換する）量である）にて表示した。 またコレステロールエステラーゼの1IUは測定
条件下１分間に1μMのコレステロールを遊離す
る酵素量である。 尚、各反応は特記しない限り、往復動シエイカ
ー（20mm×300cpm、イワシヤ生科学社製、モデ
ル：RMR−Ｓ−20）を用い、37℃の恒温室内で
行ない、有機溶媒は水飽和のものを用いた。 ［酵素（リパーゼ）］ Ps.flu……シユードモナス・フルオレツセンス由
来；238IU／mg Ps.mep……シユードモナス・メヒチカ由来；
2.16IU／mg C.c−OF……リパーゼOF（キヤンデイダ シリン
ドラシアの変異株由来；360IU／mg、名糖
産業社製） C.rugo……リパーゼAY30（キヤンデイダ ルゴ
ーサ由来；30IU／mg、天野製薬社製） C.ante……SP−382（キヤンデイダ アンターク
チカ由来；40BIU／mg） Alc.sp……アルカリゲネス属由来、1000IU／バ
イアル、生化学工業社製） ［酵素（コレステロールエステラーゼ）］ C.c……キヤンデイダ シリンドラシア由来；
20IU／mg、生化学工業社製） T18……コレステロールエステラーゼＴ−18；
105IU／mg、東洋醸造社製） Ps.sp……シユードモナス属由来；100IU／mg、
フナコシ薬品社製） ［ステロール類］ Cho……コレステロール Phyto……フイトステロール（タマ生化学社製）
（カンペステロール28％、スチグマステロ
ール14％、β−シトステロール48％、ブラ
シカステロール７％の混合物） Sito……β−シトステロール bCho……β−コレスタノール（ジヒドロコレス
テロール） Stig……スチグマステロール Ergo……エルゴステロール ［脂肪酸類］ OA……オレイン酸 SA……ステアリン酸 ISA……イソステアリン酸（エメリー社製、エマ
ゾール＃875） DecA……デカン酸（ノルマル−カプリン酸） NonA……ノナン酸（ペラルゴン酸） ProA……プロピオン酸 LFA.D……蒸留ラノリン脂肪酸（吉川製油社製） 実施例 ４ リパーゼ（Ps.flu）4.2mgを0.05Mリン酸バツフ
ア（PH７、以下PB7という）８mlに溶かした水溶
液を、Cho100mg、OA220mg及びイソオクタン３
mlからなる基質溶液に加え、37℃又は60℃で40分
間反応させた。その結果、エステル合成率はそれ
ぞれ80.7％及び78.6％であつた。 実施例 ５ Cho78mg、LFA.D159mg及びイソオクタン２ml
からなる基質溶液に、リパーゼ（シユードモナ
ス・フルオレツセンス由来；30IU／mg、リパー
ゼＰ（アマノ）天野製薬社製）1000IUをPB78ml
に溶かした水溶液を加え、37℃で40時間反応させ
た。その結果、エステル合成率は98.7％であつ
た。 実施例 ６ 各種ステロール類と脂肪酸類とを、第13表に示
す量でイソオクタン３mlに溶かして基質溶液と
し、これに各種酵素をPB7の７mlに溶した水溶液
を加えて反応させた。得られた結果を第13表に併
記する。

【表】

【表】 実施例 ７ 各種ステロール類と脂肪酸類とを、第14表に示
す量でイソオクタン10mlに溶して基質溶液とし、
これに固定化酵素（C.ante）の所定量を加えて反
応させた。得られた結果を第14表に併記する。

【表】

【表】 実施例 ８ リパーゼ（シユードモナス フラギ由来、
3040IU／mg、フナコシ薬品社製）0.33mgをPB7の
８mlに溶かした水溶液を、Cho100mg、OA219mg
及びイソオクタン３mlからなる基質溶液に加え
て、37℃で66時間反応させた。その結果、エステ
ル合成率は88.4％であつた。 実施例 ９ フイトステロール（カンペステロール32％、ス
チグマステロール10％、β−シトステロール55
％、ブラシカステロール３％の混合物）10ｇ及び
OA8.8ｇをイソオクタン75mlに溶して基質溶液と
した。これにリパーゼMYの2.4ｇを蒸留水25ml
に溶した酵素水溶液を加えて、94時間反応させ
た。その結果、エステル合成率は99.6％であつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素の使用量と目的エステルの合成
率との関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ リパーゼもしくはコレステロールエステラー
   ゼを用いて、分子内にステロイド骨格及び水酸基
   を有する化合物と脂肪酸とを接触反応させること
   を特徴とするステロール脂肪酸エステルの製造方
   法。