JPH05344890A - Ｎａｄｈオキシダーゼをコードする遺伝子及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アンフィバチルス・キシラナスＥｐ０１から
ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を単離し、この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片が導入されたプラスミドｐＮＯＸ２
を保有するエシェリヒア・コリＮＹ０２を培養すること
により、ＮＡＤＨオキシダーゼを効率的に製造すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮＡＤＨオキシダーゼを
コードする遺伝子ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を保有する
プラスミド及び該プラスミドで形質転換された微生物を
用いるＮＡＤＨオキシダーゼの製造法に関する。ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下、ＮＡＤＨと略す）を分子状酸素を用
いて酸化し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下ＮＡＤ⁺ と略す）を再生する有用な酵素である。

【０００２】ＮＡＤＨオキシダーゼによって再生される
ＮＡＤ⁺ は、生体内で行なわれる種々の脱水素酵素反応
の補酵素として作用する有用な物質である。このＮＡＤ
⁺を補酵素とする脱水素酵素の多くは、工業的に有用な
光学活性化合物や反応中間体等の製造に好適に用いられ
ているものである。

【０００３】

【従来の技術】従来より分子状酵素を電子受容体として
ＮＡＤＨを酸化するＮＡＤＨオキシダーゼとしては、ラ
クトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のもの〔アグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ
ｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）２５巻、第８７６ページ、１９６１
年〕、ストレプトコッカス・フアエカリス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のもの〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、２３７巻、第２６４７ページ、１９６２
年〕、アコレプラズマ・ライドラウイ（Ａｃｈｏｌｅｐ
ｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ）由来のもの〔ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）、１２０巻、第３２９ページ、１９８１
年〕、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のもの〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９８巻、第１４３３ページ、１９
８５年〕、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅ
ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由
来のもの〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、９
７巻、第１２７９ページ、１９８５年〕等が報告されて
いる。

【０００４】しかしながら、これらの技術で知られてい
るＮＡＤＨオキシダーゼは、該微生物の培養がむずかし
く大量調製が困難である（アコレプラズマ・ライドラウ
イ等）、該酵素が菌体内画分に存在するため採取がむず
かしい、菌体内含量の向上が困難である（バチルス・メ
ガテリウム等）、熱安定性が弱く長期にわたる活性の保
持を期待しえない（ロイコノストック・メセンテロイデ
ス等）等の欠点を有しており、いずれも工業的生産に適
していない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、工業的
製造に適したＮＡＤＨオキシダーゼ源微生物について広
く検索した結果、アルカリ性領域に至適生育pHを有し、
酸素の存在下でも不在下でも生存しうる或る種の嫌気性
細菌が、温度安定性に優れたＮＡＤＨオキシダーゼを生
産することを見い出し、該微生物を培地で培養し、ＮＡ
ＤＨオキシダーゼを工業的に製造する方法を提案した
（特開平２−１０７１８６号公報参照、以下、上記微生
物を「好アルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ
生産菌」と言うことがある）。

【０００６】本発明者らは、更に効率的にＮＡＤＨオキ
シダーゼを製造する方法を鋭意検討した結果、好アルカ
リ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌の染色体
より、ＮＡＤＨオキシダーゼの生合成を司る遺伝子を含
むＤＮＡ領域（ａ）の抽出およびその塩基配列の解析を
し、それをＣｏｌＥ１系プラスミドの自律増殖能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ領域（ｂ）を有するプラスミドベク
ターに連結し、該プラスミドで形質転換した微生物、例
えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）Ｋ−１２系微生物を生育培地で培養すると、効
率的にＮＡＤＨオキシダーゼが製造できることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、（１）ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片、（２）該ＤＮＡ断片が導入された組換
えプラスミド、（３）該組換えプラスミドで形質転換さ
れたエシェリヒア・コリＫ−１２系微生物、（４）該微
生物を培養し、培養物よりＮＡＤＨオキシダーゼを採取
することを特徴とするＮＡＤＨオキシダーゼの製造法が
提供される。

【０００８】以下、本発明の遺伝子ＤＮＡ断片、組換え
プラスミドの構成及びその調製法、並びに該プラスミド
で形質転換された微生物によるＮＡＤＨオキシダーゼの
製造法についてさらに詳細に説明する。本発明の「ＮＡ
ＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片」は、ＮＡＤＨを分子状酸素を用いて酸化してＮＡＤ
⁺ を再生する機能をもつ酵素、すわちＮＡＤＨオキシダ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味する。

【０００９】このＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺
伝子を含むＤＮＡ断片（以下これを「Ｎ断片」と略称す
ることがある）は、その塩基配列が決定された後は合成
することも可能であるが、通常はＮＡＤＨオキシダーゼ
生産性を有する微生物からクローニングすることができ
る。その供給源となる微生物としては、好アルカリ性通
性嫌気性細菌に属し、ＮＡＤＨオキシダーゼ生産能を有
する菌株（好アルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダ
ーゼ生産菌）またこれらの変異株を用いることができ
る。これらの性質を有する菌株の好適具体例としては、
例えば、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５１
巻、第２２７１〜２２７５ページ（１９８７）に記載さ
れているＥｐ０１株があげられる。本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微生物受託番号 微工研条寄第
２７４４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７４４）として寄託さ
れている。

【００１０】なお、このＥｐ０１株は、インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）第４０巻、第２９７〜３０１ページ（１９９０）
において、新属新種の細菌アンフィバチルス・キシラナ
ス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌａｎｕｓ）Ｅ
ｐ０１として認められている。

【００１１】これら供給源微生物からＮ断片を調製する
ための基本的操作の一例を述べれば次のとおりである。
Ｎ断片は、上記好アルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキ
シダーゼ生産菌、例えばＥｐ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
２７４４）の染色体上に存在し、この染色体から以下に
述べる方法で分離、取得することができる。

【００１２】先ず、好アルカリ性通気性嫌気性のＮＡＤ
Ｈオキシダーゼ生産菌ＥＰ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２
７４４）の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この染
色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ、Ｂａ
ｍＨＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。得られ
るＤＮＡ断片をクローニングベクター、例えばｐＢＲ３
２２（宝酒造製）に挿入し、このベクターを用いて適当
な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株（宝酒造製）を
形質転換し、アンピシリンを含有する栄養培地に塗抹、
培養し、コロニーを形成させる。培地上にニトロセルロ
ースメンブレンをおき、熱誘導をかけてコロニーに由来
する菌体成分をメンブレン上に移し、例えばアマシャム
社製イムノスクリーニングシステム（ＳｕｐｅｒＳｃｒ
ｅｅｎ^TM）を用いて、抗ＮＡＤＨオキシダーゼ抗体を一
次抗体として用いるイムノアッセイによりＮＡＤＨオキ
シダーゼの発現クローンを確認し、目的とするＮ断片が
導入されたプラスミドを保有するエシェリヒア・コリの
コロニー（形質転換株）を選択し、取得することができ
る。

【００１３】かくして得られる形質転換体を培養し、得
られる菌体から調製した無細胞抽出液について、酸素電
極を用いてＮＡＤＨ酸化時の酸素吸収を測定し、野性株
の酸素吸収と比較することにとりＮＡＤＨオキシダーゼ
の活性の増大を確認することができる。さらに、この形
質転換株より、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８
２）ｐ９０〜９１参照〕によりプラスミドを抽出し、適
当な制限酵素で切断し、分子量をアガロースゲル電気泳
動で解析することにより、導入されたＮ断片を確認する
ことができる。

【００１４】このようにして得られるＮ断片の一つは、
上記Ｅｐ０１株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＢａｍＨＩで切断することによって得られる大きさが
約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。この
大きさが約３．６ｋｂのＮＡＤＨオキシダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断
したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下記表１
に示す。

【００１５】 表 １ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ ＣｌａＩ １ ２．３，１．３ ＤｒａＩ １ ２．２，１．４ Ｈｉｎｃ II ２ ２．５５，１．０５ Ｈｉｎｄ III ３ １．７，１．６，０．２，０．１ＳａｃＩ ２ １．４，１．２，１．０

【００１６】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１７】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリ
ルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づ
き、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大
きさを算出した。プラスミドの大きさは、切断断片それ
ぞれの大きさを加算して求めた。なお、各ＤＮＡ断片の
大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさにつ
いては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる
結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大
きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって得られる結果を採用した。

【００１８】一方、上記したＥｐ０１株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２７４４）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＢａｍＨＩによって切断することにより得られる大き
さが約３．６ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配
列をプラスミドｐＵＣ１１８及び、またはｐＵＣ１１９
（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ法、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、ｐ５４６
３、１９７７）により決定することができる。このよう
にして決定した上記約３．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配
列のオープンリーディングフレームの存在から決定した
ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子は、後記する
配列表の配列番号：１に示す配列を有するものであり、
５０９個のアミノ酸をコードする１５２７の塩基対から
構成されている。

【００１９】上記した、後記配列表の配列番号：１に示
す塩基配列を包含して成る本発明のＮＡＤＨオキシダー
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然の好ア
ルカリ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ
−１ Ｐｌｕｓを用いて合成されたものであってもよ
い。

【００２０】また、前記の如くＥｐ０１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２７４４）の染色体ＤＮＡから取得される本発明
のＤＮＡ断片は、ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする機
能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の
塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されて
いてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであっ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のＮＡ
ＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
に包含されるものである。

【００２１】以上に詳述した大きさが約３．６ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。本発明の
ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片（Ｎ断片）は、適当なプラスミドベクター、例え
ば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を
少なくとも含むプラスミドベクターに導入することによ
り、エシェリヒア・コリ内でＮＡＤＨオキシダーゼの高
発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。

【００２２】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼをコードす
る遺伝子を発現させるためのプロモーターは、好アルカ
リ性通性嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌が保有す
る該遺伝子自身のプロモーターであることができるが、
それに限られるものではなく、ＮＡＤＨオキシダーゼ遺
伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩基配列
であれば、いかなるプロモーターであってもよい。上記
した大きさが約３・６ｋｂのＮ断片中には、本発明のＮ
ＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子を発現し得るプ
ロモーターも含有されているが、他のプロモーター、例
えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃ
プロモーター等も利用することができ、これらのプロモ
ーターの下流にＮ断片を連結すればよい。

【００２３】本発明のＮ断片、又はプロモーターの下流
にＮ断片が結合したＤＮＡ断片を導入することができる
プラスミドベクターとしては宿主微生物細胞内で複製増
殖機能を司る遺伝子を少くとも含むプラスミドベクター
であれば、いかなるベクターであってもよいが、例えば
エシェリヒア・コリ内で複製増殖機能を司る遺伝子を含
み、コピー数が１細胞染色体当り２０〜３０個であるＣ
ｏｌＥ１系プラスミドベクター、例えばプラスミドｐＢ
Ｒ３２２等を挙げることができる。

【００２４】本発明により提供される組換えプラスミド
の具体例としては、ＣｏｌＥ１系プラスミドべクターに
前記Ｎ断片を導入することにより造成されるプラスミド
ｐＮＯＸ２を挙げることができる。この組換えプラスミ
ドｐＮＯＸ２は、例えば以下に示す方法で調製すること
ができる。

【００２５】Ｎ断片の供給源としては、前記Ｅｐ０１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７４４）を用い、次のとおり、菌
体を培養し、その培養物からＮ断片を取得することがで
きる。先ず、Ｅｐ０１株の培養に使用しうる培地の栄養
源である窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の
無機窒素化合物を単独でもしくは混合して用いることが
できる。また、無機塩金属塩としては、例えば、リン酸
−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄等が
用いられる。以上のような無機栄養源の他に、コーンス
テイープリカー、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源
を加えてもよい。さらに、炭素源として、例えば、グル
コース、キシロース、マンノース、フルクトース、マル
トース、シュークロース、セロビオース、キシラン等を
培地に添加することができる。

【００２６】前述したＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌を上
記の如き組成の培地で培養するにあたり、培養温度は通
常約２０〜約５０℃、好ましくは約３５〜約４５℃の範
囲内が適当である。また、培養中の培地のpHは約７．５
以上のアルカリ性領域であれば厳密に限定されるもので
はないが、一般には８〜１０．５、好ましくは８．５〜
１０．０の範囲内が有利である。培地のpHは、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、アンモニア、炭酸ナトリウ
ム等のアルカリ性物質を培地に添加することにより至適
範囲内となるよう調整するのが好都合である。培養時間
は通常３〜２４時間、好ましくは５〜２０時間程度とす
ることができる。培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件
下で行なうことができ、或いは無酸素嫌気的条件下で行
ってもよい。

【００２７】嫌気的条件下での培養を行う場合には、還
元銅カラムで酸素を除去した、窒素ガス、ヘリウムガ
ス、アルゴンガス、又はそれらの混合物等の酸素不含ガ
ス雰囲気や、培地の酸化還元電位を低下させて嫌気性菌
の生育を容易にするチタニウム（ＩＩＩ）クエン酸、ジ
チオナイト等の還元剤の添加等、通性嫌気性菌の培養に
際し通常用いられる手法〔例えば山里、宇田川、児玉、
森地編、「微生物の分離法」Ｒ＆Ｄプランニング（１９
８６年刊）２４６〜２７４頁、等参照〕の中から、本菌
の生育至適とするアルカリ性領域において効力を有し、
かつ本菌の生育に悪影響を及ぼさない条件であれば、そ
れを適用することができる。

【００２８】さらに、菌体取得にいたるまでの培養はそ
の全段階を嫌気条件下又は好気条件下の一条件下でのみ
行う必要はなく、培養途中で嫌気条件から好気条件に、
あるいは好気条件から嫌気条件に変更することにより、
両者の条件を組み合わせて培養するのもまた好ましい方
法である。かくして培養される菌体を集め、超音波処
理、ホモジエナイズ等の通常用いられる手段により菌体
を破砕した後、それ自体既知の通常用いられる方法によ
って染色体ＤＮＡを抽出することができる。

【００２９】上記の如く抽出される染色体ＤＮＡを、前
記したとおり、適当な制限酵素、例えば制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで切断するこ
とにより、長さが３．６ｋｂのＮ断片を得ることができ
る。このＮ断片が導入される宿主微生物細胞内で複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクタ
ーとしては、前記したＣｏｌＥ１プラスミドとして代表
的なプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造製）を使用するの
が最も好ましい。

【００３０】本発明の新規なプラスミドは、前記の通性
嫌気性のＮＡＤＨオキシダーゼ生産菌Ｅｐ０１株由来の
染色体を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで
切断する事により調製された３．６ｋｂのＤＮＡ断片
（Ｎ断片）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
処理したプラスミドｐＢＲ３２２と混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させて作成することが出来る。次
いでこのプラスミド溶液を用いて適当な宿主、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、そのＮＡＤ
Ｈオキシダーゼを発現させ、それを前記したイムノアッ
セイによって確認することにより目的のプラスミドを得
ることが出来る。かくして調製される目的のプラスミド
をｐＮＯＸ２と命名する。

【００３１】プラスミドｐＮＯＸ２の制限酵素の感受性
（認識部位の数）及び該制限酵素による切断断片の長さ
（ｋｂ）を下記表２に示す。さらにこのプラスミドの制
限酵素切断地図を図２に示す。

【００３２】 表 ２ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ １ ７．６ ＣｌａＩ １ ７．６ ＢａｍＨＩ １ ７．６ＰｓｔＩ １ ７．６

【００３３】本発明のプラスミドによる形質転換に利用
できる宿主微生物としては、エシェリヒア・コリが好ま
しく、それらの中でも特にエシェリヒア・コリＫ−１２
系菌株が好ましい。

【００３４】また、これら宿主微生物に対する本発明の
プラスミドの導入はそれ自体既知の方法、例えばＭ．Ｍ
ａｎｄｅｌ、Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５
３、１５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行うこ
とができる。このようにして形質転換された宿主微生物
はそれ自体既知の方法で培養することにより、ＮＡＤＨ
オキシダーゼを菌体内に充分に生産蓄積させることがで
きる。

【００３５】かくして培養される菌体は、ＮＡＤＨオキ
シダーゼをその菌体内に含有しているので、取得菌体を
例えば超音波処理、酵素処理、ホモジナイズ等通常用い
られる手段にて破砕し、得られる無細胞抽出液を、塩
析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等のそれ
自体既知の分離、精製方法〔例えば日本生化学会編 生
化学実験講座第１巻「タンパク質の化学Ｉ分離精製」東
京化学同人刊、１〜３３４頁；堀尾武一、山下仁平編
「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂刊、１〜３７９頁
等参照〕に付することによりＮＡＤＨオキシダーゼを採
取することができる。

【００３６】なお、上記お如く形質転換された菌の培養
は、宿主菌の種類によって異なるが、一般には、通常用
いられる合成又は天然培地を用いて行なうことができ
る。培地に用いることができる炭素源としては、例え
ば、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュク
ロース、糖蜜等の種々の炭水化物が挙げられる。また、
窒素源としては、例えば、トリプトン、酵母エキス、コ
ーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物等の天然
有機窒素源を挙げることができる。天然有機窒素源の多
くは窒素源と共に炭素源にもなり得る。

【００３７】培養は、振盪培養あるいは通気攪拌深部培
養などの好気的条件下に行うことができる。培養温度は
一般に２０〜５０℃であり、培地中の培地のpHは中性ま
たは微アルカリ性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１０〜４０時間程度である。

【００３８】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。 実施例１：プラスミドｐＮＯＸ２の造成及び該プラスミ
ドによるエシェリヒア・コリの形質転換 Ａ） 好アルカリ性通性嫌気性ＮＡＤＨオキシダーゼ生
産菌Ｅｐ０１株染色体ＤＮＡの調製 Ｋ₂ ＨＰＯ₄ １ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、ＭｇＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ２００mg、ＭｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ５mg、Ｆｅ
ＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ５mg、ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ７００m
g、酵母エキス３ｇ、ポリペプトン３００mg、キシラン
１０ｇ及びレサズリン１mgを蒸留水９００mlに溶解し、
９０mlずつ１００ml容血清ビンに分注した。煮沸脱気
し、還元銅カラムを通過して調製した無酸素窒素ガスを
通気後ブチルゴム栓をかぶせ、アルミナキャップにて封
じ１２０℃１５分殺菌を行なった。この培地に１２０
℃、１５分滅菌済みの１０％炭酸ナトリウム水溶液（pH
１０．６）を１０ml添加し、培地のpHを１０とした。さ
らに、還元剤としてサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１
９４巻１１６５〜１１６６頁記載のＡ．Ｊ．Ｂ．Ｚｅｈ
ｎｄｅｒ＆Ｋ．Ｗｕｈｒｍａｎｎらの方法に準じて調製
したチタニウム（ＩＩＩ）クエン酸溶液を最終濃度０．
１３mMとなるように添加した。本培地に好アルカリ性通
性嫌気性細菌Ｅｐ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７４４）
を採種し、４０℃、２０時間静置培養を行なったものを
種培養液とした。

【００３９】キシラン１０ｇをグルコース１０ｇに変え
た他は同組成の培地４５０mlを５００ml容血清ビンに分
注し、同様の操作を行ない１２０℃、１５分殺菌後、１
０％炭酸ナトリウム水溶液５０ml、チタニウム（ＩＩ
Ｉ）クエン酸溶液を最終濃度０．１３mMとなるように添
加した。前記種培養液１０mlを接種し、４０℃、２４時
間静置培養した。培養終了後培養液１００mlを１０，０
００×ｇ、２０分間延遠心分離し、得られた菌体を５０
mMトリス緩衝液（pH８．０）−１０mM ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液５０mlに懸濁した。次にリゾチウムを最終濃度が
２mg／mlになるように添加し、５分間静置後、１０％ド
デシル硫酸ナトリウム溶液を６ml添加し、６５℃で３０
分間保温した。この溶菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１５ml
を添加し、０℃で１時間冷却し、全量を遠心分離（１
２，０００×ｇ、６０分間、４℃）し、上清画分を分取
し、２倍量のエタノールを加え、混合後、遠心分離
（５，０００×ｇ、１０分間、４℃）した。得られた沈
澱物を１０mMトリス緩衝液（pH７．５）−１mM ＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ溶液に溶解し、フェノール処理（除タンパク
処理）およびＲＮＡ分解酵素による処理を行ないＤＮＡ
を得た。

【００４０】Ｂ） ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｎ断片）の調製 前記Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ５０μｇを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ各々１００unitｓを用い、３
０℃で１時間反応させて切断し、染色体ＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製した。上記の分解
物溶液をアガロースゲル電気泳動により分離し、１〜４
ｋｂの長さのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、常法
〔Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｉｎ ＆ Ｄ．ＧｉＬ Ｌｅｓｐ
ｉｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、ｖｏｌ ７６、ｐ６１５〜６１９（１９７９）〕に
従いＮａＩにより溶解し、ガラスパウダーにＤＮＡ断片
を吸着させる方法により精製した。

【００４１】Ｃ） プラスミドｐＮＯＸ２の造成及び該
プラスミドによるエシェリヒア・コリの形質転換 プラスミドｐＢＲ３２２ １μｇを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩ（各１unit）を用い３０℃で１時間反
応させ切断して得た分解物溶液に、前記Ｂ）項で調製し
た３．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｎ領域）１μｇを混合し、
最終濃度で各々５０mM、１０mM、１mM、１mM、１０mM、
１unitとなるようにトリス緩衝液（pH７．６）、ジチオ
スライトール、ＡＴＰ、ＭｇＣｌ₂ 、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添加し、１６℃で１５時間反応させ結合した。

【００４２】この溶液を用い、常法〔Ｍ．Ｍａｎｄｅ
ｌ、Ａ．Ｈｉｇａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ
５３、ｐ１５９（１９７０）参照〕に従ってエシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＢ１
０１株を形質添加し、Ｌ培地（トリプトン１０ｇ，酵母
エキス５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース１ｇ及び蒸留
水１リットル；pH７．２）にアンピシリンを５０μｇ／
ml濃度に添加し、１．５％寒天で固化させた培地に塗抹
し、３０℃で２０時間培養し、コロニーを形成させた。
培地上にニトロセルロースメンブランを置き、４２℃で
３時間熱誘導をかけた。メンブランフィルター上のコロ
ニーを溶菌させ、牛血清アルブミンでメンブランの非特
異的結合をブロックした後、例えばアマシャム社製イム
ノスクリーニングシステム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｅｅ
ｎ^TM）を用い、精製したＮＡＤＨオキシダーゼでウサギ
を免疫して調製した抗ＮＡＤＨオキシダーゼ抗体を一次
抗体としてイムノスクリーニングを行った。更に、上記
メンブランを、ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈパーオキシダ
ーゼを結合させたａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧで処
理したのち、過酸化水素−３，３−ジアミノベンジデイ
ン系または過酸化水素−４−クロロ−１−ナフトール系
で発色させて、目的のコロニーを選択した。形質転換株
は５×１０^-5の割合で取得できた。

【００４３】得られた５株をＬ培地で３０℃、２０時間
培養し、遠心分離（１２，０００rpm 、２０分間）によ
り集菌した。該菌体１ｇを２mlのトリス緩衝液（pH７．
８）に懸濁後、超音波破砕、遠心分離により残渣を除い
た無細胞抽出液について、酸素電極（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓ
ｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いてＮ
ＡＤＨ酸化時の酸素吸収の最も大きな菌株を選択した。
この株より、アルカリ−ＳＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）
ｐ９０〜９１参照）によりプラスミドを抽出し、制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、分子量をアガロ
ースゲル電気泳動により調べたことろ、ｐＢＲ３２２の
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ切断部位に３．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片が挿入されていることがわかった。このプラスミ
ドをｐＮＯＸ２と命名した。また、このプラスミドｐＮ
ＯＸ２で形質転換されたエシェリヒア・コリＫ−１２系
菌株ＨＢ１０１株をエシェリヒア・コリＮＹ０２と命名
した。このＮＹ０２株は、茨城県つくば市東１丁目１番
３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号：
微工研条寄第２７６４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７６４）
として寄託されている。

【００４４】実施例２：ＮＡＤＨオキシダーゼをコード
する遺伝子領域の塩基配列の決定 Ａ） ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびＳａｃＩ断片のｐＵＣ
１８／１９へのサブクローニング プラスミドｐＮＯＸ２にクローニングされた、ＮＡＤＨ
オキシダーゼをコードする遺伝子領域の塩基配列を決定
するために、ｐＮＯＸ２をＨｉｎｄＩＩＩによって切断
して得られる１．６ｋｂのＤＮＡ断片と、ＳａｃＩによ
る切断によって得られる１．４ｋｂのＤＮＡ断片をプラ
スミドｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９（宝酒造製）に下記
のとおりサブクローニングした。

【００４５】実施例１で得たプラスミドｐＮＯＸ２を制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものと、プラスミドｐ
ＵＣ１９を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したものを混
合し、５０mMトリス緩衝液（pH７．６）、１０mMジチオ
スレイトール、１mM ＡＴＰ、１０mM ＭｇＣｌ₂ 及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各成分の
濃度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、
結合させた。

【００４６】この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ
１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は３０μｇ／ml（最終濃度）のカナマイシ
ン、１００μｇ／ml（最終濃度）のＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、１００μｇ
／ml（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を
含むＬ培地（トリプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ及び蒸留水１リットル；pH７．２）で３７℃
にて２４時間培養し、生育株として得た。これら生育株
のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択し、各
々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）９０〜９１参照〕により
ＤＮＡを抽出した。

【００４７】培養液より抽出したプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、アガロースゲル電
気泳動を用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１９の
長さ２．７ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．６ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められ、そのプラスミドをｐＵＣ１
９Ｈと命名し、また１．６ｋｂのＤＮＡ断片がｐＵＣ１
９Ｈと逆方向に挿入されたプラスミドをｐＵＣ１９ＨＲ
と命名した。

【００４８】次に実施例１で得たプラスミドｐＮＯＸ２
を制限酵素ＳａｃＩで切断したものと、プラスミドｐＵ
Ｃ１８を制限酵素ＳａｃＩで切断したものを混合し、５
０mMトリス緩衝液（pH７．６）、１０mMジチオスレイト
ール、１mM ＡＴＰ、１０mMＭｇＣｌ₂ 及びＴ４ＤＮＡ
リガーゼ１unitの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合させ
た。

【００４９】この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ
１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は３０μｇ／ml（最終濃度）のカナマイシ
ン、１００μｇ／ml（最終濃度）のＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、１００μｇ
／ml（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を
含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ及び蒸留水１リットル；pH７．２）で３７℃
にて２４時間培養し、生育株として得た。これら生育株
のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択し、各
々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）９０〜９１参照〕により
ＤＮＡを抽出した。

【００５０】培養液より抽出したプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＳａｃＩにより切断し、アガロースゲル電気泳動
を用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１８の長さ
２．７ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．４ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められ、そのプラスミドをｐＵＣ１８Ｓ
と命名し、また１．４ｋｂのＤＮＡ断片がｐＵＣ１８Ｓ
と逆方向に挿入されたプラスミドをｐＵＣ１８ＳＲと命
名した。

【００５１】Ｂ） ｐＵＣ１９ＨおよびｐＵＣ１９ＨＲ
のデレーションミュータントの作製 上記Ａ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１９Ｈの３０μ
ｇを制限酵素ＫｐｎＩを用いて、３７℃、１時間反応に
より切断した。この反応液を７５℃で１５分間加熱し
て、制限酵素を失活させ反応液と同量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）で抽出したのち、２．５倍量のエ
タノールを加えＤＮＡを沈澱させた。遠心分離後、真空
乾燥し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを溶解し、制限
酵素ＢａｍＨＩで３７℃１時間反応により切断した。こ
の溶液から同量のフェノール／クロロホルム（１：１）
でＤＮＡを抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加
えＤＮＡを沈澱させ、遠心分離後、真空乾燥して、ＤＮ
Ａを回収した。

【００５２】得られたＤＮＡを１００μｌのＥｘｏＩＩ
Ｉバッファー〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０、
１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ 、１０mM β−
メルカプトエタノール〕に溶解した。このＤＮＡ溶液に
１８０units のエキソヌクレアーゼＩＩＩを加えボルテ
ックスにて攪拌し、３７℃にてインキュベートした。こ
の溶液を１分毎に１０μｌずつサンプリングし、予め準
備した１００μｌのＭＢヌクレアーゼバッファー（４０
mM酢酸ナトリウムpH４．５、１００mM ＮａＣｌ、１０
％グリセロール）中へ順次加え、６５℃、５分間の処理
によりエキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させたのち３７
℃にもどし、５０units のＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレア
ーゼを加え３０分間インキュベートした。同量の１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１mM ＥＤＴＡ飽和フェノールで
１回上清をクロロホルム／イソアミルアルコール（２
４：１）で１回、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。上清を別
のチューブに移し、２．５倍量のエタノールを加え遠心
分離にて沈澱を回収し、７０％エタノールで洗浄したの
ち真空乾燥した。

【００５３】得られたＤＮＡを、５０μｌのクレノー
（ｋｌｅｎｏｗ）バッファー〔７mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ
pH７．５、０．１mM ＥＤＴＡ、２０mM ＮａＣｌ、７
mMＭｇＣｌ₂ 、０．１mM ｄＮＴＰｓ〕に溶解させた
後、２units のクレノー断片を加え、３７℃、１５分間
インキュベートした。この溶液に２．５倍量のエタノー
ルを加え、遠心分離にて沈澱を回収し、７０％エタノー
ルで洗浄後、真空乾燥した。

【００５４】得られた沈澱を４０μｌのＴＥバッファー
に溶解し、１０mMジチオスレイトール、１mM ＡＴＰ、
１０mM ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ５units
の各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。得られたＤＮＡミクスチャーを用い、エシェリヒア
・コリＪＨ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシ
リン（５０mg／ml）を含むＬＢ培地〔１０ｇトリプン、
５ｇ酵母エキス、５ｇ ＮａＣｌ、１６ｇ寒天、蒸留水
１リットル〕に塗沫した。

【００５５】生育したコロニーよりプラスミドを抽出
し、インサートＤＮＡの大きさを調べべ、インサートの
大きさが２００ｂｐ〜１．６ｋｂまで約２００ｂｐおき
に７クローンのデレーションミュータントを選抜した。
同様にして逆方向のクローンｐＵＣ１９ＨＲについても
７クローンのデレーションミュータントを選抜した。

【００５６】Ｃ） ｐＵＣ１８ＳおよびｐＵＣ１８ＳＲ
のデレーションミュータントの作製 上記Ａ）項で得られたプラスミドｐＵＣ１８Ｓの３０μ
ｇを制限酵素ＰｓｔＩを用いて、３７℃、１時間反応に
より切断した。この反応液を７５℃で１５分間加熱し
て、制限酵素を失活させ、反応液と同量のフェノール／
クロロホルム（１：１）で抽出したのち、２．５倍量の
エタノールを加えＤＮＡを沈澱させた。遠心分離後、真
空乾燥し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを溶解し、制
限酵素ＢａｍＨＩで３７℃１時間反応により切断した。
この溶液から同量のフェノール／クロロホルム（１：
１）でＤＮＡを抽出したのち、２．５倍量のエターノル
を加えＤＮＡを沈澱させ、遠心分離後、真空乾燥し、Ｄ
ＮＡを回収した。

【００５７】得られたＤＮＡを１００μｌのＥｘｏＩＩ
Ｉバッファー〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０、
１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ 、１０mM β−
メルカプトエタノール〕に溶解した。このＤＮＡ溶液に
１８０units のエキソヌクレアーゼＩＩＩを加えボルテ
ックスにて攪拌し、３７℃にてインキュベートした。こ
の溶液を１分毎に１０μｌずつサンプリングし、予め準
備した１００μｌのＭＢヌクレアーゼバッファー（４０
mM酢酸ナトリウムpH４．５、１００mM ＮａＣｌ，１０
％グリセロール）中へ順次加え、６５℃、５分間の処理
によりエキソヌクレアーゼＩＩＩを失活させたのち３７
℃にもどし、５０units のＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレア
ーゼを加え３０分間インキュベートした。同量の１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−１mM ＥＤＴＡ飽和フェノールで
１回上清をクロロホルム／イソアミルアルコール（２
４：１）で１回、ＤＮＡをそれぞれ抽出した。上清を別
のチューブに移し、２．５倍量のエタノールを加え遠心
分離にて沈澱を回収し、７０％エタノールで洗浄したの
ち真空乾燥した。

【００５８】得られたＤＮＡを、５０μｌのクレノー
（ｋｌｅｎｏｗ）バッファー〔７mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ
pH７．５、０．１mM ＥＤＴＡ、２０mM ＮａＣｌ、７
mMＭｇＣｌ₂ 、０．１mM ｄＮＴＰｓ〕に溶解させた
後、２units のクレノー断片を加え、３７℃、１５分間
インキュベートした。この溶液に２．５倍量のエタノー
ルを加え、遠心分離にて沈澱を回収し、７０％エタノー
ルで洗浄後、真空乾燥した。

【００５９】得られた沈澱を４０μｌのＴＥバッファー
に溶解し、１０mMジチオスレイトール、１mM ＡＴＰ、
１０mM ＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガーゼ５units
の各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。得られたＤＮＡミクスチャーを用い、エシェリヒア
・コリＪＨ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシ
リン（５０mg／ml）を含むＬＢ培地〔１０ｇトリプトフ
ァン、５ｇ酵母エキス、５ｇ ＮａＣｌ、１６ｇ寒天、
蒸留水１リットル〕に塗沫した。

【００６０】生育したコロニーよりプラスミドを抽出
し、インサートＤＮＡの大きさをしらべ、インサートの
大きさが２００ｂｐ〜１．４ｋｂまで約２００ｂｐおき
に７クローンのデレーションミュータントを選抜した。
同様にして逆方向のクローンｐＵＣ１８ＳＲについても
７クローンのデレーションミュータントを選抜した。

【００６１】Ｄ） ＮＡＤＨオキシダーゼをコードする
遺伝子の塩基配列の決定 実施例１のＣ）項で得られた、ＮＡＤＨオキシダーゼを
コードする遺伝子を含む長さ３．６ｋｂの図１に示すＤ
ＮＡ断片のうち、約１．９ｋｂのＤＮＡ断片について、
実施例２のＢ）およびＣ）項で得られた２８クローンを
使って、その塩基配列をＭ１３ファージを用いる、ダイ
デオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａ
ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ、
Ｆ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ ７４、５４６３、１９７７）により決定し
た。

【００６２】その塩基配列中には、図１の切断点地図に
示したＤｒａＩ部位の４７２〜４７０塩基上流の翻訳開
始コドンから１５２７塩基つながっているオープンリー
ディングフレームの存在から、ＮＡＤＨオキシダーゼを
コードする遺伝子は、後記配列表の配列番号：１に示す
塩基配列を有する５０９のアミノ酸をコードする１５２
７の塩基対より構成されていることが明らかとなった。

【００６３】実施例３：ＮＡＤＨオキシダーゼの製造 Ｍ９Ｓ培地（５．８ｇ Ｎａ₂ ＰＯ₄ 、３ｇ ＫＨ₂ Ｐ
Ｏ₄ 、５ｇ ＮａＣｌ、１ｇ ＮＨ₄ Ｃｌ、５ｇグリセ
ロール、５ｇカザミノ酸、４mgチアミン塩酸、１リット
ル蒸留水）１００mlを５００ml容三角フラスコに分注
し、１２０℃で１５分間滅菌処理した。この培地にアン
ピシリンを４０μｇ／ml濃度に加え、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＹ０２株及
びＨＢ１０１株をそれぞれ別途植菌し、３０℃で約１６
時間培養を行った。これを１：１００の希釈率で新鮮な
培地１００mlに植菌し、３０℃で培養を続けた。約４時
間後、遠心（１２，０００rpm 、２０分）集菌し、集菌
体を１mlのトリス緩衝液に懸濁し、超音波破砕を行っ
た。遠心（１２，０００rpm 、２０分）により残渣を除
き、膜系に存在するエシェリヒア・コリのＮＡＤＨデヒ
ドゲナーゼの影響を最小限にするため１００，０００×
ｇ，１時間の超遠心分離を行ない、その上清を酵素液と
した。

【００６４】ＮＡＤＨオキシダーゼの活性測定は、次の
ようにして行った。すなわち５０mMリン酸カリウム緩衝
液１．９ml、上記の酵素液０．０５mlからなる反応液を
指定する温度にて予め保持した後、５mM ＮＡＤＨ０．
０５mlを加え反応を開始し、３４０nmにおける吸光の減
少を測定した。酵素活性は１分間に１μmol のＮＡＤＨ
を酸化する酵素量を１単位とした。

【００６５】上記で得た酵素液につき、３７℃にて活性
を測定した結果を下記表３に示す。対照として、ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼ遺伝子の供給源である好アルカリ性通性
嫌気性のＮＡＤＨオキシターゼ生産菌Ｅｐ０１株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２７４４）菌体より同様に調製した酵素液
の活性も併せて示す。

【００６６】 表 ３ 菌 株 ＮＡＤＨオキシダーゼ比活性 Ｅｐ０１ ０．０５単位／mg蛋白 ＨＢ１０１ ０．０１ 〃 ＮＹ０２ １．２ 〃 表３に示すように、本発明のプラスミドで形質転換した
菌株（ＮＹ０２）を用いれば、遺伝子の供給源である親
株（Ｅｐ０１）に比して２０倍以上比活性が上ると同時
に、本発明のプラスミドはエシェリヒア・コリＫ−１２
系菌株の中で効率よくＮＡＤＨオキシダーゼを発現でき
ることが明らかとなった。

【００６７】

【発明の効果】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入されたプラスミド
は、コピー数が多く、効率的にＮＡＤＨオキシダーゼを
発現できるという特徴を有している。従って、本発明の
プラスミドで形質転換された微生物を培養することによ
り、ＮＡＤＨオキシダーゼの効率的な工業的生産が可能
となる。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アンフィバシルス キシラナス (Amphibacill
us xylanus) 株名：Ep01 配列の特徴 特徴を表す記号：Peptide 存在位置：1-1527 特徴を決定した方法：S 配列： ATG CTA GAT AAA GAT ATA AAA CAA CAA CTT GAA CAA TAT CTA GCT CTA 48 Met Leu Asp Lys Asp Ile Lys Gln Gln Leu Glu Gln Tyr Leu Ala Leu 1 5 10 15 TTA GAA AAC GAT ATC GTC ATC AAA GTA AGT GTT GGT GAC GAT AAA GTT 96 Leu Glu Asn Asp Ile Val Ile Lys Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Val 20 25 30 TCT AAA GAT ACA CTT GAA CTT GTT AAC GAA ATT GCT GAC ATG TCT TCA 144 Ser Lys Asp Thr Leu Glu Leu Val Asn Glu Ile Ala Asp Met Ser Ser 35 40 45 ATG ATT TCA GTC GAA GAA ACG ACT TTA GAG CGA ACA CCA AGC TTT AGT 192 Met Ile Ser Val Glu Glu Thr Thr Leu Glu Arg Thr Pro Ser Phe Ser 50 55 60 ATT AAT CGT AAG GGT GAA CCA GAT AGT GGT GTT GTA TTT GCA GGT ATT 240 Ile Asn Arg Lys Gly Glu Pro Asp Ser Gly Val Val Phe Ala Gly Ile 65 70 75 80 CCA CTA GGT CAT GAA TTT ACA TCA CTC GTT CTT GCC TTA CTA CAA GTT 288 Pro Leu Gly His Glu Phe Thr Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Gln Val 85 90 95 AGC GGA CGC GCA CCT AAA GTT GAA GCA TCT GTA ATT GAT GCA ATT AAA 336 Ser Gly Arg Ala Pro Lys Val Glu Ala Ser Val Ile Asp Ala Ile Lys 100 105 110 AAG GTT GAA GGC AAG CAT GAC TTT GTA ACT TAC GTT AGT TTA ACA TGT 384 Lys Val Glu Gly Lys His Asp Phe Val Thr Tyr Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 CAA AAC TGT CCA GAT GTT GTT CAA GCG CTT AAC TTA ATG AGT GTA GTT 432 Gln Asn Cys Pro Asp Val Val Gln Ala Leu Asn Leu Met Ser Val Val 130 135 140 AAT CCA AAC ATT ACA CAT ACG ATG GTC GAG GGA TCT GCT TTT AAA GAT 480 Asn Pro Asn Ile Thr His Thr Met Val Glu Gly Ser Ala Phe Lys Asp 145 150 155 160 GAA GTA GAT CGA CTA AAT ATT CTT GCC GTT CCA TCT GTT TAT TTA AAT 528 Glu Val Asp Arg Leu Asn Ile Leu Ala Val Pro Ser Val Tyr Leu Asn 165 170 175 GGA GAG TTC ATG GCA AGT GGC CGT ATG ACA ATT GAA GAT ATT TTA GGT 576 Gly Glu Phe Met Ala Ser Gly Arg Met Thr Ile Glu Asp Ile Leu Gly 180 185 190 CAT CTA GGA AGC GGT ATC GAT GCT TCT GAG CTT AAC GAA AAA GAT CCA 624 His Leu Gly Ser Gly Ile Asp Ala Ser Glu Leu Asn Glu Lys Asp Pro 195 200 205 TTT GAC GTT CTT GTA ATC GGT GGT GGA CCT GCC GGT GCA AGT TCA GCA 672 Phe Asp Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Ala Ser Ser Ala 210 215 220 ATC TAT GCT GCT CGT AAA GGG ATT AGA GTT GGT ATT ATT GCT GAT CGC 720 Ile Tyr Ala Ala Arg Lys Gly Ile Arg Val Gly Ile Ile Ala Asp Arg 230 235 240 TTT GGC GGT CAA GTT ATG GAT ACA CTT GGG ATC GAA AAC TTT ATC GGT 768 Phe Gly Gly Gln Val Met Asp Thr Leu Gly Ile Glu Asn Phe Ile Gly 245 250 255 ACA AAA TAT ACT GAA GGT CCT AAG CTA ATC TCA GAA ATT GAG CAA CAC 816 Thr Lys Tyr Thr Glu Gly Pro Lys Leu Ile Ser Glu Ile Glu Gln His 260 265 270 GTT AAC GAG TAT AAT ATT GAC GTT ATG AAA GGC CTT CGA GCT CAT AAC 864 Val Asn Glu Tyr Asn Ile Asp Val Met Lys Gly Leu Arg Ala His Asn 275 280 285 ATT GAG AAG AAA GAT CTA TTC GAG GTT CAA CTT GAT AAC GGT GCT GTT 912 Ile Glu Lys Lys Asp Leu Phe Glu Val Gln Leu Asp Asn Gly Ala Val 290 295 300 CTA AAG AGT AAA ACA ATT ATT CTT GCA ACT GGT GCA CGT TGG AGA GAC 960 Leu Lys Ser Lys Thr Ile Ile Leu Ala Thr Gly Ala Arg Trp Arg Asp 305 310 315 320 ATT GGC GTT CCA GGT GAA AAA GAG TAT AAA AAT AAA GGT GTA GCA TAT 1008 Ile Gly Val Pro Gly Glu Lys Glu Tyr Lys Asn Lys Gly Val Ala Tyr 325 330 335 TGT ACA CAC TGC GAT GCC CCA CTG TTT GAA GGA AAA CAC GTA GCT GTT 1056 Cys Thr His Cys Asp Ala Pro Leu Phe Glu Gly Lys His Val Ala Val 340 345 350 GTT GGC GGT GGA AAC TCT GGT ATT GAA TCT GCA TTA GAT CTT GCA GGT 1104 Val Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ile Glu Ser Ala Leu Asp Leu Ala Gly 355 360 365 ATC GTT AAA CAT GTA ACT GTA TTT GAG TTT ATG TCA GAG TTA AAG GCA 1152 Ile Val Lys His Val Thr Val Phe Glu Phe Met Ser Glu Leu Lys Ala 370 375 380 GAT GCA GTA CTA CAA GAA AGA CTA CGT AGC TTA CCT AAC GTA GAT GTA 1200 Asp Ala Val Leu Gln Glu Arg Leu Arg Ser Leu Pro Asn Val Asp Val 385 390 395 400 ATT CTA AAT GCA CAG ACA ACT GAA ATC ACA GGT GAT GAA ACA GTT AAA 1248 Ile Leu Asn Ala Gln Thr Thr Glu Ile Thr Gly Asp Glu Thr Val Lys 405 410 415 GGT ATC TCT TAC ATT GAC CGC ACA ACA AAC GAA GAA AAA CAT GTT GAG 1296 Gly Ile Ser Tyr Ile Asp Arg Thr Thr Asn Glu Glu Lys His Val Glu 420 425 430 TTA CAA GGT GCA TTC ATC CAA ATT GGT CTA GCT CCT AAT ACT GAG TGG 1344 Leu Gln Gly Ala Phe Ile Gln Ile Gly Leu Ala Pro Asn Thr Glu Trp 435 440 445 TTA GGT GAC ACA GTT GAG CGA AAT CAA ATC GGT GAA ATT GTC ATT GAT 1392 Leu Gly Asp Thr Val Glu Arg Asn Gln Ile Gly Glu Ile Val Ile Asp 450 455 460 AAG AAA GGT CAA ACG AGT GTA CCA GGT ATT TTC GCT GCT GGT GAC TGT 1440 Lys Lys Gly Gln Thr Ser Val Pro Gly Ile Phe Ala Ala Gly Asp Cys 465 470 475 480 ACT GAC ACG CCT TAC AAG CAA ATT ATT GTA TCT ATG GGT GCT GGT GCA 1488 Thr Asp Thr Pro Tyr Lys Gln Ile Ile Val Ser Met Gly Ala Gly Ala 485 490 495 ACT GCC GCA CTT GGC GCA TTT GAC TAT CTA CTA CGT AAT TAA 1530 Thr Ala Ala Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Leu Leu Arg Asn 500 505

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺
伝子を含む大きさが約３．６ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵
素切断地図。

【図２】本発明のプラスミドｐＮＯＸ２の制限酵素切断
点地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のＤＮＡ塩基配列 ATGCTAGATA AAGATATAAA ACAACAACTT GAACAATATC TAGCTCTATT AGAAAACGAT 60 ATCGTCATCA AAGTAAGTGT TGGTGACGAT AAAGTTTCTA AAGATACACT TGAACTTGTT 120 AACGAAATTG CTGACATGTC TTCAATGATT TCAGTCGAAG AAACGACTTT AGAGCGAACA 180 CCAAGCTTTA GTATTAATCG TAAGGGTGAA CCAGATAGTG GTGTTGTATT TGCAGGTATT 240 CCACTAGGTC ATGAATTTAC ATCACTCGTT CTTGCCTTAC TACAAGTTAG CGGACGCGCA 300 CCTAAAGTTG AAGCATCTGT AATTGATGCA ATTAAAAAGG TTGAAGGCAA GCATGACTTT 360 GTAACTTACG TTAGTTTAAC ATGTCAAAAC TGTCCAGATG TTGTTCAAGC GCTTAACTTA 420 ATGAGTGTAG TTAATCCAAA CATTACACAT ACGATGGTCG AGGGATCTGC TTTTAAAGAT 480 GAAGTAGATC GACTAAATAT TCTTGCCGTT CCATCTGTTT ATTTAAATGG AGAGTTCATG 540 GCAAGTGGCC GTATGACAAT TGAAGATATT TTAGGTCATC TAGGAAGCGG TATCGATGCT 600 TCTGAGCTTA ACGAAAAAGA TCCATTTGAC GTTCTTGTAA TCGGTGGTGG ACCTGCCGGT 660 GCAAGTTCAG CAATCTATGC TGCTCGTAAA GGGATTAGAG TTGGTATTAT TGCTGATCGC 720 TTTGGCGGTC AAGTTATGGA TACACTTGGG ATCGAAAACT TTATCGGTAC AAAATATACT 780 GAAGGTCCTA AGCTAATCTC AGAAATTGAG CAACACGTTA ACGAGTATAA TATTGACGTT 840 ATGAAAGGCC TTCGAGCTCA TAACATTGAG AAGAAAGATC TATTCGAGGT TCAACTTGAT 900 AACGGTGCTG TTCTAAAGAG TAAAACAATT ATTCTTGCAA CTGGTGCACG TTGGAGAGAC 960 ATTGGCGTTC CAGGTGAAAA AGAGTATAAA AATAAAGGTG TAGCATATTG TACACACTGC 1020 GATGCCCCAC TGTTTGAAGG AAAACACGTA GCTGTTGTTG GCGGTGGAAA CTCTGGTATT 1080 GAATCTGCAT TAGATCTTGC AGGTATCGTT AAACATGTAA CTGTATTTGA GTTTATGTCA 1140 GAGTTAAAGG CAGATGCAGT ACTACAAGAA AGACTACGTA GCTTACCTAA CGTAGATGTA 1200 ATTCTAAATG CACAGACAAC TGAAATCACA GGTGATGAAA CAGTTAAAGG TATCTCTTAC 1260 ATTGACCGCA CAACAAACGA AGAAAAACAT GTTGAGTTAC AAGGTGCATT CATCCAAATT 1320 GGTCTAGCTC CTAATACTGA GTGGTTAGGT GACACAGTTG AGCGAAATCA AATCGGTGAA 1380 ATTGTCATTG ATAAGAAAGG TCAAACGAGT GTACCAGGTA TTTTCGCTGC TGGTGACTGT 1440 ACTGACACGC CTTACAAGCA AATTATTGTA TCTATGGGTG CTGGTGCAAC TGCCGCACTT 1500 GGCGCATTTG ACTATCTACT ACGTAATTAA で示されるＮＤＡＨオキシタ−ゼをコ−ドする遺伝子Ｄ
   ＮＡ断片。
2. 【請求項２】 次のアミノ酸配列 Met Leu Asp Lys Asp Ile Lys Gln Gln Leu Glu Gln Tyr Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Glu Asn Asp Ile Val Ile Lys Val Ser Val Gly Asp Asp Lys Val 20 25 30 Ser Lys Asp Thr Leu Glu Leu Val Asn Glu Ile Ala Asp Met Ser Ser 35 40 45 Met Ile Ser Val Glu Glu Thr Thr Leu Glu Arg Thr Pro Ser Phe Ser 50 55 60 Ile Asn Arg Lys Gly Glu Pro Asp Ser Gly Val Val Phe Ala Gly Ile 65 70 75 80 Pro Leu Gly His Glu Phe Thr Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Gln Val 85 90 95 Ser Gly Arg Ala Pro Lys Val Glu Ala Ser Val Ile Asp Ala Ile Lys 100 105 110 Lys Val Glu Gly Lys His Asp Phe Val Thr Tyr Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Gln Asn Cys Pro Asp Val Val Gln Ala Leu Asn Leu Met Ser Val Val 130 135 140 Asn Pro Asn Ile Thr His Thr Met Val Glu Gly Ser Ala Phe Lys Asp 145 150 155 160 Glu Val Asp Arg Leu Asn Ile Leu Ala Val Pro Ser Val Tyr Leu Asn 165 170 175 Gly Glu Phe Met Ala Ser Gly Arg Met Thr Ile Glu Asp Ile Leu Gly 180 185 190 His Leu Gly Ser Gly Ile Asp Ala Ser Glu Leu Asn Glu Lys Asp Pro 195 200 205 Phe Asp Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Pro Ala Gly Ala Ser Ser Ala 210 215 220 Ile Tyr Ala Ala Arg Lys Gly Ile Arg Val Gly Ile Ile Ala Asp Arg 225 230 235 240 Phe Gly Gly Gln Val Met Asp Thr Leu Gly Ile Glu Asn Phe Ile Gly 245 250 255 Thr Lys Tyr Thr Glu Gly Pro Lys Leu Ile Ser Glu Ile Glu Gln His 260 265 270 Val Asn Glu Tyr Asn Ile Asp Val Met Lys Gly Leu Arg Ala His Asn 275 280 285 Ile Glu Lys Lys Asp Leu Phe Glu Val Gln Leu Asp Asn Gly Ala Val 290 295 300 Leu Lys Ser Lys Thr Ile Ile Leu Ala Thr Gly Ala Arg Trp Arg Asp 305 310 315 320 Ile Gly Val Pro Gly Glu Lys Glu Tyr Lys Asn Lys Gly Val Ala Tyr 325 330 335 Cys Thr His Cys Asp Ala Pro Leu Phe Glu Gly Lys His Val Ala Val 340 345 350 Val Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ile Glu Ser Ala Leu Asp Leu Ala Gly 355 360 365 Ile Val Lys His Val Thr Val Phe Glu Phe Met Ser Glu Leu Lys Ala 370 375 380 Asp Ala Val Leu Gln Glu Arg Leu Arg Ser Leu Pro Asn Val Asp Val 385 390 395 400 Ile Leu Asn Ala Gln Thr Thr Glu Ile Thr Gly Asp Glu Thr Val Lys 405 410 415 Gly Ile Ser Tyr Ile Asp Arg Thr Thr Asn Glu Glu Lys His Val Glu 420 425 430 Leu Gln Gly Ala Phe Ile Gln Ile Gly Leu Ala Pro Asn Thr Glu Trp 435 440 445 Leu Gly Asp Thr Val Glu Arg Asn Gln Ile Gly Glu Ile Val Ile Asp 450 455 460 Lys Lys Gly Gln Thr Ser Val Pro Gly Ile Phe Ala Ala Gly Asp Cys 465 470 475 480 Thr Asp Thr Pro Tyr Lys Gln Ile Ile Val Ser Met Gly Ala Gly Ala 485 490 495 Thr Ala Ala Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Leu Leu Arg Asn 500 505 で示されるＮＡＤＨオキシダーゼをコードする遺伝子Ｄ
   ＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項１〜２のいずれかに記載されたＤ
   ＮＡ断片が導入された組換えプラスミド。
4. 【請求項４】 請求項３に記載されたプラスミドで形質
   転換されたエシェリヒア・コリＫ−１２系微生物。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の微生物を生育培地で培
   養し、培養物よりＮＡＤＨオキシダーゼを採取すること
   を特徴とするＮＡＤＨオキシダーゼの製造法。