JPH05344898A - 不動化微生物細胞の使用方法 - Google Patents
不動化微生物細胞の使用方法Info
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- JPH05344898A JPH05344898A JP3250122A JP25012291A JPH05344898A JP H05344898 A JPH05344898 A JP H05344898A JP 3250122 A JP3250122 A JP 3250122A JP 25012291 A JP25012291 A JP 25012291A JP H05344898 A JPH05344898 A JP H05344898A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 Ｌ−アスパルターゼ活性微生物細胞好ましく
は大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を製造する改
良方法の提供。 【構成】 固体状不活性担体上に不溶性架橋ポリマーを
介して固定化された酵素活性含有微生物細胞の使用方法
であって、Ｌ−アスパルターゼ活性含有不動化細胞によ
るＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸デカルボキ
シラーゼ活性含有不動化細胞によるＬ−アラニン、ペニ
シリン−Ｇアシラーゼ活性含有不動化細胞による６−ア
ミノペニシラニック酸、グルコースイソメラーゼ活性含
有不動化細胞によるフルクトースの濃いコーンシロッ
プ、ステロイド脱水素酵素活性含有不動化細胞によるプ
レゾニドロンもしくは関連ステロイド、およびフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ活性含有不動化細胞による
フェニルアラニンを製造する。
は大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を製造する改
良方法の提供。 【構成】 固体状不活性担体上に不溶性架橋ポリマーを
介して固定化された酵素活性含有微生物細胞の使用方法
であって、Ｌ−アスパルターゼ活性含有不動化細胞によ
るＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸デカルボキ
シラーゼ活性含有不動化細胞によるＬ−アラニン、ペニ
シリン−Ｇアシラーゼ活性含有不動化細胞による６−ア
ミノペニシラニック酸、グルコースイソメラーゼ活性含
有不動化細胞によるフルクトースの濃いコーンシロッ
プ、ステロイド脱水素酵素活性含有不動化細胞によるプ
レゾニドロンもしくは関連ステロイド、およびフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ活性含有不動化細胞による
フェニルアラニンを製造する。
Description
本発明は微生物細胞の不動化および該細胞の製造もしく
は使用方法に係る。本発明は特に、Ｌ−アスパルターゼ
活性を含有する不動化微生物細胞、特に大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を用いたＬ−アスパ
ラギン酸を製造する改良方法に係る。しかしながら、他
の細胞の不動化及び使用もまた考えられる。Ｌ−アスパ
ラギン酸の製造に使用する大腸菌もしくは他の微生物細
胞の不動化に関するかなりの量の先行技術がある。例え
ば、米国特許第３，７９１，９２６号（Ｃｈｉｂａｔａ
他）には、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の如きアスパルタ
ーゼ−産生微生物を含有する水性懸濁液中で、アクリル
アミド，Ｎ，Ｎ′−低級アルキレン−ビス（アクリルア
ミド）およびビス（アクリルアクドメチル）エーテルか
ら選択されるモノマーの重合を伴なうＬ−アスパラギン
酸の製造方法が記載されいる。得られたアスパルターゼ
−産生不動化微生物を、酵素反応によりＬ−アスパラギ
ン酸を付与するフマル酸アンモニウム又はフマル酸もし
くはその塩と無機のアンモニウム塩との混合物で処理す
る。アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞の不動化
及び得られた不動化細胞のＬ−アスパラギン酸製造用の
使用はまた、Ｆｕｓｅｅ他によりＡｐｐｌｉｅｄａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，４２巻，４号，６７２〜６７６頁（１９８１年１
０月）にも記載されている。Ｆｕｓｅｅ他によると、細
胞は、液体イソシアナートでおおわれた（ｉｓｏｃｙａ
ｎａｔｅ−ｃａｐｐｅｄ）ポリウレタンプレポリマー
（ハイポール（登録商標）（ＨＹＰＯＬ（登録商標））
と細胞懸濁液との混合により不動化され、そうして不動
化細胞を含有する“フォーム（ｆｏａｍ）”を形成す
る。Ｓａｔｏ他（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｐ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５７０，１７９〜１８６ペ
ージ，１９７９年）は、アスパルターゼ活性を含有する
大腸菌細胞のκ−カラジーナン（κ−ｃａｒｒａｇｅｅ
ｎａｎ）による不動化及びＬ−アスパラギン酸を生産す
るための不動化生成物の使用について発表した。ウレタ
ンプレポリマー，ポリウレタンもしくは類似物中での微
生物細胞の不動化について記載したほかの文献発表は、
以下のことを含む： （ａ） ポリウレタンマトリックス中での微生物細胞の
不動化、Ｋｌｅｉｎ他によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３巻，２号，６５〜７０ページ
（１９８１年）； （ｂ） 親水性ウレタンプレポリマー：酵素捕捉（ｅｎ
ｔｒａｐｍｅｎｔ）用に便利な物質、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
２０巻，１４６５〜１４６９ページ（１９７８年）； （ｃ） 有機溶媒中でゲル内に捕捉された細胞によるス
テロイドの転換，Ｏｍａｔａ他によるＥｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１４３〜１５
５ページ（１９７９年）； （ｄ） 親水性ウレタンプレポリマーを用いた微生物細
胞とオルガネラの捕捉、Ｔａｎａｋａ他によるＥｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，３
５１〜３５４（１９７９）。 不動化微生物細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を製造す
る上記の方法には、種々の不便がある。例えばＦｕｓｅ
ｅ他及びＳａｔｏ他により発表された如きＫ−カラジー
ナンガム及びポリウレタン“フォーム”は、比較的柔軟
で且つ圧縮性である。したがってこれらの不動化細胞組
成物は、フマル酸アンモニウムがアンモニウムアスパル
ターゼへの変換のために通るカラム中で使用されると
き、該細胞組成物は、特に高流速および／もしくは比較
的長めのカラムを使用する場合、圧縮されそして詰ま
る。本発明の主な目的は、Ｌ−アスパルターゼ活性微生
物細胞好ましくは大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン
酸を製造する改良方法を提供することであり、該微生物
細胞は特別な方法で不動化され、それによって得られた
組成物はＬ−アスパラギン酸のバッチ式もしくは連続式
製造に極めて有用である。更に特別の目的は、比較的長
期間最適なＬ−アスパルターゼ活性を保持する不動化大
腸菌細胞を用いて、フマル酸アンモニウムからＬ−アス
パラギン酸を製造する改良方法の提供を含む。本発明の
他の特別の目的は、不動化細胞の使用を含む先行技術で
当面する問題を取り除く、Ｌ−アスパラギン酸作製の使
用に適した新規な不動化微生物システムを提供すること
である。他の目的はまた、以下で明らかとなるであろ
う。本発明の一態様によると、Ｌ−アスパルターゼ活性
を含有する大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞もしくは同等
の細胞を含む不動化微生物細胞組成物とフマル酸アンモ
ニウムもしくは同等のものとの接触によるＬ−アスパラ
ギン酸の製造方法が提供され、該細胞は、ポリアゼチジ
ンプレポリマー，カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ），ポリウレタンヒドロゲルプレポリマー及びポリメ
チレンイソシアナートから成るグループから選択される
硬化性プレポリマー物質の硬化により得られる固定化不
溶性架橋ポリマーによって不動化され、該プレポリマー
物質は微生物細胞のＬ−アスパルターゼ活性が著しくは
減弱する温度より低い温度で硬化され、該細胞／架橋ポ
リマー組成物は固体状不活性担体上の被膜を構成する。
不動化細胞／架橋ポリマー被膜の担体上への適用は、Ｌ
−アスパラギン酸製造に使用するためのすこぶる有利な
形態の細胞／ポリマー組成物を提供する。本発明の細胞
／ポリマーシステムが、Ｌ−アスパルターゼ活性の著し
い損失なしに担体上の乾燥被膜として提供され得ること
は、特に有利な特徴である。本発明の特に好ましい態様
は、Ｌ−アスパルターゼ活性を有する不動化大腸菌細胞
の提供を意図し、該細胞はポリアゼチジンプレポリマー
の硬化により得られる架橋水不溶性ポリマーにより不動
化される。概して本発明は、Ｌ−アスパルターゼ活性を
有することが知られており、それゆえ、細胞を結合する
ため上で説明したように特別な架橋ポリマーシステムを
用いて新規で有用な配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏ
ｎ）でフマル酸アンモニウムの変換によりＬ−アスパラ
ギン酸（もしくはそのアンモニウム塩）を産生できる、
結合している大腸菌特に大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の全
細胞もしくはその同等物に依存している。示したプレポ
リマーシステムは、４０℃より低い温度で、細胞のＬ−
アスパルターゼ活性を著しくは低下させることなく大腸
菌を含有する比較的多量の水の存在下で架橋され得る。
このような水性架橋条件が、たとえ細胞が不溶性架橋ポ
リマー網目構造中に不動化されても、Ｌ−アスパルター
ゼ活性を有する大腸菌細胞を残すことは、本発明の驚く
べき面である。本発明の他のすばらしい面は、ポリマー
水溶液中の大腸菌細胞の湿分散（ｗｅｔｄｉｓｐｅｒｓ
ｉｏｎ）が、不動化細胞がまだ驚くべきことにそのもと
のＬ−アスパルターゼ活性をほとんど保持しながら、乾
燥され得ることである。該乾燥工程は、Ｌ−アスパルタ
ーゼ活性を保持している細胞を高濃度で有している被
膜，膜，粒子等の形態で、強力な，良く架橋した，不溶
性組成物を提供する利点を有している。ここに記載の新
規な不動化Ｌ−アスパルターゼ細胞組成物は、以前例え
ばＦｕｓｅｅ他およびＳａｔｏ他により前記の文献中に
報告された不動化Ｌ−アスパルターゼ活性大腸菌細胞組
成物より性能がすぐれていることが判明した。本発明の
大腸菌細胞の不動化用の架橋ポリマー網目構造を提供す
るための使用に適したプレポリマー物質は、以下を含
む： （１） 水溶液中で＝ＮＨ，−ＳＨ，−ＯＨ，−ＣＯＯ
Ｈとの反応により架橋され得るポリアゼチジンプレポリ
マー；又はＨ２Ｏ除去、加熱もしくはより塩基性ｐＨへ
の変化により架橋され得る他のポリアゼチジン。本方法
に使用できるポリカップ（登録商標）１７２（Ｐｏｌｙ
ｃｕｐ（登録商標）１７２）（ハーキュレス社）の如き
代表的ポリアゼチジンの理想的構造は、次の通りであ
り、式中Ｒは典型的には−（ＣＨ２）４−である：
は使用方法に係る。本発明は特に、Ｌ−アスパルターゼ
活性を含有する不動化微生物細胞、特に大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞を用いたＬ−アスパ
ラギン酸を製造する改良方法に係る。しかしながら、他
の細胞の不動化及び使用もまた考えられる。Ｌ−アスパ
ラギン酸の製造に使用する大腸菌もしくは他の微生物細
胞の不動化に関するかなりの量の先行技術がある。例え
ば、米国特許第３，７９１，９２６号（Ｃｈｉｂａｔａ
他）には、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の如きアスパルタ
ーゼ−産生微生物を含有する水性懸濁液中で、アクリル
アミド，Ｎ，Ｎ′−低級アルキレン−ビス（アクリルア
ミド）およびビス（アクリルアクドメチル）エーテルか
ら選択されるモノマーの重合を伴なうＬ−アスパラギン
酸の製造方法が記載されいる。得られたアスパルターゼ
−産生不動化微生物を、酵素反応によりＬ−アスパラギ
ン酸を付与するフマル酸アンモニウム又はフマル酸もし
くはその塩と無機のアンモニウム塩との混合物で処理す
る。アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞の不動化
及び得られた不動化細胞のＬ−アスパラギン酸製造用の
使用はまた、Ｆｕｓｅｅ他によりＡｐｐｌｉｅｄａｎｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ，４２巻，４号，６７２〜６７６頁（１９８１年１
０月）にも記載されている。Ｆｕｓｅｅ他によると、細
胞は、液体イソシアナートでおおわれた（ｉｓｏｃｙａ
ｎａｔｅ−ｃａｐｐｅｄ）ポリウレタンプレポリマー
（ハイポール（登録商標）（ＨＹＰＯＬ（登録商標））
と細胞懸濁液との混合により不動化され、そうして不動
化細胞を含有する“フォーム（ｆｏａｍ）”を形成す
る。Ｓａｔｏ他（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｐ
ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５７０，１７９〜１８６ペ
ージ，１９７９年）は、アスパルターゼ活性を含有する
大腸菌細胞のκ−カラジーナン（κ−ｃａｒｒａｇｅｅ
ｎａｎ）による不動化及びＬ−アスパラギン酸を生産す
るための不動化生成物の使用について発表した。ウレタ
ンプレポリマー，ポリウレタンもしくは類似物中での微
生物細胞の不動化について記載したほかの文献発表は、
以下のことを含む： （ａ） ポリウレタンマトリックス中での微生物細胞の
不動化、Ｋｌｅｉｎ他によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３巻，２号，６５〜７０ページ
（１９８１年）； （ｂ） 親水性ウレタンプレポリマー：酵素捕捉（ｅｎ
ｔｒａｐｍｅｎｔ）用に便利な物質、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
２０巻，１４６５〜１４６９ページ（１９７８年）； （ｃ） 有機溶媒中でゲル内に捕捉された細胞によるス
テロイドの転換，Ｏｍａｔａ他によるＥｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，１４３〜１５
５ページ（１９７９年）； （ｄ） 親水性ウレタンプレポリマーを用いた微生物細
胞とオルガネラの捕捉、Ｔａｎａｋａ他によるＥｕｒｏ
ｐｅａｎ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，３
５１〜３５４（１９７９）。 不動化微生物細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を製造す
る上記の方法には、種々の不便がある。例えばＦｕｓｅ
ｅ他及びＳａｔｏ他により発表された如きＫ−カラジー
ナンガム及びポリウレタン“フォーム”は、比較的柔軟
で且つ圧縮性である。したがってこれらの不動化細胞組
成物は、フマル酸アンモニウムがアンモニウムアスパル
ターゼへの変換のために通るカラム中で使用されると
き、該細胞組成物は、特に高流速および／もしくは比較
的長めのカラムを使用する場合、圧縮されそして詰ま
る。本発明の主な目的は、Ｌ−アスパルターゼ活性微生
物細胞好ましくは大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン
酸を製造する改良方法を提供することであり、該微生物
細胞は特別な方法で不動化され、それによって得られた
組成物はＬ−アスパラギン酸のバッチ式もしくは連続式
製造に極めて有用である。更に特別の目的は、比較的長
期間最適なＬ−アスパルターゼ活性を保持する不動化大
腸菌細胞を用いて、フマル酸アンモニウムからＬ−アス
パラギン酸を製造する改良方法の提供を含む。本発明の
他の特別の目的は、不動化細胞の使用を含む先行技術で
当面する問題を取り除く、Ｌ−アスパラギン酸作製の使
用に適した新規な不動化微生物システムを提供すること
である。他の目的はまた、以下で明らかとなるであろ
う。本発明の一態様によると、Ｌ−アスパルターゼ活性
を含有する大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞もしくは同等
の細胞を含む不動化微生物細胞組成物とフマル酸アンモ
ニウムもしくは同等のものとの接触によるＬ−アスパラ
ギン酸の製造方法が提供され、該細胞は、ポリアゼチジ
ンプレポリマー，カルボキシメチルセルロース（ＣＭ
Ｃ），ポリウレタンヒドロゲルプレポリマー及びポリメ
チレンイソシアナートから成るグループから選択される
硬化性プレポリマー物質の硬化により得られる固定化不
溶性架橋ポリマーによって不動化され、該プレポリマー
物質は微生物細胞のＬ−アスパルターゼ活性が著しくは
減弱する温度より低い温度で硬化され、該細胞／架橋ポ
リマー組成物は固体状不活性担体上の被膜を構成する。
不動化細胞／架橋ポリマー被膜の担体上への適用は、Ｌ
−アスパラギン酸製造に使用するためのすこぶる有利な
形態の細胞／ポリマー組成物を提供する。本発明の細胞
／ポリマーシステムが、Ｌ−アスパルターゼ活性の著し
い損失なしに担体上の乾燥被膜として提供され得ること
は、特に有利な特徴である。本発明の特に好ましい態様
は、Ｌ−アスパルターゼ活性を有する不動化大腸菌細胞
の提供を意図し、該細胞はポリアゼチジンプレポリマー
の硬化により得られる架橋水不溶性ポリマーにより不動
化される。概して本発明は、Ｌ−アスパルターゼ活性を
有することが知られており、それゆえ、細胞を結合する
ため上で説明したように特別な架橋ポリマーシステムを
用いて新規で有用な配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏ
ｎ）でフマル酸アンモニウムの変換によりＬ−アスパラ
ギン酸（もしくはそのアンモニウム塩）を産生できる、
結合している大腸菌特に大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の全
細胞もしくはその同等物に依存している。示したプレポ
リマーシステムは、４０℃より低い温度で、細胞のＬ−
アスパルターゼ活性を著しくは低下させることなく大腸
菌を含有する比較的多量の水の存在下で架橋され得る。
このような水性架橋条件が、たとえ細胞が不溶性架橋ポ
リマー網目構造中に不動化されても、Ｌ−アスパルター
ゼ活性を有する大腸菌細胞を残すことは、本発明の驚く
べき面である。本発明の他のすばらしい面は、ポリマー
水溶液中の大腸菌細胞の湿分散（ｗｅｔｄｉｓｐｅｒｓ
ｉｏｎ）が、不動化細胞がまだ驚くべきことにそのもと
のＬ−アスパルターゼ活性をほとんど保持しながら、乾
燥され得ることである。該乾燥工程は、Ｌ−アスパルタ
ーゼ活性を保持している細胞を高濃度で有している被
膜，膜，粒子等の形態で、強力な，良く架橋した，不溶
性組成物を提供する利点を有している。ここに記載の新
規な不動化Ｌ−アスパルターゼ細胞組成物は、以前例え
ばＦｕｓｅｅ他およびＳａｔｏ他により前記の文献中に
報告された不動化Ｌ−アスパルターゼ活性大腸菌細胞組
成物より性能がすぐれていることが判明した。本発明の
大腸菌細胞の不動化用の架橋ポリマー網目構造を提供す
るための使用に適したプレポリマー物質は、以下を含
む： （１） 水溶液中で＝ＮＨ，−ＳＨ，−ＯＨ，−ＣＯＯ
Ｈとの反応により架橋され得るポリアゼチジンプレポリ
マー；又はＨ２Ｏ除去、加熱もしくはより塩基性ｐＨへ
の変化により架橋され得る他のポリアゼチジン。本方法
に使用できるポリカップ（登録商標）１７２（Ｐｏｌｙ
ｃｕｐ（登録商標）１７２）（ハーキュレス社）の如き
代表的ポリアゼチジンの理想的構造は、次の通りであ
り、式中Ｒは典型的には−（ＣＨ２）４−である：
【化１】 （２） 水溶液中でＦｅ＋＋＋，Ａｌ＋＋＋，Ｃ
ａ＋＋，Ｍｇ＋＋の如き多価イオンとの反応により架橋
され得るカルボキシメチルセルロース。ＣＭＣ７ＨＦ
（ハーキュレス社）の如きカルボキシメチルセルロース
ポリマーの理想的構造は、次の通りである：
ａ＋＋，Ｍｇ＋＋の如き多価イオンとの反応により架橋
され得るカルボキシメチルセルロース。ＣＭＣ７ＨＦ
（ハーキュレス社）の如きカルボキシメチルセルロース
ポリマーの理想的構造は、次の通りである：
【化２】 （３） 水溶液中で−ＮＨ，−ＳＨ，−ＯＨ，−ＣＯＯ
ＨもしくはＨ２Ｏとの反応により架橋され得るポリウレ
タンヒドロゲルプレポリマー。代表的ポリウレタンヒド
ロゲルプレポリマーの理想的構造は次の通りであり、該
プレポリマーは、１分子当たり２個より多いヒドロキシ
ル基及び３，０００より大きな分子量を有し且つ各ヒド
ロキシル基は低分子量のポリイソシアナートでおおわれ
ている水溶性ポリエーテルポリオールを用いて作られ
る：
ＨもしくはＨ２Ｏとの反応により架橋され得るポリウレ
タンヒドロゲルプレポリマー。代表的ポリウレタンヒド
ロゲルプレポリマーの理想的構造は次の通りであり、該
プレポリマーは、１分子当たり２個より多いヒドロキシ
ル基及び３，０００より大きな分子量を有し且つ各ヒド
ロキシル基は低分子量のポリイソシアナートでおおわれ
ている水溶性ポリエーテルポリオールを用いて作られ
る：
【化３】 ［式中、Ｒ１は典型的には低分子量のポリオールフラグ
メント（グリセロール，ペンタエリトリトール，ソルビ
トール等からの）であり；ａ及びｂは整数であり、例え
ばａは典型的には＞１０であり且つａ／ｂの比は一般的
には２乃至５であり、ａ及びｂセグメントの配列順はで
たらめもしくはかたまりになっており；ｎもまた典型的
には＞２の整数であり；Ｒ２は典型的にはトルエンジイ
ソシアナート，メチレンジ（フェニルイソシアナー
ト），ｍ−キシレンジイソシアナート，イソホロン−ジ
イソシアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート，ヘ
キサヒドロ−ｍ−キシリレンジイソシアナート，ドデカ
ヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナート）及び類似
物の如きジイソシアナートである］ （４） 水との混合により硬化し得る次式の如きポリメ
チレンイソシアナート：
メント（グリセロール，ペンタエリトリトール，ソルビ
トール等からの）であり；ａ及びｂは整数であり、例え
ばａは典型的には＞１０であり且つａ／ｂの比は一般的
には２乃至５であり、ａ及びｂセグメントの配列順はで
たらめもしくはかたまりになっており；ｎもまた典型的
には＞２の整数であり；Ｒ２は典型的にはトルエンジイ
ソシアナート，メチレンジ（フェニルイソシアナー
ト），ｍ−キシレンジイソシアナート，イソホロン−ジ
イソシアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート，ヘ
キサヒドロ−ｍ−キシリレンジイソシアナート，ドデカ
ヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナート）及び類似
物の如きジイソシアナートである］ （４） 水との混合により硬化し得る次式の如きポリメ
チレンイソシアナート：
【化４】 ［但し、式中ｎは０乃至４である］このようなポリイソ
シアナートは商品として入手可能であり、一般に“未精
製重合メチレンジ（フェニルイソシアナート）”と呼ば
れる。水により架橋不溶性ポリマーに転換しうる他のポ
リイソシアナートもまた使用しうると考えられる。例え
ば、トルエンジイソシアナート，メチレンジ（フェニル
イソシアナート），ｍ−キシリレンジイソシアナート，
イソホロン−ジイソシアナート，ヘキサメチレンジイソ
シアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシリレンジイソシア
ナート，ドデカヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナ
ート）及び類似物がある。イソシアナートは、適当な粒
子状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）を被覆し、次いで大腸菌細胞の水性スラリーと混
合することにより有効に使用される。前記のポリマーシ
ステムのいずれも、種々の異なる形態（ｆｏｒｍ）及び
形（ｓｈａｐｅ）を有する細胞／ポリマー組成物を提供
するＬ−アスパルターゼ活性大腸菌の不動化に使用され
得る。例えば、不動化細胞／ポリマー組成物は、膜，フ
ィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔ），繊維（ｆｉｂｅ
ｒ），管，ビーズもしくは類似物の形態で製造され得
る。本発明の特に重要な実施態様は、適当な形の支持体
上の被膜として不動化細胞／ポリマー組成物を提供する
ことを含み、該支持体は、有利には、必ずしもその必要
はないけれども、不活性固体状の有機もしくは無機の多
孔性もしくは非多孔性物質の固体または網状ビーズまた
は粒子の形態である。上記に記載したように、本発明の
組成物は、細胞のＬ−アスパルターゼ活性に本質的な影
響絵を及ぼさずに硬化且つ乾燥され得、その結果として
該組成物は、乾燥被膜ビーズあるいは他の粒子状物質
（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）の形態
に製造でき、且つ使用に必要となるまで貯蔵できる。典
型的には、本発明の不動化細胞／架橋ポリマー組成物用
に使用しうる支持体もしくは担体は，ビーズもしくは粒
子状の形態の次のものを含む： モレキュラーシーブ イオン交換樹脂 ア ル ミ ナ シリカ及びシリカゲル 有孔虫の骨格 ポリマーラテックス 金 属 本発明で使用されるポリマーシステムの有用な性質は、
該システムがＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞
と水中で接触もしくは混合でき、次いで大腸菌細胞を保
持もしくは不動化する不溶性で比較的固定したポリマー
マトリックスを形成するように架橋（もしくは硬化）で
きることである。使用されるに必要な架橋条件は充分に
温和であり、そのため大腸菌突然変異細胞のＬ−アスパ
ルターゼ活性が保持されるということは特に有利であ
る。上記に示したように、本発明の特に所望の組成物
は、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞と不
動化ポリマーを、被膜としてかたい無機もしくは有機ポ
リマービーズ上に適用することにより得られる。これら
の比較的非圧縮性組成物を用いると、固定床もしくは流
動床に於いて高生産量が可能なＬ−アスパルターゼ活性
触媒ベッドが可能である。上記に記載してたように、比
較的柔軟で圧縮性であるκ−カラジーナンガム又はポリ
ウレタンフォームを使用する、従来の文献に記載された
Ｌ−アスパルターゼ活性不動化細胞組成物にあっては、
圧縮性であるため、高流速および／又は長いカラム（ベ
ッド）の場合、詰まる傾向があったのである。本発明に
よれば、種々の方法が、硬化もしくは架橋された形態の
プレポリマーとの組み合わせにより、Ｌ−アスパルター
ゼ活性を保持しながら、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞
の不動化のために利用され得る。いずれかの特定の場合
に於いて使用される好ましい方法は、少なくともある程
度まで使用されるプレポリマーに依存する。すなわち、 ａ）好ましいポリアゼチジンプレポリマーの場合、大腸
菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞は、プレポリマーの水溶液と
有利に混合され、そうして均質混合物が得られ、その後
でポリアゼチジンは次のいずれかの方法により不溶性Ｌ
−アスパルターゼ活性組成物を付与するために硬化もし
くは架橋され得る：水の一部もしくはほとんど全部を６
０℃より低い温度（通常は４０℃と０℃の間）で且つ７
６０〜１．０Ｔｏｒｒの圧力下で除去すること；７．５
以上にｐＨを上昇させること；大腸菌／ポリアゼチジン
混合物をポリアミンにさらすこと（例えば、１〜２重量
部（ｐａｒｔｓ／ｗｅｉｇｈｔ）のポリエチレンイミ
ン，ポリアミノイオン交換樹脂，ジエチレントリアミ
ン，エチレンジアミン等の各々に対し組成物１００部を
使用する）。 ｂ） カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ガムの場
合、大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３との均質混合物は、水
性混合物例えば１．０重量部の細胞ペースト／ＣＭＣ混
合物を０．００１〜１．０重量部の多価カチオン塩と接
触させることにより、又は理想的には１．０重量部の細
胞ペースト／ＣＭＣ混合物につき０．０１〜０．４重量
部の多価カチオン塩を接触させることにより、膜，フア
イバー，ビーズ等に架橋（硬化）され得る。得られた水
不溶性不動化細胞／ポリマー網目構造組成物は、このよ
うに膜，繊維もしくはビーズの形で、しかしながら最も
効率よくは高表面積粒子のまわりの被膜として硬化され
得る。実例として、１０乃至１０００重量部の高表面積
粒子は１．０重量部の細胞ペースト／ＣＭＣ混合物で被
覆され得、理想的には細胞ペースト／ＣＭＣ混合物１．
０重量部当り粒子５０乃至５００重量部使用される。硬
化被膜中に含有される７５％以上の水の除去は、細胞／
ポリマー被膜の強度および結合を改良するのに望まし
い、 ｃ） ポリウレタンヒドロゲルを使用するときには、大
腸菌ＡＴＣＣ １１３０３の均質水性分散（典型的に
は、広くは１．０乃至１０００ｍｌのＨ２Ｏ当たり細胞
１．０ｇ）を該ヒドロゲルポリマーと混合し、ポリイソ
シアナートを水と反応させることにより、又はより迅速
な方法として、１０００乃至０．１Ｔｏｒｒ且つ５０℃
より低い温度（好ましくは７６０乃至５．０Ｔｏｏｒ且
つ０℃乃至３０℃）で除去し得る水の５０乃至１００％
を除去することにより、もしくは２つの１級もしくは２
級アミン基を有する分子の水溶液に未乾燥組成物をさら
すことにより、該プレポリマーは、水不溶性Ｌ−アスパ
ルターゼ活性組成物に硬化される。典型的には、これら
のポリアミン分子は、ヒドラジンもしくはエチレンジア
ミンからポリエチレンイミンまで利用できる。一般的に
使用される該ヒドロゲルプレポリマー各１．０ｇに対し
て、１．０乃至５００ｍｌの水中の０．０１乃至１０．
０ｇのポリアミンが使用できる。特に０．１乃至１．０
ｇのポリアミンと１０乃至１００ｍｌの水が、使用され
るヒドロゲルプレポリマー１ｇ当たり使用される。上記
の大腸菌／ヒドロゲル組成物を、膜，繊維，ビーズ等に
することができる。しかし好ましい配置は、前記したよ
うに、高表面積粒子上の被膜として該組成物を使用する
ことである。使用される粒子の表面積によって、０．１
乃至１００．０ｇの大腸菌／ヒドロゲル組成物を１００
ｇの粒子に被覆することができる。 ｄ） ポリイソシアナートが使用される場合には、これ
らが一般的にはじめに表面に適用され、そしてその後に
大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３細胞がそこに添加される。
通常は、表面物質１０．０ｇ当たりポリイソシアナート
０．１乃至２０．０ｇが使用され得、好ましくは表面物
質１０．０ｇ当たりポリイソシアナート０．５乃至１
０．０ｇが使用され得る。ポリイソシアナートは、もし
液体の場合には、希釈せずに良好な混合（かきまぜ機も
しくは回転）により支持体に加えることができる。しか
しながら、好ましい方法は、トルエン，アセトン，クロ
ロホルム，テトラヒドロフラン，ジメトキシエタン，酢
酸エチル及び類似物の如き不活性で容易に蒸発する溶媒
中のポリイソシアナート溶液を使用することである。こ
のような溶液は、支持体好ましくは高表面積の乾燥粒子
によく混合して加えられ、そして溶媒は７６０Ｔｏｒｒ
以下で各々の沸点で、均質に被覆された可動性支持体粒
子を得るために良好な混合を継続しながら、除去され
る。使用される溶媒量は、通常には、ポリイソシアナー
ト１．０重量部あたり１．０乃至１００重量部で変化す
る。本発明の不動化細胞／ポリマー組成物は、バッチ式
もしくは連続式の両方法によりアスパラギン酸を作るの
に使用され得る。しかしながら、これらの組成物は、特
にビーズもしくは他の粒子状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌ
ａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）上に被覆される場合には、次
式にしたがうフマル酸アンモニウム水溶液のＬ−アスパ
ラギン酸アンモニウムへの連続変換に特に有効である：
シアナートは商品として入手可能であり、一般に“未精
製重合メチレンジ（フェニルイソシアナート）”と呼ば
れる。水により架橋不溶性ポリマーに転換しうる他のポ
リイソシアナートもまた使用しうると考えられる。例え
ば、トルエンジイソシアナート，メチレンジ（フェニル
イソシアナート），ｍ−キシリレンジイソシアナート，
イソホロン−ジイソシアナート，ヘキサメチレンジイソ
シアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシリレンジイソシア
ナート，ドデカヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナ
ート）及び類似物がある。イソシアナートは、適当な粒
子状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）を被覆し、次いで大腸菌細胞の水性スラリーと混
合することにより有効に使用される。前記のポリマーシ
ステムのいずれも、種々の異なる形態（ｆｏｒｍ）及び
形（ｓｈａｐｅ）を有する細胞／ポリマー組成物を提供
するＬ−アスパルターゼ活性大腸菌の不動化に使用され
得る。例えば、不動化細胞／ポリマー組成物は、膜，フ
ィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔ），繊維（ｆｉｂｅ
ｒ），管，ビーズもしくは類似物の形態で製造され得
る。本発明の特に重要な実施態様は、適当な形の支持体
上の被膜として不動化細胞／ポリマー組成物を提供する
ことを含み、該支持体は、有利には、必ずしもその必要
はないけれども、不活性固体状の有機もしくは無機の多
孔性もしくは非多孔性物質の固体または網状ビーズまた
は粒子の形態である。上記に記載したように、本発明の
組成物は、細胞のＬ−アスパルターゼ活性に本質的な影
響絵を及ぼさずに硬化且つ乾燥され得、その結果として
該組成物は、乾燥被膜ビーズあるいは他の粒子状物質
（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）の形態
に製造でき、且つ使用に必要となるまで貯蔵できる。典
型的には、本発明の不動化細胞／架橋ポリマー組成物用
に使用しうる支持体もしくは担体は，ビーズもしくは粒
子状の形態の次のものを含む： モレキュラーシーブ イオン交換樹脂 ア ル ミ ナ シリカ及びシリカゲル 有孔虫の骨格 ポリマーラテックス 金 属 本発明で使用されるポリマーシステムの有用な性質は、
該システムがＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞
と水中で接触もしくは混合でき、次いで大腸菌細胞を保
持もしくは不動化する不溶性で比較的固定したポリマー
マトリックスを形成するように架橋（もしくは硬化）で
きることである。使用されるに必要な架橋条件は充分に
温和であり、そのため大腸菌突然変異細胞のＬ−アスパ
ルターゼ活性が保持されるということは特に有利であ
る。上記に示したように、本発明の特に所望の組成物
は、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞と不
動化ポリマーを、被膜としてかたい無機もしくは有機ポ
リマービーズ上に適用することにより得られる。これら
の比較的非圧縮性組成物を用いると、固定床もしくは流
動床に於いて高生産量が可能なＬ−アスパルターゼ活性
触媒ベッドが可能である。上記に記載してたように、比
較的柔軟で圧縮性であるκ−カラジーナンガム又はポリ
ウレタンフォームを使用する、従来の文献に記載された
Ｌ−アスパルターゼ活性不動化細胞組成物にあっては、
圧縮性であるため、高流速および／又は長いカラム（ベ
ッド）の場合、詰まる傾向があったのである。本発明に
よれば、種々の方法が、硬化もしくは架橋された形態の
プレポリマーとの組み合わせにより、Ｌ−アスパルター
ゼ活性を保持しながら、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞
の不動化のために利用され得る。いずれかの特定の場合
に於いて使用される好ましい方法は、少なくともある程
度まで使用されるプレポリマーに依存する。すなわち、 ａ）好ましいポリアゼチジンプレポリマーの場合、大腸
菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞は、プレポリマーの水溶液と
有利に混合され、そうして均質混合物が得られ、その後
でポリアゼチジンは次のいずれかの方法により不溶性Ｌ
−アスパルターゼ活性組成物を付与するために硬化もし
くは架橋され得る：水の一部もしくはほとんど全部を６
０℃より低い温度（通常は４０℃と０℃の間）で且つ７
６０〜１．０Ｔｏｒｒの圧力下で除去すること；７．５
以上にｐＨを上昇させること；大腸菌／ポリアゼチジン
混合物をポリアミンにさらすこと（例えば、１〜２重量
部（ｐａｒｔｓ／ｗｅｉｇｈｔ）のポリエチレンイミ
ン，ポリアミノイオン交換樹脂，ジエチレントリアミ
ン，エチレンジアミン等の各々に対し組成物１００部を
使用する）。 ｂ） カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ガムの場
合、大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３との均質混合物は、水
性混合物例えば１．０重量部の細胞ペースト／ＣＭＣ混
合物を０．００１〜１．０重量部の多価カチオン塩と接
触させることにより、又は理想的には１．０重量部の細
胞ペースト／ＣＭＣ混合物につき０．０１〜０．４重量
部の多価カチオン塩を接触させることにより、膜，フア
イバー，ビーズ等に架橋（硬化）され得る。得られた水
不溶性不動化細胞／ポリマー網目構造組成物は、このよ
うに膜，繊維もしくはビーズの形で、しかしながら最も
効率よくは高表面積粒子のまわりの被膜として硬化され
得る。実例として、１０乃至１０００重量部の高表面積
粒子は１．０重量部の細胞ペースト／ＣＭＣ混合物で被
覆され得、理想的には細胞ペースト／ＣＭＣ混合物１．
０重量部当り粒子５０乃至５００重量部使用される。硬
化被膜中に含有される７５％以上の水の除去は、細胞／
ポリマー被膜の強度および結合を改良するのに望まし
い、 ｃ） ポリウレタンヒドロゲルを使用するときには、大
腸菌ＡＴＣＣ １１３０３の均質水性分散（典型的に
は、広くは１．０乃至１０００ｍｌのＨ２Ｏ当たり細胞
１．０ｇ）を該ヒドロゲルポリマーと混合し、ポリイソ
シアナートを水と反応させることにより、又はより迅速
な方法として、１０００乃至０．１Ｔｏｒｒ且つ５０℃
より低い温度（好ましくは７６０乃至５．０Ｔｏｏｒ且
つ０℃乃至３０℃）で除去し得る水の５０乃至１００％
を除去することにより、もしくは２つの１級もしくは２
級アミン基を有する分子の水溶液に未乾燥組成物をさら
すことにより、該プレポリマーは、水不溶性Ｌ−アスパ
ルターゼ活性組成物に硬化される。典型的には、これら
のポリアミン分子は、ヒドラジンもしくはエチレンジア
ミンからポリエチレンイミンまで利用できる。一般的に
使用される該ヒドロゲルプレポリマー各１．０ｇに対し
て、１．０乃至５００ｍｌの水中の０．０１乃至１０．
０ｇのポリアミンが使用できる。特に０．１乃至１．０
ｇのポリアミンと１０乃至１００ｍｌの水が、使用され
るヒドロゲルプレポリマー１ｇ当たり使用される。上記
の大腸菌／ヒドロゲル組成物を、膜，繊維，ビーズ等に
することができる。しかし好ましい配置は、前記したよ
うに、高表面積粒子上の被膜として該組成物を使用する
ことである。使用される粒子の表面積によって、０．１
乃至１００．０ｇの大腸菌／ヒドロゲル組成物を１００
ｇの粒子に被覆することができる。 ｄ） ポリイソシアナートが使用される場合には、これ
らが一般的にはじめに表面に適用され、そしてその後に
大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３細胞がそこに添加される。
通常は、表面物質１０．０ｇ当たりポリイソシアナート
０．１乃至２０．０ｇが使用され得、好ましくは表面物
質１０．０ｇ当たりポリイソシアナート０．５乃至１
０．０ｇが使用され得る。ポリイソシアナートは、もし
液体の場合には、希釈せずに良好な混合（かきまぜ機も
しくは回転）により支持体に加えることができる。しか
しながら、好ましい方法は、トルエン，アセトン，クロ
ロホルム，テトラヒドロフラン，ジメトキシエタン，酢
酸エチル及び類似物の如き不活性で容易に蒸発する溶媒
中のポリイソシアナート溶液を使用することである。こ
のような溶液は、支持体好ましくは高表面積の乾燥粒子
によく混合して加えられ、そして溶媒は７６０Ｔｏｒｒ
以下で各々の沸点で、均質に被覆された可動性支持体粒
子を得るために良好な混合を継続しながら、除去され
る。使用される溶媒量は、通常には、ポリイソシアナー
ト１．０重量部あたり１．０乃至１００重量部で変化す
る。本発明の不動化細胞／ポリマー組成物は、バッチ式
もしくは連続式の両方法によりアスパラギン酸を作るの
に使用され得る。しかしながら、これらの組成物は、特
にビーズもしくは他の粒子状支持体（ｐａｒｔｉｃｕｌ
ａｔｅ ｓｕｐｐｏｒｔ）上に被覆される場合には、次
式にしたがうフマル酸アンモニウム水溶液のＬ−アスパ
ラギン酸アンモニウムへの連続変換に特に有効である：
【化５】 本発明のＬ−アスパラギン酸もしくはＬ−アスパラギン
酸アンモニウムの製造に使用し得る方法の実例として
は、次の通りである： （ｉ） 触媒組成物が、０．１乃至５．０モル（好まし
くは０．５乃至２．０モル）のフマル酸アンモニウムの
水溶液中で、ｐＨ５．０乃至１０．０（好ましくはｐＨ
７．５乃至９．５）で、１．０乃至１００時間（好まし
くは８乃至４８時間）、５０℃より低い温度（好ましく
は２０乃至４０℃）で撹拌されるバッチ式工程。広くは
０．０５乃至５０ｇの好ましくは１．０乃至１５ｇの不
動化細胞を、出発フマル酸アンモニウム１モル当たりに
使用する。変換後、触媒組成物は、濾過もしくは同等の
方法により、フマル酸塩溶液を変換する新しいバッチで
の再使用のために除去され得る。生成物溶液は、Ｌ−ア
スパラギン酸を単離するための普通の工程（酸性化，沈
殿，濾過，洗浄，再結晶，乾燥）に適した形態で得られ
る。 （ｉｉ） 触媒組成物例えば被覆ビーズをカラム内に置
き、そしてフマル酸アンモニウム溶液（濃度，ｐＨ，温
度はバッチ式工程に記載のものと同じである）を、上か
らもしくは下から（流動床方式）のどちらかから触媒ベ
ット内を通過させる連続式工程。これらのフマル酸塩溶
液の通過速度は、０．１乃至１０００空間速度／時間で
変化し得る。例えば、１時間当たり５．０リットルの溶
液が、１．０リットルの触媒ベットを通り、これは１時
間当たり５．０空間速度（Ｓ．Ｖ．）と表わされる。好
ましくは、フマル酸塩からＬ−アスパラギン酸塩への本
質的に１００％の変換が生じるフマル酸塩溶液の流速
は、０．５乃至２０．０Ｓ．Ｖ．／時間に一致する。こ
れらの触媒ベットカラムからの溶出液は、Ｌ−アスパラ
ギン酸を単離するための通常の工程（上記のバッチ式工
程に於いて概略を述べたように）に適している。本発明
を、以下の実施例により詳細に説明する：実施例１ ＣＭＣガム中に不動化したＬ−アスパルター
ゼを含有する大腸菌の製造 高分子量のカルボキシメチルセルロース（ハーキュレス
７ ＨＦ ＣＭＣガム、分子量約７００，０００、無
水グルコース１ユニット当たり０．６５乃至０．８５の
カルボキシメチル基を有する）の１％水溶液１０ｇに、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＡＴＣＣ １１３０３のペ
ースト０．５ｇを加えた。完全な均質分散を、木製の棒
を用いて手で撹拌して作った。この分散の一部２．０ｇ
を、水和５オングストロームモレキュラーシーブビーズ
（８〜１２メッシュ、あらかじめビーズ１００ｇを水２
００ｇと混合し、次いで過剰の水をデカントしそしてビ
ーズを空気中２５℃で乾燥させることにより水和したも
の）１０ｇ上に置いた。５乃至１０分間手で完全に撹拌
後、一様に被覆された湿気の多い、しかし自由に流動す
るビーズが得られた。次いでこれらの被覆ビーズを、Ｆ
ｅＳＯ４・ｎＨ２Ｏの０．１％水溶液４０ｍｌ中に注い
だ。２５℃に於ける周期的な穏やかな撹拌の４時間後
に、液体をデカントし、（考えられるゲル状微粒子が液
体中に認められた）そしてビーズを０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝溶液で４回洗浄した。湿った被覆ビーズが合
計２２．２ｇ得られた。ビーズは、５℃で湿気の多い空
気中に貯蔵した。Ｌ−アスパルターゼ活性（第１表参
照）に、これらの湿ったビーズの一部５．０ｍｌを使用
した。この一部は６．３ｇの重さがあり、大腸菌細胞
０．０２７ｇを含有すると計算された。
酸アンモニウムの製造に使用し得る方法の実例として
は、次の通りである： （ｉ） 触媒組成物が、０．１乃至５．０モル（好まし
くは０．５乃至２．０モル）のフマル酸アンモニウムの
水溶液中で、ｐＨ５．０乃至１０．０（好ましくはｐＨ
７．５乃至９．５）で、１．０乃至１００時間（好まし
くは８乃至４８時間）、５０℃より低い温度（好ましく
は２０乃至４０℃）で撹拌されるバッチ式工程。広くは
０．０５乃至５０ｇの好ましくは１．０乃至１５ｇの不
動化細胞を、出発フマル酸アンモニウム１モル当たりに
使用する。変換後、触媒組成物は、濾過もしくは同等の
方法により、フマル酸塩溶液を変換する新しいバッチで
の再使用のために除去され得る。生成物溶液は、Ｌ−ア
スパラギン酸を単離するための普通の工程（酸性化，沈
殿，濾過，洗浄，再結晶，乾燥）に適した形態で得られ
る。 （ｉｉ） 触媒組成物例えば被覆ビーズをカラム内に置
き、そしてフマル酸アンモニウム溶液（濃度，ｐＨ，温
度はバッチ式工程に記載のものと同じである）を、上か
らもしくは下から（流動床方式）のどちらかから触媒ベ
ット内を通過させる連続式工程。これらのフマル酸塩溶
液の通過速度は、０．１乃至１０００空間速度／時間で
変化し得る。例えば、１時間当たり５．０リットルの溶
液が、１．０リットルの触媒ベットを通り、これは１時
間当たり５．０空間速度（Ｓ．Ｖ．）と表わされる。好
ましくは、フマル酸塩からＬ−アスパラギン酸塩への本
質的に１００％の変換が生じるフマル酸塩溶液の流速
は、０．５乃至２０．０Ｓ．Ｖ．／時間に一致する。こ
れらの触媒ベットカラムからの溶出液は、Ｌ−アスパラ
ギン酸を単離するための通常の工程（上記のバッチ式工
程に於いて概略を述べたように）に適している。本発明
を、以下の実施例により詳細に説明する：実施例１ ＣＭＣガム中に不動化したＬ−アスパルター
ゼを含有する大腸菌の製造 高分子量のカルボキシメチルセルロース（ハーキュレス
７ ＨＦ ＣＭＣガム、分子量約７００，０００、無
水グルコース１ユニット当たり０．６５乃至０．８５の
カルボキシメチル基を有する）の１％水溶液１０ｇに、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ＡＴＣＣ １１３０３のペ
ースト０．５ｇを加えた。完全な均質分散を、木製の棒
を用いて手で撹拌して作った。この分散の一部２．０ｇ
を、水和５オングストロームモレキュラーシーブビーズ
（８〜１２メッシュ、あらかじめビーズ１００ｇを水２
００ｇと混合し、次いで過剰の水をデカントしそしてビ
ーズを空気中２５℃で乾燥させることにより水和したも
の）１０ｇ上に置いた。５乃至１０分間手で完全に撹拌
後、一様に被覆された湿気の多い、しかし自由に流動す
るビーズが得られた。次いでこれらの被覆ビーズを、Ｆ
ｅＳＯ４・ｎＨ２Ｏの０．１％水溶液４０ｍｌ中に注い
だ。２５℃に於ける周期的な穏やかな撹拌の４時間後
に、液体をデカントし、（考えられるゲル状微粒子が液
体中に認められた）そしてビーズを０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝溶液で４回洗浄した。湿った被覆ビーズが合
計２２．２ｇ得られた。ビーズは、５℃で湿気の多い空
気中に貯蔵した。Ｌ−アスパルターゼ活性（第１表参
照）に、これらの湿ったビーズの一部５．０ｍｌを使用
した。この一部は６．３ｇの重さがあり、大腸菌細胞
０．０２７ｇを含有すると計算された。
【数１】 実施例２ ポリウレタンヒドロゲル中に不動化したＬ−
アスパルターゼを含有する大腸菌細胞の製造 ａ） ポリウレタンヒドロゲル プレポリマーは、分子
量７，０００の水溶性ポリエーテル（高レベルのポリオ
キシエチレン セグメント）トリオール、ＢＡＳＦ ワ
イアンドットからのプルラコール（登録商標）Ｖ−７
（Ｐｌｕｒａｃｏｌ（登録商標）Ｖ−７）を、３モルの
ドデカヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナート）、
モーベイケミカル（Ｍｏｂａｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社
からのデスモジュール（登録商標）Ｗによりキャッピン
グして製造した。このヒドロゲルプレポリマー１．０ｇ
の水９．０ｇ中の溶液を、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細
胞ペースト１．０ｇと２５℃で完全に混合した。水和し
た５オングストローム、８〜１２メッシュのモレキュラ
ーシーブビーズ２０ｇに、大腸菌−水和プレポリマー水
性分散の一部２．０ｇを加えた。得られた混合物を、２
２，０ｇの湿っているが自由に流動する被覆ビーズを与
えるように、２５℃で木製の棒を用い手で１０分間撹拌
した。予備実験により、このヒドロゲルプレポリマーの
１０％水溶液は、８乃至２４時間の２５℃での空気中で
の乾燥により、水溶性ゲルを形成することが示された。
このように、湿った被覆ビーズを、２０．１ｇの自由に
流動する硬化被覆ビーズを与えるように、１６時間２５
℃の開け放した空気中で乾燥させた。これらの被覆ビー
ズの一部４．３ｇは、５．０ｍｌの体積及び０．０３９
ｇの概算した大腸菌細胞含量
アスパルターゼを含有する大腸菌細胞の製造 ａ） ポリウレタンヒドロゲル プレポリマーは、分子
量７，０００の水溶性ポリエーテル（高レベルのポリオ
キシエチレン セグメント）トリオール、ＢＡＳＦ ワ
イアンドットからのプルラコール（登録商標）Ｖ−７
（Ｐｌｕｒａｃｏｌ（登録商標）Ｖ−７）を、３モルの
ドデカヒドロメチレンジ（フェニルイソシアナート）、
モーベイケミカル（Ｍｏｂａｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社
からのデスモジュール（登録商標）Ｗによりキャッピン
グして製造した。このヒドロゲルプレポリマー１．０ｇ
の水９．０ｇ中の溶液を、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細
胞ペースト１．０ｇと２５℃で完全に混合した。水和し
た５オングストローム、８〜１２メッシュのモレキュラ
ーシーブビーズ２０ｇに、大腸菌−水和プレポリマー水
性分散の一部２．０ｇを加えた。得られた混合物を、２
２，０ｇの湿っているが自由に流動する被覆ビーズを与
えるように、２５℃で木製の棒を用い手で１０分間撹拌
した。予備実験により、このヒドロゲルプレポリマーの
１０％水溶液は、８乃至２４時間の２５℃での空気中で
の乾燥により、水溶性ゲルを形成することが示された。
このように、湿った被覆ビーズを、２０．１ｇの自由に
流動する硬化被覆ビーズを与えるように、１６時間２５
℃の開け放した空気中で乾燥させた。これらの被覆ビー
ズの一部４．３ｇは、５．０ｍｌの体積及び０．０３９
ｇの概算した大腸菌細胞含量
【数２】 を有した。この試料５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼ活
性の測定（第１表参照）に使用した。 ｂ） 上記の大腸菌−ヒドロゲル プレポリマー水性分
散の一部１．０ｇを、５オングストローム、８〜１２メ
ッシュの水和モレキュラーシーブビーズ１０．０ｇ上に
２５℃で同様に被覆した。５乃至１０分間の撹拌後、得
られた自由に流動する湿ったビーズを、良く撹拌しなが
らポリエチレンイミン（アルドリッチケミカル社＃１８
１９７−８）の０．１％水溶液４０ｍｌ中に注いだ。予
備実験により、Ｈ２Ｏ １０ｍｌ中のヒドロゲル プレ
ポリマー１．０ｇの新鮮な、１５分経っていない溶液
は、ポリエチレンイミンの０．１％水溶液との接触によ
り直ちに水不溶性ゲルを形成することが示された。ポリ
エチレンイミン溶液中の被覆ビーズのスラリーを２５℃
で３０分間穏やかに撹拌し、次いで、１１．５ｇの湿気
の多い自由に流動するビーズを与えるように、４０ｍｌ
ずつの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．
５）で４回洗浄した。これらのビーズの一部５．０ｍｌ
は５．１ｇの重さがあり、０．０４１ｇの大腸菌細胞を
含有すると概算された。
性の測定（第１表参照）に使用した。 ｂ） 上記の大腸菌−ヒドロゲル プレポリマー水性分
散の一部１．０ｇを、５オングストローム、８〜１２メ
ッシュの水和モレキュラーシーブビーズ１０．０ｇ上に
２５℃で同様に被覆した。５乃至１０分間の撹拌後、得
られた自由に流動する湿ったビーズを、良く撹拌しなが
らポリエチレンイミン（アルドリッチケミカル社＃１８
１９７−８）の０．１％水溶液４０ｍｌ中に注いだ。予
備実験により、Ｈ２Ｏ １０ｍｌ中のヒドロゲル プレ
ポリマー１．０ｇの新鮮な、１５分経っていない溶液
は、ポリエチレンイミンの０．１％水溶液との接触によ
り直ちに水不溶性ゲルを形成することが示された。ポリ
エチレンイミン溶液中の被覆ビーズのスラリーを２５℃
で３０分間穏やかに撹拌し、次いで、１１．５ｇの湿気
の多い自由に流動するビーズを与えるように、４０ｍｌ
ずつの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ７．
５）で４回洗浄した。これらのビーズの一部５．０ｍｌ
は５．１ｇの重さがあり、０．０４１ｇの大腸菌細胞を
含有すると概算された。
【数３】 この一部５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼの測定（第１
表参照）に使用した。 ｃ） Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌ＡＴＣＣ１
１３０３を有するポリウレタンヒドロゲル膜を、次の方
法で製造した：リン酸塩で緩衝化した塩水（ｐＨ７．
４）１０．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞ペー
スト１０．０ｇのスラリーを、均質分散を確実にするた
めに３０分間２５℃で混合した。脱イオン水１０．０ｇ
中の上記のヒドロゲル プレポリマー（分子量７，００
０、３モルのデスモジュール（登録商標）Ｗでトリオー
ルはおおわれている）５．０ｇの溶液を、１分間２５℃
での激しい撹拌により形成した。この溶液を均質な細胞
ペーストスラリーと混合した。激しい撹拌の２０秒内
に、得られた混合物は極めて濃厚になり、直ちにテフロ
ン（登録商標）シート上に注いだ。２５℃で数秒内に混
合物は、エラストマーゲル（ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ
ｇｅｌ）になった。２５℃の空気中で４５分後、得られ
たエラストマー膜合成物（厚さ１／１６乃至１／４イン
チ、直径４インチ）を、テフロン（登録商標）表面から
はいだ。膜を１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液５００
ｍｌ中に置き、３０分間振りまぜた。細胞および／もし
くはゲルが膜から洗出されたことを示すかなりの濁り
が、水溶液中に現われた。この洗浄工程を、１．５Ｍフ
マル酸アンモニウム溶液１ｌを用い、２５℃で６４時間
繰り返した。溶液はほんの非常にわずかにかすんでお
り、その２８０ｎｍ（１／１０００希釈）に於ける光学
密度は、はじめの０．４３（１／１０００希釈）に比較
して０．００５であった。このことは、本質的にすべて
のフマル酸アンモニウムが消費されたことを示す。膜を
そのまま除去し、そして新鮮な１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウム７５０ｍｌ中に置いた。２５℃での１６時間の穏
やかな撹拌後、膜上の透明液体生成物は２８０ｎｍ（１
／１０００希釈）に於いて０．００５の光学密度を有し
た。この工程を、さらに７５０ｍｌのフマル酸アンモニ
ウムを用い２０時間２５℃で繰り返した。合わせて１
５，０００ｍｌの生成物溶液は透明で、２８０ｎｍに於
いて０．００５の光学密度を有した。合わせた生成物溶
液の一部１０００ｍｌを、濃塩酸１４５ｇを用いてｐＨ
２．８まで酸性化した。得られた白色結晶のスラリーを
５℃に１６時間保ち、次に濾過した。湿気の多いフィル
ターケーキを次に脱イオン水１０００ｍｌ中で８０乃至
９０℃で２時間撹拌し、次に３０℃まで放冷した。白色
結晶状固体を濾過により集め、脱イオン水２５０ｍｌで
洗浄した。固体を２５乃至１００℃で且つ５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで１６時間、１７８．０ｇの定重量になるまで乾
燥した。重量１７８．０ｇは、Ｌ−アスパラギン酸の収
率８９．４％を表わす。
表参照）に使用した。 ｃ） Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌ＡＴＣＣ１
１３０３を有するポリウレタンヒドロゲル膜を、次の方
法で製造した：リン酸塩で緩衝化した塩水（ｐＨ７．
４）１０．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３細胞ペー
スト１０．０ｇのスラリーを、均質分散を確実にするた
めに３０分間２５℃で混合した。脱イオン水１０．０ｇ
中の上記のヒドロゲル プレポリマー（分子量７，００
０、３モルのデスモジュール（登録商標）Ｗでトリオー
ルはおおわれている）５．０ｇの溶液を、１分間２５℃
での激しい撹拌により形成した。この溶液を均質な細胞
ペーストスラリーと混合した。激しい撹拌の２０秒内
に、得られた混合物は極めて濃厚になり、直ちにテフロ
ン（登録商標）シート上に注いだ。２５℃で数秒内に混
合物は、エラストマーゲル（ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ
ｇｅｌ）になった。２５℃の空気中で４５分後、得られ
たエラストマー膜合成物（厚さ１／１６乃至１／４イン
チ、直径４インチ）を、テフロン（登録商標）表面から
はいだ。膜を１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液５００
ｍｌ中に置き、３０分間振りまぜた。細胞および／もし
くはゲルが膜から洗出されたことを示すかなりの濁り
が、水溶液中に現われた。この洗浄工程を、１．５Ｍフ
マル酸アンモニウム溶液１ｌを用い、２５℃で６４時間
繰り返した。溶液はほんの非常にわずかにかすんでお
り、その２８０ｎｍ（１／１０００希釈）に於ける光学
密度は、はじめの０．４３（１／１０００希釈）に比較
して０．００５であった。このことは、本質的にすべて
のフマル酸アンモニウムが消費されたことを示す。膜を
そのまま除去し、そして新鮮な１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウム７５０ｍｌ中に置いた。２５℃での１６時間の穏
やかな撹拌後、膜上の透明液体生成物は２８０ｎｍ（１
／１０００希釈）に於いて０．００５の光学密度を有し
た。この工程を、さらに７５０ｍｌのフマル酸アンモニ
ウムを用い２０時間２５℃で繰り返した。合わせて１
５，０００ｍｌの生成物溶液は透明で、２８０ｎｍに於
いて０．００５の光学密度を有した。合わせた生成物溶
液の一部１０００ｍｌを、濃塩酸１４５ｇを用いてｐＨ
２．８まで酸性化した。得られた白色結晶のスラリーを
５℃に１６時間保ち、次に濾過した。湿気の多いフィル
ターケーキを次に脱イオン水１０００ｍｌ中で８０乃至
９０℃で２時間撹拌し、次に３０℃まで放冷した。白色
結晶状固体を濾過により集め、脱イオン水２５０ｍｌで
洗浄した。固体を２５乃至１００℃で且つ５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで１６時間、１７８．０ｇの定重量になるまで乾
燥した。重量１７８．０ｇは、Ｌ−アスパラギン酸の収
率８９．４％を表わす。
【数４】 ６．０ＮＨＣｌ１００ｍｌ中の白色固体２．０４ｇ溶液
を旋光度を、パーキン−エルマー旋光計を用い２５℃で
測定し、＋０．４９７であることがわかった。同装置
で、Ｌ−アスパラギン酸（シグマケミカル社＃Ａ−９２
５６）の標品２．０４ｇの溶液は、＋０．４９５の旋光
を有した。実施例３ ポリイソシアナートで前処理した表面上で不
動化したＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） 活性化した無水５オングストローム、８〜１２メ
ッシュのモレキュラーシーブビーズ１０．０ｇを、回転
蒸発装置中で、未精製の重合した芳香族ポリイソシアナ
ート（アップジョンケミカル社製パピ（登録商標）２０
（ＰＡＰＩ（登録商標）２０）、７．１ｍｅｑＮＣＯ／
ｇ）２．０ｇの乾燥トルエン５０．０ｇ溶液と混合し
た。トルエンを、１時間の連続回転の間に８５℃で且つ
１０乃至２０Ｔｏｒｒで除去した。自由に流動する含浸
したビーズを２５℃迄冷却し、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）１．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ
１１３０３ペースト１．０ｇのスラリーを加えた。得ら
れたビーズ混合物を、４時間２５℃１気圧で、乾燥した
自由に流動するビーズ１２．９ｇを与えるように、ゆっ
くりと回転させた。乾燥ビーズの一部５．０ｍｌは４．
９ｇの重さであった。この体積は、１．５Ｍフマル酸ア
ンモニウム溶液中に浸けた後でも変らなかった。概算の
大腸菌細胞０．３８ｇはこの一部５．０ｍｌ中にあり、
を旋光度を、パーキン−エルマー旋光計を用い２５℃で
測定し、＋０．４９７であることがわかった。同装置
で、Ｌ−アスパラギン酸（シグマケミカル社＃Ａ−９２
５６）の標品２．０４ｇの溶液は、＋０．４９５の旋光
を有した。実施例３ ポリイソシアナートで前処理した表面上で不
動化したＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） 活性化した無水５オングストローム、８〜１２メ
ッシュのモレキュラーシーブビーズ１０．０ｇを、回転
蒸発装置中で、未精製の重合した芳香族ポリイソシアナ
ート（アップジョンケミカル社製パピ（登録商標）２０
（ＰＡＰＩ（登録商標）２０）、７．１ｍｅｑＮＣＯ／
ｇ）２．０ｇの乾燥トルエン５０．０ｇ溶液と混合し
た。トルエンを、１時間の連続回転の間に８５℃で且つ
１０乃至２０Ｔｏｒｒで除去した。自由に流動する含浸
したビーズを２５℃迄冷却し、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）１．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ
１１３０３ペースト１．０ｇのスラリーを加えた。得ら
れたビーズ混合物を、４時間２５℃１気圧で、乾燥した
自由に流動するビーズ１２．９ｇを与えるように、ゆっ
くりと回転させた。乾燥ビーズの一部５．０ｍｌは４．
９ｇの重さであった。この体積は、１．５Ｍフマル酸ア
ンモニウム溶液中に浸けた後でも変らなかった。概算の
大腸菌細胞０．３８ｇはこの一部５．０ｍｌ中にあり、
【数５】 これをＬ−アスパルターゼ活性（第１表参照）の測定に
使用した。 ｂ） 同様の方法で、無水弱塩基性＝Ｎ−Ｈ型イオン交
換ビーズ（ロームアンドハース社、アンバーライト（登
録商標）ＩＲＡ４５、直径０．４２ｍｍ、８５乃至９０
℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで数時間乾燥したもの）１
０．０ｇを、乾燥トルエン５０ｍｌ中のパピ（登録商
標）２０２．０ｇの溶液で処理した。８５乃至９０℃且
つ５乃至２０Ｔｏｒｒでの１時間にわたるトルエンの除
去は、いくらか粘着性であるがそれでも可動性の塊の被
覆ビーズを付与した。この回転させた混合物（ｔｕｍｂ
ｌｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）に、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０
３ペースト１ｇの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
５）緩衝溶液１．０ｍｌ中のスラリーを加えた。この幾
分ガム状塊の均質な被覆を達成するのを助けるために、
６０個の直径０．２５インチのテフロン（登録商標）球
を加えた。得られた混合物を、２５℃且つ５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで２時間、テフロン（登録商標）球の除去後、１
５．６ｇの乾燥した自由に流動する被覆ビーズを付与す
るように、回転させた。これらの被覆ビーズの一部５．
０ｍｌは２．８ｇの重さであり、１．５Ｍフマル酸アン
モニウム溶液に浸した後でも体積は変らなかった。この
５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）
に使用し、０．１８ｇの大腸菌を含有すると概算され
た。
使用した。 ｂ） 同様の方法で、無水弱塩基性＝Ｎ−Ｈ型イオン交
換ビーズ（ロームアンドハース社、アンバーライト（登
録商標）ＩＲＡ４５、直径０．４２ｍｍ、８５乃至９０
℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで数時間乾燥したもの）１
０．０ｇを、乾燥トルエン５０ｍｌ中のパピ（登録商
標）２０２．０ｇの溶液で処理した。８５乃至９０℃且
つ５乃至２０Ｔｏｒｒでの１時間にわたるトルエンの除
去は、いくらか粘着性であるがそれでも可動性の塊の被
覆ビーズを付与した。この回転させた混合物（ｔｕｍｂ
ｌｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）に、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０
３ペースト１ｇの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
５）緩衝溶液１．０ｍｌ中のスラリーを加えた。この幾
分ガム状塊の均質な被覆を達成するのを助けるために、
６０個の直径０．２５インチのテフロン（登録商標）球
を加えた。得られた混合物を、２５℃且つ５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで２時間、テフロン（登録商標）球の除去後、１
５．６ｇの乾燥した自由に流動する被覆ビーズを付与す
るように、回転させた。これらの被覆ビーズの一部５．
０ｍｌは２．８ｇの重さであり、１．５Ｍフマル酸アン
モニウム溶液に浸した後でも体積は変らなかった。この
５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）
に使用し、０．１８ｇの大腸菌を含有すると概算され
た。
【数６】 実施例４ ポリアゼチジンゲルで不動化したＬ−アスパ
ルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） ポリアゼチジン水溶液２．０ｇ（ヘルクレスポリ
カップ（登録商標）１７２、Ｈ２Ｏ中に１２％の固体を
有する如き）と大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ペースト２．
０ｇとの混合物を、均質分散を確実にするために、２５
℃で５分間磁気撹拌棒で迅速に撹拌した。次いでこの混
合物を、２５℃で１６時間乾燥させるために、ポリスチ
レンの表面上に注いだ。得られた２インチ×２インチ×
１／１６インチの厚さの屈曲できる膜を、前記表面から
取り除き、すると０．７ｇの重さであった。このフィル
ムをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用
し、大腸菌細胞（水和状態）２．０ｇを含有すると概算
された。 ｂ） ２．０ｇのポリカップ（登録商標）１７２と２．
０ｇの大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の均質混合物を、３０
ｇの水和した５オングストローム、８〜１２メッシュの
モレキュラーシーブビーズ上に、２５℃で５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで４５分間回転させることにより分布させた。２
５℃で開放された空気中でさらに１６時間乾燥の後、得
られた被覆ビーズは３０．４ｇの重さであった。これら
の被覆ビーズの一部５．０ｍｌは３．９ｇの重さであっ
た。この試料をＬ−アスパルターゼ活性（第１表参照）
の測定に使用し、０．２６ｇの大腸菌細胞を有している
と概算された。
ルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） ポリアゼチジン水溶液２．０ｇ（ヘルクレスポリ
カップ（登録商標）１７２、Ｈ２Ｏ中に１２％の固体を
有する如き）と大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ペースト２．
０ｇとの混合物を、均質分散を確実にするために、２５
℃で５分間磁気撹拌棒で迅速に撹拌した。次いでこの混
合物を、２５℃で１６時間乾燥させるために、ポリスチ
レンの表面上に注いだ。得られた２インチ×２インチ×
１／１６インチの厚さの屈曲できる膜を、前記表面から
取り除き、すると０．７ｇの重さであった。このフィル
ムをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用
し、大腸菌細胞（水和状態）２．０ｇを含有すると概算
された。 ｂ） ２．０ｇのポリカップ（登録商標）１７２と２．
０ｇの大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の均質混合物を、３０
ｇの水和した５オングストローム、８〜１２メッシュの
モレキュラーシーブビーズ上に、２５℃で５乃至２０Ｔ
ｏｒｒで４５分間回転させることにより分布させた。２
５℃で開放された空気中でさらに１６時間乾燥の後、得
られた被覆ビーズは３０．４ｇの重さであった。これら
の被覆ビーズの一部５．０ｍｌは３．９ｇの重さであっ
た。この試料をＬ−アスパルターゼ活性（第１表参照）
の測定に使用し、０．２６ｇの大腸菌細胞を有している
と概算された。
【数７】 ｃ） ２．０ｇの大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の２．０ｇ
のポリカップ（登録商標）１７２中の均質分散を２５℃
で、３０分間２５℃で木製の棒を用いて手で混合するこ
とにより、３０．０ｇのアンバーライト（登録商標）Ｉ
ＲＡ４５イオン交換ビーズ（４２％Ｈ２Ｏ＝Ｎ−Ｈ型
の）上に分散させた。いくらか粘着性の薄層を、空気中
に２５℃で１６時間放置した。得られた自由に流動する
ビーズは、２５．８ｇの重さであった。これらの乾燥被
覆ビーズの試料３．０ｇは、体積５．０ｍｌを有してい
た。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液に浸すことによ
り、体積は５．５ｍｌに膨脹した。これらの湿った被覆
ビーズの一部５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼの測定
（第１表参照）に使用し、大腸菌含量の概算値は０．２
１ｇであった。
のポリカップ（登録商標）１７２中の均質分散を２５℃
で、３０分間２５℃で木製の棒を用いて手で混合するこ
とにより、３０．０ｇのアンバーライト（登録商標）Ｉ
ＲＡ４５イオン交換ビーズ（４２％Ｈ２Ｏ＝Ｎ−Ｈ型
の）上に分散させた。いくらか粘着性の薄層を、空気中
に２５℃で１６時間放置した。得られた自由に流動する
ビーズは、２５．８ｇの重さであった。これらの乾燥被
覆ビーズの試料３．０ｇは、体積５．０ｍｌを有してい
た。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液に浸すことによ
り、体積は５．５ｍｌに膨脹した。これらの湿った被覆
ビーズの一部５．０ｍｌをＬ−アスパルターゼの測定
（第１表参照）に使用し、大腸菌含量の概算値は０．２
１ｇであった。
【数８】 ｄ） 脱イオン水４．０ｇとポリカップ（登録商標）１
７２ ２．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ ４．０
ｇの均質分散を同量の三部に分けて、３．５時間かけ
て、６０個の直径０．２５のテフロン（登録商標）球を
含有するアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５（４２
％Ｈ２Ｏ、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）１０．０ｇに加え
た。この混合物を、２５℃で５乃至２０Ｔｏｒｒで回転
させた。合計で５時間減圧下で乾燥の後、得られた乾燥
被覆ビーズ（テフロン（登録商標）球は除去した）は、
７．８ｇの重さであった。これらの乾燥した自由に流動
する被覆ビーズの一部５．０ｍｌは、２．９ｇの重さで
あった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液で飽和の
後、体積は６．２５ｍｌに膨脹した。これらの湿った被
覆ビーズの一部５．０ｍｌを、Ｌ−アスパルターゼの測
定（第１表参照）に使用した。概算のこの部分の大腸菌
含量は、
７２ ２．０ｇ中の大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ ４．０
ｇの均質分散を同量の三部に分けて、３．５時間かけ
て、６０個の直径０．２５のテフロン（登録商標）球を
含有するアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５（４２
％Ｈ２Ｏ、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）１０．０ｇに加え
た。この混合物を、２５℃で５乃至２０Ｔｏｒｒで回転
させた。合計で５時間減圧下で乾燥の後、得られた乾燥
被覆ビーズ（テフロン（登録商標）球は除去した）は、
７．８ｇの重さであった。これらの乾燥した自由に流動
する被覆ビーズの一部５．０ｍｌは、２．９ｇの重さで
あった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液で飽和の
後、体積は６．２５ｍｌに膨脹した。これらの湿った被
覆ビーズの一部５．０ｍｌを、Ｌ−アスパルターゼの測
定（第１表参照）に使用した。概算のこの部分の大腸菌
含量は、
【数９】 であった。 ｅ） ３．０ｇの大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の６．０ｍ
ｌの脱イオン水と３．０ｇのポリカップ（登録商標）１
７２中の均質分散を、上記の減圧下での乾燥と同じ方法
で１０．０ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５
（４２％Ｈ２Ｏ、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）上に広げた。
合計で１０．７ｇの乾燥被覆した自由に流動するビーズ
が得られた。乾燥被覆ビーズの一部５．０ｍｌは、３．
０ｇの重さであった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶
液中に浸した後、この体積は５．７５ｍｌに膨脹した。
湿った被覆ビーズの一部５．０ｍｌを、Ｌ−アスパルタ
ーゼの測定（第１表参照）に使用した。この５．０ｍｌ
部分の概算の大腸菌含量は、０．７３ｇであった。
ｌの脱イオン水と３．０ｇのポリカップ（登録商標）１
７２中の均質分散を、上記の減圧下での乾燥と同じ方法
で１０．０ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５
（４２％Ｈ２Ｏ、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）上に広げた。
合計で１０．７ｇの乾燥被覆した自由に流動するビーズ
が得られた。乾燥被覆ビーズの一部５．０ｍｌは、３．
０ｇの重さであった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶
液中に浸した後、この体積は５．７５ｍｌに膨脹した。
湿った被覆ビーズの一部５．０ｍｌを、Ｌ−アスパルタ
ーゼの測定（第１表参照）に使用した。この５．０ｍｌ
部分の概算の大腸菌含量は、０．７３ｇであった。
【数１０】 ｆ） ４．０ｇの大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の４．０ｇ
のポリカップ（登録商標）１７２および８．０ｇの脱イ
オン水中の均質分散を、おおよそ等しい６部に分けて、
５．５時間かけて２５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで、直
径０．５インチの８個のテフロン（登録商標）球を含有
する１０．０ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９
３８ビーズ（ローム＆ハース、７３％Ｈ２Ｏ、直径０．
３８ｍｍ、四級アミンクロリド塩の形態）に加えた。２
５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒでの合計６時間回転した
後、得られた乾燥被覆した自由に流動するビーズは、１
０．３ｇの重さであり且つ１６．６ｍｌの体積を有して
いた。これらのビーズを過剰の１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウム溶液（ｐＨ８．５）に１６時間２５℃で浸すと、
１７．５ｍｌの湿ったビーズが得られた。１．１４ｇの
大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３
のポリカップ（登録商標）１７２および８．０ｇの脱イ
オン水中の均質分散を、おおよそ等しい６部に分けて、
５．５時間かけて２５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで、直
径０．５インチの８個のテフロン（登録商標）球を含有
する１０．０ｇのアンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９
３８ビーズ（ローム＆ハース、７３％Ｈ２Ｏ、直径０．
３８ｍｍ、四級アミンクロリド塩の形態）に加えた。２
５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒでの合計６時間回転した
後、得られた乾燥被覆した自由に流動するビーズは、１
０．３ｇの重さであり且つ１６．６ｍｌの体積を有して
いた。これらのビーズを過剰の１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウム溶液（ｐＨ８．５）に１６時間２５℃で浸すと、
１７．５ｍｌの湿ったビーズが得られた。１．１４ｇの
大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３
【数１１】 を含有すると概算された湿ったビーズの一部５．０ｍｌ
を、Ｌ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）に使
用した。実施例５ ポリマー結合剤を用いない、Ｌ−アスパルタ
ーゼを含有する大腸菌細胞によるモレキュラーシーブビ
ーズ及びイオン交換樹脂ビーズの被覆 Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞を不動化する
のに使用される上記のポリマーシステムの効用を実証す
るために、Ｌ−アスパルターゼだけを含有する細胞、例
えばポリマーではない結合剤で物質を被覆する次の実験
をおこなった。Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細
胞を不動化するのに使用される上記のポリマーシステム
の効用を実証するために、Ｌ−アスパルターゼを含有す
る細胞だけで、即ちポリマー結合剤を用いずに物質を被
覆する次の実験をおこなった。 ａ）Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞ＡＴＣＣ
１１３０３ １．０ｇのリン酸ナトリウム緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ７．５）５．０ｍｌ中のスラリーを同量ずつ
４つに分けて３．５時間かけて、直径０．５インチの１
０個のフテロン（登録商標）球を含有する水和した５Ａ
モレキュラーシーブビーズ（８〜１２メッシュ）１０．
０ｇに加えた。この混合物を、２５℃且つ５乃至１０Ｔ
ｏｒｒで回転させた。合計約４時間後、得られた乾燥被
覆された自由に流動するビーズは、９．９ｇの重さであ
った。これらの乾燥ビーズの一部５．０ｍｌは４．２ｇ
の重さであった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液に
浸しても、体積は変化しなかった。被覆ビーズのこの一
部概算の大腸菌細胞含量は、０．４２ｇであった。
を、Ｌ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）に使
用した。実施例５ ポリマー結合剤を用いない、Ｌ−アスパルタ
ーゼを含有する大腸菌細胞によるモレキュラーシーブビ
ーズ及びイオン交換樹脂ビーズの被覆 Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞を不動化する
のに使用される上記のポリマーシステムの効用を実証す
るために、Ｌ−アスパルターゼだけを含有する細胞、例
えばポリマーではない結合剤で物質を被覆する次の実験
をおこなった。Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細
胞を不動化するのに使用される上記のポリマーシステム
の効用を実証するために、Ｌ−アスパルターゼを含有す
る細胞だけで、即ちポリマー結合剤を用いずに物質を被
覆する次の実験をおこなった。 ａ）Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞ＡＴＣＣ
１１３０３ １．０ｇのリン酸ナトリウム緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ７．５）５．０ｍｌ中のスラリーを同量ずつ
４つに分けて３．５時間かけて、直径０．５インチの１
０個のフテロン（登録商標）球を含有する水和した５Ａ
モレキュラーシーブビーズ（８〜１２メッシュ）１０．
０ｇに加えた。この混合物を、２５℃且つ５乃至１０Ｔ
ｏｒｒで回転させた。合計約４時間後、得られた乾燥被
覆された自由に流動するビーズは、９．９ｇの重さであ
った。これらの乾燥ビーズの一部５．０ｍｌは４．２ｇ
の重さであった。１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液に
浸しても、体積は変化しなかった。被覆ビーズのこの一
部概算の大腸菌細胞含量は、０．４２ｇであった。
【数１２】 被覆ビーズの一部５．０ｍｌを、１．５Ｍフマル酸アン
モニウム溶液５０ｍｌ中で２５℃で２４時間穏やかに撹
拌した。溶液は、かなりの量の物質がビーズから抜け落
ちたことを示して、非常に濁った。ビーズをデカントに
より単離し、再び新しい１．５Ｍフマル酸アンモニウム
５０．０ｍｌ中２５℃でＬ−アスパルターゼ活性の測定
（第１表参照）のために、穏やかに撹拌した。しかしな
がら、１時間後であっても、溶液は再び非常に濁った。
時折、ビーズを単離し、そして新しい１．５Ｍフマル酸
アンモニウム溶液と穏やかに撹拌した。ビーズは、溶液
を非常に濁すかなりの量の物質を放ち続けた。ポリマー
結合剤を同様に細胞／ビーズ調製物（ｆｏｒｍｕｌａｔ
ｉｏｎ）に加えると、この性質はＬ−アスパルターゼ活
性細胞被覆ビーズの製造のいずれにおいても観察されな
かった。すべてのポリマーの実施例では、フマル酸アン
モニウム溶液は、被覆ビーズの上に透明に残っていた。 ｂ）同様の方法で、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ １０．
０ｇのリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）３０ｇ
中のスラリーをポリマー結合剤なしで、５０．０ｇのア
ンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５（ロム＆ハスから
の、４２％Ｈ２Ｏ、＝Ｎ−Ｈ型）上に、４．５時間かけ
て２５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで被覆した。得られた
４７．６ｇの自由に流動する乾燥被覆ビーズは８３．５
ｍｌの体積を有していた。これらのビーズを過剰の１．
５Ｍフマル酸アンモニウム水溶液に浸すと、溶液はビー
ズから離れた多量の物質で濃厚且つ不透明になった。こ
の不透明な母液からビーズを濾別（木綿濾布、ファイバ
ーガラスマット、４３メッシュのナイロンスクリーン、
中位の多孔性半融グラス（ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｒｏｓｉ
ｔｙ ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｇｌａｓｓ））するすべての
試みは失敗した。なぜならば、濃厚なゼラチン状粒子が
すぐにフィルターにつまったからである。この性質は、
ポリマー結合剤が細胞／ビーズ調製物（ｆｏｒｍｕｌａ
ｔｉｏｎ）中に混合されたいずれの実施例の場合にも、
観察されなかった。このような場合には、ビーズ上の水
溶液は常に透明に保たれ、フィルター内をすみやかに流
れた。実施例６ Ｌ−アスパルターゼ活性の測定 前記の実施例中に記載の不動化大腸菌ＡＴＣＣ１１３０
３組成物のＬ−アスパルターゼ活性を、第１表に示す。
各々の場合、０．００２ＭＭｇＳＯ４を含有する１．５
Ｍフマル酸アンモニウムの脱イオン水溶液（ｐＨ８．
５）５０ｍｌ中で穏やかに８乃至１６時間２５℃で振り
まぜることによって、試料を試験準備した。次いで各試
料から溶液を流出させ、再び８乃至１６時間２５℃で穏
やかに振りまぜる前に５０ｍｌの新しいフマル酸塩溶液
を加えた。この時点ですべての試料は、前記実施例で議
論したポリマー結合剤と調合した。該実施例は、その上
澄み溶液はすべて透明であって、固体状支持体から抜け
落ちた物質証拠がないことを示した。ポリマー結合剤を
使用せずに製造した試料（実施例５）は、数回の洗浄後
でさえも、非常に濁った上澄み溶液を付与し続けた。こ
のことは、細胞物質は固体状支持体に確実に結合してい
ないことを示している。各実施例の次の段階では、洗浄
し且つ良く排水した合成物の一部５．０ｍｌを（又は膜
の場合、２インチ×２インチ×０．１２５インチ）取
り、新しい上記のフマル酸アンモニウム溶液５０．０ｍ
ｌ中で２５℃で振りまぜた。６０分後に試料を除去し、
脱イオン水で１／１０００に希釈した。２８０ｎｍに於
ける開始時の１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液（１／
１０００希釈で０．４３であると観察した）からの光学
密度の減少は、Ｌ−アルパルターゼ活性を示した。２８
０ｎｍにおける１５ＭＬ−アスパラギン酸アンモニウム
塩（ｐＨ８．５）の光学密度は、実質的にゼロ（＜０．
００５）である。フマル酸塩からＬ−アスパルターゼへ
の観察された変化は、第１表にアスパラギン酸のモル数
／時間／触媒ベットの１として及びアスパラギン酸のモ
ル数／時間／湿った大腸菌のｋｇとして示す。例えば、
ポリアゼチジン，細胞ペーストおよびイオン交換ビーズ
を用いて実験４ｄでは、２８０ｎｍに於ける光学密度は
２５℃で６０分後に０．４３から０．３２に低下した。
計算は次の通りである：
モニウム溶液５０ｍｌ中で２５℃で２４時間穏やかに撹
拌した。溶液は、かなりの量の物質がビーズから抜け落
ちたことを示して、非常に濁った。ビーズをデカントに
より単離し、再び新しい１．５Ｍフマル酸アンモニウム
５０．０ｍｌ中２５℃でＬ−アスパルターゼ活性の測定
（第１表参照）のために、穏やかに撹拌した。しかしな
がら、１時間後であっても、溶液は再び非常に濁った。
時折、ビーズを単離し、そして新しい１．５Ｍフマル酸
アンモニウム溶液と穏やかに撹拌した。ビーズは、溶液
を非常に濁すかなりの量の物質を放ち続けた。ポリマー
結合剤を同様に細胞／ビーズ調製物（ｆｏｒｍｕｌａｔ
ｉｏｎ）に加えると、この性質はＬ−アスパルターゼ活
性細胞被覆ビーズの製造のいずれにおいても観察されな
かった。すべてのポリマーの実施例では、フマル酸アン
モニウム溶液は、被覆ビーズの上に透明に残っていた。 ｂ）同様の方法で、大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３ １０．
０ｇのリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）３０ｇ
中のスラリーをポリマー結合剤なしで、５０．０ｇのア
ンバーライト（登録商標）ＩＲＡ４５（ロム＆ハスから
の、４２％Ｈ２Ｏ、＝Ｎ−Ｈ型）上に、４．５時間かけ
て２５℃且つ５乃至２０Ｔｏｒｒで被覆した。得られた
４７．６ｇの自由に流動する乾燥被覆ビーズは８３．５
ｍｌの体積を有していた。これらのビーズを過剰の１．
５Ｍフマル酸アンモニウム水溶液に浸すと、溶液はビー
ズから離れた多量の物質で濃厚且つ不透明になった。こ
の不透明な母液からビーズを濾別（木綿濾布、ファイバ
ーガラスマット、４３メッシュのナイロンスクリーン、
中位の多孔性半融グラス（ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｒｏｓｉ
ｔｙ ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｇｌａｓｓ））するすべての
試みは失敗した。なぜならば、濃厚なゼラチン状粒子が
すぐにフィルターにつまったからである。この性質は、
ポリマー結合剤が細胞／ビーズ調製物（ｆｏｒｍｕｌａ
ｔｉｏｎ）中に混合されたいずれの実施例の場合にも、
観察されなかった。このような場合には、ビーズ上の水
溶液は常に透明に保たれ、フィルター内をすみやかに流
れた。実施例６ Ｌ−アスパルターゼ活性の測定 前記の実施例中に記載の不動化大腸菌ＡＴＣＣ１１３０
３組成物のＬ−アスパルターゼ活性を、第１表に示す。
各々の場合、０．００２ＭＭｇＳＯ４を含有する１．５
Ｍフマル酸アンモニウムの脱イオン水溶液（ｐＨ８．
５）５０ｍｌ中で穏やかに８乃至１６時間２５℃で振り
まぜることによって、試料を試験準備した。次いで各試
料から溶液を流出させ、再び８乃至１６時間２５℃で穏
やかに振りまぜる前に５０ｍｌの新しいフマル酸塩溶液
を加えた。この時点ですべての試料は、前記実施例で議
論したポリマー結合剤と調合した。該実施例は、その上
澄み溶液はすべて透明であって、固体状支持体から抜け
落ちた物質証拠がないことを示した。ポリマー結合剤を
使用せずに製造した試料（実施例５）は、数回の洗浄後
でさえも、非常に濁った上澄み溶液を付与し続けた。こ
のことは、細胞物質は固体状支持体に確実に結合してい
ないことを示している。各実施例の次の段階では、洗浄
し且つ良く排水した合成物の一部５．０ｍｌを（又は膜
の場合、２インチ×２インチ×０．１２５インチ）取
り、新しい上記のフマル酸アンモニウム溶液５０．０ｍ
ｌ中で２５℃で振りまぜた。６０分後に試料を除去し、
脱イオン水で１／１０００に希釈した。２８０ｎｍに於
ける開始時の１．５Ｍフマル酸アンモニウム溶液（１／
１０００希釈で０．４３であると観察した）からの光学
密度の減少は、Ｌ−アルパルターゼ活性を示した。２８
０ｎｍにおける１５ＭＬ−アスパラギン酸アンモニウム
塩（ｐＨ８．５）の光学密度は、実質的にゼロ（＜０．
００５）である。フマル酸塩からＬ−アスパルターゼへ
の観察された変化は、第１表にアスパラギン酸のモル数
／時間／触媒ベットの１として及びアスパラギン酸のモ
ル数／時間／湿った大腸菌のｋｇとして示す。例えば、
ポリアゼチジン，細胞ペーストおよびイオン交換ビーズ
を用いて実験４ｄでは、２８０ｎｍに於ける光学密度は
２５℃で６０分後に０．４３から０．３２に低下した。
計算は次の通りである：
【数１３】 大腸菌ＡＴＣＣ １１３０３を含有するポリウレタンフ
ォーム（パイポール（登録商標））の３７℃に於けるＬ
−アスパルターゼ性能を示す文献中にあるデータから計
算値もまた、第１表に示す。ここでは１２６ｇの細胞を
有する０．７７７ｌのベットは、２．０ｌの１．０Ｍフ
マル酸塩を１００％Ｌ−アスパラギン酸塩に３７℃で変
換するために３２分間要した。これらの研究者らはま
た、１．５Ｍフマル酸塩の平均変換速度は、１．０Ｍフ
マル酸塩よりも８％低いことを報告している。彼らはま
た、３７℃における速度は、２５℃の１．６７倍である
ことも観察した。このように、我々のデータ（２５℃、
１．５Ｍフマル酸塩）と比較した彼らのＬ−アスパラギ
ン酸生成速度の正しい評価は、次の通りである：
ォーム（パイポール（登録商標））の３７℃に於けるＬ
−アスパルターゼ性能を示す文献中にあるデータから計
算値もまた、第１表に示す。ここでは１２６ｇの細胞を
有する０．７７７ｌのベットは、２．０ｌの１．０Ｍフ
マル酸塩を１００％Ｌ−アスパラギン酸塩に３７℃で変
換するために３２分間要した。これらの研究者らはま
た、１．５Ｍフマル酸塩の平均変換速度は、１．０Ｍフ
マル酸塩よりも８％低いことを報告している。彼らはま
た、３７℃における速度は、２５℃の１．６７倍である
ことも観察した。このように、我々のデータ（２５℃、
１．５Ｍフマル酸塩）と比較した彼らのＬ−アスパラギ
ン酸生成速度の正しい評価は、次の通りである：
【数１４】 これらの値を本発明の例で得られたデータと比較する
と、ポリウレタンフォームシステムより本方法の優位が
示される。
と、ポリウレタンフォームシステムより本方法の優位が
示される。
【表１】
【表２】 実施例７ Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−アスパラギン酸ア
ンモニウムとして）の連続生成 実施例４ｄからの湿ったビーズの一部５．０ｍｌを、直
径０．７ｃｍ×１５ｃｍのカバーをかぶせたガラスカラ
ムの中に入れた。カラム温度は、３７℃に保った。０．
０２ｍＭＭｇＳＯ４を含有する１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウムの脱イオン水の溶液（すべてｐＨ８．５）を、連
続的に０．５ｍｌ／分の速度でビーズのベットを通し
た。溶出生成物溶液試料を定期的にとり、実施例６に記
載したように脱イオン水で１／１０００希釈としてＬ−
アスパラギン酸塩含量を分析した。溶出液の大部分を集
めたが、カラムに戻さなかった。次のデータは、５０日
間の連続運転にわたって被覆ビーズのＬ−アスパルター
ゼ活性は保持され本質的に変化しないことを示す。 時間（日） 溶出物のＬ−アスパラギン酸塩含量（％） １ ５９．６ ２５ ６１．５ 平均６２．５ ５０ ６６．５ ６．０ベット容量／時間（５．０ｍｌの触媒ベットを
０．５ｍｌ／分で通る）での６２．５％変換率に於ける
Ｌ−アスパラギン酸の生成速度は次の通りである：
ンモニウムとして）の連続生成 実施例４ｄからの湿ったビーズの一部５．０ｍｌを、直
径０．７ｃｍ×１５ｃｍのカバーをかぶせたガラスカラ
ムの中に入れた。カラム温度は、３７℃に保った。０．
０２ｍＭＭｇＳＯ４を含有する１．５Ｍフマル酸アンモ
ニウムの脱イオン水の溶液（すべてｐＨ８．５）を、連
続的に０．５ｍｌ／分の速度でビーズのベットを通し
た。溶出生成物溶液試料を定期的にとり、実施例６に記
載したように脱イオン水で１／１０００希釈としてＬ−
アスパラギン酸塩含量を分析した。溶出液の大部分を集
めたが、カラムに戻さなかった。次のデータは、５０日
間の連続運転にわたって被覆ビーズのＬ−アスパルター
ゼ活性は保持され本質的に変化しないことを示す。 時間（日） 溶出物のＬ−アスパラギン酸塩含量（％） １ ５９．６ ２５ ６１．５ 平均６２．５ ５０ ６６．５ ６．０ベット容量／時間（５．０ｍｌの触媒ベットを
０．５ｍｌ／分で通る）での６２．５％変換率に於ける
Ｌ−アスパラギン酸の生成速度は次の通りである：
【数１５】 ３７℃で１時間にわたって同じカラムを４．０ベット容
量／時間（５．０ｍｌの触媒ベットを０．３３ｍｌ／分
で通る）の速度で動かすと、フマル酸塩（１．５Ｍ）の
平均変換率は８０．０％であった。これは次に該当す
る：
量／時間（５．０ｍｌの触媒ベットを０．３３ｍｌ／分
で通る）の速度で動かすと、フマル酸塩（１．５Ｍ）の
平均変換率は８０．０％であった。これは次に該当す
る：
【数１６】 それぞれ６．０及び４．０ベット容量／時間に対応する
これらの変換率６２．５％及び８０．０％に基づく、１
００％変換を達成するのに必要な流速の図式的方法によ
る控え目の概算は、１．５ベット容量／時間である。
１．５ベット容量／時間でのＬ−ＡＳＰ生成速度は：
これらの変換率６２．５％及び８０．０％に基づく、１
００％変換を達成するのに必要な流速の図式的方法によ
る控え目の概算は、１．５ベット容量／時間である。
１．５ベット容量／時間でのＬ−ＡＳＰ生成速度は：
【数１７】 これらの値（１．５ベット容量／時間での１００％変
換）および
換）および
【数１８】 は、κ−カラジーナンゲル上に不動化した大腸菌ＡＴＣ
Ｃ １１３０３細胞のカラムの連続操作で報告された１
００％変換のための１．１ベット容量／時間および
Ｃ １１３０３細胞のカラムの連続操作で報告された１
００％変換のための１．１ベット容量／時間および
【数１９】 の値よりも著しく良い。本発明のこれ以上の変化では、
実施例７で得られたＬ−アスパラギン酸アンモニウム水
溶液は、直接に使用しうることが予想される。例えば、
乾燥固体アスパラギン酸の回収もしくは分離なしで、ア
スパラギン酸のアミンのベンゾイルオキシカーバメイト
を形成するためのベンジルクロロホルメイトとの反応の
ために使用し得、このカーバメイトは商業上重要な甘味
剤Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニン メチルエ
ステル製造の重要な中間体である。現在ではこのベンゾ
イルオキシカーバメイトは、乾燥結晶固体Ｌ−アスパラ
ギン酸から出発して作られる。前記の酸を、次の反応に
したがったベンジルクロロホルメイトとの反応の前に水
酸化ナトリウム水溶液中に溶解する：
実施例７で得られたＬ−アスパラギン酸アンモニウム水
溶液は、直接に使用しうることが予想される。例えば、
乾燥固体アスパラギン酸の回収もしくは分離なしで、ア
スパラギン酸のアミンのベンゾイルオキシカーバメイト
を形成するためのベンジルクロロホルメイトとの反応の
ために使用し得、このカーバメイトは商業上重要な甘味
剤Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フェニルアラニン メチルエ
ステル製造の重要な中間体である。現在ではこのベンゾ
イルオキシカーバメイトは、乾燥結晶固体Ｌ−アスパラ
ギン酸から出発して作られる。前記の酸を、次の反応に
したがったベンジルクロロホルメイトとの反応の前に水
酸化ナトリウム水溶液中に溶解する：
【化６】 本発明に従ったフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギ
ン酸アンモニウムに変換するための不動化全細胞の酵素
法は、直接的に塩基性水性生成物の流体、例えば１．５
モルの９８．５％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム溶液
を提供する。該溶液は、アンモニアの除去の後、所望の
ベンジル（もしくは他の）オキシカーバメイトの水溶液
を作るためのベンジルクロロホルメイト（もしくは他の
クロロホルメイト）との反応における直接使用に適して
いる。これは、乾燥アスパラギン酸結晶の単離の必要性
及び時間及びこれらに付随した費用を避けることを可能
にさせる。例えば、実施例７のＬ−アスパラギン酸アン
モニウム溶液からの乾燥Ｌ−アスパラギン酸結晶の単離
は、一般に次のことが必要である。 （１） ｐＨ２．８でＬ−ＡＳＰを沈殿させるための、
役０．７乃至０．８モルのＨ２ＳＯ４を用いた、１．５
モルのＬ−アスパラギン酸アンモニウム生成物（Ｌ−Ａ
ＳＰ）の流体の酸性化； （２） Ｌ−ＡＳＰ生成物流体は９８．５％のＬ−ＡＳ
Ｐ（残りはフマル酸アンモニウム）を含有しているけれ
ども、Ｌ−ＡＳＰの沈殿物の水洗により固型Ｌ−ＡＳＰ
はたつたの８９〜９３％の収率でしか得られない。母液
中のＬ−ＡＳＰの５〜９％の保持は、Ｌ−ＡＳＰの値か
ら考えてかなりの損失である； （３） 沈殿したＬ−ＡＳＰ結晶の続いての乾燥もまた
高価である（１ポンド当り約５〜１０セントと概算され
る）。 本発明にしたがった水性アンモニウムＬ−ＡＳＰ生成物
の直接的使用は、段階（１）〜（３）に固有の不便を除
去する。アンモニウムＬ−ＡＳＰ生成物流体の調整は、
最適の結果を得るのに適している。例えば、水酸化ナト
リウム（アンモニウムＬ−ＡＳＰ１モル当り０．５乃至
２．０モルのオーダーで）の添加は、ＮＨ４ ＋のＮＨ３
との置換を生じ、ＮＨ３は沸騰により除去でき、さらに
さらにフマル酸アンモニウムを作るのに使用できる。Ｎ
Ｈ４ ＋イオンのほとんどは、クロロホルメイト反応を促
進するために除去される。本発明は、大腸菌の不動化も
しくはＬ−アスパラギン酸製造のためのこのような不動
化細胞の使用に限定されない。このように、他の細胞
は、記載した硬化性ポリマー物質を用いて一般に同様の
方法で不動化され得る。更にこのような不動化細胞の変
形例及びその使用を次の実施例で例示する。実施例８ ポリアゼチジンゲルで不動化したシュウドモ
ナス ダカンエの不動化を介したＬ−アラニンの製造 シュウドモナス ダカンエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を、 ペプトン（バクトーデイフコ） ９．０ｇ／ｌ カゼイン水解物（カザミノ酸、デイフコ） ２．０ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １５．０ｇ／ｌ ｐＨはＮＨ４ＯＨで７．２に調整 の培地で培養した。醗酵は、好気性条件下で、２３時
間、３０℃、３００回転／分でおこなった。３．６２ｇ
（湿重量）の細胞ペーストと３．６ｇのポリアゼチジン
水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録商標）１７２）と
の混合物を、木製の棒を用いて手で２５℃で均質に撹拌
した。この混合物を、３．６ｇのアンバーライト（登録
商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビーズ（ローム＆ハス）
上に分散させた。前記ビーズは、８５％より多いビーズ
と会合している湿気を除去するために、あらかじめ２５
〜３０℃で６０時間空気中乾燥した。ビーズ上の混合物
の薄いフィルムを２５℃で２４時間空気中で乾燥させ
た。得られた自由に流動するビーズは、体積２０ｍｌを
占めた。これらのビーズを５容量の普通の塩水で洗浄
し、そのうちの一部１８ｍｌを、３７℃に保たれたｐＨ
５．５（Ｈ２ＳＯ４で調整）の１．５Ｍアスパラギン酸
アンモニウム溶液０．５ｌを含有するフラスコ中に入れ
た。全部の混合物を４８時間撹拌し、一方ｐＨは必要な
とき硫酸の添加により保持した。この期間の最後に、Ｈ
ＰＬＣ（μＮＨ２ボンダパックカラム、ウォーターズ
社；溶出液ＣＨ３ＣＮ２５％、５ｍＭＫＨＰＯ４ｐＨ
４．４ ７５％）による液体の分析は、Ｌ−アスパラギ
ン酸が９８％収率でＬ−アラニンを形成するように脱カ
ルボキシル化されたことを示した。実施例９ ポリアゼチジンゲルで不動化された巨大菌を
含有するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 巨大菌ＡＴＣＣ１４９４５を先に記載（米国特許第３，
４４６，７０５号）した如き好気性条件下で培養した。
１０．５ｇ（湿重量）の細胞物質と１０．５ｇのポリア
ゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録商標）１
７２）との混合物を、木製の棒を用いて手で２５℃で均
質になるまで撹拌した。この混合物を９．８ｇのアンバ
ーライト（登録商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビーズ
（ローム＆ハス）上に分散させた。前記のビーズは前も
って２５〜３０℃で６０時間空気乾燥し、ビーズから＞
８５％の湿気を除去しておいた。混合物の薄層を、２５
℃で２４時間空気乾燥させた。得られた自由に流動する
ビーズは１３．１ｇの重さであり、且つ体積５３ｍｌを
占めた。１ｇのフリーな細胞に対応するこれらのビーズ
に一部１２４７ｍｇを、ペニシリンアシラーゼ活性の測
定に用いた。６−アミノペニシラニック酸生成物を、高
速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した。
不動化製造物の活性は、細胞ペースト１ｇ当たり１９．
７μモル／時間であった。この値は、フリーな細胞の活
性の６７％であった。実施例１０ ポリアゼチジンゲルで不動化した大腸菌を
含有するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 大腸菌ＡＴＣＣ９６３７を、Ｓａｔｏ他、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ａｐｐｌ．Ｍｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：１５３〜１６
０（１９７６）により報告されたよに好気的に培養し
た。２０．７ｇ（湿重量）の細胞ペーストと２０．７ｇ
のポリアゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録
商標）１７２）との混合物を、木製棒を用いて手で２５
℃で均質になるまで撹拌した。この混合物を１９３ｇの
アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビ
ーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。前記のビーズ
は、ビーズと会合している＞８５％の湿気を除くため
に、前もって２５〜３０℃で６０時間空気乾燥した。混
合物の薄いフィルムを２５℃で２４時間空気乾燥させ
た。得られた自由に流動するビーズは２７．４ｇの重さ
があり、体積９５ｍｌを占めた。１ｇのフリーの細胞に
対応するこれらのビーズの一部１３２５ｍｌで、ペニシ
リンアシラーゼ活性を測定した。６−アミノペニシラニ
ック酸生成物を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｃ）により定量した。不動化生成物の活性は細胞ペース
ト１ｇ当たり５３．６μモル／時間であり、これはフリ
ーな細胞活性の９９％であった。実施例１１ フルクトースの濃いコーンシロップ（Ｈｉ
ｇｈ ＦｒｕｃｔｏｓｅＣｏｒｎ Ｓｙｒｕｐ）製造用
のグルコースイソメラーゼ活性を含有するアルスロバク
ター種の不動化 アルスロバクター種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ
ｅｃｉｅｓ）ＡＴＣＣ２１７４８を液中好気性条件下で
増殖させ、細胞を取り出した。該細胞は、６０℃で細胞
ペースト１ｇ（湿重量）当たり４２０μモル／時間のグ
ルコースイソメラーゼ活性を有した。４７ｇのポリカッ
プ（登録商標）１７２に４７ｇ（湿重量）のアルスロバ
クター種ＡＴＣＣ２１７４８を加え、そして混合物を５
〜１０分間激しく撹拌した。ポリカップ（登録商標）／
細胞混合物を次に撹拌しながら４６．４ｇの空気乾燥し
たＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズにゆっくり加え、得
られたビーズを室温で２４時間乾燥させた。５ｍｌのア
ルスロバクター種ＡＴＣＣ２１７４８不動化ビーズを含
有するフラスコに、５０ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝
液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣＯ
Ｃｌ２を加え、そして溶液を撹拌しながら６０℃まで加
熱した。４５０ｍｇのα−Ｄ−グルコースをフラスコに
加え、そしてフラスコを６０℃１時間、１５０ｒｐｍで
培養振とう器中に入れた。不動化アルスロバクター種Ａ
ＴＣＣ２１７４８のグルコースイソメラーゼ活性は、シ
ステイン／Ｈ２ＳＯ４反応［Ｄｉｓｃｈｅ． Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，３９１４０
（１９６０）］により決定すると、６０℃に於いては細
胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり５３０μモル／時間で
あった。１０Ｍｌのアルスロバクター種ＡＴＣＣ２１７
４８不動化ビーズを、循環式水浴により６０℃に保たれ
ている０．９×３０ｃｍのカバーのかかったガラスカラ
ムに添加した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液中に２５０
ｍＭグルコース、５ｍＭＭｇＳＯ４と０．５ｍＭ ＣＯ
Ｃｌ２を含有するあらかじめ湿った基質溶液ｐＨ７．５
を、カラムに通した。連続操作の６日後、不動化アルス
ロバクター種ＡＴＣＣ２１７４８のグルコースイソメラ
ーゼ活性は、６０℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当た
り２８０μモル／時間であり、３７日後ではグルコース
イソメラーゼ活性は６０℃で細胞ペースト１ｇ（湿重
量）当たり１８μモル／時間であった。実施例１２ プレドニゾロンもしくは関連するステロイ
ドを製造するためのステロイドデヒドロゲナーゼ活性を
有するアルスロバクター シンプレックスの不動化 アルスロバクター シンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）ＡＴＣＣ６９４６を、液中
好気性条件下で増殖させ、細胞を取り出した。細胞は、
３４℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり９８０μモ
ル／時間のΔ−１−デヒドロゲナーゼ活性を有してい
た。２０ｇのポリカップ（登録商標）１７２に２０ｇの
アルスロバクター シンプレックスＡＴＣＣ６９４６を
加え、そして混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次
にポリカップ（登録商標）／細胞混合物をゆっくり１
８．６ｇの空気乾燥ＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズに
撹拌しながら加え、得られたビーズを室温で２４時間乾
燥させた。５Ｍｌのアルスロバクター シンプレックス
ＡＴＣＣ６９４６不動化ビーズを含有するフラスコに３
６Ｍｌの２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を加
え、次いで６０ｍｇのヒドロコルチゾンを含有する４Ｍ
ｌのエタノールを加えた。フラスコを、３４℃１時間
１５０ｒｐｍで培養振とう器中に置いた。不動化アルス
ロバクター シンプレックスＡＴＣＣ６９４６のΔ−１
−デヒドロゲナーゼ活性は、２８５ｎｍの吸光度で決定
するとき、３４℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり
４４０μモル／時間であった。実施例１３ フルクトースの濃いコーンシロップを製造
するためのグルコースイソメラーゼ活性を有するストレ
プトマイセス種の不動化 ストレプトマイセス フエオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
ＮＲＲＬ Ｂ３５５９を液中好気性条件下で成長させ、
そして細胞を取り出した。細胞は６０℃で、細胞ペース
ト１ｇ（湿重量）当たり７．７μモル／分のグルコース
イソメラーゼ活性を有していた。６４．５ｇのポリカッ
プ（登録商標）１７２に６４．５ｇのストレプトマイセ
ス フエオクロモゲネスＮＲＲＬ Ｂ３５５９を加え、
そして混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次いポリ
カップ（登録商標）／細胞混合物を、６０．０ｇの空気
乾燥ＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズに撹拌しながらゆ
っくり加え、そして得られたビーズを室温で２４時間乾
燥させた。１０Ｍｌのストレプトマイセス フエオクロ
モゲネスＮＲＲＬ Ｂ３５５９不動化ビーズを、循環式
水浴で６０℃に保った０．９×３０ｃｍのカバーをかけ
たガラスカラムに添加した。２５０ｍＭグルコース、１
００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３，１０ｍＭ ＭｇＳＯ４および
１ｍＭ ＣＯＣｌ２を含有しＨＣｌでｐＨ７．０に調整
されたあらかじめ湿った基質溶液を、流速２８ｍｌ／時
間でカラムに通した。不動化ストレプトマイセスフエオ
クロモゲネス ＮＲＲＬ Ｂ３５５９のグルコースイソ
メラーゼ活性は、システイン／Ｈ２ＳＯ４反応（Ｄｉｓ
ｃｈｅ他、上を見よ）により決定すると、６０℃で細胞
ペースト１ｇ（湿重量）当たり７．７μモル／分であっ
た。実施例 １４ フエニルアラニンを製造するためのフエニルアラニン
アンモニア リアーゼの濃いロドスポリジウム種の不動
化 ロドスポリジウム トルロデイス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ １０７８
８を液中好気性条件下で増殖させ、そして細胞を取り出
した。細胞は３０℃で細胞ペースト １ｇ（質重量）当
たり１１２μモル／時間のＬ−フエニルアラニンアンモ
ニア−リアーゼ活性を有していた。１４．９ｇのポリカ
ツプ（登録商標）１７２に１４．９ｇのロドストポリジ
ウム トルロイデス ＡＴＣＣ １０７８８を加え、そ
して細胞混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次に、
ポリカツプ（登録商標）／細胞混合物を１３．８ｇの空
気乾燥ＩＲＡ（登録商標） ９３８ビーズに攪拌しなが
らゆっくり加え、得られたビーズを室温で２４時間乾燥
させた。１Ｍｌのポドスポリジウム トルロイデス Ａ
ＴＣＣ １０７８８ 不動化ビーズを含有するフラスコ
に、５Ｍｌの２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
８），２５ｍＭ Ｌ−フエニルアラニン，０．００５％
セチルピリジニウム クロライドを加えた。フラスコ
を、３０℃ １時間 １００ｒｐｍでダブノフ（Ｄｕｂ
ｎｏｆｆ）振とう培養器中に入れた。不動化ロドスポリ
ジウム トルロイデス ＡＴＣＣ １０７８８のフェニ
ルアラニンアンモニアーリアーゼ活性は、２７８ｎｍの
吸光度により決定すると、３０℃で細胞ペースト１ｇ
（湿重量）当たり１０μモル／時間であった。実施例８
〜１４に示した不動化細胞／ポリマー組成物がどのよう
に使用されて示した生成物を作るのかは、先行文献から
明らかである。このように、実施例８に関して、アスパ
ラギン酸の脱カルボキシル化を介してのＬ−アラニンの
生成は、酵素、Ｌ−アスパルチック−β−デカルボキシ
ラーゼにより媒介される。この酵素の存在は、Ｃｈｉｂ
ａｔａ他、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１３巻，５号，６３８〜６４５ページ（１９６５
年）により報告されているように、微生物学の多数の概
論でよく知られている。これは、クロストリジウムパー
フリンジェンス，デスルホビブリオ デスルフリカン
ス，ノカルジア グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌ
ｏｂｅｒｕｌａ），シュードモナス レプチリボラ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ），ア
セトバクター種，アクロモバクター（Ａｃｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒ）種およびアルカリゲネスフェカーリスにより
産生さされる。Ｃｈｉｂａｔａ他は、アラニン形成菌株
は、概論に於いてかなり共通で、アセトバクター，アク
ロモバクター，シュードモナス，トルラ（Ｔｏｌｕｒ
ａ），トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ），アブシ
ディス，アスペルギルス，ムコールおよびオオスポラで
あると決定した。ｃｈｉｂａｔａ他はＭｅｉｓｔｅｒと
共同研究者により以前に得られた知識を増加させ、そし
てＬ−アスパラギン酸を化学量論的にアラニンに変換す
ることを測定した。Ｌ−アスパラギン酸から９０％をこ
えるＬ−アラニンの単離収率が、容易に得られた。この
工程は、米国特許第３，４５８，４００号に生物，シュ
ードモナス ダカンエおよびアクロモバクター ペスチ
ファー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｅｓｔｉｆｅ
ｒ）に関連して記載されており、該特許では水性普通培
地中で、乾燥生細胞もしくは細胞フリ−抽出物によりＬ
−アラニンを製造する工程が特許請求されている。この
工程の変更例は、Ｃｈｉｂａｔａ他の１９７５年米国特
許第３，８９８，１２８号により、アクルアミドポリマ
ー中で微生物の不動化によって特許を受けている。シュ
ードモナス ダカンエからの酵素の使用に於ける他の特
許は、１９６９年米国特許第３，４６３，７０４号で得
られた。Ｓｈｉｂａｔａｎｉ他のＡｐｐｌｉｅｄ＆Ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
３８巻，３号，３５９〜３６４ページ（１９７９年）に
よる連続研究は、他の研究者によりＬ−アスパルチック
−β−デカルボキシラーゼを所有するほかの種が見つけ
られ、そしてこの酵素の製造はグルタミン酸塩の如きあ
るアミノ酸の添加により促進できることを示した。改良
した製造の連続方法はＹａｍａｔｏ他のＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＸＸＩ
Ｉ巻，２０４５〜２０５４ページ（１９８５年）により
発表され、この場合全生物はカラジーナンゲル中に不動
化されていた。さらに、他の研究者はハイポール（登録
商標）フォーム中に不動化したシュードモナス ダカン
エおよびアルカリゲネス フェカーリスからのアラニン
の製造の研究をおこなった［Ｆｕｓｅｅ他、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｄｉｏｌ
ｏｇｙ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ダラス（１９８０年３
月）］。本発明は、以前に使用した細胞組成物の代わり
にアスパラギン酸からＬ−アラニンを製造するために例
示した細胞／ポリマー組成物の使用を意図している。多
量の研究が、酵素ペニシリンアシラーゼの不動化に関連
しても以前になされた。例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，
６２：３１７〜３２１（１９８１）を参照。Ｍａｒｃｏ
ｎｉ他はセルローストリアセテート繊維中にペニシリン
アシラーゼを不動化し［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：７３５
〜７５６（１９８０）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１：１０５
７〜１０７３（１９７９）］、そして米国特許のいくつ
かは酵素不動化を問題としていた：米国特許第３，２７
８，３１９号；第３，１１６，２１８号；第３１９０，
５８６号；第３，４４６，７０５号；第３，６２２，４
６２号；第３，７３６，２３０号；第３，１６６，００
９号；第３，８０１，９６２号；第３，８８３，３９４
号；第３，９００，４８８号；第３，４９９，９０９
号；第３，７３６，２３０号；第４，００１，２６４
号；第４，１１３，５６６号および第４，２３０，８０
４号。全細胞不動化に関する比較的２，３の論文しか用
いえないことが明らかである。田辺製薬は、ポリアクリ
ルイミドゲル内な捕捉された細胞のリポートを発行して
いる。また、ｃｈｉｂａｔａ他（１９７４年）、ドイツ
特許第２，４１４，１２８号およびＭａｎｄｅｌ他はポ
リアクリルアミドゲル内への捕捉を発表している［Ｐｒ
ｉｋｌ． Ｂｌｋｈｉｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．１１：
２１９〜２２５（１９７５）］。ＤＥＡＥセルロース上
に吸着した巨大菌もしくはアクロモバクターの不動化全
細胞は、東洋醸造により使用されており、Ｆｕｊｉｉ他
の日本特許第７３ ９３９３号及びＳａｔｏ他のＥｕ
ｒ．Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
２：１５３〜１６０（１９７６）は、ペニシリンアシラ
ーゼを高活性で有する不動化大腸菌の使用によるペニシ
リン−Ｇからの６−ＡＰＡの製造を報告している。種々
の他の変更もまた本発明から離れることなしになし得、
本発明の範囲は特許請求の範囲で定義されると理解され
る。
ン酸アンモニウムに変換するための不動化全細胞の酵素
法は、直接的に塩基性水性生成物の流体、例えば１．５
モルの９８．５％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム溶液
を提供する。該溶液は、アンモニアの除去の後、所望の
ベンジル（もしくは他の）オキシカーバメイトの水溶液
を作るためのベンジルクロロホルメイト（もしくは他の
クロロホルメイト）との反応における直接使用に適して
いる。これは、乾燥アスパラギン酸結晶の単離の必要性
及び時間及びこれらに付随した費用を避けることを可能
にさせる。例えば、実施例７のＬ−アスパラギン酸アン
モニウム溶液からの乾燥Ｌ−アスパラギン酸結晶の単離
は、一般に次のことが必要である。 （１） ｐＨ２．８でＬ−ＡＳＰを沈殿させるための、
役０．７乃至０．８モルのＨ２ＳＯ４を用いた、１．５
モルのＬ−アスパラギン酸アンモニウム生成物（Ｌ−Ａ
ＳＰ）の流体の酸性化； （２） Ｌ−ＡＳＰ生成物流体は９８．５％のＬ−ＡＳ
Ｐ（残りはフマル酸アンモニウム）を含有しているけれ
ども、Ｌ−ＡＳＰの沈殿物の水洗により固型Ｌ−ＡＳＰ
はたつたの８９〜９３％の収率でしか得られない。母液
中のＬ−ＡＳＰの５〜９％の保持は、Ｌ−ＡＳＰの値か
ら考えてかなりの損失である； （３） 沈殿したＬ−ＡＳＰ結晶の続いての乾燥もまた
高価である（１ポンド当り約５〜１０セントと概算され
る）。 本発明にしたがった水性アンモニウムＬ−ＡＳＰ生成物
の直接的使用は、段階（１）〜（３）に固有の不便を除
去する。アンモニウムＬ−ＡＳＰ生成物流体の調整は、
最適の結果を得るのに適している。例えば、水酸化ナト
リウム（アンモニウムＬ−ＡＳＰ１モル当り０．５乃至
２．０モルのオーダーで）の添加は、ＮＨ４ ＋のＮＨ３
との置換を生じ、ＮＨ３は沸騰により除去でき、さらに
さらにフマル酸アンモニウムを作るのに使用できる。Ｎ
Ｈ４ ＋イオンのほとんどは、クロロホルメイト反応を促
進するために除去される。本発明は、大腸菌の不動化も
しくはＬ−アスパラギン酸製造のためのこのような不動
化細胞の使用に限定されない。このように、他の細胞
は、記載した硬化性ポリマー物質を用いて一般に同様の
方法で不動化され得る。更にこのような不動化細胞の変
形例及びその使用を次の実施例で例示する。実施例８ ポリアゼチジンゲルで不動化したシュウドモ
ナス ダカンエの不動化を介したＬ−アラニンの製造 シュウドモナス ダカンエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を、 ペプトン（バクトーデイフコ） ９．０ｇ／ｌ カゼイン水解物（カザミノ酸、デイフコ） ２．０ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム １５．０ｇ／ｌ ｐＨはＮＨ４ＯＨで７．２に調整 の培地で培養した。醗酵は、好気性条件下で、２３時
間、３０℃、３００回転／分でおこなった。３．６２ｇ
（湿重量）の細胞ペーストと３．６ｇのポリアゼチジン
水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録商標）１７２）と
の混合物を、木製の棒を用いて手で２５℃で均質に撹拌
した。この混合物を、３．６ｇのアンバーライト（登録
商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビーズ（ローム＆ハス）
上に分散させた。前記ビーズは、８５％より多いビーズ
と会合している湿気を除去するために、あらかじめ２５
〜３０℃で６０時間空気中乾燥した。ビーズ上の混合物
の薄いフィルムを２５℃で２４時間空気中で乾燥させ
た。得られた自由に流動するビーズは、体積２０ｍｌを
占めた。これらのビーズを５容量の普通の塩水で洗浄
し、そのうちの一部１８ｍｌを、３７℃に保たれたｐＨ
５．５（Ｈ２ＳＯ４で調整）の１．５Ｍアスパラギン酸
アンモニウム溶液０．５ｌを含有するフラスコ中に入れ
た。全部の混合物を４８時間撹拌し、一方ｐＨは必要な
とき硫酸の添加により保持した。この期間の最後に、Ｈ
ＰＬＣ（μＮＨ２ボンダパックカラム、ウォーターズ
社；溶出液ＣＨ３ＣＮ２５％、５ｍＭＫＨＰＯ４ｐＨ
４．４ ７５％）による液体の分析は、Ｌ−アスパラギ
ン酸が９８％収率でＬ−アラニンを形成するように脱カ
ルボキシル化されたことを示した。実施例９ ポリアゼチジンゲルで不動化された巨大菌を
含有するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 巨大菌ＡＴＣＣ１４９４５を先に記載（米国特許第３，
４４６，７０５号）した如き好気性条件下で培養した。
１０．５ｇ（湿重量）の細胞物質と１０．５ｇのポリア
ゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録商標）１
７２）との混合物を、木製の棒を用いて手で２５℃で均
質になるまで撹拌した。この混合物を９．８ｇのアンバ
ーライト（登録商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビーズ
（ローム＆ハス）上に分散させた。前記のビーズは前も
って２５〜３０℃で６０時間空気乾燥し、ビーズから＞
８５％の湿気を除去しておいた。混合物の薄層を、２５
℃で２４時間空気乾燥させた。得られた自由に流動する
ビーズは１３．１ｇの重さであり、且つ体積５３ｍｌを
占めた。１ｇのフリーな細胞に対応するこれらのビーズ
に一部１２４７ｍｇを、ペニシリンアシラーゼ活性の測
定に用いた。６−アミノペニシラニック酸生成物を、高
速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した。
不動化製造物の活性は、細胞ペースト１ｇ当たり１９．
７μモル／時間であった。この値は、フリーな細胞の活
性の６７％であった。実施例１０ ポリアゼチジンゲルで不動化した大腸菌を
含有するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 大腸菌ＡＴＣＣ９６３７を、Ｓａｔｏ他、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ａｐｐｌ．Ｍｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：１５３〜１６
０（１９７６）により報告されたよに好気的に培養し
た。２０．７ｇ（湿重量）の細胞ペーストと２０．７ｇ
のポリアゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカップ（登録
商標）１７２）との混合物を、木製棒を用いて手で２５
℃で均質になるまで撹拌した。この混合物を１９３ｇの
アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９３８イオン交換ビ
ーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。前記のビーズ
は、ビーズと会合している＞８５％の湿気を除くため
に、前もって２５〜３０℃で６０時間空気乾燥した。混
合物の薄いフィルムを２５℃で２４時間空気乾燥させ
た。得られた自由に流動するビーズは２７．４ｇの重さ
があり、体積９５ｍｌを占めた。１ｇのフリーの細胞に
対応するこれらのビーズの一部１３２５ｍｌで、ペニシ
リンアシラーゼ活性を測定した。６−アミノペニシラニ
ック酸生成物を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬ
Ｃ）により定量した。不動化生成物の活性は細胞ペース
ト１ｇ当たり５３．６μモル／時間であり、これはフリ
ーな細胞活性の９９％であった。実施例１１ フルクトースの濃いコーンシロップ（Ｈｉ
ｇｈ ＦｒｕｃｔｏｓｅＣｏｒｎ Ｓｙｒｕｐ）製造用
のグルコースイソメラーゼ活性を含有するアルスロバク
ター種の不動化 アルスロバクター種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ
ｅｃｉｅｓ）ＡＴＣＣ２１７４８を液中好気性条件下で
増殖させ、細胞を取り出した。該細胞は、６０℃で細胞
ペースト１ｇ（湿重量）当たり４２０μモル／時間のグ
ルコースイソメラーゼ活性を有した。４７ｇのポリカッ
プ（登録商標）１７２に４７ｇ（湿重量）のアルスロバ
クター種ＡＴＣＣ２１７４８を加え、そして混合物を５
〜１０分間激しく撹拌した。ポリカップ（登録商標）／
細胞混合物を次に撹拌しながら４６．４ｇの空気乾燥し
たＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズにゆっくり加え、得
られたビーズを室温で２４時間乾燥させた。５ｍｌのア
ルスロバクター種ＡＴＣＣ２１７４８不動化ビーズを含
有するフラスコに、５０ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝
液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣＯ
Ｃｌ２を加え、そして溶液を撹拌しながら６０℃まで加
熱した。４５０ｍｇのα−Ｄ−グルコースをフラスコに
加え、そしてフラスコを６０℃１時間、１５０ｒｐｍで
培養振とう器中に入れた。不動化アルスロバクター種Ａ
ＴＣＣ２１７４８のグルコースイソメラーゼ活性は、シ
ステイン／Ｈ２ＳＯ４反応［Ｄｉｓｃｈｅ． Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，３９１４０
（１９６０）］により決定すると、６０℃に於いては細
胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり５３０μモル／時間で
あった。１０Ｍｌのアルスロバクター種ＡＴＣＣ２１７
４８不動化ビーズを、循環式水浴により６０℃に保たれ
ている０．９×３０ｃｍのカバーのかかったガラスカラ
ムに添加した。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液中に２５０
ｍＭグルコース、５ｍＭＭｇＳＯ４と０．５ｍＭ ＣＯ
Ｃｌ２を含有するあらかじめ湿った基質溶液ｐＨ７．５
を、カラムに通した。連続操作の６日後、不動化アルス
ロバクター種ＡＴＣＣ２１７４８のグルコースイソメラ
ーゼ活性は、６０℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当た
り２８０μモル／時間であり、３７日後ではグルコース
イソメラーゼ活性は６０℃で細胞ペースト１ｇ（湿重
量）当たり１８μモル／時間であった。実施例１２ プレドニゾロンもしくは関連するステロイ
ドを製造するためのステロイドデヒドロゲナーゼ活性を
有するアルスロバクター シンプレックスの不動化 アルスロバクター シンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘ）ＡＴＣＣ６９４６を、液中
好気性条件下で増殖させ、細胞を取り出した。細胞は、
３４℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり９８０μモ
ル／時間のΔ−１−デヒドロゲナーゼ活性を有してい
た。２０ｇのポリカップ（登録商標）１７２に２０ｇの
アルスロバクター シンプレックスＡＴＣＣ６９４６を
加え、そして混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次
にポリカップ（登録商標）／細胞混合物をゆっくり１
８．６ｇの空気乾燥ＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズに
撹拌しながら加え、得られたビーズを室温で２４時間乾
燥させた。５Ｍｌのアルスロバクター シンプレックス
ＡＴＣＣ６９４６不動化ビーズを含有するフラスコに３
６Ｍｌの２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を加
え、次いで６０ｍｇのヒドロコルチゾンを含有する４Ｍ
ｌのエタノールを加えた。フラスコを、３４℃１時間
１５０ｒｐｍで培養振とう器中に置いた。不動化アルス
ロバクター シンプレックスＡＴＣＣ６９４６のΔ−１
−デヒドロゲナーゼ活性は、２８５ｎｍの吸光度で決定
するとき、３４℃で細胞ペースト１ｇ（湿重量）当たり
４４０μモル／時間であった。実施例１３ フルクトースの濃いコーンシロップを製造
するためのグルコースイソメラーゼ活性を有するストレ
プトマイセス種の不動化 ストレプトマイセス フエオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
ＮＲＲＬ Ｂ３５５９を液中好気性条件下で成長させ、
そして細胞を取り出した。細胞は６０℃で、細胞ペース
ト１ｇ（湿重量）当たり７．７μモル／分のグルコース
イソメラーゼ活性を有していた。６４．５ｇのポリカッ
プ（登録商標）１７２に６４．５ｇのストレプトマイセ
ス フエオクロモゲネスＮＲＲＬ Ｂ３５５９を加え、
そして混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次いポリ
カップ（登録商標）／細胞混合物を、６０．０ｇの空気
乾燥ＩＲＡ（登録商標）９３８ビーズに撹拌しながらゆ
っくり加え、そして得られたビーズを室温で２４時間乾
燥させた。１０Ｍｌのストレプトマイセス フエオクロ
モゲネスＮＲＲＬ Ｂ３５５９不動化ビーズを、循環式
水浴で６０℃に保った０．９×３０ｃｍのカバーをかけ
たガラスカラムに添加した。２５０ｍＭグルコース、１
００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３，１０ｍＭ ＭｇＳＯ４および
１ｍＭ ＣＯＣｌ２を含有しＨＣｌでｐＨ７．０に調整
されたあらかじめ湿った基質溶液を、流速２８ｍｌ／時
間でカラムに通した。不動化ストレプトマイセスフエオ
クロモゲネス ＮＲＲＬ Ｂ３５５９のグルコースイソ
メラーゼ活性は、システイン／Ｈ２ＳＯ４反応（Ｄｉｓ
ｃｈｅ他、上を見よ）により決定すると、６０℃で細胞
ペースト１ｇ（湿重量）当たり７．７μモル／分であっ
た。実施例 １４ フエニルアラニンを製造するためのフエニルアラニン
アンモニア リアーゼの濃いロドスポリジウム種の不動
化 ロドスポリジウム トルロデイス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ １０７８
８を液中好気性条件下で増殖させ、そして細胞を取り出
した。細胞は３０℃で細胞ペースト １ｇ（質重量）当
たり１１２μモル／時間のＬ−フエニルアラニンアンモ
ニア−リアーゼ活性を有していた。１４．９ｇのポリカ
ツプ（登録商標）１７２に１４．９ｇのロドストポリジ
ウム トルロイデス ＡＴＣＣ １０７８８を加え、そ
して細胞混合物を５〜１０分間激しく撹拌した。次に、
ポリカツプ（登録商標）／細胞混合物を１３．８ｇの空
気乾燥ＩＲＡ（登録商標） ９３８ビーズに攪拌しなが
らゆっくり加え、得られたビーズを室温で２４時間乾燥
させた。１Ｍｌのポドスポリジウム トルロイデス Ａ
ＴＣＣ １０７８８ 不動化ビーズを含有するフラスコ
に、５Ｍｌの２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
８），２５ｍＭ Ｌ−フエニルアラニン，０．００５％
セチルピリジニウム クロライドを加えた。フラスコ
を、３０℃ １時間 １００ｒｐｍでダブノフ（Ｄｕｂ
ｎｏｆｆ）振とう培養器中に入れた。不動化ロドスポリ
ジウム トルロイデス ＡＴＣＣ １０７８８のフェニ
ルアラニンアンモニアーリアーゼ活性は、２７８ｎｍの
吸光度により決定すると、３０℃で細胞ペースト１ｇ
（湿重量）当たり１０μモル／時間であった。実施例８
〜１４に示した不動化細胞／ポリマー組成物がどのよう
に使用されて示した生成物を作るのかは、先行文献から
明らかである。このように、実施例８に関して、アスパ
ラギン酸の脱カルボキシル化を介してのＬ−アラニンの
生成は、酵素、Ｌ−アスパルチック−β−デカルボキシ
ラーゼにより媒介される。この酵素の存在は、Ｃｈｉｂ
ａｔａ他、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１３巻，５号，６３８〜６４５ページ（１９６５
年）により報告されているように、微生物学の多数の概
論でよく知られている。これは、クロストリジウムパー
フリンジェンス，デスルホビブリオ デスルフリカン
ス，ノカルジア グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌ
ｏｂｅｒｕｌａ），シュードモナス レプチリボラ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ），ア
セトバクター種，アクロモバクター（Ａｃｒｏｍｏｂａ
ｃｔｅｒ）種およびアルカリゲネスフェカーリスにより
産生さされる。Ｃｈｉｂａｔａ他は、アラニン形成菌株
は、概論に於いてかなり共通で、アセトバクター，アク
ロモバクター，シュードモナス，トルラ（Ｔｏｌｕｒ
ａ），トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ），アブシ
ディス，アスペルギルス，ムコールおよびオオスポラで
あると決定した。ｃｈｉｂａｔａ他はＭｅｉｓｔｅｒと
共同研究者により以前に得られた知識を増加させ、そし
てＬ−アスパラギン酸を化学量論的にアラニンに変換す
ることを測定した。Ｌ−アスパラギン酸から９０％をこ
えるＬ−アラニンの単離収率が、容易に得られた。この
工程は、米国特許第３，４５８，４００号に生物，シュ
ードモナス ダカンエおよびアクロモバクター ペスチ
ファー（Ａｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｅｓｔｉｆｅ
ｒ）に関連して記載されており、該特許では水性普通培
地中で、乾燥生細胞もしくは細胞フリ−抽出物によりＬ
−アラニンを製造する工程が特許請求されている。この
工程の変更例は、Ｃｈｉｂａｔａ他の１９７５年米国特
許第３，８９８，１２８号により、アクルアミドポリマ
ー中で微生物の不動化によって特許を受けている。シュ
ードモナス ダカンエからの酵素の使用に於ける他の特
許は、１９６９年米国特許第３，４６３，７０４号で得
られた。Ｓｈｉｂａｔａｎｉ他のＡｐｐｌｉｅｄ＆Ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
３８巻，３号，３５９〜３６４ページ（１９７９年）に
よる連続研究は、他の研究者によりＬ−アスパルチック
−β−デカルボキシラーゼを所有するほかの種が見つけ
られ、そしてこの酵素の製造はグルタミン酸塩の如きあ
るアミノ酸の添加により促進できることを示した。改良
した製造の連続方法はＹａｍａｔｏ他のＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＸＸＩ
Ｉ巻，２０４５〜２０５４ページ（１９８５年）により
発表され、この場合全生物はカラジーナンゲル中に不動
化されていた。さらに、他の研究者はハイポール（登録
商標）フォーム中に不動化したシュードモナス ダカン
エおよびアルカリゲネス フェカーリスからのアラニン
の製造の研究をおこなった［Ｆｕｓｅｅ他、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｄｉｏｌ
ｏｇｙ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ダラス（１９８０年３
月）］。本発明は、以前に使用した細胞組成物の代わり
にアスパラギン酸からＬ−アラニンを製造するために例
示した細胞／ポリマー組成物の使用を意図している。多
量の研究が、酵素ペニシリンアシラーゼの不動化に関連
しても以前になされた。例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，
６２：３１７〜３２１（１９８１）を参照。Ｍａｒｃｏ
ｎｉ他はセルローストリアセテート繊維中にペニシリン
アシラーゼを不動化し［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：７３５
〜７５６（１９８０）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１：１０５
７〜１０７３（１９７９）］、そして米国特許のいくつ
かは酵素不動化を問題としていた：米国特許第３，２７
８，３１９号；第３，１１６，２１８号；第３１９０，
５８６号；第３，４４６，７０５号；第３，６２２，４
６２号；第３，７３６，２３０号；第３，１６６，００
９号；第３，８０１，９６２号；第３，８８３，３９４
号；第３，９００，４８８号；第３，４９９，９０９
号；第３，７３６，２３０号；第４，００１，２６４
号；第４，１１３，５６６号および第４，２３０，８０
４号。全細胞不動化に関する比較的２，３の論文しか用
いえないことが明らかである。田辺製薬は、ポリアクリ
ルイミドゲル内な捕捉された細胞のリポートを発行して
いる。また、ｃｈｉｂａｔａ他（１９７４年）、ドイツ
特許第２，４１４，１２８号およびＭａｎｄｅｌ他はポ
リアクリルアミドゲル内への捕捉を発表している［Ｐｒ
ｉｋｌ． Ｂｌｋｈｉｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．１１：
２１９〜２２５（１９７５）］。ＤＥＡＥセルロース上
に吸着した巨大菌もしくはアクロモバクターの不動化全
細胞は、東洋醸造により使用されており、Ｆｕｊｉｉ他
の日本特許第７３ ９３９３号及びＳａｔｏ他のＥｕ
ｒ．Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
２：１５３〜１６０（１９７６）は、ペニシリンアシラ
ーゼを高活性で有する不動化大腸菌の使用によるペニシ
リン−Ｇからの６−ＡＰＡの製造を報告している。種々
の他の変更もまた本発明から離れることなしになし得、
本発明の範囲は特許請求の範囲で定義されると理解され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 33/02 Ｚ 8931−4Ｂ 37/06 8931−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 11/04 (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 33/02 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 37/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ルイス・エル・ウツド アメリカ合衆国、ステイト・オブ・メリー ランド・20 854、ロツクヴイレ、ゲイン ズバーロウ・ロード・11 760
Claims (18)
- 【請求項１】 ポリアゼチジンプレポリマー，カルボキ
シメチルセルロース，ポリウレタンヒドロゲルプレポリ
マー及びポリメチレンイソシアナートから構成されるグ
ループから選択される硬化性プレポリマー物質の硬化に
より得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって不動化
されるＬ−アスパルターゼ活性を含有する細胞を含む不
動化微生物細胞組成物とフマル酸アンモニウムとを接触
させることからなり、前記のポリマーが微生物細胞のＬ
−アスパルターゼ活性を著しく減弱させる温度より低い
温度で硬化され、該細胞／架橋ポリマー組成物が固体状
不活性担体上の被膜を形成していることを特徴とする、
Ｌ−アスパラギン酸の製造方法。 - 【請求項２】 細胞が大腸菌１１３０３の全細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 プレポリマー物質がポリアゼチジンプレ
ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】 プレポリマー物質がカルボキシメチルセ
ルロースであることを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】 プレポリマー物質がポリウレタンヒドロ
ゲルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 プレポリマー物質がポリメチレンイソシ
アナートであることを特徴とする請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質を
含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの硬
化により得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって不
動化されるＬ−アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性
を含有する細胞を含む不動化細胞／ポリマー組成物とＬ
−アスパラギン酸溶液とを接触させることからなり、前
記組成物が固体状不活性担体上の被膜を形成しているこ
とを特徴とする、Ｌ−アラニンの製造方法。 - 【請求項９】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質を
含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 細胞／ポリマー組成物が、ポリアゼチ
ジンプレポリマー中に不動化されたシュードモナスダカ
ンエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄａｃｕｎｈａｅ）を
含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの
硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって
不動化されるペニシリン−Ｇアシラーゼ活性を含有する
細胞を含む不動化細胞／ポリマー組成物を使用すること
からなり、該組成物が固体状不活性担体上の被膜を形成
することを特徴とする、６−アミノペニシラニック酸の
製造方法。 - 【請求項１２】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質
を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの
硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって
不動化されるグルコースイソメラーゼ活性を含有する細
胞を含む不動化細胞／ポリマー組成物を使用することか
らなり、該組成物が固体状不活性担体上の被膜を形成す
ることを特徴とする、フルクトースの濃いコーンシロッ
プを製造する方法。 - 【請求項１４】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質
を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの
硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって
不動化されるステロイド脱水素酵素活性を有する細胞を
含む不動化細胞／ポリマー組成物を使用することからな
り、該組成物が固体状不活性担体上の被膜を形成するこ
とを特徴とする、プレドニゾロンもしくは関連するステ
ロイドの製造方法。 - 【請求項１６】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質
を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの
硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって
不動化されるフェニルアラニンアンモニアーリアーゼ活
性を含有する細胞を含む不動化細胞／ポリマー組成物を
使用することからなり、該組成物が固体状不活性担体上
の被膜を形成することを特徴とする、フェニルアラニン
の製造方法。 - 【請求項１８】 担体がビーズもしくは他の粒子状物質
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
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Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4600692A (en) * | 1983-02-10 | 1986-07-15 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized cells for preparing phenylalanine |
| DE3312578A1 (de) * | 1983-04-08 | 1984-10-11 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Biologisch aktive zusammensetzung zur abwasser- und abluftreinigung |
| US4710467A (en) * | 1983-07-29 | 1987-12-01 | Purification Engineering, Inc. | Process for preparing phenylalanine |
| DK152764C (da) * | 1985-06-14 | 1988-10-03 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| DK336987D0 (da) * | 1987-07-01 | 1987-07-01 | Novo Industri As | Immobiliseringsmetode |
| EP0439527A4 (en) * | 1988-10-21 | 1991-11-21 | Synergen, Inc. | A process for producing l-phenyl acetyl carbinol (pac), an immobilized cell mass for use in the process and a method for preparing the cell mass |
| US5037555A (en) * | 1990-07-09 | 1991-08-06 | Texaco Inc. | Desalination of water |
| FR2695638B1 (fr) * | 1992-09-15 | 1995-04-07 | Rhone Poulenc Chimie | Procédé de préparation de l'acide L-aspartique via l'aspartate d'ammonium. |
| CA2127605A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-24 | Peter J. Degen | Affinity separation method |
| US5688904A (en) * | 1995-11-16 | 1997-11-18 | Calwood Chemical Industries Inc. | Polyaspartic acid catalysis |
| WO1998015641A1 (fr) * | 1996-10-04 | 1998-04-16 | Rhodia Chimie | Preparation d'une composition comprenant une substance thermosensible et un compose thermoreticulable et utilisation de ladite composition |
| FR2755143B1 (fr) * | 1996-10-25 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase |
| DE69803129T2 (de) * | 1997-02-14 | 2002-08-29 | Nippon Shokubai Co. Ltd., Osaka | Immobilisierter Biokatalysator |
| US5981239A (en) * | 1997-09-24 | 1999-11-09 | Great Lakes Chemical Corp. | Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis |
| EP0945513B1 (en) * | 1998-02-13 | 2005-09-21 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for producing L-aspartic acid |
| RU2299905C2 (ru) * | 2000-06-30 | 2007-05-27 | Адиссео Айэленд Лимитед | Гранулированный ферментативный катализатор и способ его получения |
| US6355468B1 (en) | 2000-07-24 | 2002-03-12 | Pcbu Services, Inc., | Phenylalanine ammonia lyase polypeptide and polynucleotide sequences and methods of obtaining and using same |
| US6967097B2 (en) * | 2000-07-24 | 2005-11-22 | Pcbu Services, Inc. | Phenylalainine ammonia lyase polypeptide and polynucleotide sequences and methods of obtaining and using same |
| US6546074B1 (en) * | 2001-03-27 | 2003-04-08 | Astex Technology Limited | Protein crystal structure and method for identifying protein modulators |
| AU2002351164A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-06-10 | Molecular Reflections, Inc. | Microscale immobilization of molecules using a hydrogel and methods of use thereof |
| AU2002314790A1 (en) * | 2001-12-05 | 2003-06-23 | Dow Global Technologies Inc. | Method for immobilizing a biologic in a polyurethane-hydrogel composition, a composition prepared from the method, and biomedical applications |
| RU2341560C1 (ru) * | 2007-06-07 | 2008-12-20 | Институт Катализа Им. Г.К. Борескова Сибирского Отделения Российской Академии Наук | Биокатализатор, способ его приготовления и способ получения глюкозо-фруктозных сиропов |
| US20220025351A1 (en) * | 2018-09-18 | 2022-01-27 | Kaneka Corporation | Production method for immobilized microorganisms and production method for amino acid using the same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4832347A (ja) * | 1971-08-31 | 1973-04-28 | ||
| JPS5366491A (en) * | 1976-11-18 | 1978-06-13 | Grace W R & Co | Fixing of protein |
| JPS5617073A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-18 | Seiko Instr & Electronics Ltd | Manufacture of semiconductor integrated circuit |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5617073B2 (ja) * | 1971-10-28 | 1981-04-20 | ||
| US3860490A (en) * | 1972-02-11 | 1975-01-14 | Nat Patent Dev Corp | Process of subjecting a microorganism susceptible material to a microorganism |
| JPS5130390B2 (ja) * | 1973-03-26 | 1976-08-31 | ||
| DE2612138C2 (de) * | 1975-06-10 | 1986-09-11 | W.R. Grace & Co., New York, N.Y. | Verfahren zur Herstellung von gebundenes Protein enthaltendem Polyurethanschaum |
| US4195127A (en) * | 1975-06-10 | 1980-03-25 | W. R. Grace & Co. | Process for immobilizing proteins |
| US4237229A (en) * | 1975-06-10 | 1980-12-02 | W. R. Grace & Co. | Immobilization of biological material with polyurethane polymers |
| JPS536483A (en) * | 1976-07-02 | 1978-01-20 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Composition having enzymatic activity and its preparation |
| BE861602A (fr) * | 1976-12-10 | 1978-03-31 | Grace W R & Co | Proteines propres a la dispersion dans l'eau modifiees par des polyurethannes |
| FR2421920A1 (fr) * | 1978-04-06 | 1979-11-02 | Dia Prosim | Procede d'agglomeration de substances chimiquement et/ou biologiquement actives |
| IT1207172B (it) * | 1979-02-15 | 1989-05-17 | Anic Spa | Processo per la preparazione dicorpi microporosi inglobanti uno o piu' agenti attivi. |
| DE3071031D1 (en) * | 1979-06-27 | 1985-10-03 | Brodelius P | Catalysts for the production and transformation of natural products having their origin in higher plants, process for production of the catalysts, and use thereof |
| JPS5675097A (en) * | 1979-11-27 | 1981-06-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Thermophilic aspartase and its preparation |
| US4436813A (en) * | 1982-03-16 | 1984-03-13 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized microbial cell composition for making L-aspartic acid |
-
1983
- 1983-02-10 US US06/465,551 patent/US4732851A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-03-07 AU AU12121/83A patent/AU561899B2/en not_active Ceased
- 1983-03-07 EP EP83301220A patent/EP0089165B1/en not_active Expired
- 1983-03-07 DE DE8383301220T patent/DE3382425D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1983-03-16 JP JP58044041A patent/JPH0771490B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-25 JP JP3250122A patent/JPH082311B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4832347A (ja) * | 1971-08-31 | 1973-04-28 | ||
| JPS5366491A (en) * | 1976-11-18 | 1978-06-13 | Grace W R & Co | Fixing of protein |
| JPS5617073A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-18 | Seiko Instr & Electronics Ltd | Manufacture of semiconductor integrated circuit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0089165B1 (en) | 1991-10-09 |
| JPH082311B2 (ja) | 1996-01-17 |
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| JPH0771490B2 (ja) | 1995-08-02 |
| US4732851A (en) | 1988-03-22 |
| AU561899B2 (en) | 1987-05-21 |
| DE3382425D1 (de) | 1991-11-14 |
| EP0089165A3 (en) | 1987-06-03 |
| JPS58170480A (ja) | 1983-10-07 |
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