JPH0771490B2 - 固定化微生物細胞およびその製造方法 - Google Patents
固定化微生物細胞およびその製造方法Info
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- JPH0771490B2 JPH0771490B2 JP58044041A JP4404183A JPH0771490B2 JP H0771490 B2 JPH0771490 B2 JP H0771490B2 JP 58044041 A JP58044041 A JP 58044041A JP 4404183 A JP4404183 A JP 4404183A JP H0771490 B2 JPH0771490 B2 JP H0771490B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は微生物細胞の固定化および該細胞の製造に係
る。本発明は特に、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する
固定化微生物細胞、特に大腸菌（Escherichia coli）細
胞を用いたＬ−アスパラギン酸を製造する改良方法に係
る。しかしながら、他の細胞の固定化及び使用もまた考
えられる。
る。本発明は特に、Ｌ−アスパルターゼ活性を含有する
固定化微生物細胞、特に大腸菌（Escherichia coli）細
胞を用いたＬ−アスパラギン酸を製造する改良方法に係
る。しかしながら、他の細胞の固定化及び使用もまた考
えられる。
Ｌ−アスパラギン酸の製造に使用する大腸菌もしくは他
の微生物細胞の固定化に関するかなりの量の先行技術が
ある。例えば、米国特許第3,791,926号（Chibata他）に
は、大腸菌ATCC11303の如きアスパルターゼ−産生微生
物を含有する水性懸濁液中で、アクリルアミド,N,N′−
低級アルキレン−ビス（アクリルアミド）およびビス
（アクリルアミドメチル）エーテルから選択されるモノ
マーの重合を伴なうＬ−アスパラギン酸の製造方法が記
載されている。得られたアスパルターゼ−産生固定化微
生物を、酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を付与する
フマル酸アンモニウム又はフマル酸もしくはその塩と無
機のアンモニウム塩との混合物で処理する。
の微生物細胞の固定化に関するかなりの量の先行技術が
ある。例えば、米国特許第3,791,926号（Chibata他）に
は、大腸菌ATCC11303の如きアスパルターゼ−産生微生
物を含有する水性懸濁液中で、アクリルアミド,N,N′−
低級アルキレン−ビス（アクリルアミド）およびビス
（アクリルアミドメチル）エーテルから選択されるモノ
マーの重合を伴なうＬ−アスパラギン酸の製造方法が記
載されている。得られたアスパルターゼ−産生固定化微
生物を、酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を付与する
フマル酸アンモニウム又はフマル酸もしくはその塩と無
機のアンモニウム塩との混合物で処理する。
アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞の不動化及び
得られた固定化細胞のＬ−アスパラギン酸製造用の使用
はまた、Fusee他によりApplied and Environmental Mic
robiology,42巻,4号,672〜676ページ（1981年10月）に
も記載されている。Fusee他によると、細胞は、液体イ
ソシアナートでおおわれた（isocyanate−capped）ポリ
ウレタンプレポリマー（ハイポール （HYPOL ））と
細胞懸濁液との混合により固定化され、そうして固定化
細胞を含有する“フオーム（foam）”を形成する。
得られた固定化細胞のＬ−アスパラギン酸製造用の使用
はまた、Fusee他によりApplied and Environmental Mic
robiology,42巻,4号,672〜676ページ（1981年10月）に
も記載されている。Fusee他によると、細胞は、液体イ
ソシアナートでおおわれた（isocyanate−capped）ポリ
ウレタンプレポリマー（ハイポール （HYPOL ））と
細胞懸濁液との混合により固定化され、そうして固定化
細胞を含有する“フオーム（foam）”を形成する。
Sato他（Biochimica et Biophysica Acta,570,179〜186
ページ,1979年）は、アスパルターゼ活性を含有する大
腸菌細胞のＫ−カラジーナン（Ｋ−carrageenan）によ
る固定化及びＬ−アスパラギン酸を生産するための固定
化生成物の使用について発表した。
ページ,1979年）は、アスパルターゼ活性を含有する大
腸菌細胞のＫ−カラジーナン（Ｋ−carrageenan）によ
る固定化及びＬ−アスパラギン酸を生産するための固定
化生成物の使用について発表した。
ウレタンプレポリマー，ポリウレタンもしくは類似物中
での微生物細胞の固体化について記載したほかの文献発
表は、以下のことを含む： （ａ） ポリウレタンマトリックス中での微生物細胞の
固定化、Klein他によるBiotechnology Letters,3巻,2
号,65〜70ページ（1981年）； （ｂ） 親水性ウレタンプレポリマー：酵素包括（entr
apment）用に便利な物質、Biotechnology and Bioengin
eering,20巻,1465〜1469ページ（1978年）； （ｃ） 有機溶媒中でゲル内に包括された細胞によるス
テロイドの転換、Omata他によるEuropean J.Applied Mi
crobiology and Biotechnology,8,143〜155ページ（197
9年）； （ｄ） 親水性ウレタンプレポリマーを用いた微生物細
胞とオルガネラの包括、Tanaka他によるEuropean J.App
lied Microbiology and Biotechnology,7,351〜354（19
79）。
での微生物細胞の固体化について記載したほかの文献発
表は、以下のことを含む： （ａ） ポリウレタンマトリックス中での微生物細胞の
固定化、Klein他によるBiotechnology Letters,3巻,2
号,65〜70ページ（1981年）； （ｂ） 親水性ウレタンプレポリマー：酵素包括（entr
apment）用に便利な物質、Biotechnology and Bioengin
eering,20巻,1465〜1469ページ（1978年）； （ｃ） 有機溶媒中でゲル内に包括された細胞によるス
テロイドの転換、Omata他によるEuropean J.Applied Mi
crobiology and Biotechnology,8,143〜155ページ（197
9年）； （ｄ） 親水性ウレタンプレポリマーを用いた微生物細
胞とオルガネラの包括、Tanaka他によるEuropean J.App
lied Microbiology and Biotechnology,7,351〜354（19
79）。
固定化微生物細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を製造す
る上記の方法には、種々の不便がある。例えばFusee他
及びSato他により発表された如きＫ−カラジーナンガム
及びポリウレタン“フオーム”は、比較的柔軟で且つ圧
縮性である。したがつてこれらの固定化細胞組成物は、
フマル酸アンモニウムがアンモニウムアスパルターゼへ
の変換のために通るカラム中で使用されるとき、該細胞
組成物は、特に高流速および／もしくは比較的長めのカ
ラムを使用する場合、圧縮されそして詰まる。
る上記の方法には、種々の不便がある。例えばFusee他
及びSato他により発表された如きＫ−カラジーナンガム
及びポリウレタン“フオーム”は、比較的柔軟で且つ圧
縮性である。したがつてこれらの固定化細胞組成物は、
フマル酸アンモニウムがアンモニウムアスパルターゼへ
の変換のために通るカラム中で使用されるとき、該細胞
組成物は、特に高流速および／もしくは比較的長めのカ
ラムを使用する場合、圧縮されそして詰まる。
本発明の主な目的は、Ｌ−アスパルターゼ活性微生物細
胞好ましくは大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を
製造する改良方法を提供することであり、該微生物細胞
は特別な方法で固定化され、それによつて得られた組成
物はＬ−アスパラギン酸のバツチ式もしくは連続式製造
に極めて有用である。
胞好ましくは大腸菌細胞を用いてＬ−アスパラギン酸を
製造する改良方法を提供することであり、該微生物細胞
は特別な方法で固定化され、それによつて得られた組成
物はＬ−アスパラギン酸のバツチ式もしくは連続式製造
に極めて有用である。
更に特別の目的は、比較的長期間最適なＬ−アスパルタ
ーゼ活性を保持する固定化大腸菌細胞を用いて、フマル
酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を製造する改良
方法の提供を含む。本発明の他の特別な目的は、固定化
細胞の使用を含む先行技術で当面する問題を取り除く、
Ｌ−アスパラギン酸作成の使用に適した新規な固定化微
生物システムを提供することである。他の目的はまた、
以下で明らかとなるであろう。
ーゼ活性を保持する固定化大腸菌細胞を用いて、フマル
酸アンモニウムからＬ−アスパラギン酸を製造する改良
方法の提供を含む。本発明の他の特別な目的は、固定化
細胞の使用を含む先行技術で当面する問題を取り除く、
Ｌ−アスパラギン酸作成の使用に適した新規な固定化微
生物システムを提供することである。他の目的はまた、
以下で明らかとなるであろう。
本発明の一態様によると、Ｌ−アスパルターゼ活性を含
有する大腸菌ATCC11303細胞もしくは同等の細胞を含む
固定化微生物細胞組成物とフマル酸アンモニウムもしく
は同等のものとの接触によるＬ−アスパラギン酸の製造
方法が提供され、該細胞は、ポリアゼチジンプレポリマ
ー，カルボキシメチルセルロース（CMC），ポリウレタ
ンヒドロゲルプレポリマー及びポリメチレンイソシアナ
ートから成るグループから選択される硬化性プレポリマ
ー物質の硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマー
によつて固定化され、該プレポリマー物質は微生物細胞
のＬ−アスパルターゼ活性が著しく減弱する温度より低
い温度で硬化され、該細胞／架橋ポリマー組成物は固体
状不活性担体上の被膜を構成する。固定化細胞／架橋ポ
リマー被膜の担体上への適用は、Ｌ−アスパラギン酸製
造に使用するためのすこぶる有利な形態の細胞／ポリマ
ー組成物を提供する。本発明の細胞／ポリマーシステム
が、Ｌ−アスパルターゼ活性の著しく損失なしに担体上
の乾燥被膜として提供され得ることは、特に有利な特徴
である。
有する大腸菌ATCC11303細胞もしくは同等の細胞を含む
固定化微生物細胞組成物とフマル酸アンモニウムもしく
は同等のものとの接触によるＬ−アスパラギン酸の製造
方法が提供され、該細胞は、ポリアゼチジンプレポリマ
ー，カルボキシメチルセルロース（CMC），ポリウレタ
ンヒドロゲルプレポリマー及びポリメチレンイソシアナ
ートから成るグループから選択される硬化性プレポリマ
ー物質の硬化により得られる固定化不溶性架橋ポリマー
によつて固定化され、該プレポリマー物質は微生物細胞
のＬ−アスパルターゼ活性が著しく減弱する温度より低
い温度で硬化され、該細胞／架橋ポリマー組成物は固体
状不活性担体上の被膜を構成する。固定化細胞／架橋ポ
リマー被膜の担体上への適用は、Ｌ−アスパラギン酸製
造に使用するためのすこぶる有利な形態の細胞／ポリマ
ー組成物を提供する。本発明の細胞／ポリマーシステム
が、Ｌ−アスパルターゼ活性の著しく損失なしに担体上
の乾燥被膜として提供され得ることは、特に有利な特徴
である。
本発明の特に好ましい態様は、Ｌ−アスパルターゼ活性
を有する固定化大腸菌細胞の提供を意図し、該細胞はポ
リアゼチジンプレポリマーの硬化により得られる架橋水
不溶性ポリマーにより不動化される。
を有する固定化大腸菌細胞の提供を意図し、該細胞はポ
リアゼチジンプレポリマーの硬化により得られる架橋水
不溶性ポリマーにより不動化される。
概して本発明は、Ｌ−アスパルターゼ活性を有すること
が知られており、それゆえ、細胞を結合するため上で説
明したように特別な架橋ポリマーシステムを用いて新規
で有用な配置（configuration）でフマル酸アンモニウ
ムの変換によりＬ−アスパラギン酸（もしくはそのアン
モニウム塩）を産生できる、結合している大腸菌特に大
腸菌ATCC11303の全細胞もしくはその同等物に依存して
いる。
が知られており、それゆえ、細胞を結合するため上で説
明したように特別な架橋ポリマーシステムを用いて新規
で有用な配置（configuration）でフマル酸アンモニウ
ムの変換によりＬ−アスパラギン酸（もしくはそのアン
モニウム塩）を産生できる、結合している大腸菌特に大
腸菌ATCC11303の全細胞もしくはその同等物に依存して
いる。
示したプレポリマーシステムは、40℃より低い温度で、
細胞のＬ−アスパルターゼ活性を著しく低下させること
なく大腸菌細胞を含有する比較的多量の水の存在下で架
橋され得る。このような水性架橋条件が、たとえ細胞が
不溶性架橋ポリマー網目構造中に固定化されても、Ｌ−
アスパルターゼ活性を有する大腸菌細胞を残すことは、
本発明の驚くべき面である。
細胞のＬ−アスパルターゼ活性を著しく低下させること
なく大腸菌細胞を含有する比較的多量の水の存在下で架
橋され得る。このような水性架橋条件が、たとえ細胞が
不溶性架橋ポリマー網目構造中に固定化されても、Ｌ−
アスパルターゼ活性を有する大腸菌細胞を残すことは、
本発明の驚くべき面である。
本発明の他のすばらしい面は、ポリマー水溶液中の大腸
菌細胞の湿分散（wet dispersion）が、固定化細胞がま
だ驚くべきことにそのもとのＬ−アスパルターゼ活性を
ほとんど保持しながら、乾燥され得ることである。該乾
燥工程は、Ｌ−アスパルターゼ活性を保持している細胞
を高濃度で有している被膜，膜，粒子等の形態で、強力
な，良く架橋した，不溶性組成物を提供する利点を有し
ている。
菌細胞の湿分散（wet dispersion）が、固定化細胞がま
だ驚くべきことにそのもとのＬ−アスパルターゼ活性を
ほとんど保持しながら、乾燥され得ることである。該乾
燥工程は、Ｌ−アスパルターゼ活性を保持している細胞
を高濃度で有している被膜，膜，粒子等の形態で、強力
な，良く架橋した，不溶性組成物を提供する利点を有し
ている。
ここに記載の新規な固定化Ｌ−アスパルターゼ細胞組成
物は、以前例えばFusee他およびSato他により前記の文
献中に報告された固定化Ｌ−アスパルターゼ活性大腸菌
細胞組成物により性能がすぐれていることが判明した。
物は、以前例えばFusee他およびSato他により前記の文
献中に報告された固定化Ｌ−アスパルターゼ活性大腸菌
細胞組成物により性能がすぐれていることが判明した。
本発明の大腸菌細胞の固定化用の架橋ポリマー網目構造
を提供するための使用に適したプレポリマー物質は、以
下を含む： （１） 水溶液中で＝NH,−SH,−OH,−COOHとの反応に
より架橋され得るポリアゼチジンプレポリマー；又はH2
O除去、加熱もしくはより塩基性pHへの変化により架橋
され得る他のポリアゼチジン。本方法に使用できるポリ
カツプ 172（Polycup 172）（ハーキユレス社）の如
き代表的ポリアゼチジンの理想的構造は、次の通りであ
り、式中Ｒは典型的にはCH2 ４である： （２） 水溶液中でFe+++,Al+++,Ca++,Mg++の如き多価
イオンとの反応により架橋され得るカルボキシメチルセ
ルロース。CMC7HF（ハーキユレス社）の如きカルボキシ
メチルセルロースポリマーの理想的構造は、次の通りで
ある： （３） 水溶液中で−NH,−SH,−OH,−COOHもしくはH2O
との反応により架橋され得るポリウレタンヒドロゲルプ
レポリマー。代表的ポリウレタンヒドロゲルプレポリマ
ーの理想的構造は次の通りであり、該プレポリマーは、
１分子当たり２個より多いヒドロキシル基及び3,000よ
り大きな分子量を有し且つ各ヒドロキシル基は低分子量
のポリイソシアナートでおおわれている水溶性ポリエー
テルポリオールを用いて作られる： 〔式中、R1は典型的には低分子量のポリオールフラグメ
ント（グリセロール，ペンタエリトリトール，ソルビト
ール等からの）であり； ａ及びｂは整数であり、例えばａは典型的には＞10であ
り且つa/bの比は一般的には２乃至５であり、ａ及びｂ
セグメントの配列順はでたらめもしくはかたまりになつ
ており； ｎもまた典型的には＞２の整数であり； R2は典型的にはトルエンジイソシアナート，メチレンジ
（フエニルイソシアナート）,m−キシリレンジイソシア
ナート，イソホロン−ジイソシアナート，ヘキサメチレ
ンジイソシアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシリレンジ
イソシアナート，ドデカヒドロメチレンジ（フエニルイ
ソシアナート）及び類似物の如きジイソシアナートであ
る〕 （４） 水との混合により硬化し得る方式の如きポリメ
チレンイソシアナート： 〔但し、式中ｎは０乃至４である〕 このようなポリイソシアナートは商品として入手可能で
あり、一般に“未精製重合メチレンジ（フエニルイソシ
アナート）”と呼ばれる。水により架橋不溶性ポリマー
に転換しうる他のポリイソシアナートもまた使用しうる
と考えられる。例えば、トルエンジイソシアナート，メ
チレンジ（フエニルイソシアナート）,m−キシリレンジ
イソシアナート，イソホロン−ジイソシアナート，ヘキ
サメチレンジイソシアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシ
リレンジイソシアナート，ドデカヒドロメチレンジ（フ
エニルイソシアナート）及び類似物がある。
を提供するための使用に適したプレポリマー物質は、以
下を含む： （１） 水溶液中で＝NH,−SH,−OH,−COOHとの反応に
より架橋され得るポリアゼチジンプレポリマー；又はH2
O除去、加熱もしくはより塩基性pHへの変化により架橋
され得る他のポリアゼチジン。本方法に使用できるポリ
カツプ 172（Polycup 172）（ハーキユレス社）の如
き代表的ポリアゼチジンの理想的構造は、次の通りであ
り、式中Ｒは典型的にはCH2 ４である： （２） 水溶液中でFe+++,Al+++,Ca++,Mg++の如き多価
イオンとの反応により架橋され得るカルボキシメチルセ
ルロース。CMC7HF（ハーキユレス社）の如きカルボキシ
メチルセルロースポリマーの理想的構造は、次の通りで
ある： （３） 水溶液中で−NH,−SH,−OH,−COOHもしくはH2O
との反応により架橋され得るポリウレタンヒドロゲルプ
レポリマー。代表的ポリウレタンヒドロゲルプレポリマ
ーの理想的構造は次の通りであり、該プレポリマーは、
１分子当たり２個より多いヒドロキシル基及び3,000よ
り大きな分子量を有し且つ各ヒドロキシル基は低分子量
のポリイソシアナートでおおわれている水溶性ポリエー
テルポリオールを用いて作られる： 〔式中、R1は典型的には低分子量のポリオールフラグメ
ント（グリセロール，ペンタエリトリトール，ソルビト
ール等からの）であり； ａ及びｂは整数であり、例えばａは典型的には＞10であ
り且つa/bの比は一般的には２乃至５であり、ａ及びｂ
セグメントの配列順はでたらめもしくはかたまりになつ
ており； ｎもまた典型的には＞２の整数であり； R2は典型的にはトルエンジイソシアナート，メチレンジ
（フエニルイソシアナート）,m−キシリレンジイソシア
ナート，イソホロン−ジイソシアナート，ヘキサメチレ
ンジイソシアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシリレンジ
イソシアナート，ドデカヒドロメチレンジ（フエニルイ
ソシアナート）及び類似物の如きジイソシアナートであ
る〕 （４） 水との混合により硬化し得る方式の如きポリメ
チレンイソシアナート： 〔但し、式中ｎは０乃至４である〕 このようなポリイソシアナートは商品として入手可能で
あり、一般に“未精製重合メチレンジ（フエニルイソシ
アナート）”と呼ばれる。水により架橋不溶性ポリマー
に転換しうる他のポリイソシアナートもまた使用しうる
と考えられる。例えば、トルエンジイソシアナート，メ
チレンジ（フエニルイソシアナート）,m−キシリレンジ
イソシアナート，イソホロン−ジイソシアナート，ヘキ
サメチレンジイソシアナート，ヘキサヒドロ−ｍ−キシ
リレンジイソシアナート，ドデカヒドロメチレンジ（フ
エニルイソシアナート）及び類似物がある。
イソシアナートは、適当は粒子状支持体（particulate
sabstrate）を被覆し、次いで大腸菌細胞の水性スラリ
ーと混合することにより有効に使用される。
sabstrate）を被覆し、次いで大腸菌細胞の水性スラリ
ーと混合することにより有効に使用される。
前記のポリマーシステムのいずれも、種々の異なる形態
（form）及び形（shape）を有する細胞／ポリマー組成
物を提供するＬ−アスパルターゼ活性大腸菌細胞の固定
化に使用され得る。例えば、固定化細胞／ポリマー組成
物は、膜，フイラメント（filament），繊維（fibe
r），管，ビーズもしくは類似物の形態で製造され得
る。本発明の特に重要な実施態様は、適当な形の支持体
上の被膜として固定化細胞／ポリマー組成物を提供する
ことを含み、該支持体は、有利には、必ずしもその必要
はないけれども、不活性固体状の有機もしくは無機の多
孔性もしくは非多孔性物質の固体または網状ビーズまた
は粒子の形態である。上記に記載したように、本発明の
組成物は、細胞のＬ−アスパルターゼ活性に本質的な影
響を及ぼさずに硬化且つ乾燥され得、その結果として該
組成物は、乾燥被覆ビーズあるいは他の粒子状物質（pa
rticulate material）の形態に製造でき、且つ使用に必
要となるまで貯蔵できる。典型的には、本発明の固定化
細胞／架橋ポリマー組成物用に使用しうる支持体もしく
は担体は、ビーズもしくは粒子状の形態の次のものを含
む： モレキユラーシーブ イオン交換樹脂 アルミナ シリカ及びシリカゲル 有孔虫の骨格 ポリマーラテツクス 金属 本発明で使用されるポリマーシステムの有用な性質は、
該システムがＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞
と水中で接触もしくは混合でき、次いで大腸菌細胞を保
持もしくは固定化する不溶性で比較的固定したポリマー
マトリツクスを形成するように架橋（もしくは硬化）で
きることである。使用されるに必要な架橋条件は充分に
温和であり、そのため大腸菌突然変異細胞のＬ−アスパ
ルターゼ活性が保持されるということは特に有利であ
る。
（form）及び形（shape）を有する細胞／ポリマー組成
物を提供するＬ−アスパルターゼ活性大腸菌細胞の固定
化に使用され得る。例えば、固定化細胞／ポリマー組成
物は、膜，フイラメント（filament），繊維（fibe
r），管，ビーズもしくは類似物の形態で製造され得
る。本発明の特に重要な実施態様は、適当な形の支持体
上の被膜として固定化細胞／ポリマー組成物を提供する
ことを含み、該支持体は、有利には、必ずしもその必要
はないけれども、不活性固体状の有機もしくは無機の多
孔性もしくは非多孔性物質の固体または網状ビーズまた
は粒子の形態である。上記に記載したように、本発明の
組成物は、細胞のＬ−アスパルターゼ活性に本質的な影
響を及ぼさずに硬化且つ乾燥され得、その結果として該
組成物は、乾燥被覆ビーズあるいは他の粒子状物質（pa
rticulate material）の形態に製造でき、且つ使用に必
要となるまで貯蔵できる。典型的には、本発明の固定化
細胞／架橋ポリマー組成物用に使用しうる支持体もしく
は担体は、ビーズもしくは粒子状の形態の次のものを含
む： モレキユラーシーブ イオン交換樹脂 アルミナ シリカ及びシリカゲル 有孔虫の骨格 ポリマーラテツクス 金属 本発明で使用されるポリマーシステムの有用な性質は、
該システムがＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞
と水中で接触もしくは混合でき、次いで大腸菌細胞を保
持もしくは固定化する不溶性で比較的固定したポリマー
マトリツクスを形成するように架橋（もしくは硬化）で
きることである。使用されるに必要な架橋条件は充分に
温和であり、そのため大腸菌突然変異細胞のＬ−アスパ
ルターゼ活性が保持されるということは特に有利であ
る。
上記に示したように、本発明の特に所望の組成物は、Ｌ
−アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞と固定化ポ
リマーを、被膜としてかたい無機もしくは有機ポリマー
ビーズ上に適用することにより得られる。これらの比較
的非圧縮性組成物を用いると、固定化もしくは流動性ベ
ツトに於いて高生産量が可能なＬ−アスパルターゼ活性
触媒ベツトが可能である。上記に記載したように、比較
的柔軟で圧縮性であるＫ−カラジーナンガム又はポリウ
レタンフオームを使用する、従来の文献に記載されたＬ
−アスパルターゼ活性固定化細胞組成物にあつては、圧
縮性であるため、高流速および／又は長いカラム（ベツ
ト）の場合、詰まる傾向があつたのである。
−アスパルターゼ活性を含有する大腸菌細胞と固定化ポ
リマーを、被膜としてかたい無機もしくは有機ポリマー
ビーズ上に適用することにより得られる。これらの比較
的非圧縮性組成物を用いると、固定化もしくは流動性ベ
ツトに於いて高生産量が可能なＬ−アスパルターゼ活性
触媒ベツトが可能である。上記に記載したように、比較
的柔軟で圧縮性であるＫ−カラジーナンガム又はポリウ
レタンフオームを使用する、従来の文献に記載されたＬ
−アスパルターゼ活性固定化細胞組成物にあつては、圧
縮性であるため、高流速および／又は長いカラム（ベツ
ト）の場合、詰まる傾向があつたのである。
本発明によれば、種々の方法が、硬化もしくは架橋され
た形態のプレポリマーとの組み合わせにより、Ｌ−アス
パルターゼ活性を保持しながら、大腸菌ATCC11303細胞
の固定化のために利用され得る。いずれかの特定の場合
に於いて使用される好ましい方法は、少なくともある程
度まで使用されるプレポリマーに依存する。すなわち、 ａ） 好ましいポリアゼチジンプレポリマーの場合、大
腸菌ATCC11303細胞は、プレポリマーの水溶液と有利に
混合され、そうして均質混合物が得られ、その後でポリ
アゼチジンは次のいずれかの方法により不溶性Ｌ−アス
パルターゼ活性組成物を付与するために硬化もしくは架
橋され得る： 水の一部もしくはほとんど全部を60℃より低い温度（通
常は40℃と０℃の間）で且つ760〜1.0Torrの圧力下で除
去すること； 7.5以上にpHを上昇させること； 大腸菌／ポリアゼチジン混合物をポリアミンにさらすこ
と（例えば、１〜２重量部（parts/weight）のポリエチ
レンイミン，ポリアミノイオン交換樹脂，ジエチレント
リアミン，エチレンジアミン等の各々に対し組成物100
部を使用する） ｂ） カルボキシメチルセルロース（CMC）ガムの場
合、大腸菌ATCC11303との均質混合物は、水性混合物例
えば1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物を0.001〜1.0
重量部の多価カチオン塩と接触させることにより、又は
理想的には1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物につき
0.01〜0.4重量部の多価カチオン塩を接触させることに
より、膜，フアイバー，ビーズ等に架橋（硬化）され得
る。
た形態のプレポリマーとの組み合わせにより、Ｌ−アス
パルターゼ活性を保持しながら、大腸菌ATCC11303細胞
の固定化のために利用され得る。いずれかの特定の場合
に於いて使用される好ましい方法は、少なくともある程
度まで使用されるプレポリマーに依存する。すなわち、 ａ） 好ましいポリアゼチジンプレポリマーの場合、大
腸菌ATCC11303細胞は、プレポリマーの水溶液と有利に
混合され、そうして均質混合物が得られ、その後でポリ
アゼチジンは次のいずれかの方法により不溶性Ｌ−アス
パルターゼ活性組成物を付与するために硬化もしくは架
橋され得る： 水の一部もしくはほとんど全部を60℃より低い温度（通
常は40℃と０℃の間）で且つ760〜1.0Torrの圧力下で除
去すること； 7.5以上にpHを上昇させること； 大腸菌／ポリアゼチジン混合物をポリアミンにさらすこ
と（例えば、１〜２重量部（parts/weight）のポリエチ
レンイミン，ポリアミノイオン交換樹脂，ジエチレント
リアミン，エチレンジアミン等の各々に対し組成物100
部を使用する） ｂ） カルボキシメチルセルロース（CMC）ガムの場
合、大腸菌ATCC11303との均質混合物は、水性混合物例
えば1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物を0.001〜1.0
重量部の多価カチオン塩と接触させることにより、又は
理想的には1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物につき
0.01〜0.4重量部の多価カチオン塩を接触させることに
より、膜，フアイバー，ビーズ等に架橋（硬化）され得
る。
得られた水不溶性固定化細胞／ポリマー網目構造組成物
は、このように膜，繊維もしくはビーズの形で、しかし
ながら最も効率よくは高表面積粒子のまわりの被膜とし
て硬化され得る。実例として、10乃至1000重量部の高表
面積粒子は1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物で被覆
され得、理想的には細胞ペースト/CMC混合物1.0重量部
当たり粒子50乃至500重量部使用される。硬化被膜中に
含有される75％以上の水の除去は、細胞／ポリマー被膜
の強度および結合を改良するのに望ましい。
は、このように膜，繊維もしくはビーズの形で、しかし
ながら最も効率よくは高表面積粒子のまわりの被膜とし
て硬化され得る。実例として、10乃至1000重量部の高表
面積粒子は1.0重量部の細胞ペースト/CMC混合物で被覆
され得、理想的には細胞ペースト/CMC混合物1.0重量部
当たり粒子50乃至500重量部使用される。硬化被膜中に
含有される75％以上の水の除去は、細胞／ポリマー被膜
の強度および結合を改良するのに望ましい。
ｃ） ポリウレタンヒドロゲルを使用するときには、大
腸菌ATCC11303の均質水性分散（典型的には、広くは1.0
乃至1000mlのH2O当たりもしくは好ましくは10乃至100ml
のH2O当たり細胞1.0g）を該ヒドロゲルプレポリマーと
混合し、ポリイソシアナートを水と反応させることによ
り、又はより迅速な方法として、1000乃至0.1Torr且つ5
0℃より低い温度（好ましくは760乃至5.0Torr且つ０℃
乃至30℃）で除去し得る水の50乃至100％を除去するこ
とにより、もしくは２つの１級もしくは２級アミン基を
有する分子の水溶液に未乾燥組成物をさらすことによ
り、該プレポリマーは、水不溶性Ｌ−アスパルターゼ活
性組成物に硬化される。典型的には、これらのポリアミ
ン分子は、ヒドラジンもしくはエチレンジアミンからポ
リエチレンイミンまで利用できる。一般的に使用される
該ヒドロゲルプレポリマー各1.0gに対して、1.0乃至500
mlの水中の0.01乃至10.0gのポリアミンが使用できる。
特に0.1乃至1.0gのポリアミンと10乃至100mlの水が、使
用されるヒドロゲルプリポリマー1g当たり使用される。
腸菌ATCC11303の均質水性分散（典型的には、広くは1.0
乃至1000mlのH2O当たりもしくは好ましくは10乃至100ml
のH2O当たり細胞1.0g）を該ヒドロゲルプレポリマーと
混合し、ポリイソシアナートを水と反応させることによ
り、又はより迅速な方法として、1000乃至0.1Torr且つ5
0℃より低い温度（好ましくは760乃至5.0Torr且つ０℃
乃至30℃）で除去し得る水の50乃至100％を除去するこ
とにより、もしくは２つの１級もしくは２級アミン基を
有する分子の水溶液に未乾燥組成物をさらすことによ
り、該プレポリマーは、水不溶性Ｌ−アスパルターゼ活
性組成物に硬化される。典型的には、これらのポリアミ
ン分子は、ヒドラジンもしくはエチレンジアミンからポ
リエチレンイミンまで利用できる。一般的に使用される
該ヒドロゲルプレポリマー各1.0gに対して、1.0乃至500
mlの水中の0.01乃至10.0gのポリアミンが使用できる。
特に0.1乃至1.0gのポリアミンと10乃至100mlの水が、使
用されるヒドロゲルプリポリマー1g当たり使用される。
上記の大腸菌／ヒドロゲル組成物を、膜，繊維，ビーズ
等にすることができる。しかし好ましい配置は、前記し
たように、高表面積粒子上の被膜として該組成物を使用
することである。使用される粒子の表面積によつて、0.
1乃至100.0gの大腸菌／ヒドロゲル組成物を100gの粒子
に被覆することができる。
等にすることができる。しかし好ましい配置は、前記し
たように、高表面積粒子上の被膜として該組成物を使用
することである。使用される粒子の表面積によつて、0.
1乃至100.0gの大腸菌／ヒドロゲル組成物を100gの粒子
に被覆することができる。
ｄ） ポリイソシアナートが使用される場合には、これ
らが一般的にはじめに表面に適用され、そしてその後に
大腸菌ATCC11303細胞がそこに添加される。通常は、表
面物質10.0g当たりポリイソシアナート0.1乃至20.0gが
使用され得、好ましくは表面物質10.0g当たりポリイソ
シアナート0.5乃至10.0gが使用され得る。ポリイソシア
ナートは、もし液体の場合には、希釈せずに良好な混合
（かきまぜ機もしくは回転）により支持体に加えること
ができる。しかしながら、好ましい方法は、トルエン，
アセトン，クロロホルム，テトラヒドロフラン，ジメト
キシエタン，酢酸エチル及び類似物の如き不活性で容易
に蒸発する溶媒中のポリイソシアナート溶液を使用する
ことである。このような溶液は、支持体好ましくは高表
面積の乾燥粒子によく混合して加えられ、そして溶媒は
760Torr以下で各々の沸点で、均質に被覆された可動性
支持体粒子を得るために良好な混合を継続しながら、除
去される。使用される溶媒量は、通常には、ポリイソシ
アナート1.0重量部当たり1.0乃至100重量部で変化す
る。
らが一般的にはじめに表面に適用され、そしてその後に
大腸菌ATCC11303細胞がそこに添加される。通常は、表
面物質10.0g当たりポリイソシアナート0.1乃至20.0gが
使用され得、好ましくは表面物質10.0g当たりポリイソ
シアナート0.5乃至10.0gが使用され得る。ポリイソシア
ナートは、もし液体の場合には、希釈せずに良好な混合
（かきまぜ機もしくは回転）により支持体に加えること
ができる。しかしながら、好ましい方法は、トルエン，
アセトン，クロロホルム，テトラヒドロフラン，ジメト
キシエタン，酢酸エチル及び類似物の如き不活性で容易
に蒸発する溶媒中のポリイソシアナート溶液を使用する
ことである。このような溶液は、支持体好ましくは高表
面積の乾燥粒子によく混合して加えられ、そして溶媒は
760Torr以下で各々の沸点で、均質に被覆された可動性
支持体粒子を得るために良好な混合を継続しながら、除
去される。使用される溶媒量は、通常には、ポリイソシ
アナート1.0重量部当たり1.0乃至100重量部で変化す
る。
本発明の固定化細胞／ポリマー組成物は、バツチ式もし
くは連続式の両方法によりアスパラギン酸を作るのに使
用され得る。しかしながら、これらの組成物は、特にビ
ーズもしくは他の粒子状支持体（particulate suppor
t）上に被覆される場合には、次式にしたがうフマル酸
アンモニウム水溶液のＬ−アスパラギン酸アンモニウム
への連続変換に特に有効である： 本発明のＬ−アスパラギン酸もしくはＬ−アスパラギン
酸アンモニウムの製造に使用し得る方法の実例として
は、次の通りである： （ｉ） 触媒組成物が、0.1乃至5.0モル（好ましくは0.
5乃至2.0モル）のフマル酸アンモニウムの水溶液中で、
pH5.0乃至10.0（好ましくはpH7.5乃至9.5）で、1.0乃至
100時間（好ましくは８乃至48時間）、50℃より低い温
度（好ましくは20乃至40℃）で撹拌されるバツチ式工
程。広くは0.05乃至50gの好ましくは1.0乃至15gの固定
化細胞を、出発フマル酸アンモニウム１モル当たりに使
用する。変換後、触媒組成物は、過もしくは同等の方
法により、フマル酸塩溶液を変換する新しいバツチでの
再使用のために除去され得る。生成物溶液は、Ｌ−アス
パラギン酸を単離するための普通の工程（酸性化，沈
殿，過，洗浄，再結晶，乾燥）に適した形態で得られ
る。
くは連続式の両方法によりアスパラギン酸を作るのに使
用され得る。しかしながら、これらの組成物は、特にビ
ーズもしくは他の粒子状支持体（particulate suppor
t）上に被覆される場合には、次式にしたがうフマル酸
アンモニウム水溶液のＬ−アスパラギン酸アンモニウム
への連続変換に特に有効である： 本発明のＬ−アスパラギン酸もしくはＬ−アスパラギン
酸アンモニウムの製造に使用し得る方法の実例として
は、次の通りである： （ｉ） 触媒組成物が、0.1乃至5.0モル（好ましくは0.
5乃至2.0モル）のフマル酸アンモニウムの水溶液中で、
pH5.0乃至10.0（好ましくはpH7.5乃至9.5）で、1.0乃至
100時間（好ましくは８乃至48時間）、50℃より低い温
度（好ましくは20乃至40℃）で撹拌されるバツチ式工
程。広くは0.05乃至50gの好ましくは1.0乃至15gの固定
化細胞を、出発フマル酸アンモニウム１モル当たりに使
用する。変換後、触媒組成物は、過もしくは同等の方
法により、フマル酸塩溶液を変換する新しいバツチでの
再使用のために除去され得る。生成物溶液は、Ｌ−アス
パラギン酸を単離するための普通の工程（酸性化，沈
殿，過，洗浄，再結晶，乾燥）に適した形態で得られ
る。
（ii） 触媒組成物例えば被覆ビーズをカラム内に置
き、そしてフマル酸アンモニウム溶液（濃度,pH,温度は
バツチ式工程に記載のものと同じである）を、上からも
しくは下から（流動床方式）のどちらかから触媒ベツト
内を通過させる連続式工程。これらのフマル酸塩溶液の
通過速度は、0.1乃至1000空間速度／時間で変化し得
る。例えば、１時間当たり5.0リツトルの溶液が、1.0リ
ツトルの触媒ベツトを通り、これは１時間当たり5.0空
間速度（S.V.）と表わされる。好ましくは、フマル酸塩
からＬ−アスパラギン酸塩への本質的に100％の変換が
生じるフマル酸塩溶液の流速は、0.5乃至20.0S.V./時間
に一致する。これらの触媒ベツトカラムからの溶出液
は、Ｌ−アスパラギン酸を単離するための通常の工程
（上記のバツチ式工程に於いて概略を述べたように）に
適している。本発明を、以下の例により詳細に説明す
る： 例１ CMCガム中に固定化したＬ−アスパルターゼを含
有する大腸菌の製造 高分子量のカルボキシメチルセルロース（ハーキユレス
７ HF CMCガム、分子量約700,000、無水グルコース
１ユニツト当たり0.65乃至0.85のカルボキシメチル基を
有する）の１％水溶液10gに、大腸菌（E.coil）細胞ATC
C11303のペースト0.5gを加えた。完全な均質分散を、木
製の棒を用いて手で撹拌して作つた。この分散の一部2.
0gを、水和５Åモレキユラーシーブビーズ（８〜12メツ
シユ、あらかじめビーズ100gを水200gと混合し、次いで
過剰の水をデカントしそしてビーズを空気中25℃で乾燥
させることにより水和したもの）10g上に置いた。５乃
至10分間手で完全に撹拌後、一様に被覆された湿気の多
い，しかし自由に流動するビーズが得られた。次いでこ
れらの被覆ビーズを、FeSO4・nH2Oの0.1％水溶液40ml中
に注いだ。25℃に於ける周期的な穏やかな撹拌の４時間
後に、液体をデカントし（考えられるゲル状微粒子が液
体中に認められた）そしてビーズを0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液で４回洗浄した。湿つた被覆ビーズが合計2
2.2g得られた。ビーズは、５℃で湿気の多い空気中に貯
蔵した。Ｌ−アスパルターゼ活性（第１表参照）に、こ
れらの湿つたビーズの一部5.0mlを使用した。この一部
は6.3gの重さがあり、大腸菌細胞0.027gを含有すると計
算された 例２ ポリウレタンヒドロゲル中に固定化したＬ−アス
パルターゼを含有する大腸菌細胞の製造 ａ） ポリウレタンヒドロゲル プレポリマーは、分子
量7,000の水溶性ポリエーテル（高レベルのポリオキシ
エチレン セグメント）トリオール、BASF ワイアンド
ツトからのプルラコール Ｖ−７（Pluracol Ｖ−７）
を、３モルのドデカヒドロメチレンジ（フエニルイソシ
アナート）、モーベイケミカル（Mobay Chemical）社か
らのデスモジユール Ｗによりキヤツピングして製造し
た。このヒドロゲルプレポリマー1.0gの水9.0g中の溶液
を、大腸菌ATCC11303細胞ペースト1.0gと25℃で完全に
混合した。水和した５Å,8〜12メツシユのモレキユラー
シーブビーズ20gに、大腸菌−水和プレポリマー水性分
散の一部2.0gを加えた。得られた混合物を、22.0gの湿
つているが自由に流動する被覆ビーズを付与するよう
に、25℃で木製の棒を用い手で10分間撹拌した。予備実
験により、このヒドロゲルプレポリマーの10％水溶液
は、８乃至24時間の25℃での空気中での乾燥により、水
溶性ゲルを形成することが示された。このように、湿つ
た被覆ビーズを、20.1gの自由に流動する硬化被覆ビー
ズを付与するように、16時間25℃の開け放した空気中で
乾燥させた。これらの被覆ビーズの一部4.3gは、5.0ml
の体積及び0.039gの概算した大腸菌細胞含量 を有した。
き、そしてフマル酸アンモニウム溶液（濃度,pH,温度は
バツチ式工程に記載のものと同じである）を、上からも
しくは下から（流動床方式）のどちらかから触媒ベツト
内を通過させる連続式工程。これらのフマル酸塩溶液の
通過速度は、0.1乃至1000空間速度／時間で変化し得
る。例えば、１時間当たり5.0リツトルの溶液が、1.0リ
ツトルの触媒ベツトを通り、これは１時間当たり5.0空
間速度（S.V.）と表わされる。好ましくは、フマル酸塩
からＬ−アスパラギン酸塩への本質的に100％の変換が
生じるフマル酸塩溶液の流速は、0.5乃至20.0S.V./時間
に一致する。これらの触媒ベツトカラムからの溶出液
は、Ｌ−アスパラギン酸を単離するための通常の工程
（上記のバツチ式工程に於いて概略を述べたように）に
適している。本発明を、以下の例により詳細に説明す
る： 例１ CMCガム中に固定化したＬ−アスパルターゼを含
有する大腸菌の製造 高分子量のカルボキシメチルセルロース（ハーキユレス
７ HF CMCガム、分子量約700,000、無水グルコース
１ユニツト当たり0.65乃至0.85のカルボキシメチル基を
有する）の１％水溶液10gに、大腸菌（E.coil）細胞ATC
C11303のペースト0.5gを加えた。完全な均質分散を、木
製の棒を用いて手で撹拌して作つた。この分散の一部2.
0gを、水和５Åモレキユラーシーブビーズ（８〜12メツ
シユ、あらかじめビーズ100gを水200gと混合し、次いで
過剰の水をデカントしそしてビーズを空気中25℃で乾燥
させることにより水和したもの）10g上に置いた。５乃
至10分間手で完全に撹拌後、一様に被覆された湿気の多
い，しかし自由に流動するビーズが得られた。次いでこ
れらの被覆ビーズを、FeSO4・nH2Oの0.1％水溶液40ml中
に注いだ。25℃に於ける周期的な穏やかな撹拌の４時間
後に、液体をデカントし（考えられるゲル状微粒子が液
体中に認められた）そしてビーズを0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液で４回洗浄した。湿つた被覆ビーズが合計2
2.2g得られた。ビーズは、５℃で湿気の多い空気中に貯
蔵した。Ｌ−アスパルターゼ活性（第１表参照）に、こ
れらの湿つたビーズの一部5.0mlを使用した。この一部
は6.3gの重さがあり、大腸菌細胞0.027gを含有すると計
算された 例２ ポリウレタンヒドロゲル中に固定化したＬ−アス
パルターゼを含有する大腸菌細胞の製造 ａ） ポリウレタンヒドロゲル プレポリマーは、分子
量7,000の水溶性ポリエーテル（高レベルのポリオキシ
エチレン セグメント）トリオール、BASF ワイアンド
ツトからのプルラコール Ｖ−７（Pluracol Ｖ−７）
を、３モルのドデカヒドロメチレンジ（フエニルイソシ
アナート）、モーベイケミカル（Mobay Chemical）社か
らのデスモジユール Ｗによりキヤツピングして製造し
た。このヒドロゲルプレポリマー1.0gの水9.0g中の溶液
を、大腸菌ATCC11303細胞ペースト1.0gと25℃で完全に
混合した。水和した５Å,8〜12メツシユのモレキユラー
シーブビーズ20gに、大腸菌−水和プレポリマー水性分
散の一部2.0gを加えた。得られた混合物を、22.0gの湿
つているが自由に流動する被覆ビーズを付与するよう
に、25℃で木製の棒を用い手で10分間撹拌した。予備実
験により、このヒドロゲルプレポリマーの10％水溶液
は、８乃至24時間の25℃での空気中での乾燥により、水
溶性ゲルを形成することが示された。このように、湿つ
た被覆ビーズを、20.1gの自由に流動する硬化被覆ビー
ズを付与するように、16時間25℃の開け放した空気中で
乾燥させた。これらの被覆ビーズの一部4.3gは、5.0ml
の体積及び0.039gの概算した大腸菌細胞含量 を有した。
この試料5.0mlをＬ−アスパルターゼ活性の測定（第１
表参照）に使用した。
表参照）に使用した。
ｂ） 上記の大腸菌−ヒドロゲル プレポリマー水性分
散の一部1.0gを、５Å,8〜12メツシユの水和モレキユラ
ーシーブビーズ10.0g上に25℃で同様に被覆した。５乃
至10分間の撹拌後、得られた自由に流動する湿つたビー
ズを、良く撹拌しながらポリエチレンイミン（アルドリ
ツチケミカル社＃18197−８）の0.1％水溶液40ml中に注
いだ。予備実験により、H2O 10ml中のヒドロゲル プ
レポリマー1.0gの新鮮な,15分経つていない溶液は、ポ
リエチレンイミンの0.1％水溶液との接触により直ちに
水不溶性ゲルを形成することが示された。ポリエチレン
イミン溶液中の被覆ビーズのスラリーを25℃で30分間穏
やかに撹拌し、次いで、11.5gの湿気の多い自由に流動
するビーズを付与するように、40mlずつの0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝溶液（pH7.5）で４回洗浄した。これらの
ビーズの一部5.0mlは5.1gの重さがあり、0.041gの大腸
菌細胞を含有すると概算された この一部を5.0mlをＬ−アスパルターゼの測定（第１表
参照）に使用した。
散の一部1.0gを、５Å,8〜12メツシユの水和モレキユラ
ーシーブビーズ10.0g上に25℃で同様に被覆した。５乃
至10分間の撹拌後、得られた自由に流動する湿つたビー
ズを、良く撹拌しながらポリエチレンイミン（アルドリ
ツチケミカル社＃18197−８）の0.1％水溶液40ml中に注
いだ。予備実験により、H2O 10ml中のヒドロゲル プ
レポリマー1.0gの新鮮な,15分経つていない溶液は、ポ
リエチレンイミンの0.1％水溶液との接触により直ちに
水不溶性ゲルを形成することが示された。ポリエチレン
イミン溶液中の被覆ビーズのスラリーを25℃で30分間穏
やかに撹拌し、次いで、11.5gの湿気の多い自由に流動
するビーズを付与するように、40mlずつの0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝溶液（pH7.5）で４回洗浄した。これらの
ビーズの一部5.0mlは5.1gの重さがあり、0.041gの大腸
菌細胞を含有すると概算された この一部を5.0mlをＬ−アスパルターゼの測定（第１表
参照）に使用した。
ｃ） Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌ATCC11303
を有するポリウレタンヒドロゲル膜を、次の方法で製造
した： リン酸塩で緩衝化した塩水（pH7.4）10.0g中の大腸菌AT
CC11303細胞ペースト10.0gのスラリーを、均質分散を確
実にするために30分間25℃で混合した。脱イオン水10.0
g中の上記のヒドロゲル プレポリマー（分子量7,000、
３モルのデスモジユール Ｗでトリオールはおおわれて
いる）5.0gの溶液を、１分間で25℃での激しい撹拌によ
り形成した。この溶液を均質な細胞ペーストスラリーと
混合した。激しい撹拌の20秒内に、得られた混合物は極
めて濃厚になり、直ちにテフロン シート上に注いだ。
25℃で数秒内に混合物は、エラストマーゲル（elastome
ricgel）になつた。25℃の空気中で45分後、得られたエ
ラストマー膜合成物（厚さ1/16乃至1/4インチ、直径４
インチ）を、テフロン 表面からはいだ。
を有するポリウレタンヒドロゲル膜を、次の方法で製造
した： リン酸塩で緩衝化した塩水（pH7.4）10.0g中の大腸菌AT
CC11303細胞ペースト10.0gのスラリーを、均質分散を確
実にするために30分間25℃で混合した。脱イオン水10.0
g中の上記のヒドロゲル プレポリマー（分子量7,000、
３モルのデスモジユール Ｗでトリオールはおおわれて
いる）5.0gの溶液を、１分間で25℃での激しい撹拌によ
り形成した。この溶液を均質な細胞ペーストスラリーと
混合した。激しい撹拌の20秒内に、得られた混合物は極
めて濃厚になり、直ちにテフロン シート上に注いだ。
25℃で数秒内に混合物は、エラストマーゲル（elastome
ricgel）になつた。25℃の空気中で45分後、得られたエ
ラストマー膜合成物（厚さ1/16乃至1/4インチ、直径４
インチ）を、テフロン 表面からはいだ。
膜を1.5Mフタル酸アンモニウム溶液500ml中に置き、30
分間振りまぜた。細胞および／もしくはゲルが膜から洗
出されたことを示すかなりの濁りが、水溶液中に現われ
た。この洗浄工程を、1.5Mフマル酸アンモニウム溶液１
を用い、25℃で64時間繰り返した。溶液はほんの非常
にわずかにかすんでおり、その280nm（1/1000希釈）に
於ける光学密度は、はじめの0.43（1/1000希釈）に比較
して0.005であつた。このことは、本質的にすべてのフ
マル酸アンモニウムが消費されたことを示す。
分間振りまぜた。細胞および／もしくはゲルが膜から洗
出されたことを示すかなりの濁りが、水溶液中に現われ
た。この洗浄工程を、1.5Mフマル酸アンモニウム溶液１
を用い、25℃で64時間繰り返した。溶液はほんの非常
にわずかにかすんでおり、その280nm（1/1000希釈）に
於ける光学密度は、はじめの0.43（1/1000希釈）に比較
して0.005であつた。このことは、本質的にすべてのフ
マル酸アンモニウムが消費されたことを示す。
膜をそのまま除去し、そして新鮮な1.5Mフマル酸アンモ
ニウム750ml中に置いた。25℃での16時間の穏やかな撹
拌後、膜上の透明液体生成物は280nm（1/1000希釈）に
於いて0.005の光学密度を有した。この工程を、さらに7
50mlのフマル酸アンモニウムを用い20時間25℃で繰り返
した。合わせて15,000mlの生成物溶液は透明で、280nm
に於いて0.005の光学密度を有した。
ニウム750ml中に置いた。25℃での16時間の穏やかな撹
拌後、膜上の透明液体生成物は280nm（1/1000希釈）に
於いて0.005の光学密度を有した。この工程を、さらに7
50mlのフマル酸アンモニウムを用い20時間25℃で繰り返
した。合わせて15,000mlの生成物溶液は透明で、280nm
に於いて0.005の光学密度を有した。
合わせた生成物溶液の一部1000mlを、濃塩酸145gを用い
てpH2.8まで酸性化した。得られた白色結晶のスラリー
を５℃に16時間保ち、次に過した。湿気の多いフイル
ターケーキを次に脱イオン水1000ml中で80乃至90℃で２
時間撹拌し、次に30℃まで放冷した。白色結晶状固体を
過により集め、脱イオン水250mlで洗浄した。固体を2
5乃至100℃で且つ５乃至20Torrで16時間、178.0gの定重
量になるまで乾燥した。重量178.0gは、Ｌ−アスパラギ
ン酸の収率89.4％を表わす 6.0N HCl 100ml中の白色固体2.04g溶液の施光を、パ
ーキン−エルマー施光計を用い25℃で測定し、＋0.497
であることがわかつた。同装置で、Ｌ−アスパラギン酸
（シグマケミカル社＃Ａ−9256）の標品2.04gの溶液
は、＋0.495の施光を有した。
てpH2.8まで酸性化した。得られた白色結晶のスラリー
を５℃に16時間保ち、次に過した。湿気の多いフイル
ターケーキを次に脱イオン水1000ml中で80乃至90℃で２
時間撹拌し、次に30℃まで放冷した。白色結晶状固体を
過により集め、脱イオン水250mlで洗浄した。固体を2
5乃至100℃で且つ５乃至20Torrで16時間、178.0gの定重
量になるまで乾燥した。重量178.0gは、Ｌ−アスパラギ
ン酸の収率89.4％を表わす 6.0N HCl 100ml中の白色固体2.04g溶液の施光を、パ
ーキン−エルマー施光計を用い25℃で測定し、＋0.497
であることがわかつた。同装置で、Ｌ−アスパラギン酸
（シグマケミカル社＃Ａ−9256）の標品2.04gの溶液
は、＋0.495の施光を有した。
例３ ポリイソシアナートで前処理した表面上で固定化
したＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） 活性化した無水５Å,8〜12メツシユのモレキユラ
ーシーブビーズ10.0gを、回転蒸発装置中で、未精製の
重合した芳香族ポリイソシアナート（アツプジヨンケミ
カル社製パピ 20（PAPI 20）、7.1megNCO/g）2.0gの
乾燥トルエン50.0g溶液と混合した。トルエンを、１時
間の連続回転の間に85℃で且つ10乃至20Torrで除去し
た。自由に流動する含浸したビーズを25℃迄冷却し、0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）1.0g中の大腸菌ATC
C11303ペースト1.0gのスラリーを加えた。得られたビー
ズ混合物を、４時間25℃１気圧で、乾燥した自由に流動
するビーズ12.9gを付与するように、ゆつくりと回転さ
せた。乾燥ビーズの一部5.0mlは4.9gの重さであつた。
この体積は、1.5Mフマル酸アンモニウム溶液中に浸けた
後でも変らなかつた。概算の大腸菌細胞0.38gはこの一
部5.0ml中にあり これをＬ−アスパルターゼ活性（第１表参照）の測定に
使用した。
したＬ−アスパルターゼを含有する大腸菌の製造 ａ） 活性化した無水５Å,8〜12メツシユのモレキユラ
ーシーブビーズ10.0gを、回転蒸発装置中で、未精製の
重合した芳香族ポリイソシアナート（アツプジヨンケミ
カル社製パピ 20（PAPI 20）、7.1megNCO/g）2.0gの
乾燥トルエン50.0g溶液と混合した。トルエンを、１時
間の連続回転の間に85℃で且つ10乃至20Torrで除去し
た。自由に流動する含浸したビーズを25℃迄冷却し、0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）1.0g中の大腸菌ATC
C11303ペースト1.0gのスラリーを加えた。得られたビー
ズ混合物を、４時間25℃１気圧で、乾燥した自由に流動
するビーズ12.9gを付与するように、ゆつくりと回転さ
せた。乾燥ビーズの一部5.0mlは4.9gの重さであつた。
この体積は、1.5Mフマル酸アンモニウム溶液中に浸けた
後でも変らなかつた。概算の大腸菌細胞0.38gはこの一
部5.0ml中にあり これをＬ−アスパルターゼ活性（第１表参照）の測定に
使用した。
ｂ） 同様の方法で、無水弱塩基性＝Ｎ−Ｈ型イオン交
換ビーズ（ロームアンドハース社、アンバーライト IR
A45、直径0.42mm、85乃至90℃且つ５乃至20Torrで数時
間乾燥したもの）10.0gを、乾燥トルエン50ml中のパピ
202.0gの溶液で処理した。85乃至90℃且つ５乃至20To
rrでの１時間にわたるトルエンの除去は、いくらか粘着
性であるがそれでも可動性の塊の被覆ビーズを付与し
た。この回転させた混合物（tumbled mixture）に、大
腸菌ATCC11303ペースト1gの0.1Mリン酸ナトリウム（pH
7.5）緩衝溶液1.0ml中のスラリーを加えた。この幾分ガ
ム状塊の均質な被覆を達成するのを助けるために、60個
の直径0.25インチのテフロン 球を加えた。得られた混
合物を、25℃且つ５乃至20Torrで２時間、テフロン 球
の除去後、15.6gの乾燥した自由に流動する被覆ビーズ
を付与するように、回転させた。これらの被覆ビーズの
一部5.0mlは2.8gの重さであり、1.5Mフマル酸アンモニ
ウム溶液に浸した後でも体積は変らなかつた。この5.0m
lをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用
し、0.18gの大腸菌を含有すると概算された 例４ ポリアゼチジンゲルで固定化したＬ−アスパルタ
ーゼを含有する大腸菌の製造 ａ） ポリアゼチジン水溶液2.0g（ヘルクレスポリカツ
プ 172、H2O中に12％の固体を有する如き）と大腸菌AT
CC11303ペースト2.0gとの混合物を、均質分散を確実に
するために、25℃で５分間磁気撹拌棒で迅速に撹拌し
た。次いでこの混合物を、25℃で16時間乾燥させるため
に、ポリスチレンの表面上に注いだ。得られた２インチ
×２インチ×1/16インチの厚さの屈曲できる膜を、前記
表面から取り除き、すると0.7gの重さであつた。このフ
イルムをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使
用し、大腸菌細胞（水和状態）2.0gを含有すると概算さ
れた。
換ビーズ（ロームアンドハース社、アンバーライト IR
A45、直径0.42mm、85乃至90℃且つ５乃至20Torrで数時
間乾燥したもの）10.0gを、乾燥トルエン50ml中のパピ
202.0gの溶液で処理した。85乃至90℃且つ５乃至20To
rrでの１時間にわたるトルエンの除去は、いくらか粘着
性であるがそれでも可動性の塊の被覆ビーズを付与し
た。この回転させた混合物（tumbled mixture）に、大
腸菌ATCC11303ペースト1gの0.1Mリン酸ナトリウム（pH
7.5）緩衝溶液1.0ml中のスラリーを加えた。この幾分ガ
ム状塊の均質な被覆を達成するのを助けるために、60個
の直径0.25インチのテフロン 球を加えた。得られた混
合物を、25℃且つ５乃至20Torrで２時間、テフロン 球
の除去後、15.6gの乾燥した自由に流動する被覆ビーズ
を付与するように、回転させた。これらの被覆ビーズの
一部5.0mlは2.8gの重さであり、1.5Mフマル酸アンモニ
ウム溶液に浸した後でも体積は変らなかつた。この5.0m
lをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用
し、0.18gの大腸菌を含有すると概算された 例４ ポリアゼチジンゲルで固定化したＬ−アスパルタ
ーゼを含有する大腸菌の製造 ａ） ポリアゼチジン水溶液2.0g（ヘルクレスポリカツ
プ 172、H2O中に12％の固体を有する如き）と大腸菌AT
CC11303ペースト2.0gとの混合物を、均質分散を確実に
するために、25℃で５分間磁気撹拌棒で迅速に撹拌し
た。次いでこの混合物を、25℃で16時間乾燥させるため
に、ポリスチレンの表面上に注いだ。得られた２インチ
×２インチ×1/16インチの厚さの屈曲できる膜を、前記
表面から取り除き、すると0.7gの重さであつた。このフ
イルムをＬ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使
用し、大腸菌細胞（水和状態）2.0gを含有すると概算さ
れた。
ｂ） 2.0gのポリカツプ 172と2.0gの大腸菌ATCC11303
の均質混合物を、30gの水和した５Å,8〜12メツシユの
モレキユラーシーブビーズ上に、25℃で５乃至20Torrで
45分間回転させることにより分布させた。25℃で開放さ
れた空気中でさらに16時間乾燥の後、得られた被覆ビー
ズは30.4gの重さであつた。これらの被覆ビーズの一部
5.0mlは3.9gの重さであつた。この試料をＬ−アスパル
ターゼ活性（第１表参照）の測定に使用し、0.26gの大
腸菌細胞を有していると概算された ｃ） 2.0gの大腸菌ATCC11303の2.0gのポリカツプ 172
中の均質分散を25℃で、30分間25℃で木製の棒を用いて
混合することにより、30.0gのアンバーライト IRA45イ
オン交換ビーズ（42％H2O、＝Ｎ−Ｈ型の）上に分散さ
せた。いくらか粘着性の薄層を、空気中に25℃で16時間
放置した。得られた自由に流動するビーズは、25.8gの
重さであつた。これらの乾燥被覆ビーズの試料3.0gは、
体積5.0mlを有していた。1.5Mフマル酸アンモニウム溶
液に浸すことにより、体積は5.5mlに膨張した。これら
の湿つた被覆ビーズの一部5.0mlをＬ−アスパルターゼ
の測定（第１表参照）に使用し、大腸菌含量の概算値は
0.21gであつた ｄ） 脱イオン水4.0gとポリカツプ 172 2.0g中の大腸
菌ATCC11303 4.0gの均質分散を同量の三部に分けて、3.
5時間かけて、60個の直径0.25のテフロン 球を含有す
るアンバーライト IRA45（42％H2O、フリーの＝Ｎ−Ｈ
型の）10.0gに加えた。この混合物を、25℃で５乃至20T
orrで回転させた。合計で５時間減圧下で乾燥の後、得
られた乾燥被覆ビーズ（テフロン 球は除去した）は、
7.8gの重さであつた。これらの乾燥した自由に流動する
被覆ビーズの一部5.0mlは、2.9gの重さであつた。1.5M
フマル酸アンモニウム溶液で飽和の後、体積は6.25mlに
膨潤した。これらの湿つた被覆ビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用した。
概算のこの部分の大腸菌含量は、 であつた。
の均質混合物を、30gの水和した５Å,8〜12メツシユの
モレキユラーシーブビーズ上に、25℃で５乃至20Torrで
45分間回転させることにより分布させた。25℃で開放さ
れた空気中でさらに16時間乾燥の後、得られた被覆ビー
ズは30.4gの重さであつた。これらの被覆ビーズの一部
5.0mlは3.9gの重さであつた。この試料をＬ−アスパル
ターゼ活性（第１表参照）の測定に使用し、0.26gの大
腸菌細胞を有していると概算された ｃ） 2.0gの大腸菌ATCC11303の2.0gのポリカツプ 172
中の均質分散を25℃で、30分間25℃で木製の棒を用いて
混合することにより、30.0gのアンバーライト IRA45イ
オン交換ビーズ（42％H2O、＝Ｎ−Ｈ型の）上に分散さ
せた。いくらか粘着性の薄層を、空気中に25℃で16時間
放置した。得られた自由に流動するビーズは、25.8gの
重さであつた。これらの乾燥被覆ビーズの試料3.0gは、
体積5.0mlを有していた。1.5Mフマル酸アンモニウム溶
液に浸すことにより、体積は5.5mlに膨張した。これら
の湿つた被覆ビーズの一部5.0mlをＬ−アスパルターゼ
の測定（第１表参照）に使用し、大腸菌含量の概算値は
0.21gであつた ｄ） 脱イオン水4.0gとポリカツプ 172 2.0g中の大腸
菌ATCC11303 4.0gの均質分散を同量の三部に分けて、3.
5時間かけて、60個の直径0.25のテフロン 球を含有す
るアンバーライト IRA45（42％H2O、フリーの＝Ｎ−Ｈ
型の）10.0gに加えた。この混合物を、25℃で５乃至20T
orrで回転させた。合計で５時間減圧下で乾燥の後、得
られた乾燥被覆ビーズ（テフロン 球は除去した）は、
7.8gの重さであつた。これらの乾燥した自由に流動する
被覆ビーズの一部5.0mlは、2.9gの重さであつた。1.5M
フマル酸アンモニウム溶液で飽和の後、体積は6.25mlに
膨潤した。これらの湿つた被覆ビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用した。
概算のこの部分の大腸菌含量は、 であつた。
ｅ） 3.0gの大腸菌ATCC11303の6.0mlの脱イオン水と3.
0gのポリカツプ 172中の均質分散を、上記の減圧下で
の乾燥と同じ方法で10.0gのアンバーライト IRA45（42
％H2O、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）上に広げた。合計で10.
7gの乾燥被覆した自由に流動するビーズが得られた。乾
燥被覆ビーズの一部5.0mlは、3.0gの重さであつた。1.5
Mフタル酸アンモニウム溶液中に浸した後、この体積は
5.75mlに膨潤した。湿つた被覆ビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用した。
この5.0ml部分の概算の大腸菌含量は、0.73gであつた ｆ） 4.0gの大腸菌ATCC11303の4.0gのポリカツプ 172
および8.0gの脱イオン水中の均質分散を、おおよそ等し
い６部に分けて、5.5時間かけて25℃且つ５乃至20Torr
で、直径0.5インチの８個のテフロン 球を含有する10.
0gのアンバーライト IRA938ビーズ（ローム＆ハス、73
％H2O、直径0.38mm、四級アミンクロリド塩の形態）に
加えた。25℃且つ５乃至20Torrでの合計６時間回転した
後、得られた乾燥被覆した自由に流動するビーズは、1
0.3gの重さであり且つ16.6mlの体積を有していた。これ
らのビーズを過剰の1.5Mフマル酸アンモニウム溶液（pH
8.5）に16時間25℃で浸すと、17.5mlの湿つたビーズが
得られた。1.14gの大腸菌ATCC11303 を含有すると概算された湿つたビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）に使用し
た。
0gのポリカツプ 172中の均質分散を、上記の減圧下で
の乾燥と同じ方法で10.0gのアンバーライト IRA45（42
％H2O、フリーの＝Ｎ−Ｈ型の）上に広げた。合計で10.
7gの乾燥被覆した自由に流動するビーズが得られた。乾
燥被覆ビーズの一部5.0mlは、3.0gの重さであつた。1.5
Mフタル酸アンモニウム溶液中に浸した後、この体積は
5.75mlに膨潤した。湿つた被覆ビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼの測定（第１表参照）に使用した。
この5.0ml部分の概算の大腸菌含量は、0.73gであつた ｆ） 4.0gの大腸菌ATCC11303の4.0gのポリカツプ 172
および8.0gの脱イオン水中の均質分散を、おおよそ等し
い６部に分けて、5.5時間かけて25℃且つ５乃至20Torr
で、直径0.5インチの８個のテフロン 球を含有する10.
0gのアンバーライト IRA938ビーズ（ローム＆ハス、73
％H2O、直径0.38mm、四級アミンクロリド塩の形態）に
加えた。25℃且つ５乃至20Torrでの合計６時間回転した
後、得られた乾燥被覆した自由に流動するビーズは、1
0.3gの重さであり且つ16.6mlの体積を有していた。これ
らのビーズを過剰の1.5Mフマル酸アンモニウム溶液（pH
8.5）に16時間25℃で浸すと、17.5mlの湿つたビーズが
得られた。1.14gの大腸菌ATCC11303 を含有すると概算された湿つたビーズの一部5.0mlを、
Ｌ−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）に使用し
た。
例５ ポリマー結合剤を用いない、Ｌ−アスパルターゼ
含有大腸菌細胞によるモレキュラーシーブビーズ及びイ
オン交換樹脂ビーズの被覆 Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞を固定化する
のに使用される上記のポリマーシステムの効用を実証す
るために、Ｌ−アスパルターゼを含有する細胞だけで、
即ちポリマー結合剤を用いずに物質を被覆する次の実験
をおこなつた。
含有大腸菌細胞によるモレキュラーシーブビーズ及びイ
オン交換樹脂ビーズの被覆 Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞を固定化する
のに使用される上記のポリマーシステムの効用を実証す
るために、Ｌ−アスパルターゼを含有する細胞だけで、
即ちポリマー結合剤を用いずに物質を被覆する次の実験
をおこなつた。
ａ） Ｌ−アスパルターゼを含有する大腸菌細胞ATCC11
303 1.0gのリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.5）ml
中のスラリーを同量ずつ４つに分けて3.5時間かけて、
直径0.5インチの10個のテフロン 球を含有する水和し
た5Aモレキユラーシーブビーズ（８〜12メツシユ）10.0
gに加えた。この混合物を、25℃且つ５乃至10Torrで回
転させた。合計約４時間後、得られた乾燥被覆された自
由に流動するビーズは、9.9gの重さであつた。これらの
乾燥ビーズの一部5.0mlは、4.2gの重さであつた。1.5M
フタル酸アンモニウム溶液に浸しても、体積は変化しな
かつた。被覆ビーズのこの一部の概算の大腸菌細胞含量
は、0.42gであつた 被覆ビーズの一部5.0mlを、1.5Mフマル酸アンモニウム
溶液50ml中で、25℃で24時間穏やかに撹拌した。溶液
は、かなりの量の物質がビーズから抜け落ちたことを示
して、非常に濁つた。ビーズをデカントにより単離し、
再び新しい1.5Mフマル酸アンモニウム50.0ml中25℃でＬ
−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）のために、
穏やかに撹拌した。しかしながら、１時間後であつて
も、溶液は再び非常に濁つた。時折、ビーズを単離し、
そして新しい1.5Mフマル酸アンモニウム溶液と穏やかに
撹拌した。ビーズは、溶液を非常に濁すかなりの量の物
質を放ち続けた。ポリマー結合剤を同様にビーズ／細胞
調製物（formulation）に加えると、この性質はＬ−ア
スパルターゼ活性細胞被覆ビーズの製造のいずれにおい
ても観察されなかつた。すべてのポリマーの例では、フ
マル酸アンモニウム溶液は、被覆ビーズの上に透明に残
つていた。
303 1.0gのリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M、pH7.5）ml
中のスラリーを同量ずつ４つに分けて3.5時間かけて、
直径0.5インチの10個のテフロン 球を含有する水和し
た5Aモレキユラーシーブビーズ（８〜12メツシユ）10.0
gに加えた。この混合物を、25℃且つ５乃至10Torrで回
転させた。合計約４時間後、得られた乾燥被覆された自
由に流動するビーズは、9.9gの重さであつた。これらの
乾燥ビーズの一部5.0mlは、4.2gの重さであつた。1.5M
フタル酸アンモニウム溶液に浸しても、体積は変化しな
かつた。被覆ビーズのこの一部の概算の大腸菌細胞含量
は、0.42gであつた 被覆ビーズの一部5.0mlを、1.5Mフマル酸アンモニウム
溶液50ml中で、25℃で24時間穏やかに撹拌した。溶液
は、かなりの量の物質がビーズから抜け落ちたことを示
して、非常に濁つた。ビーズをデカントにより単離し、
再び新しい1.5Mフマル酸アンモニウム50.0ml中25℃でＬ
−アスパルターゼ活性の測定（第１表参照）のために、
穏やかに撹拌した。しかしながら、１時間後であつて
も、溶液は再び非常に濁つた。時折、ビーズを単離し、
そして新しい1.5Mフマル酸アンモニウム溶液と穏やかに
撹拌した。ビーズは、溶液を非常に濁すかなりの量の物
質を放ち続けた。ポリマー結合剤を同様にビーズ／細胞
調製物（formulation）に加えると、この性質はＬ−ア
スパルターゼ活性細胞被覆ビーズの製造のいずれにおい
ても観察されなかつた。すべてのポリマーの例では、フ
マル酸アンモニウム溶液は、被覆ビーズの上に透明に残
つていた。
ｂ） 同様の方法で、大腸菌ATCC11303 10.0gのリン酸
塩緩衝溶液（0.1M、pH7.5）30g中のスラリーを、ポリマ
ー結合剤なしで、50.0gのアンバーライト IRA45（ロム
＆ハスからの、42％H2O、＝Ｎ−Ｈ型）上に、4.5時間か
けて25℃且つ５乃至20Torrで被覆した。得られた47.6g
の自由に流動する乾燥被覆ビーズは83.5mlの体積を有し
ていた。これらのビーズを過剰の1.5Mフマル酸アンモニ
ウム水溶液に浸すと、溶液は、ビーズから離れた多量の
物質で濃厚且つ不透明になつた。この不透明な母液から
ビーズを別（木製布、フアイバーガラスマツト、43
メツシユのナイロンスクリーン、中位の多孔性半融グラ
ス（medium porosity sintered glass））するすべての
試みは失敗した。なぜならば、濃厚なゼラチン状粒子が
すぐにフイルターにつまつたからである。この性質は、
ポリマー結合剤がビーズ／細胞調製物（formulation）
中に混合されたいずれの例の場合にも、観察されなかつ
た。このような場合には、ビーズ上の水溶液は常に透明
に保たれ、フイルター内をすみやかに流れた。
塩緩衝溶液（0.1M、pH7.5）30g中のスラリーを、ポリマ
ー結合剤なしで、50.0gのアンバーライト IRA45（ロム
＆ハスからの、42％H2O、＝Ｎ−Ｈ型）上に、4.5時間か
けて25℃且つ５乃至20Torrで被覆した。得られた47.6g
の自由に流動する乾燥被覆ビーズは83.5mlの体積を有し
ていた。これらのビーズを過剰の1.5Mフマル酸アンモニ
ウム水溶液に浸すと、溶液は、ビーズから離れた多量の
物質で濃厚且つ不透明になつた。この不透明な母液から
ビーズを別（木製布、フアイバーガラスマツト、43
メツシユのナイロンスクリーン、中位の多孔性半融グラ
ス（medium porosity sintered glass））するすべての
試みは失敗した。なぜならば、濃厚なゼラチン状粒子が
すぐにフイルターにつまつたからである。この性質は、
ポリマー結合剤がビーズ／細胞調製物（formulation）
中に混合されたいずれの例の場合にも、観察されなかつ
た。このような場合には、ビーズ上の水溶液は常に透明
に保たれ、フイルター内をすみやかに流れた。
例６ Ｌ−アスパルターゼ活性の測定 前記の例中に記載の固定化大腸菌ATCC11303組成物のＬ
−アスパルターゼ活性を、第１表に示す。各々の場合、
0.002M MgSO4を含有する1.5Mフマル酸アンモニウムの脱
イオン水溶液（pH8.5）50ml中で穏やかに８乃至16時間2
5℃で振りまぜることによつて、試料を試験準備した。
次いで各試料から溶液を流出させ、再び８乃至16時間25
℃で穏やかに振りまぜる前に50mlの新しいフマル酸塩溶
液を加えた。この時点ですべての試料は、前記の例で議
論したポリマー結合剤と調合した。該例は、その上澄み
溶液はすべて透明であつて、固型支持体から抜け落ちた
物質証拠がないことを示した。ポリマー結合剤を使用せ
ずに製造した試料（例５）は、数回の洗浄後でさえも、
非常に濁つた上澄み溶液を付与し続けた。このことは、
細胞物質は固型支持体に確実に結合していないことを示
している。
−アスパルターゼ活性を、第１表に示す。各々の場合、
0.002M MgSO4を含有する1.5Mフマル酸アンモニウムの脱
イオン水溶液（pH8.5）50ml中で穏やかに８乃至16時間2
5℃で振りまぜることによつて、試料を試験準備した。
次いで各試料から溶液を流出させ、再び８乃至16時間25
℃で穏やかに振りまぜる前に50mlの新しいフマル酸塩溶
液を加えた。この時点ですべての試料は、前記の例で議
論したポリマー結合剤と調合した。該例は、その上澄み
溶液はすべて透明であつて、固型支持体から抜け落ちた
物質証拠がないことを示した。ポリマー結合剤を使用せ
ずに製造した試料（例５）は、数回の洗浄後でさえも、
非常に濁つた上澄み溶液を付与し続けた。このことは、
細胞物質は固型支持体に確実に結合していないことを示
している。
各例の次の段階では、洗浄し且つ良く排水した合成物の
一部5.0mlを、（又は膜の場合、２インチ×２インチ×
0.125インチ）取り、新しい上記のフマル酸アンモニウ
ム溶液50.0ml中で25℃で振りまぜた。60分後に試料を除
去し、脱イオン水で1/1000に希釈した。280nmに於ける
開始時の1.5Mフマル酸アンモニウム溶液（1/1000希釈で
0.43であると観察した）からの光学密度の減少は、Ｌ−
アスパルターゼ活性を示した。280nmにおける15M L−ア
スパラギン酸アンモニウム塩（pH8.5）の光学密度は、
実質的にゼロ（＜0.005）である。
一部5.0mlを、（又は膜の場合、２インチ×２インチ×
0.125インチ）取り、新しい上記のフマル酸アンモニウ
ム溶液50.0ml中で25℃で振りまぜた。60分後に試料を除
去し、脱イオン水で1/1000に希釈した。280nmに於ける
開始時の1.5Mフマル酸アンモニウム溶液（1/1000希釈で
0.43であると観察した）からの光学密度の減少は、Ｌ−
アスパルターゼ活性を示した。280nmにおける15M L−ア
スパラギン酸アンモニウム塩（pH8.5）の光学密度は、
実質的にゼロ（＜0.005）である。
フマル酸塩からＬ−アスパルターゼへの観察された変化
は、第１表にアスパラギン酸のモル数／時間／触媒ベツ
トのとして及びアスパラギン酸のモル数／時間／湿つ
た大腸菌のkgとして示す。例えば、ポリアゼチジン，細
胞ペーストおよびイオン交換ビーズを用いた実験4dで
は、280nmに於ける光学密度は25℃で60分後に0.43から
0.32に低下した。計算は次の通りである： 大腸菌ATCC11303を含有するポリウレタンフオーム（パ
イポール ）の37℃に於けるＬ−アスパルターゼ性能を
示す文献中にあるデータから計算した値もまた、第１表
に示す。ここでは126gの細胞を有する0.777のベツト
は、2.0の1.0Mフマル酸塩を100％Ｌ−アスパラギン酸
塩に37℃で変換するために32分間要した。これらの研究
者らはまた、1.5Mフマル酸塩の平均変換速度は、1.0Mフ
マル酸塩よりも８％低いことを報告している。彼らはま
た、37℃における速度は、25℃の1.67倍であることも観
察した。このように、我々のデータ（25℃、1.5Mフマル
酸塩）と比較した彼らのＬ−アスパラギン酸生成速度の
正しい評価は、次の通りである： これらの値を本発明の例で得られたデータと比較する
と、ポリウレタンフオームシステムより本方法の優位が
示される。
は、第１表にアスパラギン酸のモル数／時間／触媒ベツ
トのとして及びアスパラギン酸のモル数／時間／湿つ
た大腸菌のkgとして示す。例えば、ポリアゼチジン，細
胞ペーストおよびイオン交換ビーズを用いた実験4dで
は、280nmに於ける光学密度は25℃で60分後に0.43から
0.32に低下した。計算は次の通りである： 大腸菌ATCC11303を含有するポリウレタンフオーム（パ
イポール ）の37℃に於けるＬ−アスパルターゼ性能を
示す文献中にあるデータから計算した値もまた、第１表
に示す。ここでは126gの細胞を有する0.777のベツト
は、2.0の1.0Mフマル酸塩を100％Ｌ−アスパラギン酸
塩に37℃で変換するために32分間要した。これらの研究
者らはまた、1.5Mフマル酸塩の平均変換速度は、1.0Mフ
マル酸塩よりも８％低いことを報告している。彼らはま
た、37℃における速度は、25℃の1.67倍であることも観
察した。このように、我々のデータ（25℃、1.5Mフマル
酸塩）と比較した彼らのＬ−アスパラギン酸生成速度の
正しい評価は、次の通りである： これらの値を本発明の例で得られたデータと比較する
と、ポリウレタンフオームシステムより本方法の優位が
示される。
例７ Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−アスパラギン酸アンモ
ニウムとして）の連続生成 例4dからの湿つたビーズの一部5.0mlを、直径0.7cm×15
cmのカバーをかぶせたガラスカラムの中に入れた。カラ
ム温度は、37℃に保つた。0.02m MgSO4を含有する1.5M
フマル酸アンモニウムの脱イオン水の溶液（すべてpH8.
5）を、連続的に0.5ml/分の速度でビーズのベツトを通
した。溶出生成物溶液試料を定期的にとり、実施例６に
記載したように脱イオン水で1/1000希釈としてＬ−アス
パラギン酸塩含量を分析した。溶出液の大部分を集めた
が、カラムに戻さなかつた。次のデータは、50日間の連
続運転にわたつて被覆ビーズのＬ−アスパルターゼ活性
は保持され本質的に変化しないことを示す。
ニウムとして）の連続生成 例4dからの湿つたビーズの一部5.0mlを、直径0.7cm×15
cmのカバーをかぶせたガラスカラムの中に入れた。カラ
ム温度は、37℃に保つた。0.02m MgSO4を含有する1.5M
フマル酸アンモニウムの脱イオン水の溶液（すべてpH8.
5）を、連続的に0.5ml/分の速度でビーズのベツトを通
した。溶出生成物溶液試料を定期的にとり、実施例６に
記載したように脱イオン水で1/1000希釈としてＬ−アス
パラギン酸塩含量を分析した。溶出液の大部分を集めた
が、カラムに戻さなかつた。次のデータは、50日間の連
続運転にわたつて被覆ビーズのＬ−アスパルターゼ活性
は保持され本質的に変化しないことを示す。
6.0ベツト容量／時間（5.0mlの触媒ベツトを0.5ml/分で
通る）での62.5％変換率に於けるＬ−アスパラギン酸の
生成速度は次の通りである： 37℃で１時間にわたつて同じカラムを4.0ベツト容量／
時間（5.0mlの触媒ベツトを0.33ml/分で通る）の速度で
動かすと、フマル酸塩（1.5M）の平均変換率は80.0％で
あつた。これは次に該当する： それぞれ6.0及び4.0ベツト容量／時間に対応するこれら
の変換率62.5％及び80.0％に基づく、100％変換を達成
するのに必要な流速の図式的方法による控え目の概算
は、 である。1.5ベツト容量／時間でのＬ−ASP生成速度は： これらの値（1.5ベツト容量／時間での100％変換）およ
び は、ｋ−カラジーナンゲル上に不動化した大腸菌ATCC11
303細胞のカラムの連続操作で報告された100％変換のた
めの1.1ベツト容量／時間および の値よりも著しく良い。
通る）での62.5％変換率に於けるＬ−アスパラギン酸の
生成速度は次の通りである： 37℃で１時間にわたつて同じカラムを4.0ベツト容量／
時間（5.0mlの触媒ベツトを0.33ml/分で通る）の速度で
動かすと、フマル酸塩（1.5M）の平均変換率は80.0％で
あつた。これは次に該当する： それぞれ6.0及び4.0ベツト容量／時間に対応するこれら
の変換率62.5％及び80.0％に基づく、100％変換を達成
するのに必要な流速の図式的方法による控え目の概算
は、 である。1.5ベツト容量／時間でのＬ−ASP生成速度は： これらの値（1.5ベツト容量／時間での100％変換）およ
び は、ｋ−カラジーナンゲル上に不動化した大腸菌ATCC11
303細胞のカラムの連続操作で報告された100％変換のた
めの1.1ベツト容量／時間および の値よりも著しく良い。
本発明のこれ以上の変化では、例７で得られたＬ−アス
パラギン酸アンモニウム水溶液は、直接に使用しうるこ
とが予想される。例えば、乾燥固体アスパラギン酸の回
収もしくは分離なしで、アスパラギン酸のアミンのベン
ゾイルオキシカーバメイトを形成するためのベンジルク
ロロホルメイトとの反応のために使用し得、このカーバ
メイトは商業上重要な甘味剤Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フ
エニルアラニン メチルエステル製造の重要な中間体で
ある。現在ではこのベンゾイルオキシカーバメイトは、
乾燥結晶固体Ｌ−アスパラギン酸から出発して作られ
る。前記の酸を、次の反応にしたがつたベンジルクロロ
ホルメイトとの反応の前に、水酸化ナトリウム水溶液中
に溶解する： 本発明に従つたフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギ
ン酸アンモニウムに変換するための不動化全細胞の酵素
法は、直接的に塩基性水性生成物の流体、例えば1.5モ
ルの98.5％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を提供
する。該溶液は、アンモニアの除去の後、所望のベンジ
ル（もしくは他の）オキシカーバメイトの水溶液を作る
ためのベンジルクロロホルメイト（もしくは他のクロロ
ホルメイト）との反応における直接使用に適している。
これは、乾燥アスパラギン酸結晶の単離の必要性及び時
間及びこれらに付随した費用を避けることを可能にさせ
る。例えば、実施例７のＬ−アスパラギン酸アンモニウ
ム溶液からの乾燥Ｌ−アスパラギン酸結晶の単離は、一
般に次のことが必要である。
パラギン酸アンモニウム水溶液は、直接に使用しうるこ
とが予想される。例えば、乾燥固体アスパラギン酸の回
収もしくは分離なしで、アスパラギン酸のアミンのベン
ゾイルオキシカーバメイトを形成するためのベンジルク
ロロホルメイトとの反応のために使用し得、このカーバ
メイトは商業上重要な甘味剤Ｌ−アスパラチル−Ｌ−フ
エニルアラニン メチルエステル製造の重要な中間体で
ある。現在ではこのベンゾイルオキシカーバメイトは、
乾燥結晶固体Ｌ−アスパラギン酸から出発して作られ
る。前記の酸を、次の反応にしたがつたベンジルクロロ
ホルメイトとの反応の前に、水酸化ナトリウム水溶液中
に溶解する： 本発明に従つたフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギ
ン酸アンモニウムに変換するための不動化全細胞の酵素
法は、直接的に塩基性水性生成物の流体、例えば1.5モ
ルの98.5％Ｌ−アスパラギン酸アンモニウム溶液を提供
する。該溶液は、アンモニアの除去の後、所望のベンジ
ル（もしくは他の）オキシカーバメイトの水溶液を作る
ためのベンジルクロロホルメイト（もしくは他のクロロ
ホルメイト）との反応における直接使用に適している。
これは、乾燥アスパラギン酸結晶の単離の必要性及び時
間及びこれらに付随した費用を避けることを可能にさせ
る。例えば、実施例７のＬ−アスパラギン酸アンモニウ
ム溶液からの乾燥Ｌ−アスパラギン酸結晶の単離は、一
般に次のことが必要である。
（１） pH2.8でＬ−ASPを沈殿させるための、約0.7乃
至0.8モルのH2SO4を用いた、1.5モルのＬ−アスパラギ
ン酸アンモニウム生成物（Ｌ−ASP）の流体の酸性化； （２） Ｌ−ASP生成物流体は98.5％のＬ−ASP（残りは
フマル酸アンモニウム）を含有しているけれども、Ｌ−
ASPの沈殿物の水洗により固型Ｌ−ASPはたつたの89〜93
％の収率でしか得られない。母液中のＬ−ASPの５〜９
％の保持は、Ｌ−ASPの値から考えてかなりの損失であ
る； （３） 沈殿したＬ−ASP結晶の続いての乾燥もまた高
価である（１ポンド当たり約５〜10セントと概算され
る）。
至0.8モルのH2SO4を用いた、1.5モルのＬ−アスパラギ
ン酸アンモニウム生成物（Ｌ−ASP）の流体の酸性化； （２） Ｌ−ASP生成物流体は98.5％のＬ−ASP（残りは
フマル酸アンモニウム）を含有しているけれども、Ｌ−
ASPの沈殿物の水洗により固型Ｌ−ASPはたつたの89〜93
％の収率でしか得られない。母液中のＬ−ASPの５〜９
％の保持は、Ｌ−ASPの値から考えてかなりの損失であ
る； （３） 沈殿したＬ−ASP結晶の続いての乾燥もまた高
価である（１ポンド当たり約５〜10セントと概算され
る）。
本発明にしたがつた水性アンモニウムＬ−ASP生成物の
直接的使用は、段階（１）〜（３）に固有の不便を除去
する。アンモニウムＬ−ASP生成物流体の調整は、最適
の結果を得るのに適している。例えば、水酸化ナトリウ
ム（アンモニウムＬ−ASP1モル当り0.5乃至2.0モルのオ
ーダーで）の添加は、NH4 +のNH3との置換を生じ、NH3は
沸騰により除去でき、さらにフマル酸アンモニウムを作
るのに使用できる。NH4 +イオンのほとんどは、クロロホ
ルメイト反応を促進するために除去される。
直接的使用は、段階（１）〜（３）に固有の不便を除去
する。アンモニウムＬ−ASP生成物流体の調整は、最適
の結果を得るのに適している。例えば、水酸化ナトリウ
ム（アンモニウムＬ−ASP1モル当り0.5乃至2.0モルのオ
ーダーで）の添加は、NH4 +のNH3との置換を生じ、NH3は
沸騰により除去でき、さらにフマル酸アンモニウムを作
るのに使用できる。NH4 +イオンのほとんどは、クロロホ
ルメイト反応を促進するために除去される。
本発明は、大腸菌の固定化もしくはＬ−アスパラギン酸
製造のためのこのような固定化細胞の使用に限定されな
い。このように、他の細胞は、記載した硬化性ポリマー
物質を用いて一般に同様の方法で固定化され得る。更に
このような固定化細胞の変形例及びその使用を次の例で
例示する。
製造のためのこのような固定化細胞の使用に限定されな
い。このように、他の細胞は、記載した硬化性ポリマー
物質を用いて一般に同様の方法で固定化され得る。更に
このような固定化細胞の変形例及びその使用を次の例で
例示する。
例８ ポリアゼチジンゲルで固定化したシユウドモナス
ダカンエの固定化を介したＬ−アラニンの製造 シユウドモナス ダカンエ（Pseudomonas dacunhae）AT
CC21192を、 ペプトン（バクト−デイフコ） 9.0g/ カゼイン水解物（カザミノ酸、デイフコ） 2.0g/ KH2PO4 0.5g/ MgSO4・7H2O 0.1g/ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 15.0g/ pHはNH4OHで7.2に調整 の培地で培養した。醗酵は、好気性条件下で、23時間、
30℃、300回転／分でおこなつた。3.62g（湿重量）の細
胞ペーストと3.6gのポリアゼチジン水溶液（ヘルクレス
ポリカツプ 172）との混合物を、木製の棒を用いて手
で25℃で均質に撹拌した。この混合物を、3.6gのアンバ
ーライト IRA938イオン交換ビーズ（ローム＆ハス）上
に分散させた。前記のビーズは、85％より多いビーズと
会合している湿気を除去するために、あらかじめ25〜30
℃で60時間空気中乾燥した。ビーズ上の混合物の薄いフ
イルムを25℃で24時間空気中で乾燥させた。得られた自
由に流動するビーズは、体積20mlを占めた。これらのビ
ーズを５容量の普通の塩水で洗浄し、そのうちの一部18
mlを、37℃に保たれたpH5.5（H2SO4で調整）の1.5Mアス
パラギン酸アンモニウム溶液0.5を含有するフラスコ
中に入れた。全部の混合物を48時間撹拌し、一方pHは必
要なとき硫酸の添加により保持した。
ダカンエの固定化を介したＬ−アラニンの製造 シユウドモナス ダカンエ（Pseudomonas dacunhae）AT
CC21192を、 ペプトン（バクト−デイフコ） 9.0g/ カゼイン水解物（カザミノ酸、デイフコ） 2.0g/ KH2PO4 0.5g/ MgSO4・7H2O 0.1g/ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 15.0g/ pHはNH4OHで7.2に調整 の培地で培養した。醗酵は、好気性条件下で、23時間、
30℃、300回転／分でおこなつた。3.62g（湿重量）の細
胞ペーストと3.6gのポリアゼチジン水溶液（ヘルクレス
ポリカツプ 172）との混合物を、木製の棒を用いて手
で25℃で均質に撹拌した。この混合物を、3.6gのアンバ
ーライト IRA938イオン交換ビーズ（ローム＆ハス）上
に分散させた。前記のビーズは、85％より多いビーズと
会合している湿気を除去するために、あらかじめ25〜30
℃で60時間空気中乾燥した。ビーズ上の混合物の薄いフ
イルムを25℃で24時間空気中で乾燥させた。得られた自
由に流動するビーズは、体積20mlを占めた。これらのビ
ーズを５容量の普通の塩水で洗浄し、そのうちの一部18
mlを、37℃に保たれたpH5.5（H2SO4で調整）の1.5Mアス
パラギン酸アンモニウム溶液0.5を含有するフラスコ
中に入れた。全部の混合物を48時間撹拌し、一方pHは必
要なとき硫酸の添加により保持した。
この期間の最後に、HPLC（uNH2ボンダパクカラム、ウオ
ータース社；溶出液CH3CN25％、5mMKHPO4 pH4.4 75％）
による液体の分析は、Ｌ−アスパラギン酸が98％収率で
Ｌ−アラニンを形成するように脱カルボキシ化さたこと
を示した。
ータース社；溶出液CH3CN25％、5mMKHPO4 pH4.4 75％）
による液体の分析は、Ｌ−アスパラギン酸が98％収率で
Ｌ−アラニンを形成するように脱カルボキシ化さたこと
を示した。
例９ ポリアゼチジンゲルで固定化された巨大菌を含有
するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 巨大菌ATCC14945を先に記載（米国特許第3,446,705号）
した如き好気性条件下で培養した。10.5g（湿重量）の
細胞物質と10.5gのポリアゼチジン水溶液（ヘルクレス
ポリカツプ 172）との混合物を、木製の棒を用いて
手で25℃で均質になるまで撹拌した。この混合物を9.8g
のアンバーライト IRA938イオン交換ビーズ（ローム＆
ハス）上に分散させた。前記のビーズは前もつて25〜30
℃で60時間空気乾燥し、ビーズから＞85％の湿気を除去
しておいた。混合物の薄層を、25℃で24時間空気乾燥さ
せた。得られた自由に流動するビーズは13.1gの重さで
あり、且つ体積53mlを占めた。1gのフリーな細胞に対応
するこれらのビーズの一部1247mgを、ペニシリンアシラ
ーゼ活性の測定に用いた。６−アミノペニシラニツク酸
生成物を、高圧液体クロマトグラフイ（HPLC）により定
量した。固定化製造物の活性は、細胞ペースト1g当たり
19.7μモル／時間であつた。この値は、フリーな細胞の
活性の67％であつた。
するペニシリン−Ｇアシラーゼの製造 巨大菌ATCC14945を先に記載（米国特許第3,446,705号）
した如き好気性条件下で培養した。10.5g（湿重量）の
細胞物質と10.5gのポリアゼチジン水溶液（ヘルクレス
ポリカツプ 172）との混合物を、木製の棒を用いて
手で25℃で均質になるまで撹拌した。この混合物を9.8g
のアンバーライト IRA938イオン交換ビーズ（ローム＆
ハス）上に分散させた。前記のビーズは前もつて25〜30
℃で60時間空気乾燥し、ビーズから＞85％の湿気を除去
しておいた。混合物の薄層を、25℃で24時間空気乾燥さ
せた。得られた自由に流動するビーズは13.1gの重さで
あり、且つ体積53mlを占めた。1gのフリーな細胞に対応
するこれらのビーズの一部1247mgを、ペニシリンアシラ
ーゼ活性の測定に用いた。６−アミノペニシラニツク酸
生成物を、高圧液体クロマトグラフイ（HPLC）により定
量した。固定化製造物の活性は、細胞ペースト1g当たり
19.7μモル／時間であつた。この値は、フリーな細胞の
活性の67％であつた。
例10 ポリアゼチジンゲルで固定化した大腸菌を含有す
るベニシリン−Ｇアシラーゼの製造 大腸菌ATCC9637を、Sato他,Eur.J.Appl.Microbiol.,2:1
53〜160（1976）により報告されたように好気的に培養
した。20.7g（湿重量）の細胞ペーストと20.7gのポリア
ゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカツプ 172）との混
合物を、木製棒を用いて手で25℃で均質になるまで撹拌
した。この混合物を19.3gのアンバーライト IRA938イ
オン交換ビーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。前記
のビーズは、ビーズと会合している＞85％の湿気を除く
ために、前もつて25〜30℃で60時間空気乾燥した。混合
物の薄いフイルムを25℃で24時間空気乾燥させた。得ら
れた自由に流動するビーズは27.4gの重さがあり、体積9
5mlを占めた。1gのフリーの細胞に対応するこれらのビ
ーズの一部1325mgで、ペニシリンアシラーゼ活性を測定
した。６−アミノペニシラニツク酸生成物を、高圧液体
クロマトグラフイ（HPLC）により定量した。不動化生成
物の活性は細胞ペースト1g当たり53.6μモル／時間であ
り、これはフリーな細胞活性の99％であつた。
るベニシリン−Ｇアシラーゼの製造 大腸菌ATCC9637を、Sato他,Eur.J.Appl.Microbiol.,2:1
53〜160（1976）により報告されたように好気的に培養
した。20.7g（湿重量）の細胞ペーストと20.7gのポリア
ゼチジン水溶液（ヘルクレスポリカツプ 172）との混
合物を、木製棒を用いて手で25℃で均質になるまで撹拌
した。この混合物を19.3gのアンバーライト IRA938イ
オン交換ビーズ（ローム＆ハス）上に分散させた。前記
のビーズは、ビーズと会合している＞85％の湿気を除く
ために、前もつて25〜30℃で60時間空気乾燥した。混合
物の薄いフイルムを25℃で24時間空気乾燥させた。得ら
れた自由に流動するビーズは27.4gの重さがあり、体積9
5mlを占めた。1gのフリーの細胞に対応するこれらのビ
ーズの一部1325mgで、ペニシリンアシラーゼ活性を測定
した。６−アミノペニシラニツク酸生成物を、高圧液体
クロマトグラフイ（HPLC）により定量した。不動化生成
物の活性は細胞ペースト1g当たり53.6μモル／時間であ
り、これはフリーな細胞活性の99％であつた。
例 11 フルクトースの濃いコーンシロツプ（High F
ructose Corn Syrup）製造用のグルコースイソメラーゼ
活性を含有するアルスロバクター種の固定化 アルスロバクター種（Arthrobacter species）ATCC2174
8を液中好気性条件下で成長させ、細胞を取り出した。
該細胞は、60℃で細胞ペースト1g（湿重量）当たり420
μモル／時間のグルコースイソメラーゼ活性を有した。
ructose Corn Syrup）製造用のグルコースイソメラーゼ
活性を含有するアルスロバクター種の固定化 アルスロバクター種（Arthrobacter species）ATCC2174
8を液中好気性条件下で成長させ、細胞を取り出した。
該細胞は、60℃で細胞ペースト1g（湿重量）当たり420
μモル／時間のグルコースイソメラーゼ活性を有した。
47gのポリカツプ 172に47g（湿重量）のアルスロバク
ター種ATCC21748を加え、そして混合物を５〜10分間激
しく撹拌した。ポリカツプ ／細胞混合物を次に撹拌し
ながら46.4gの空気乾燥したIRA 938ビーズにゆつくり
加え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
ター種ATCC21748を加え、そして混合物を５〜10分間激
しく撹拌した。ポリカツプ ／細胞混合物を次に撹拌し
ながら46.4gの空気乾燥したIRA 938ビーズにゆつくり
加え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
5mlのアルスロバクター種ATCC21748不動化ビーズを含有
するフラスコに、50mlの0.2Mリン酸塩緩衝液,pH7.5,10m
M MgSO4,1mM CoCl2を加え、そして溶液を撹拌しながら6
0℃まで加熱した。450mgのα−Ｄ−グルコースをフラス
コに加え、そしてフラスコを60℃ １時間、150rpmで培
養振とう器中に入れた。固定化アルスロバクター種ATCC
21748のグルコースイソメラーゼ活性は、システイン/H2
SO4反応〔Dische,Biochim.Biophys.Acta,39,140（196
0）〕により決定すると、60℃に於いては細胞ペースト1
g（湿重量）当たり530μモル／時間であつた。
するフラスコに、50mlの0.2Mリン酸塩緩衝液,pH7.5,10m
M MgSO4,1mM CoCl2を加え、そして溶液を撹拌しながら6
0℃まで加熱した。450mgのα−Ｄ−グルコースをフラス
コに加え、そしてフラスコを60℃ １時間、150rpmで培
養振とう器中に入れた。固定化アルスロバクター種ATCC
21748のグルコースイソメラーゼ活性は、システイン/H2
SO4反応〔Dische,Biochim.Biophys.Acta,39,140（196
0）〕により決定すると、60℃に於いては細胞ペースト1
g（湿重量）当たり530μモル／時間であつた。
10Mlのアルスロバクター種ATCC21748固定化ビーズを、
循環式水浴により60℃に保たれている0.9×30cmのカバ
ーのかかつたガラスカラムに添加した。50mMトリス−塩
酸緩衝液中に250mMグルコース,5mM MgSO4と0.5mM CoCl2
を含有するあらかじめ温めた基質溶液pH7.5を、カラム
に通した。連続操作の６日後、固定化アルスロバクター
種ATCC21748のグルコースイソメラーゼ活性は、60℃で
細胞ペースト 1g（湿重量）当たり280μモル／時間で
あり、37日後ではグルコースイソメラーゼ活性は60℃で
細胞ペースト 1g（湿重量）当たり18μモル／時間であ
つた。
循環式水浴により60℃に保たれている0.9×30cmのカバ
ーのかかつたガラスカラムに添加した。50mMトリス−塩
酸緩衝液中に250mMグルコース,5mM MgSO4と0.5mM CoCl2
を含有するあらかじめ温めた基質溶液pH7.5を、カラム
に通した。連続操作の６日後、固定化アルスロバクター
種ATCC21748のグルコースイソメラーゼ活性は、60℃で
細胞ペースト 1g（湿重量）当たり280μモル／時間で
あり、37日後ではグルコースイソメラーゼ活性は60℃で
細胞ペースト 1g（湿重量）当たり18μモル／時間であ
つた。
例 12 プレドニゾロンもしくは関連するステロイド
を製造するためのステロイドデヒドロゲナーゼ活性を有
するアルスロバクター シンプレツクスの固定化 アルスロバクター シンプレツクス（Arthrobacter sim
plex）ATCC6946を、液中好気性条件下で成長させ、細胞
を取り出した。細胞は、34℃で細胞ペースト 1g（湿重
量）当たり980μモル／時間のΔ−１−デヒドロゲナー
ゼ活性を有していた。
を製造するためのステロイドデヒドロゲナーゼ活性を有
するアルスロバクター シンプレツクスの固定化 アルスロバクター シンプレツクス（Arthrobacter sim
plex）ATCC6946を、液中好気性条件下で成長させ、細胞
を取り出した。細胞は、34℃で細胞ペースト 1g（湿重
量）当たり980μモル／時間のΔ−１−デヒドロゲナー
ゼ活性を有していた。
20gのポリカツプ 172に20gのアルスロバクター シン
プレツクスATCC6946を加え、そして混合物を５〜10分間
激しく撹拌した。次にポリカツプ ／細胞混合物をゆつ
くり18.6gの空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながら加
え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
プレツクスATCC6946を加え、そして混合物を５〜10分間
激しく撹拌した。次にポリカツプ ／細胞混合物をゆつ
くり18.6gの空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながら加
え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
5Mlのアルスロバクター シンプレツクスATCC6946固定
化ビーズを含有するフラスコに36Mlの20mMリン酸塩緩衝
液（pH7.0）を加え、次いで60mgのヒドロコルチゾンを
含有する4Mlのエタノールを加えた。フラスコを、34℃
１時間 150rpmで培養振とう器中に置いた。固定化ア
ルスロバクター シンプレツクスATCC6946のΔ−１−デ
ヒドロゲナーゼ活性は、285nmの吸光度で決定すると
き、34℃で細胞ペースト1g（湿重量）当たり440μモル
／時間であつた。
化ビーズを含有するフラスコに36Mlの20mMリン酸塩緩衝
液（pH7.0）を加え、次いで60mgのヒドロコルチゾンを
含有する4Mlのエタノールを加えた。フラスコを、34℃
１時間 150rpmで培養振とう器中に置いた。固定化ア
ルスロバクター シンプレツクスATCC6946のΔ−１−デ
ヒドロゲナーゼ活性は、285nmの吸光度で決定すると
き、34℃で細胞ペースト1g（湿重量）当たり440μモル
／時間であつた。
例 13 フルクトースの濃いコーンシロツプを製造す
るためのグルコースイソメラーゼ活性を有するストレプ
トマイエス種の固定化 ストレプトマイエス フエオクロモゲネス（Streptomyc
es phaeochromogenes）NRRL B3559を液中好気性条件下
で成長させ、そして細胞を取り出した。細胞は60℃で、
細胞ペースト1g（湿重量）当たり7.7μモル／分のグル
コースイソメラーゼ活性を有していた。64.5gのポリカ
ツプ 172に64.5gのストレプトマイエス フエオクロモ
ゲネスNRRL B3559を加え、そして混合物を５〜10分激し
く撹拌した。次にポリカツプ ／細胞混合物を、60.0g
の空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながらゆつくり加
え、そして得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
るためのグルコースイソメラーゼ活性を有するストレプ
トマイエス種の固定化 ストレプトマイエス フエオクロモゲネス（Streptomyc
es phaeochromogenes）NRRL B3559を液中好気性条件下
で成長させ、そして細胞を取り出した。細胞は60℃で、
細胞ペースト1g（湿重量）当たり7.7μモル／分のグル
コースイソメラーゼ活性を有していた。64.5gのポリカ
ツプ 172に64.5gのストレプトマイエス フエオクロモ
ゲネスNRRL B3559を加え、そして混合物を５〜10分激し
く撹拌した。次にポリカツプ ／細胞混合物を、60.0g
の空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながらゆつくり加
え、そして得られたビーズを室温で24時間乾燥させた。
10Mlのストレプトマイエス フエオクロモゲネスNRRL B
3559不動化ビーズを、循環式水浴で60℃に保つた0.9×3
0cmのカバーをかけたガラスカラムに添加した。250mMグ
ルコース,100mM Na2SO3,10mM MgSO4および1mM CoCl2を
含有しHClでpH7.0に調整されたあらかじめ温めた基質溶
液を、流速28ml/時間でカラムに通した。固定化ストレ
プトマイエス フエオクロモゲネス NRRL B3559のグ
ルコースイソメラーゼ活性は、システイン/H2SO4反応
（Dische他、上を見よ）により決定すると、60℃で細胞
ペースト1g（湿重量）当たり7.7μモル／分であつた。
3559不動化ビーズを、循環式水浴で60℃に保つた0.9×3
0cmのカバーをかけたガラスカラムに添加した。250mMグ
ルコース,100mM Na2SO3,10mM MgSO4および1mM CoCl2を
含有しHClでpH7.0に調整されたあらかじめ温めた基質溶
液を、流速28ml/時間でカラムに通した。固定化ストレ
プトマイエス フエオクロモゲネス NRRL B3559のグ
ルコースイソメラーゼ活性は、システイン/H2SO4反応
（Dische他、上を見よ）により決定すると、60℃で細胞
ペースト1g（湿重量）当たり7.7μモル／分であつた。
例 14 フエニルアラニンを製造するためのフエニルア
ラニン アンモニア リアーゼの濃いロドスポリジウム
種の固定化 ロドスポリジウム トルロイデス（Rhodosporidium tor
uloides）ATCC10788を液中好気性条件下で成長させ、そ
して細胞を取り出した。細胞は30℃で細胞ペースト1g
（湿重量）当たり112μモル／時間のＬ−フエニルアラ
ニンアンモニア−リアーゼ活性を有していた。
ラニン アンモニア リアーゼの濃いロドスポリジウム
種の固定化 ロドスポリジウム トルロイデス（Rhodosporidium tor
uloides）ATCC10788を液中好気性条件下で成長させ、そ
して細胞を取り出した。細胞は30℃で細胞ペースト1g
（湿重量）当たり112μモル／時間のＬ−フエニルアラ
ニンアンモニア−リアーゼ活性を有していた。
14.9gのポリカツプ 172に14.9gのロドスポリジウム
トルロイデスATCC10788を加え、そして細胞混合物を５
〜10分間激しく撹拌した。次に、ポリカツプ ／細胞混
合物を13.8gの空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながら
ゆつくり加え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させ
た。
トルロイデスATCC10788を加え、そして細胞混合物を５
〜10分間激しく撹拌した。次に、ポリカツプ ／細胞混
合物を13.8gの空気乾燥IRA 938ビーズに撹拌しながら
ゆつくり加え、得られたビーズを室温で24時間乾燥させ
た。
1Mlのロドスポリジウム トルロイデスATCC10788固定化
ビーズを含有するフラスコに、5Mlの25mMトリス−塩酸
緩衝液（pH8.8）,25mM L−フエニルアラニン,0.005％セ
チルピリジニウム クロライドを加えた。フラスコを、
30℃ １時間 100rpmでダブノフ（Dubnoff）振とう培
養器中に入れた。固定化ロドスポリジウム トルロイデ
スATCC10788のフエニルアラニンアンモニア−リアーゼ
活性は、278nmの吸光度により決定すると、30℃で細胞
ペースト1g（湿重量）当たり10μモル／時間であつた。
ビーズを含有するフラスコに、5Mlの25mMトリス−塩酸
緩衝液（pH8.8）,25mM L−フエニルアラニン,0.005％セ
チルピリジニウム クロライドを加えた。フラスコを、
30℃ １時間 100rpmでダブノフ（Dubnoff）振とう培
養器中に入れた。固定化ロドスポリジウム トルロイデ
スATCC10788のフエニルアラニンアンモニア−リアーゼ
活性は、278nmの吸光度により決定すると、30℃で細胞
ペースト1g（湿重量）当たり10μモル／時間であつた。
例８〜14に示した固定化細胞／ポリマー組成物がどのよ
うに使用されて示した生成物を作るのかは、先行文献か
ら明らかである。このように、例８に関して、アスパラ
ギン酸の脱カルボキシル化を介してのＬ−アラニンの生
成は、酵素、Ｌ−アスパルチツク−β−デカルボキシラ
ーゼにより媒介される。この酵素の存在は、Chibata
他、Applied.Microbiology,13巻,5号,638〜645ページ
（1965年）により報告されているように、微生物学の多
数の概論でよく知られている。これは、クロストリジウ
ム パーフリンジエンス，デスルホビブリオ デスルフ
リカンス，ノカルジア グロベルラ（Nocardia globeru
la），シユードモナス レプチリボラ（Pseudomonas re
ptilivora），アセトバクター種，アクロモバクター（A
cromobacter）種およびアルカリゲネス フエカーリス
により産生される。
うに使用されて示した生成物を作るのかは、先行文献か
ら明らかである。このように、例８に関して、アスパラ
ギン酸の脱カルボキシル化を介してのＬ−アラニンの生
成は、酵素、Ｌ−アスパルチツク−β−デカルボキシラ
ーゼにより媒介される。この酵素の存在は、Chibata
他、Applied.Microbiology,13巻,5号,638〜645ページ
（1965年）により報告されているように、微生物学の多
数の概論でよく知られている。これは、クロストリジウ
ム パーフリンジエンス，デスルホビブリオ デスルフ
リカンス，ノカルジア グロベルラ（Nocardia globeru
la），シユードモナス レプチリボラ（Pseudomonas re
ptilivora），アセトバクター種，アクロモバクター（A
cromobacter）種およびアルカリゲネス フエカーリス
により産生される。
Chibata他は、アラニン形成菌株は、概論に於いてかな
り共通で、アセトバクター，アクロモバクター，シユー
ドモナス，トルラ（Tolura），トルロプシス（Torulops
is），アブシデイア，アスペルギルス，ムコールおよび
オオスポラであると決定した。Chibata他はMeisterと共
同研究者により以前に得られた知識を増加させ、そして
Ｌ−アスパラギン酸を化学量論的にアラニンに変換する
ことを測定した。Ｌ−アスパラギン酸から90％をこえる
Ｌ−アラニンの単離収率が、容易に得られた。この工程
は、米国特許第3,458,400号に生物，シユードモナス
ダカンエおよびアクロモバクター ペスチフアー（Achr
omobacter pestifer）に関連して記載されており、該特
許では水性普通培地中で、乾燥生細胞もしくは細胞フリ
ー抽出物によりＬ−アラニンを製造する工程が特許請求
されている。この工程の変更例は、Chibata他の1975年
米国特許第3,898,128号により、アクルアミドポリマー
中で微生物の固定化によつて特許を受けている。シユー
ドモナス ダカンエからの酵素の使用に於ける他の特許
は、1969年米国特許第3,463,704号で得られた。Shibata
ni他のApplied ＆ Environmental Microbiology,38巻,3
号,359〜364ページ（1979年）による連続研究は、他の
研究者によりＬ−アスパルチツク−β−デカルボキシラ
ーゼを所有するほかの種が見つけられ、そしてこの酵素
の製造はグルタミン酸塩の如きあるアミノ酸の添加によ
り促進できることを示した。改良した製造の連続方法は
Yamamoto他のBiotechnology ＆ Bioengineering,XXII
巻,2045〜2054ページ（1980年）により発表され、この
場合全生物はカラジーナンゲル中に固定化されていた。
さらに、他の研究者はハイポール フオーム中に固定化
したシユードモナス ダカンエおよびアルカリゲネス
フエカーリスからのアラニンの製造の研究をおこなつた
〔Fusee他、American Society for Microbiology Abstr
acts,ダラス（1980年３月）〕。
り共通で、アセトバクター，アクロモバクター，シユー
ドモナス，トルラ（Tolura），トルロプシス（Torulops
is），アブシデイア，アスペルギルス，ムコールおよび
オオスポラであると決定した。Chibata他はMeisterと共
同研究者により以前に得られた知識を増加させ、そして
Ｌ−アスパラギン酸を化学量論的にアラニンに変換する
ことを測定した。Ｌ−アスパラギン酸から90％をこえる
Ｌ−アラニンの単離収率が、容易に得られた。この工程
は、米国特許第3,458,400号に生物，シユードモナス
ダカンエおよびアクロモバクター ペスチフアー（Achr
omobacter pestifer）に関連して記載されており、該特
許では水性普通培地中で、乾燥生細胞もしくは細胞フリ
ー抽出物によりＬ−アラニンを製造する工程が特許請求
されている。この工程の変更例は、Chibata他の1975年
米国特許第3,898,128号により、アクルアミドポリマー
中で微生物の固定化によつて特許を受けている。シユー
ドモナス ダカンエからの酵素の使用に於ける他の特許
は、1969年米国特許第3,463,704号で得られた。Shibata
ni他のApplied ＆ Environmental Microbiology,38巻,3
号,359〜364ページ（1979年）による連続研究は、他の
研究者によりＬ−アスパルチツク−β−デカルボキシラ
ーゼを所有するほかの種が見つけられ、そしてこの酵素
の製造はグルタミン酸塩の如きあるアミノ酸の添加によ
り促進できることを示した。改良した製造の連続方法は
Yamamoto他のBiotechnology ＆ Bioengineering,XXII
巻,2045〜2054ページ（1980年）により発表され、この
場合全生物はカラジーナンゲル中に固定化されていた。
さらに、他の研究者はハイポール フオーム中に固定化
したシユードモナス ダカンエおよびアルカリゲネス
フエカーリスからのアラニンの製造の研究をおこなつた
〔Fusee他、American Society for Microbiology Abstr
acts,ダラス（1980年３月）〕。
本発明は、以前に使用した細胞組成物の代わりにアスパ
ラギン酸からＬ−アラニンを製造するために例示した細
胞／ポリマー組成物の使用を意図している。
ラギン酸からＬ−アラニンを製造するために例示した細
胞／ポリマー組成物の使用を意図している。
多量の研究が、酵素ペニシリンアシラーゼの固定化に関
連しても以前になされた。例えば、Biochimie,62:317〜
321（1981）を参照。Marconi他はセルローストリアセテ
ート繊維中にペニシリンアシラーゼを固定化し〔Biotec
hnology and Bioengineering,22:735〜756（1980）;Bio
technology and Bioengineering,21:1057〜1073（197
9）〕、そして米国特許のいくつかは酵素固定化を問題
としていた：米国特許第3,278,391号；第3,116,218号；
第3,190,586号；第3,446,705号；第3,622,462号；第3,7
36,230号；第3,766,009号；第3,801,962号；第3,883,39
4号；第3,900,488号；第3,499,909号；第3,736,230号；
第4,001,264号；第4,113,566号および第4,230,804号。
連しても以前になされた。例えば、Biochimie,62:317〜
321（1981）を参照。Marconi他はセルローストリアセテ
ート繊維中にペニシリンアシラーゼを固定化し〔Biotec
hnology and Bioengineering,22:735〜756（1980）;Bio
technology and Bioengineering,21:1057〜1073（197
9）〕、そして米国特許のいくつかは酵素固定化を問題
としていた：米国特許第3,278,391号；第3,116,218号；
第3,190,586号；第3,446,705号；第3,622,462号；第3,7
36,230号；第3,766,009号；第3,801,962号；第3,883,39
4号；第3,900,488号；第3,499,909号；第3,736,230号；
第4,001,264号；第4,113,566号および第4,230,804号。
全細胞固定化に関する比較的２、３の論文しか用いえな
いことが明らかである。田辺製薬は、ポリアクリルイミ
ドゲル内に包括された細胞のレポートを発行している。
またChibata他（1974年）、ドイツ特許第2,414,128号お
よびMandel他はポリアクリルアミドゲル内への包括を発
表している〔Prikl.Blkhim.Mikrobiol.11:219〜225（19
75）〕。DEAEセルロース上に吸着した巨大菌もしくはア
クロモバクターの固定化全細胞は、東洋醸造により使用
されており、Fujii他の日本特許第73 99393号及びSato
他のEur.J.Applied Microbiology,２:153〜160（1976）
は、ペニシリンアシラーゼを高活性で有する固定化大腸
菌の使用によるペニシリン−Ｇからの６−APAの製造を
報告している。
いことが明らかである。田辺製薬は、ポリアクリルイミ
ドゲル内に包括された細胞のレポートを発行している。
またChibata他（1974年）、ドイツ特許第2,414,128号お
よびMandel他はポリアクリルアミドゲル内への包括を発
表している〔Prikl.Blkhim.Mikrobiol.11:219〜225（19
75）〕。DEAEセルロース上に吸着した巨大菌もしくはア
クロモバクターの固定化全細胞は、東洋醸造により使用
されており、Fujii他の日本特許第73 99393号及びSato
他のEur.J.Applied Microbiology,２:153〜160（1976）
は、ペニシリンアシラーゼを高活性で有する固定化大腸
菌の使用によるペニシリン−Ｇからの６−APAの製造を
報告している。
種々の他の変更もまた本発明から離れることなしになし
得、本発明の範囲は特許請求の範囲で定義されると理解
される。
得、本発明の範囲は特許請求の範囲で定義されると理解
される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 33/02 9452−4Ｂ 37/06 9452−4Ｂ (72)発明者 ルイス・エル・ウツド アメリカ合衆国ステイト・オブ・メリ−ラ ンド20854ロツクヴイレ・ゲインズバ−ロ ウ・ロ−ド11760 (56)参考文献 特開 昭51−150600（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−79094（ＪＰ，Ａ) 特公 昭48−32347（ＪＰ，Ｂ１)
Claims (7)
- 【請求項１】不溶性架橋ポリマーとこれにより固定化さ
れた酵素活性含有微生物細胞からなる組成物であって、
該微生物細胞が硬化性ポリアゼチジンプレポリマーの硬
化によって得られる固定化不溶性架橋ポリマーによって
固定され、該ポリマーは微生物細胞の酵素活性が著しく
減弱する温度より低い温度で硬化されたものであり、細
胞／架橋ポリマーがかたい固体状不活性支持体上の被膜
を構成する、ことを特徴とする前記組成物。 - 【請求項２】前記細胞がＬ−アスパルターゼ活性を有す
る大腸菌細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の組成物。 - 【請求項３】前記細胞がシュードモナス ダカンエ（Ps
eudomonas dacunhae），巨大菌（Bacillus megateriu
m），アルスロバクター種（Arthrobacter species），
アルスロバクター シンプレックス（Arthrobacter sim
plex），ストレプトマイセス フェオクロモゲネス（St
reptomyces phaeochromogenes）もしくはロドスポリジ
ウム トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）の
微生物細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の組成物。 - 【請求項４】前記支持体が粒子状支持体であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の組成物。 - 【請求項５】不溶性架橋ポリマーとこれにより固定され
た酵素活性含有微生物細胞からなり且つかたい固体状不
活性支持体上の被膜を構成する組成物の製造方法であっ
て、 不溶性架橋ポリマーに硬化可能なポリアゼチジンプレポ
リマーと該微生物細胞の水性分散液とを混合し、該混合
物中のプレポリマーを微生物細胞の酵素活性が著しく減
弱する温度より低い温度で被膜状に硬化することを含む
前記方法。 - 【請求項６】前記混合物を、被膜として支持体上に塗布
した後で硬化することを特徴とする特許請求の範囲第５
項に記載の方法。 - 【請求項７】被膜を乾燥させることを特徴とする特許請
求の範囲第５又は第６項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/358,784 US4436813A (en) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | Immobilized microbial cell composition for making L-aspartic acid |
| US358784 | 1982-03-16 | ||
| US465551 | 1983-02-10 | ||
| US06/465,551 US4732851A (en) | 1982-03-16 | 1983-02-10 | Immobilization of cells with a polyazetidine prepolymer |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3250122A Division JPH082311B2 (ja) | 1982-03-16 | 1991-06-25 | ポリアゼチジンポリマー固定化微生物細胞による有用物質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58170480A JPS58170480A (ja) | 1983-10-07 |
| JPH0771490B2 true JPH0771490B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=27000196
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58044041A Expired - Lifetime JPH0771490B2 (ja) | 1982-03-16 | 1983-03-16 | 固定化微生物細胞およびその製造方法 |
| JP3250122A Expired - Lifetime JPH082311B2 (ja) | 1982-03-16 | 1991-06-25 | ポリアゼチジンポリマー固定化微生物細胞による有用物質の製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3250122A Expired - Lifetime JPH082311B2 (ja) | 1982-03-16 | 1991-06-25 | ポリアゼチジンポリマー固定化微生物細胞による有用物質の製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
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