JPH0534949B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0534949B2 JPH0534949B2 JP60292427A JP29242785A JPH0534949B2 JP H0534949 B2 JPH0534949 B2 JP H0534949B2 JP 60292427 A JP60292427 A JP 60292427A JP 29242785 A JP29242785 A JP 29242785A JP H0534949 B2 JPH0534949 B2 JP H0534949B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- hbsag
- serum
- cell
- surface antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
（HBsAg）を著量産生しかつ無血清培養すること
のできるヒト肝癌由来の変異株huGK−14に関す
る。
（HBsAg）を著量産生しかつ無血清培養すること
のできるヒト肝癌由来の変異株huGK−14に関す
る。
従来の技術
Ｂ型肝炎ウイルス（以下HBVという）の表面
抗原はBlumbergらにより、1964年オーストラリ
ア原住民の血清から発見された。
抗原はBlumbergらにより、1964年オーストラリ
ア原住民の血清から発見された。
さらにこのHBVの表面抗原は感染性のある
HBVのDane粒子の外被膜として発見されるに至
り、HBVの表面抗原HBsAgと定義された。
HBVのDane粒子の外被膜として発見されるに至
り、HBVの表面抗原HBsAgと定義された。
表面抗原HBsAgの発見により、HBVの存在と
病気との関連について研究が進み、HBVはヒト
のBB型肝炎を起すウイルスとして、知られる様
になつた。
病気との関連について研究が進み、HBVはヒト
のBB型肝炎を起すウイルスとして、知られる様
になつた。
このHBVは感染力が強く、母親から子供への
感染が顕著であるが、輸血を要する患者や医療従
事者で血液に接触する機会の多い外科系医師、看
護婦、検査技師等にもしばしば感染する。HBV
に感染すると、急性および慢性肝炎になつたり、
慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行したりするの
で、大きな医学上の問題となつている。
感染が顕著であるが、輸血を要する患者や医療従
事者で血液に接触する機会の多い外科系医師、看
護婦、検査技師等にもしばしば感染する。HBV
に感染すると、急性および慢性肝炎になつたり、
慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行したりするの
で、大きな医学上の問題となつている。
HBVに対する研究は進み、HBVに於いては
HBsAgのほかに内部抗原（HBcAg）更にｅ抗原
（HBeAg）があり、また感染者に於いては、こ
れ等に対するHBs抗体、HBe抗体と言つた抗体
をもつことも知られた。
HBsAgのほかに内部抗原（HBcAg）更にｅ抗原
（HBeAg）があり、また感染者に於いては、こ
れ等に対するHBs抗体、HBe抗体と言つた抗体
をもつことも知られた。
今日、HBsAgがHBVの感染を予防し得ること
が知られている。
が知られている。
既に、キヤリヤー（不顕性感染者）の血液を原
料としたHBsAgから成るワクチンの研究がなさ
れ、実用化の段階に達しようとしている。通常、
キヤリヤーの血液の中には、粒子状のHBsAgお
よび42nmの直径を有するDane粒子とHBsAgに
対する抗体も見い出される。
料としたHBsAgから成るワクチンの研究がなさ
れ、実用化の段階に達しようとしている。通常、
キヤリヤーの血液の中には、粒子状のHBsAgお
よび42nmの直径を有するDane粒子とHBsAgに
対する抗体も見い出される。
HBsAgはHBVの抗原であつても免疫原性をも
つ、即ちHBs抗体の産生を誘発しうると言われ
ている。HBsAgは約16−25nmの範囲の直径を有
する球状あるいは管状粒子であり、いわゆる
『22nm粒子』の形態をなし、HBVの感染者の血
液中にしばしば見い出される。
つ、即ちHBs抗体の産生を誘発しうると言われ
ている。HBsAgは約16−25nmの範囲の直径を有
する球状あるいは管状粒子であり、いわゆる
『22nm粒子』の形態をなし、HBVの感染者の血
液中にしばしば見い出される。
又HBsAgの22nm粒子は非感染性のウイルス外
被のみから成つており、Dane粒子とは明確に区
別される。
被のみから成つており、Dane粒子とは明確に区
別される。
従つてHBsAgの22nm粒子に対する抗体は、
HBV感染に対して予防効果を有することになり、
この非感染性の小型粒子をワクチンとして有効使
用することが可能となる。
HBV感染に対して予防効果を有することになり、
この非感染性の小型粒子をワクチンとして有効使
用することが可能となる。
発明が解決しようとする問題点
実際には、キヤリヤーの血液からHBsAgの小
型粒子のみを分けて回収し、それをホルマリンと
熱で不活化してワクチンとして使用する。しかし
ながら、この場合、総てキヤリヤーの血液を原料
とするため、原料の確保が不安定で、その供給量
に制約があることから、ヒト血液を原料としない
HBsAgの製造法の研究が精力的になされる様に
なつた。即ち、第２世代のワクチンとして、遺伝
子工学の手法で、大腸菌や酵母にHBVの遺伝子
を組み込んでHBsAgを生産する試み（特開昭58
−109427）や、第三世代のワクチンとして、抗原
決定基に関係するアミノ酸配列を基に化学的に合
成したペプチドによるワクチンの開発が試みられ
ている。
型粒子のみを分けて回収し、それをホルマリンと
熱で不活化してワクチンとして使用する。しかし
ながら、この場合、総てキヤリヤーの血液を原料
とするため、原料の確保が不安定で、その供給量
に制約があることから、ヒト血液を原料としない
HBsAgの製造法の研究が精力的になされる様に
なつた。即ち、第２世代のワクチンとして、遺伝
子工学の手法で、大腸菌や酵母にHBVの遺伝子
を組み込んでHBsAgを生産する試み（特開昭58
−109427）や、第三世代のワクチンとして、抗原
決定基に関係するアミノ酸配列を基に化学的に合
成したペプチドによるワクチンの開発が試みられ
ている。
又、細胞培養によりHBsAgを生産させる方法
についても報告（特開昭56−150020）されてい
る。しかし、これ等の公知のHBsAg生産のため
の細胞培養ははすべて牛胎児血清の添加によつて
行なわれており、その生産量は小量に過ぎない。
についても報告（特開昭56−150020）されてい
る。しかし、これ等の公知のHBsAg生産のため
の細胞培養ははすべて牛胎児血清の添加によつて
行なわれており、その生産量は小量に過ぎない。
又、宿主として大腸菌や酵母を用いた場合、生
産されるHBsAgは免疫原性が低いとの報告もあ
る。
産されるHBsAgは免疫原性が低いとの報告もあ
る。
動物細胞の培養には、通常、培地中に動物の血
清、特に牛胎児血清の添加が必要とされている。
清、特に牛胎児血清の添加が必要とされている。
ところが、血清の添加によつて有用物質の回収
精製が困難になり、その操作に於いて、多大のコ
ストを必要とすることになる。更には、添加する
血清そのものが高価であることから、有用物質の
工業生産に大きな障害となつている。
精製が困難になり、その操作に於いて、多大のコ
ストを必要とすることになる。更には、添加する
血清そのものが高価であることから、有用物質の
工業生産に大きな障害となつている。
これは、HBsAgの生産においても、同様であ
り、HBsAgが無血清培地で生産することが可能
となれば、培地の価格に於いて不利な点をなく
し、回収精製も容易であり、HBsAgの生産に於
ける画期的方法となるものである。
り、HBsAgが無血清培地で生産することが可能
となれば、培地の価格に於いて不利な点をなく
し、回収精製も容易であり、HBsAgの生産に於
ける画期的方法となるものである。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、Ｂ型肝炎に対する予防ワクチン
として有効な抗原を大量に生産すべく研究を行つ
たところ、ヒト肝癌細胞株の中から、adr型
HBVのDNAの一部が組込まれており、HBsAg
を著量生産する変異細胞株huGK−14をクローニ
ングすることに成功した。huGK−14は、先に小
池らによつて樹立されたヒト肝癌細胞株huSP（特
許出願昭58−148774）をHBsAgの産生量の高い
コロニーのセレクトを繰り返し、さらに数多くの
クローニングの結果、huSPと比べて極めて
HBsAg産生量が高く、かつhuSPが高い血清要求
性細胞株であるのに対して無血清でも培養できる
性質を得たものである。
として有効な抗原を大量に生産すべく研究を行つ
たところ、ヒト肝癌細胞株の中から、adr型
HBVのDNAの一部が組込まれており、HBsAg
を著量生産する変異細胞株huGK−14をクローニ
ングすることに成功した。huGK−14は、先に小
池らによつて樹立されたヒト肝癌細胞株huSP（特
許出願昭58−148774）をHBsAgの産生量の高い
コロニーのセレクトを繰り返し、さらに数多くの
クローニングの結果、huSPと比べて極めて
HBsAg産生量が高く、かつhuSPが高い血清要求
性細胞株であるのに対して無血清でも培養できる
性質を得たものである。
本発明のhuGK−14は−196℃にほぼ永久的に
凍結保存が可能であつて、財団法人癌研究会癌研
究所に登録保管されており、領布可能な状態にあ
る。
凍結保存が可能であつて、財団法人癌研究会癌研
究所に登録保管されており、領布可能な状態にあ
る。
次にhuGK−14の細胞学的性質を示す。
(1) ヒト肝癌細胞由来変異株である。
(2) 染色体モード数は51である。
(3) adr型Ｂ肝炎ウイルス表面抗原をコードする
遺伝子を含むDNAフラグメントが、染色体ハ
プロイド当たり約８ケ所組み込まれている。
遺伝子を含むDNAフラグメントが、染色体ハ
プロイド当たり約８ケ所組み込まれている。
(4) adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を著量産生
する。
する。
(5) 細胞は不正円形で上皮性である。
(6) 接着型の細胞である。
(7) 生育温度は36.5±１℃が適している。
(8) 抗原の産生量は、細胞密度が飽和状態に達し
た後急激に増加する。
た後急激に増加する。
(9) 細胞の増殖はDM−160基礎培地に10％以上
の血清を添加したものが適当であるが、無血清
培地のウイリアムスＥ基礎培地でも良好な分裂
増殖を示す。
の血清を添加したものが適当であるが、無血清
培地のウイリアムスＥ基礎培地でも良好な分裂
増殖を示す。
(10) 抗原産生の培地としてはウイリアムスＥ基礎
培地が最も適しており、培地交換のみで長期に
わたり産生物回収が可能である。
培地が最も適しており、培地交換のみで長期に
わたり産生物回収が可能である。
(11) デキサメサゾン添加により、adr型Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原の産生量を増加させることが
できる。
ウイルス表面抗原の産生量を増加させることが
できる。
ちなみにヒト肝癌由来細胞株huSPは、53歳の
日本人の男性の肝癌組織より分離されたhuH−１
細胞系（日本癌学会総会第37回120頁 1978年参
照）から樹立された細胞株であり、その細胞学的
な性質は次の通りである。
日本人の男性の肝癌組織より分離されたhuH−１
細胞系（日本癌学会総会第37回120頁 1978年参
照）から樹立された細胞株であり、その細胞学的
な性質は次の通りである。
１ 細胞由来：ヒト肝細胞癌組織。
２ 細胞の形態：上皮性細胞。
３ 染色体数：染色体モードは69。
４ 細胞の増殖温度：32〜42℃。
５ 凍結保存：−70℃限界なく継代培養可能。
６ 血性要求性：血性要求性が高い牛胎児血清10
％要求する）。
％要求する）。
７ HBウイルスDNA：染色体ハプロイド当た
り約９ケ所に組込まれている。
り約９ケ所に組込まれている。
８ HBウイルスの遊離：認められない。
９ HBsAgの遊離：培養時に培養液中へ多量に
分泌する。
分泌する。
これら２つの細胞株（huGK−14とhuSP）に
は明らかに変異がみられる。
は明らかに変異がみられる。
huGK−14細胞株の培養は、細胞増殖期と抗原
生産期に特徴的に分けられる。即ち細胞分裂増殖
状態にある時（細胞増殖期）のHBsAg産生量は
少なく、細胞密度が飽和状態に達した後（抗原生
産期）HBsAg産生量は急激に増加する（図１参
照）。
生産期に特徴的に分けられる。即ち細胞分裂増殖
状態にある時（細胞増殖期）のHBsAg産生量は
少なく、細胞密度が飽和状態に達した後（抗原生
産期）HBsAg産生量は急激に増加する（図１参
照）。
(イ) 細胞増殖用の培地として適性をみるために、
幾つかの代表的な培地での細胞増殖とそれに血
清添加した場合の増殖を調べた。結果を図２に
示す。細胞の増殖には、10％牛胎児血清
（FCS）添加DM−160培地（極東製薬(株)）が適
当であるが、無血清のウイリアムスＥ基礎培地
でも良好な増殖を示す。
幾つかの代表的な培地での細胞増殖とそれに血
清添加した場合の増殖を調べた。結果を図２に
示す。細胞の増殖には、10％牛胎児血清
（FCS）添加DM−160培地（極東製薬(株)）が適
当であるが、無血清のウイリアムスＥ基礎培地
でも良好な増殖を示す。
(ロ) 抗原用の培地としての適性をみるために、
DM−160培地とウイリアムスＥ培地について
デキサメサゾンを添加した場合と添加しない場
合のHBsAg産生量をみた。結果を表１に示す。
DM−160培地とウイリアムスＥ培地について
デキサメサゾンを添加した場合と添加しない場
合のHBsAg産生量をみた。結果を表１に示す。
表 １
培地 HBsAg産生量（ng／ml）
デキサメサゾン（−）DM−160 990
ウイリアムスＥ 1340
デキサメサゾン（＋）DM−160 1370
ウイリアムスＥ 2400
抗原生産期の培地として血清を添加しないウイ
リアムスＥ培地（GIBCO社）が最適である。ま
たデキサメサゾンは、HBsAgの産生促進物質と
して有効である。デキサメサゾンの添加量は
10-7M〜10-5Mの範囲で良いが10-6M程度が好ま
しい。
リアムスＥ培地（GIBCO社）が最適である。ま
たデキサメサゾンは、HBsAgの産生促進物質と
して有効である。デキサメサゾンの添加量は
10-7M〜10-5Mの範囲で良いが10-6M程度が好ま
しい。
(イ)、(ロ)の結果から細胞増殖の各フエーズの
HBsAg産生量を測定するためにデキサメサゾン
10-6Mを添加したウイリアムスＥ基礎培地で細胞
の増殖とHBsAg産生量の関係をみた。結果を図
１に示す。HBsAgは細胞密度が飽和状態に達し
た後急激に増加している。
HBsAg産生量を測定するためにデキサメサゾン
10-6Mを添加したウイリアムスＥ基礎培地で細胞
の増殖とHBsAg産生量の関係をみた。結果を図
１に示す。HBsAgは細胞密度が飽和状態に達し
た後急激に増加している。
培地中に分泌されたHBsAgの定量は、EIA法
（「酵素免疫測定法」医学書院1982年第２版第１刷
石川英治編P41−P43）に使用する市販のHBsAg
測定キツト（米国ダイナボツト社）によつて測定
することができる。培地の回収は抗原生産期に入
つてから、６日間隔で５回以上可能であり、回収
した培地のHBsAgは2400ng／ml程度の含有量が
ある。
（「酵素免疫測定法」医学書院1982年第２版第１刷
石川英治編P41−P43）に使用する市販のHBsAg
測定キツト（米国ダイナボツト社）によつて測定
することができる。培地の回収は抗原生産期に入
つてから、６日間隔で５回以上可能であり、回収
した培地のHBsAgは2400ng／ml程度の含有量が
ある。
培養後、ロ過して得られた培養ロ液を用いた
HBsAgの精製法としては、限外ロ過膜により10
乃至30倍濃縮後、硫安塩析ないしは超遠心分離を
行ない、その後、塩化セシウムによる平衡遠心
法、庶糖濃度勾配遠心法を組み合わせる方法等が
ある。
HBsAgの精製法としては、限外ロ過膜により10
乃至30倍濃縮後、硫安塩析ないしは超遠心分離を
行ない、その後、塩化セシウムによる平衡遠心
法、庶糖濃度勾配遠心法を組み合わせる方法等が
ある。
血清添加培地では、血清蛋白質が多い為、前記
の膜濃縮が困難であるとともに、その後の各超遠
心工程を数回繰返すと言う煩雑な精製工程を必要
とするが、本発明の細胞株huGK−14の無血清培
養で得られたHBsAgの標品は、血清添加培地の
それと比較して簡単に調整され、かつ満足のいく
精製標品である。
の膜濃縮が困難であるとともに、その後の各超遠
心工程を数回繰返すと言う煩雑な精製工程を必要
とするが、本発明の細胞株huGK−14の無血清培
養で得られたHBsAgの標品は、血清添加培地の
それと比較して簡単に調整され、かつ満足のいく
精製標品である。
この様に、本発明の細胞株huGK−14を用いる
と、極めて安価な培地で、極めて容易に精製でき
るHBsAgの大量生産が可能であり、得られた
HBsAgは、ワクチン原料として極めて有用であ
り、又HBV感染診断剤の原料としても有用であ
る。
と、極めて安価な培地で、極めて容易に精製でき
るHBsAgの大量生産が可能であり、得られた
HBsAgは、ワクチン原料として極めて有用であ
り、又HBV感染診断剤の原料としても有用であ
る。
実施例１ huGK−14の無血清培養
細胞株huGK−14完全無血清培養で、硫酸カナ
マイシン60μg／ml、接着因子フアイブロネクチ
ンを添加したウイリアムスＥ培地（Flow社）を
使用し、５％炭酸ガスを含む空気、37℃で完全無
血清培地にて培養した。容器は24穴プレート（１
ml／ウエル）をもちい、接種密度は２〜３×
104cells／cm2とした。細胞密度の飽和状態時点で
常法通りトリプシン処理し、細胞を新たなプレー
トに接種し、完全無血清培地で培養を継続する。
以後２日間隔で培地交換をしながら14日〜16日の
単位で継代培養を繰り返す。
マイシン60μg／ml、接着因子フアイブロネクチ
ンを添加したウイリアムスＥ培地（Flow社）を
使用し、５％炭酸ガスを含む空気、37℃で完全無
血清培地にて培養した。容器は24穴プレート（１
ml／ウエル）をもちい、接種密度は２〜３×
104cells／cm2とした。細胞密度の飽和状態時点で
常法通りトリプシン処理し、細胞を新たなプレー
トに接種し、完全無血清培地で培養を継続する。
以後２日間隔で培地交換をしながら14日〜16日の
単位で継代培養を繰り返す。
その結果を第３図に示す。無血清培地でも細胞
密度は1.2〜2.0×105cells／cm2に達し、継代培養も
少なくとも５代は可能である。
密度は1.2〜2.0×105cells／cm2に達し、継代培養も
少なくとも５代は可能である。
また継代数が増加しても、細胞増殖が認められ
た。
た。
実施例２ HBsAg生産
培地としては、デキサメサゾン（Sigma社）
10-6M、硫酸カナマイシン60μg／、接着因子フ
アイブロネクチンを添加したウイリアムスＥ基礎
培地（Flow社）を使用した。５％炭酸ガスを含
む空気、37℃、培地交換を２〜３日毎の条件で培
養した。容器２４穴プレート（１ml／ウエル）を
もちい、接種密度は、2.5＊104cells／cm2とした。
増殖・回収は同一培地で行なつた。13日で細胞密
度は飽和状態になり、この時点で新たに培地を交
換し以降30日間（６日間毎に培地回収を５回）の
HBsAgの生産回収を行なつた。結果を表２に示
す。回収した培地中のHBsAgはEIAで測定した。
10-6M、硫酸カナマイシン60μg／、接着因子フ
アイブロネクチンを添加したウイリアムスＥ基礎
培地（Flow社）を使用した。５％炭酸ガスを含
む空気、37℃、培地交換を２〜３日毎の条件で培
養した。容器２４穴プレート（１ml／ウエル）を
もちい、接種密度は、2.5＊104cells／cm2とした。
増殖・回収は同一培地で行なつた。13日で細胞密
度は飽和状態になり、この時点で新たに培地を交
換し以降30日間（６日間毎に培地回収を５回）の
HBsAgの生産回収を行なつた。結果を表２に示
す。回収した培地中のHBsAgはEIAで測定した。
表 ２
回収回数 培養日数 培養液中のHBsAg量
（ng／ml）
１回目 ６日後 2400
２ 12日後 2760
３ 18日後 2580
４ 24日後 2390
５ 30日後 2420
図１は、huGK−14培養時の細胞増殖期と抗原
生産期とを示す。図２は、DM−160培地とウイ
リアムスＥ培地について各々血清を添加する場合
としない場合についてのhuGK−14の増殖曲線を
示す。図３は、無血清のウイリアムスＥ培地を用
い、細胞株huGK−14を５代継代培養した時の増
殖曲線を示す。
生産期とを示す。図２は、DM−160培地とウイ
リアムスＥ培地について各々血清を添加する場合
としない場合についてのhuGK−14の増殖曲線を
示す。図３は、無血清のウイリアムスＥ培地を用
い、細胞株huGK−14を５代継代培養した時の増
殖曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の細胞学的性質を有する変異細胞株
huGK−14 (1) ヒト肝癌細胞由来変異株である。 (2) 染色体モード数は51である。 (3) adr型Ｂ肝炎ウイルス表面抗原をコードする
遺伝子を含むDNAフラグメントが、染色体ハ
プロイド当たり約８ケ所組み込まれている。 (4) adr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を著量産生
する。 (5) 細胞は不正円形で上皮性である。 (6) 接着型の細胞である。 (7) 生育温度は36.5±１℃が適している。 (8) 抗原の産生量は、細胞密度が飽和状態に達し
た後急激に増加する。 (9) 細胞の増殖はDM−160基礎培地に10％の血
清を添加したものが適当であるが、無血清のウ
イリアムスＥ基礎培地でも良好な分裂増殖を示
す。 (10) 細胞密度が飽和状態に達した後の維持培地と
してはウイリアムスＥ基礎培地が最も適してお
り、培地交換のみで長期にわたり産生物回収が
可能である。 (11) デキサメサゾン添加により、adr型Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原の産生量を増加させることが
できる。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27459384 | 1984-12-28 | ||
| JP59-274593 | 1984-12-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268177A JPS61268177A (ja) | 1986-11-27 |
| JPH0534949B2 true JPH0534949B2 (ja) | 1993-05-25 |
Family
ID=17543899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292427A Granted JPS61268177A (ja) | 1984-12-28 | 1985-12-27 | ヒト肝癌由来の変異細胞株ｈｕＧＫ−１４ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61268177A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2957195B2 (ja) * | 1989-05-17 | 1999-10-04 | 株式会社シノテスト | Ｂ型肝炎ウイルス抗体検出システム |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60292427A patent/JPS61268177A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61268177A (ja) | 1986-11-27 |
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