JPH0536029B2 - - Google Patents
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- JPH0536029B2 JPH0536029B2 JP59006129A JP612984A JPH0536029B2 JP H0536029 B2 JPH0536029 B2 JP H0536029B2 JP 59006129 A JP59006129 A JP 59006129A JP 612984 A JP612984 A JP 612984A JP H0536029 B2 JPH0536029 B2 JP H0536029B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
本発明は、有機溶媒に可溶であり、かつ有機溶
媒中でも酵素活性を保持した修飾リパーゼに関す
る。 一般に酵素は有機溶媒と接触すると変性して酵
素活性を失うか、または有機溶媒に不溶であるた
め、酵素の利用は水系での反応に限られていた。
そこで、酵素を化学修飾することによつて、有機
溶媒に可溶で、かつ酵素活性を発現するものが得
られれば、製造工程中の有機溶媒溶液中で酵素反
応を行わせたり、水不溶物質も酵素の基質として
用いられる可能性があるため、酵素の工業的利用
範囲が著しく拡大される。リパーゼは油脂の加水
分解と合成を可逆的に触媒する酵素であるが、大
部分の基質は水不溶性であるので、有機溶媒中で
酵素反応を行うことができれば、種々のエステル
の分解・合成やエステル交換による油脂の改質等
の利用範囲が拡大される。 本発明者等は、これらの問題を解決する目的
で、リパーゼの化学修飾を試み、有機溶媒に可溶
で酵素活性を保持した修飾リパーゼを得、本発明
を成した。 本発明は、末端に疎水性基を有するポリアルキ
レングリコールの活性誘導体がリパーゼ分子に部
分的に置換した修飾リパーゼである。リパーゼ
は、動物のスイ液又は胃液中に存在するもの及び
カビ、酵母、細菌等から生産されるものが用いら
れる。 本発明の修飾リパーゼは、疎水性と親水性の両
性質を有する置換ポリアルキレングリコールから
なる直鎖で修飾されているため、水及び有機溶媒
の両方に可溶であり、かつリパーゼ特有の高次構
造がこれら直鎖で保護され、有機溶媒との接触に
よる失活を防いでいる。 ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールなど
をあげることができるが、好ましくは分子量5000
以上のポリエチレングリコールである。また、疎
水性基としては、例えばメチル、エチル、ヘキシ
ル、オクチル、ノニルのようなアルキル基又はフ
エニル、アルキル置換フエニル、フエニル置換フ
エニル、スチリル置換フエニルのようなアリール
基をあげることができるが、好ましくはメチルで
ある。これら疎水性基はポリアルキレングリコー
ルの一方の末端水酸基とエーテル結合している。 ポリアルキレングリコールの他の末端をリパー
ゼ分子に結合させるには、酵素を担体に固定化さ
せる方法として公知の例えばアルキル化法、酸ア
ジド法、ジアゾ法、縮合法等によつて、活性誘導
体に導き、リパーゼ中の遊離のアミノ基又はカル
ボキシル基と反応させ、結合させることができ
る。 アルキル化法としては、トリアジン誘導体又は
アセチル誘導体に導き、活性化する方法があげら
れる。以下の記載において、Ｐ−OHは末端に疎
水性基を有するポリアルキレングリコールを示
し、Ｅはリパーゼ分子を示し、Ｅに結合するアミ
ノ基又はカルボキシル基はリパーゼ分子中の遊離
基を示す。 １ Ｐ−OHと塩化シアヌルとを塩基の存在下、
不活性溶媒中で反応させ、Ｐ−OH直鎖が１又
は２ケ結合した活性誘導体を得る。活性誘導体
は緩衝液中でリパーゼと反応させ、リパーゼ中
の遊離アミノ基と結合させる。 ２ Ｐ−OHとブロモアセチルブロミドをジブロ
ム酢酸−ジオキサン中で反応させてＰ−ブロモ
アセテートを得る。このアセチル誘導体をリパ
ーゼと反応させる。ジブロモ無水こはく酸を用
いて製造されるＰ−ジブロモサクシネートも又
リパーゼと反応させうる。 Ｐ−OHBrCH2COBr ―――――――――――――――――→ BrCH2COOH−ジオキサンＰ−Ｏ−COCH2BrＥ−NH2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−COCH2−NHE 酸アジド法としては、Ｐ−OHをクロル酢酸無
水物、次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸
メチルエーテルを得、これをヒドラジンで処理し
て相当するヒドラジドを得、亜硝酸ソーダで処理
して酸アジド誘導体を得る。この活性誘導体をリ
パーゼと反応させて、リパーゼ中の遊離アミノ基
とアミド結合させる。 Ｐ−OH（ClCH2CO−）2Ｏ ―――――――――――――→ Ｐ−Ｏ−CH2COOHCH2N2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2COOCH3 NH2NH2 ――――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CONHNH2NaNO2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CON3Ｅ−NH2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CONH−
Ｅ ジアゾ法としては、例えばＰ−OHをイサト酸
無水物と反応させてアントラニル酸エステルを
得、次いで酸性で亜硝酸ソーダで処理してジアゾ
ニウム誘導体とし、これをリパーゼとジアゾカツ
プリングさせる。 Ｐ−OHの末端水酸基はアミノ基に変えうる。
この方法は、例えばＰ−OHにトシルクロリドを
反応させてＰ−OH−トシレートとし、次にフタ
ルイミド塩と反応させてＮ−Ｐ置換フタルイミド
を得、これをヒドラジンで処理するとω−アミノ
Ｐ−OHが得られる。このアミノ誘導体をカルボ
ジイミド試薬やウツドワード試薬Ｋによつてリパ
ーゼ中のカルボキシル基と直接結合させる。或い
はＰ−OH−トシレート又はハロゲン化剤を反応
させて得られるＰ−OHω−ブロミドをナトリウ
ムアジドでＰ−OHω−アジドとし、水素還元し
てω−アミノＰ−OHとすることもできる。 また、Ｐ−OHのカルボン酸誘導体は前記の方
法の外に、カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブ
ロモ酢酸エステルを反応させ、加水分解してＰ−
カルボキシメチルエーテルを得ることができる。
このカルボン酸誘導体をカルボジイミド試薬を利
用してＮ−ヒドロキシこはく酸と反応させて相当
するこはく酸イミドエステルを得、これをリパー
ゼ中のアミノ基と反応させる。 上記修飾リパーゼのうち、特に式 （式中、Ｒは末端に疎水性基を有するポリアル
キレングリコール基を示す。）を有する基がリパ
ーゼ分子のアミノ基に部分的に置換した修飾リパ
ーゼは、本発明の目的のために好適に使用され
る。更に好適なものは、ポリオキシエチレン部分
が分子量5000以上である２，４−ビス（メトキシ
ポリオキシエチレン）−６−トリアジンが置換し
た上記修飾リパーゼである。 上記のようにして製造した修飾リパーゼは、常
法により精製し、凍結乾燥して保存される。修飾
リパーゼ中のポリアルキレングリコールの付加率
は、未反応のアミノ基をトリニトロベンゼンスル
ホン酸を用いて測定することができ、リパーゼ分
子中のアミノ基の約50〜70％に付加したものは最
も好ましい。 本発明の修飾リパーゼは、有機溶媒中でエステ
ルの分解、合成、エステル交換、アミノリシスの
各種反応を行える。 修飾リパーゼによるエステルの分解、合成等
は、修飾リパーゼ、基質及び生成物を溶解する有
機溶媒中で行われ、そのような溶媒としては、例
えばベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香
族炭化水素類、クロロホルム、１，１，１−トリ
クロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロ
ロエチレンのような塩素化炭化水素が好適に用い
られ、これらの溶媒はエステル合成においても少
量の水を含むことが好ましい。 エステルの合成に際して基質のカルボン酸は、
種々のカルボン酸を用いうるが、例えばC2〜C24
の飽和又は不飽和の脂肪酸、例えば酪酸、ラウリ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン
酸、リノール酸、アラキドン酸、プロスタグラン
ジン類が用いられる。アルコールは、C1-24の１
級又は２級の脂肪族アルコール、例えばメチルア
ルコール、エチルアルコール、オクチルアルコー
ル、ラウリルアルコール、ステアリルアルコー
ル、エチレングリコール、グリセリン；C7〜C9
の芳香族アルコール、例えばベンジルアルコー
ル；ステロール類、例えばシトステロール、コレ
ステロール、エルゴステロールが用いられる。一
般に脂肪族アルコールでは炭素数の多いより疎水
性の高いアルコールが好適に用いられるが、エチ
ルアルコールを用いる場合は、有機溶媒中でのエ
チルアルコールの最終濃度を５％とすることによ
つて最も高い活性が得られる。また、原料のエス
テルは、好適には上記脂肪酸とアルコールとのエ
ステル又はトリグリセリドが用いられ、特にトリ
グリセリドの脂肪酸の一部を他の脂肪酸基で交換
するアシドリシスを行つて油脂を改質することが
できる。またエステルのアルコール部分を他のア
ルコールで交換するアルコーリシスも可能であ
る。 エステル合成反応においては、生成物の増加に
伴つて水が生成し、反応が平衡に達すると停止す
るので、常法により反応系から水を除去しながら
反応を完結させることが好ましい。 以下に実施例をあげて本発明を説明する。 実施例 １ １ ２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−クロル−ｓ−トリアジンの合成 10ｇの無水炭酸ソーダを含む100mlの無水ベン
ゼンにモノメトキシポリエチレングリコール
（PEG部分の分子量5000）20ｇを溶解し、80℃で
30分間還流して反応させた後、２，４，６−トリ
クロル−ｓ−トリアジン365mgを加え、24時間80
℃で還流下反応させた。反応残留物を去し、石
油エーテル300mlを加えて沈澱を生ぜしめ、沈澱
を数回石油エーテルで洗い、２，４−ビス（メト
キシポリオキシエチレン）−６−クロル−ｓ−ト
リアジンを製造した。 ２ ２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−トリアジンで修飾されたリパーゼの
製造 シユードモナス・フルオレツセンス菌から得た
リポプロテイン・リパーゼ10mgを含む0.4Mほう
酸緩衝液（PH10.0）２mlに、１）で得た２，４−
ビス（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロ
ル−ｓ−トリアジン400mgを加え、37℃で１時間
反応させた後、常法により精製し、リパーゼ分子
中のアミノ基の52％が上記トリアジン誘導体で修
飾された修飾リパーゼを得た。これを水に対して
十分透析し、凍結乾燥した。 ３ ステアリン酸ラウリルエステルの合成 400μの水飽和ベンゼン（約30mMの水を含
む）に図に示す種々の濃度のステアリン酸及びラ
ウリルアルコールを溶解し、この溶液に100μ
の上記２で得た修飾リパーゼ（1.5mg／ml）の水
飽和ベンゼン溶液を加え、37℃で20分間保温して
反応させた。反応後、100μの0.2N硫酸のベン
ゼン溶液を加えて反応を停止したのち、１mlの
0.25N水酸化ナトリウム水溶液、２mlの石油エー
テル及び600μのメチルアルコールを加えて、
生成した目的のエステルを分離した後、常法によ
りエステル生成量を比色定量した。 図１は、ステアリン酸の濃度を0.3Mに一定し、
ラウリルアルコールの濃度を変化させたときのエ
ステル生成量を示し、図２は、ラウリルアルコー
ルの濃度を0.45Mに一定し、ステアリン酸の濃度
を変化させたときのエステル生成量を示す。この
図から修飾リパーゼは、最大4.5μmole／分／mg
蛋白のエステル合成活性を示した。 ４ 種々の有機溶媒中での修飾リパーゼの溶解性 溶解性は、凍結乾燥した上記２）で得た修飾リ
パーゼ（修飾率55％）１mgを１mlの水飽和有機溶
媒に加えて攪拌した後、遠心分離して不溶物を除
き、溶解した蛋白量を測定した。また、酵素活性
は、50μのそれぞれの溶媒にラウリン酸とラウ
リルアルコールを溶かした溶液に上記２で得た修
飾リパーゼ１mg／mlを加え、25℃で20分間保持し
た後、合成されたラウリン酸ラウリルエステルを
定量した。この結果を第１表に示す。ここで、ベ
ンゼン中での酵素活性は7.1μmole／分／mg蛋白
である。
媒中でも酵素活性を保持した修飾リパーゼに関す
る。 一般に酵素は有機溶媒と接触すると変性して酵
素活性を失うか、または有機溶媒に不溶であるた
め、酵素の利用は水系での反応に限られていた。
そこで、酵素を化学修飾することによつて、有機
溶媒に可溶で、かつ酵素活性を発現するものが得
られれば、製造工程中の有機溶媒溶液中で酵素反
応を行わせたり、水不溶物質も酵素の基質として
用いられる可能性があるため、酵素の工業的利用
範囲が著しく拡大される。リパーゼは油脂の加水
分解と合成を可逆的に触媒する酵素であるが、大
部分の基質は水不溶性であるので、有機溶媒中で
酵素反応を行うことができれば、種々のエステル
の分解・合成やエステル交換による油脂の改質等
の利用範囲が拡大される。 本発明者等は、これらの問題を解決する目的
で、リパーゼの化学修飾を試み、有機溶媒に可溶
で酵素活性を保持した修飾リパーゼを得、本発明
を成した。 本発明は、末端に疎水性基を有するポリアルキ
レングリコールの活性誘導体がリパーゼ分子に部
分的に置換した修飾リパーゼである。リパーゼ
は、動物のスイ液又は胃液中に存在するもの及び
カビ、酵母、細菌等から生産されるものが用いら
れる。 本発明の修飾リパーゼは、疎水性と親水性の両
性質を有する置換ポリアルキレングリコールから
なる直鎖で修飾されているため、水及び有機溶媒
の両方に可溶であり、かつリパーゼ特有の高次構
造がこれら直鎖で保護され、有機溶媒との接触に
よる失活を防いでいる。 ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールなど
をあげることができるが、好ましくは分子量5000
以上のポリエチレングリコールである。また、疎
水性基としては、例えばメチル、エチル、ヘキシ
ル、オクチル、ノニルのようなアルキル基又はフ
エニル、アルキル置換フエニル、フエニル置換フ
エニル、スチリル置換フエニルのようなアリール
基をあげることができるが、好ましくはメチルで
ある。これら疎水性基はポリアルキレングリコー
ルの一方の末端水酸基とエーテル結合している。 ポリアルキレングリコールの他の末端をリパー
ゼ分子に結合させるには、酵素を担体に固定化さ
せる方法として公知の例えばアルキル化法、酸ア
ジド法、ジアゾ法、縮合法等によつて、活性誘導
体に導き、リパーゼ中の遊離のアミノ基又はカル
ボキシル基と反応させ、結合させることができ
る。 アルキル化法としては、トリアジン誘導体又は
アセチル誘導体に導き、活性化する方法があげら
れる。以下の記載において、Ｐ−OHは末端に疎
水性基を有するポリアルキレングリコールを示
し、Ｅはリパーゼ分子を示し、Ｅに結合するアミ
ノ基又はカルボキシル基はリパーゼ分子中の遊離
基を示す。 １ Ｐ−OHと塩化シアヌルとを塩基の存在下、
不活性溶媒中で反応させ、Ｐ−OH直鎖が１又
は２ケ結合した活性誘導体を得る。活性誘導体
は緩衝液中でリパーゼと反応させ、リパーゼ中
の遊離アミノ基と結合させる。 ２ Ｐ−OHとブロモアセチルブロミドをジブロ
ム酢酸−ジオキサン中で反応させてＰ−ブロモ
アセテートを得る。このアセチル誘導体をリパ
ーゼと反応させる。ジブロモ無水こはく酸を用
いて製造されるＰ−ジブロモサクシネートも又
リパーゼと反応させうる。 Ｐ−OHBrCH2COBr ―――――――――――――――――→ BrCH2COOH−ジオキサンＰ−Ｏ−COCH2BrＥ−NH2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−COCH2−NHE 酸アジド法としては、Ｐ−OHをクロル酢酸無
水物、次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸
メチルエーテルを得、これをヒドラジンで処理し
て相当するヒドラジドを得、亜硝酸ソーダで処理
して酸アジド誘導体を得る。この活性誘導体をリ
パーゼと反応させて、リパーゼ中の遊離アミノ基
とアミド結合させる。 Ｐ−OH（ClCH2CO−）2Ｏ ―――――――――――――→ Ｐ−Ｏ−CH2COOHCH2N2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2COOCH3 NH2NH2 ――――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CONHNH2NaNO2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CON3Ｅ−NH2 ―――――→ Ｐ−Ｏ−CH2CONH−
Ｅ ジアゾ法としては、例えばＰ−OHをイサト酸
無水物と反応させてアントラニル酸エステルを
得、次いで酸性で亜硝酸ソーダで処理してジアゾ
ニウム誘導体とし、これをリパーゼとジアゾカツ
プリングさせる。 Ｐ−OHの末端水酸基はアミノ基に変えうる。
この方法は、例えばＰ−OHにトシルクロリドを
反応させてＰ−OH−トシレートとし、次にフタ
ルイミド塩と反応させてＮ−Ｐ置換フタルイミド
を得、これをヒドラジンで処理するとω−アミノ
Ｐ−OHが得られる。このアミノ誘導体をカルボ
ジイミド試薬やウツドワード試薬Ｋによつてリパ
ーゼ中のカルボキシル基と直接結合させる。或い
はＰ−OH−トシレート又はハロゲン化剤を反応
させて得られるＰ−OHω−ブロミドをナトリウ
ムアジドでＰ−OHω−アジドとし、水素還元し
てω−アミノＰ−OHとすることもできる。 また、Ｐ−OHのカルボン酸誘導体は前記の方
法の外に、カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブ
ロモ酢酸エステルを反応させ、加水分解してＰ−
カルボキシメチルエーテルを得ることができる。
このカルボン酸誘導体をカルボジイミド試薬を利
用してＮ−ヒドロキシこはく酸と反応させて相当
するこはく酸イミドエステルを得、これをリパー
ゼ中のアミノ基と反応させる。 上記修飾リパーゼのうち、特に式 （式中、Ｒは末端に疎水性基を有するポリアル
キレングリコール基を示す。）を有する基がリパ
ーゼ分子のアミノ基に部分的に置換した修飾リパ
ーゼは、本発明の目的のために好適に使用され
る。更に好適なものは、ポリオキシエチレン部分
が分子量5000以上である２，４−ビス（メトキシ
ポリオキシエチレン）−６−トリアジンが置換し
た上記修飾リパーゼである。 上記のようにして製造した修飾リパーゼは、常
法により精製し、凍結乾燥して保存される。修飾
リパーゼ中のポリアルキレングリコールの付加率
は、未反応のアミノ基をトリニトロベンゼンスル
ホン酸を用いて測定することができ、リパーゼ分
子中のアミノ基の約50〜70％に付加したものは最
も好ましい。 本発明の修飾リパーゼは、有機溶媒中でエステ
ルの分解、合成、エステル交換、アミノリシスの
各種反応を行える。 修飾リパーゼによるエステルの分解、合成等
は、修飾リパーゼ、基質及び生成物を溶解する有
機溶媒中で行われ、そのような溶媒としては、例
えばベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香
族炭化水素類、クロロホルム、１，１，１−トリ
クロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロ
ロエチレンのような塩素化炭化水素が好適に用い
られ、これらの溶媒はエステル合成においても少
量の水を含むことが好ましい。 エステルの合成に際して基質のカルボン酸は、
種々のカルボン酸を用いうるが、例えばC2〜C24
の飽和又は不飽和の脂肪酸、例えば酪酸、ラウリ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン
酸、リノール酸、アラキドン酸、プロスタグラン
ジン類が用いられる。アルコールは、C1-24の１
級又は２級の脂肪族アルコール、例えばメチルア
ルコール、エチルアルコール、オクチルアルコー
ル、ラウリルアルコール、ステアリルアルコー
ル、エチレングリコール、グリセリン；C7〜C9
の芳香族アルコール、例えばベンジルアルコー
ル；ステロール類、例えばシトステロール、コレ
ステロール、エルゴステロールが用いられる。一
般に脂肪族アルコールでは炭素数の多いより疎水
性の高いアルコールが好適に用いられるが、エチ
ルアルコールを用いる場合は、有機溶媒中でのエ
チルアルコールの最終濃度を５％とすることによ
つて最も高い活性が得られる。また、原料のエス
テルは、好適には上記脂肪酸とアルコールとのエ
ステル又はトリグリセリドが用いられ、特にトリ
グリセリドの脂肪酸の一部を他の脂肪酸基で交換
するアシドリシスを行つて油脂を改質することが
できる。またエステルのアルコール部分を他のア
ルコールで交換するアルコーリシスも可能であ
る。 エステル合成反応においては、生成物の増加に
伴つて水が生成し、反応が平衡に達すると停止す
るので、常法により反応系から水を除去しながら
反応を完結させることが好ましい。 以下に実施例をあげて本発明を説明する。 実施例 １ １ ２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−クロル−ｓ−トリアジンの合成 10ｇの無水炭酸ソーダを含む100mlの無水ベン
ゼンにモノメトキシポリエチレングリコール
（PEG部分の分子量5000）20ｇを溶解し、80℃で
30分間還流して反応させた後、２，４，６−トリ
クロル−ｓ−トリアジン365mgを加え、24時間80
℃で還流下反応させた。反応残留物を去し、石
油エーテル300mlを加えて沈澱を生ぜしめ、沈澱
を数回石油エーテルで洗い、２，４−ビス（メト
キシポリオキシエチレン）−６−クロル−ｓ−ト
リアジンを製造した。 ２ ２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−トリアジンで修飾されたリパーゼの
製造 シユードモナス・フルオレツセンス菌から得た
リポプロテイン・リパーゼ10mgを含む0.4Mほう
酸緩衝液（PH10.0）２mlに、１）で得た２，４−
ビス（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロ
ル−ｓ−トリアジン400mgを加え、37℃で１時間
反応させた後、常法により精製し、リパーゼ分子
中のアミノ基の52％が上記トリアジン誘導体で修
飾された修飾リパーゼを得た。これを水に対して
十分透析し、凍結乾燥した。 ３ ステアリン酸ラウリルエステルの合成 400μの水飽和ベンゼン（約30mMの水を含
む）に図に示す種々の濃度のステアリン酸及びラ
ウリルアルコールを溶解し、この溶液に100μ
の上記２で得た修飾リパーゼ（1.5mg／ml）の水
飽和ベンゼン溶液を加え、37℃で20分間保温して
反応させた。反応後、100μの0.2N硫酸のベン
ゼン溶液を加えて反応を停止したのち、１mlの
0.25N水酸化ナトリウム水溶液、２mlの石油エー
テル及び600μのメチルアルコールを加えて、
生成した目的のエステルを分離した後、常法によ
りエステル生成量を比色定量した。 図１は、ステアリン酸の濃度を0.3Mに一定し、
ラウリルアルコールの濃度を変化させたときのエ
ステル生成量を示し、図２は、ラウリルアルコー
ルの濃度を0.45Mに一定し、ステアリン酸の濃度
を変化させたときのエステル生成量を示す。この
図から修飾リパーゼは、最大4.5μmole／分／mg
蛋白のエステル合成活性を示した。 ４ 種々の有機溶媒中での修飾リパーゼの溶解性 溶解性は、凍結乾燥した上記２）で得た修飾リ
パーゼ（修飾率55％）１mgを１mlの水飽和有機溶
媒に加えて攪拌した後、遠心分離して不溶物を除
き、溶解した蛋白量を測定した。また、酵素活性
は、50μのそれぞれの溶媒にラウリン酸とラウ
リルアルコールを溶かした溶液に上記２で得た修
飾リパーゼ１mg／mlを加え、25℃で20分間保持し
た後、合成されたラウリン酸ラウリルエステルを
定量した。この結果を第１表に示す。ここで、ベ
ンゼン中での酵素活性は7.1μmole／分／mg蛋白
である。
【表】
未修飾リパーゼは上記溶媒には全く溶解しない
が、修飾リパーゼは上記の表から明らかなように
溶解するようになり、そして有機溶媒中とくにト
リクロロエタン及びベンゼン中では高い活性を示
すことがわかる。また、この修飾リパーゼはベン
ゼン中で安定で、150日後でエステル合成酵素活
性を40％保持していた。さらに、修飾リパーゼ溶
液にｎ−ヘキサンや石油エーテルを加えることに
より、酵素活性の失活を伴なうことなく、有機溶
媒中から沈澱として100％回収することができた。 ５ ラウリン酸のシトステロールエステルの合成 １mlの0.25Mシトステロールの水飽和ベンゼン
溶液に、400μの1.8Mラウリン酸の水飽和ベン
ゼン溶液を加え、更に200μの上記２で得た修
飾リパーゼ（0.74mg／ml）の水飽和ベンゼン溶液
を添加した後、37℃で50時間反応させた。反応終
了後、シリカゲルクロマトグラフイーによつて生
成した目的のエステルを分離後、再結晶を行い３
mgの目的のエステルの純品を得た。 ６ トリラウリンのエチルアルコールによるアル
コーリシス 200μの0.2Mトリラウリンの水飽和ベンゼン
溶液に、100μの種々濃度のエチルアルコール
の水飽和ベンゼン溶液を加え、更に100μの上
記２で得た修飾リパーゼ（0.27mg／ml）の水飽和
ベンゼン溶液を加えた後、37℃で１時間反応させ
た。反応終了後、薄層クロマトグラフイーにより
生成物を分離し、生成したラウリン酸エチルを比
色定量した。その結果、約１％のエチルアルコー
ル中でアルコーリシス活性は最大値を示し、約
0.7μmole／分／mg蛋白であつた。 ７ 酪酸メチルのラウリン酸によるアシドリシス 50μの1.2Mラウリン酸の水飽和ベンゼン溶液
に50μの酪酸メチルを加え、更に100μの上記
２で得た修飾リパーゼ（0.5mg／ml）の水飽和ベ
ンゼン溶液を加えた後、37℃で20分間保温し反応
させた。反応終了後、薄層クロマトグラフイーに
より生成したラウリン酸メチルを分離し、石油エ
ーテルで抽出後、常法によりラウリン酸メチルを
比色定量した。その結果、修飾リパーゼのアシド
リシス活性は約1μmole／分／mg蛋白を示した。 ８ トリラウリンの分解 200μの水飽和ベンゼンにトリラウリン
100mMを溶かした溶液に、上記２で得た修飾リ
パーゼ１mg／mlを加え、37℃で20分間保持した
後、遊離したラウリン酸量を定量した結果、この
修飾リパーゼは1.6μmole／分／mg蛋白の酵素活
性を示した。 実施例 ２ １ メトキシポリオキシエチレン−酢酸アジドの
エーテル モノメトキシポリエチレングリコール（PEG
部分の分子量5000）2.0ｇをクロル酢酸無水物５
mlと室温で反応させてメトキシポリオキシエチレ
ン−酢酸エーテルを得、これに0.2Mのジアゾメ
タンのエーテル溶液５mlを加えて０℃以下で反応
させ相当するメチルエステルとした。このメチル
エステル2.0ｇにヒドラジンヒドラート15mlとメ
タノール300mlを加えて還流下に反応させて相当
するヒドラジドとした。ヒドラジド1.0ｇを希塩
酸にとかし冷却する。かくはん下に0.5M亜硝酸
ナトリウム９mlを滴下し、約15分室温に放置して
メトキシポリオキシエチレン−酢酸アジドのエー
テルを得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンメトキシカルボ
ニルで修飾されたリパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得た５
mgのリパーゼを２mlのりん酸ナトリウム緩衝液
（PH10）に溶解し、これに上記１で得た酸アジド
誘導体1.0ｇを加え、室温で２時間攪拌下に反応
させた後、0.1Mほう酸緩衝液（PH8.5）100mlを
加え、アミコンPM−30メンブランフイルターで
限外過した。りん酸緩衝液で充分洗つた後、水
に対して十分透析し、凍結乾燥した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼの活性を実施例１の
３の方法によつて測定したところ1μmole／分／
mg蛋白を示した。 実施例 ３ １ メトキシポリオキシエチレン−ジブロモサク
シネートの合成 メトキシポリエチレングリコール1.0ｇを無水
ベンゼン10mlに溶かし、ジブロモ無水こはく酸
0.5ｇを加えて一夜攪拌して反応させた後過し、
液を減圧下で濃縮してメトキシポリオキシエチ
レン−ジブロモサクシネートを得た。これをベン
ゼン−石油エーテルを用いて精製操作をくり返し
た。 ２ メトキシポリオキシエチレンがアセチル基を
介して結合した修飾リパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得た５
mgのリパーゼを２mlのりん酸緩衝液（PH7.0）に
溶かし、PHスタートをセツトしてPH7.0に保ちつ
つ、500mgの上記１で得たメトキシポリエチレン
−ジブロモサクシネートを加え、以下実施例２の
２と同様に操作して修飾リパーゼを得た。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ４ １ メトキシポリオキシエチレンのアントラニル
酸エステルのジアゾニウム塩の合成 メトキシポリエチレングリコール1.0ｇを炭酸
ナトリウム1.0ｇを含む無水ベンゼン10mlに溶解
し、イサト酸無水物0.25ｇを加えて一夜放置し、
溶液を過して相当するイサト酸エステルを得
た。このエステルの水溶液に塩酸を加え、４℃に
冷却し、攪拌下に0.5M亜硝酸ナトリウムを滴下
してNO- 2の残存が確認されるまで行う。ジアゾ
化物を過し、冷0.01N塩酸で洗浄後、更に水で
洗浄した。 ２ メトキシポリオキシエチレンがジアゾベンゾ
イル基を介して結合した修飾リパーゼ シユードモナス・フルオレツセンスより得たリ
パーゼ25mgをりん酸緩衝液（PH７〜7.5）５mlに
溶かし、０〜２℃に冷却し、これに上記１で得た
ジアゾ化溶液を滴下し、PHスタートを７に保ちつ
つ、２時間反応させた。以下実施例２の２と同様
に操作して修飾リパーゼを得た。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは水飽和ベンゼン溶
液中でステアリン酸とラウリルアルコールから相
当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ５ １ ω−アミノ−メトキシポリエチレングリコー
ルの合成 メトキシポリエチレングリコール３ｇを50mlの
クロロホルムに溶かし、２mlのピリジン及び3.8
ｇのトシルクロリドを加え、22時間還流下に反応
させた後、減圧下に蒸留した。反応残渣を水に溶
かし、過後クロロホルムで抽出した。抽出液を
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、こ
れをクロロホルムに溶かし、更にエーテルで沈澱
させ精製した。 得られたトシル化物３ｇを30mlのジメチルホル
ムアミドに溶かし、１ｇのフタルイミドカリウム
を加え、反応溶液を窒素気流下に120℃で３日間
反応させた。得られた相当するフタルイミド誘導
体を10mlのクロロホルムに溶かし、50mlのヒドラ
ジンヒドラートを加え、70℃で３日間反応させ、
得られた縮合物を常法により精製した。更にこれ
を４×60cmのSP−セフアデツクス Ｃ−25（H+
型）カラムにかけ、０〜30mMの塩化ナトリウム
で傾斜溶離し、ω−アミノ物を分画した。これを
クロロホルムで抽出し、抽出後無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、目的物を得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンがアミド結合し
た修飾リパーゼ 500mgの上記１で得たω−アミノ−メトキシポ
リエチレングリコールをりん酸緩衝液（PH6.0）
３mlに溶かし、シユードモナス・フルオレツセン
スから得たリパーゼ10mgを加え、次いでエチルジ
メチルアミノプロピルカルボジイミド60mgを加
え、PHスタートを6.0に保ちつつ、１時間後過剰
の酢酸塩によつて反応を停止し、得られた修飾リ
パーゼを常法によつて精製した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ６ １ メトキシポリオキシエチレン−酢酸こはく酸
イミドエステルのエーテル メトキシポリエチレングリコール14ｇと10ｇの
カリウムｔ−ブトキシドを150mlのｔ−ブチルア
ルコールに加え、40℃に加熱して溶かした。これ
に５mlのブロモ酢酸エチルを10分間かけて添加
し、更に２時間攪拌した。これを減圧下で蒸留
し、生成物を100mlの1N水酸化ナトリウムに溶か
し、２時間後塩酸でPHを２とし、これをクロロホ
ルムで抽出し、相当する酢酸エーテルを得た。こ
の酢酸エーテル15ｇを130mlの無水ジオキサンに
溶かし、3.5ｇのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド
を加え、更に６ｇのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを加えて、室温で一夜反応させた。得られた
沈澱物を過後、液にヘキサン500mlを加えて
生成物を得た。これをベンゼン100mlに溶かし、
更にヘキサンで沈澱させる精製操作をくりかえ
し、目的の酢酸こはく酸イミドエステルエーテル
を得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンメトキシカルボ
ニルで修飾されたリパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得たリ
パーゼ10mgを２mlのほう酸緩衝液（PH9.0）に溶
かし、１で得た酸イミドエステルエーテル誘導体
500mgを加え、37℃で12時間反応させた。反応終
了後PM−30を用いた限外過によつて精製し、
目的の修飾リパーゼを製造した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。
が、修飾リパーゼは上記の表から明らかなように
溶解するようになり、そして有機溶媒中とくにト
リクロロエタン及びベンゼン中では高い活性を示
すことがわかる。また、この修飾リパーゼはベン
ゼン中で安定で、150日後でエステル合成酵素活
性を40％保持していた。さらに、修飾リパーゼ溶
液にｎ−ヘキサンや石油エーテルを加えることに
より、酵素活性の失活を伴なうことなく、有機溶
媒中から沈澱として100％回収することができた。 ５ ラウリン酸のシトステロールエステルの合成 １mlの0.25Mシトステロールの水飽和ベンゼン
溶液に、400μの1.8Mラウリン酸の水飽和ベン
ゼン溶液を加え、更に200μの上記２で得た修
飾リパーゼ（0.74mg／ml）の水飽和ベンゼン溶液
を添加した後、37℃で50時間反応させた。反応終
了後、シリカゲルクロマトグラフイーによつて生
成した目的のエステルを分離後、再結晶を行い３
mgの目的のエステルの純品を得た。 ６ トリラウリンのエチルアルコールによるアル
コーリシス 200μの0.2Mトリラウリンの水飽和ベンゼン
溶液に、100μの種々濃度のエチルアルコール
の水飽和ベンゼン溶液を加え、更に100μの上
記２で得た修飾リパーゼ（0.27mg／ml）の水飽和
ベンゼン溶液を加えた後、37℃で１時間反応させ
た。反応終了後、薄層クロマトグラフイーにより
生成物を分離し、生成したラウリン酸エチルを比
色定量した。その結果、約１％のエチルアルコー
ル中でアルコーリシス活性は最大値を示し、約
0.7μmole／分／mg蛋白であつた。 ７ 酪酸メチルのラウリン酸によるアシドリシス 50μの1.2Mラウリン酸の水飽和ベンゼン溶液
に50μの酪酸メチルを加え、更に100μの上記
２で得た修飾リパーゼ（0.5mg／ml）の水飽和ベ
ンゼン溶液を加えた後、37℃で20分間保温し反応
させた。反応終了後、薄層クロマトグラフイーに
より生成したラウリン酸メチルを分離し、石油エ
ーテルで抽出後、常法によりラウリン酸メチルを
比色定量した。その結果、修飾リパーゼのアシド
リシス活性は約1μmole／分／mg蛋白を示した。 ８ トリラウリンの分解 200μの水飽和ベンゼンにトリラウリン
100mMを溶かした溶液に、上記２で得た修飾リ
パーゼ１mg／mlを加え、37℃で20分間保持した
後、遊離したラウリン酸量を定量した結果、この
修飾リパーゼは1.6μmole／分／mg蛋白の酵素活
性を示した。 実施例 ２ １ メトキシポリオキシエチレン−酢酸アジドの
エーテル モノメトキシポリエチレングリコール（PEG
部分の分子量5000）2.0ｇをクロル酢酸無水物５
mlと室温で反応させてメトキシポリオキシエチレ
ン−酢酸エーテルを得、これに0.2Mのジアゾメ
タンのエーテル溶液５mlを加えて０℃以下で反応
させ相当するメチルエステルとした。このメチル
エステル2.0ｇにヒドラジンヒドラート15mlとメ
タノール300mlを加えて還流下に反応させて相当
するヒドラジドとした。ヒドラジド1.0ｇを希塩
酸にとかし冷却する。かくはん下に0.5M亜硝酸
ナトリウム９mlを滴下し、約15分室温に放置して
メトキシポリオキシエチレン−酢酸アジドのエー
テルを得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンメトキシカルボ
ニルで修飾されたリパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得た５
mgのリパーゼを２mlのりん酸ナトリウム緩衝液
（PH10）に溶解し、これに上記１で得た酸アジド
誘導体1.0ｇを加え、室温で２時間攪拌下に反応
させた後、0.1Mほう酸緩衝液（PH8.5）100mlを
加え、アミコンPM−30メンブランフイルターで
限外過した。りん酸緩衝液で充分洗つた後、水
に対して十分透析し、凍結乾燥した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼの活性を実施例１の
３の方法によつて測定したところ1μmole／分／
mg蛋白を示した。 実施例 ３ １ メトキシポリオキシエチレン−ジブロモサク
シネートの合成 メトキシポリエチレングリコール1.0ｇを無水
ベンゼン10mlに溶かし、ジブロモ無水こはく酸
0.5ｇを加えて一夜攪拌して反応させた後過し、
液を減圧下で濃縮してメトキシポリオキシエチ
レン−ジブロモサクシネートを得た。これをベン
ゼン−石油エーテルを用いて精製操作をくり返し
た。 ２ メトキシポリオキシエチレンがアセチル基を
介して結合した修飾リパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得た５
mgのリパーゼを２mlのりん酸緩衝液（PH7.0）に
溶かし、PHスタートをセツトしてPH7.0に保ちつ
つ、500mgの上記１で得たメトキシポリエチレン
−ジブロモサクシネートを加え、以下実施例２の
２と同様に操作して修飾リパーゼを得た。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ４ １ メトキシポリオキシエチレンのアントラニル
酸エステルのジアゾニウム塩の合成 メトキシポリエチレングリコール1.0ｇを炭酸
ナトリウム1.0ｇを含む無水ベンゼン10mlに溶解
し、イサト酸無水物0.25ｇを加えて一夜放置し、
溶液を過して相当するイサト酸エステルを得
た。このエステルの水溶液に塩酸を加え、４℃に
冷却し、攪拌下に0.5M亜硝酸ナトリウムを滴下
してNO- 2の残存が確認されるまで行う。ジアゾ
化物を過し、冷0.01N塩酸で洗浄後、更に水で
洗浄した。 ２ メトキシポリオキシエチレンがジアゾベンゾ
イル基を介して結合した修飾リパーゼ シユードモナス・フルオレツセンスより得たリ
パーゼ25mgをりん酸緩衝液（PH７〜7.5）５mlに
溶かし、０〜２℃に冷却し、これに上記１で得た
ジアゾ化溶液を滴下し、PHスタートを７に保ちつ
つ、２時間反応させた。以下実施例２の２と同様
に操作して修飾リパーゼを得た。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは水飽和ベンゼン溶
液中でステアリン酸とラウリルアルコールから相
当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ５ １ ω−アミノ−メトキシポリエチレングリコー
ルの合成 メトキシポリエチレングリコール３ｇを50mlの
クロロホルムに溶かし、２mlのピリジン及び3.8
ｇのトシルクロリドを加え、22時間還流下に反応
させた後、減圧下に蒸留した。反応残渣を水に溶
かし、過後クロロホルムで抽出した。抽出液を
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、こ
れをクロロホルムに溶かし、更にエーテルで沈澱
させ精製した。 得られたトシル化物３ｇを30mlのジメチルホル
ムアミドに溶かし、１ｇのフタルイミドカリウム
を加え、反応溶液を窒素気流下に120℃で３日間
反応させた。得られた相当するフタルイミド誘導
体を10mlのクロロホルムに溶かし、50mlのヒドラ
ジンヒドラートを加え、70℃で３日間反応させ、
得られた縮合物を常法により精製した。更にこれ
を４×60cmのSP−セフアデツクス Ｃ−25（H+
型）カラムにかけ、０〜30mMの塩化ナトリウム
で傾斜溶離し、ω−アミノ物を分画した。これを
クロロホルムで抽出し、抽出後無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、目的物を得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンがアミド結合し
た修飾リパーゼ 500mgの上記１で得たω−アミノ−メトキシポ
リエチレングリコールをりん酸緩衝液（PH6.0）
３mlに溶かし、シユードモナス・フルオレツセン
スから得たリパーゼ10mgを加え、次いでエチルジ
メチルアミノプロピルカルボジイミド60mgを加
え、PHスタートを6.0に保ちつつ、１時間後過剰
の酢酸塩によつて反応を停止し、得られた修飾リ
パーゼを常法によつて精製した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。 実施例 ６ １ メトキシポリオキシエチレン−酢酸こはく酸
イミドエステルのエーテル メトキシポリエチレングリコール14ｇと10ｇの
カリウムｔ−ブトキシドを150mlのｔ−ブチルア
ルコールに加え、40℃に加熱して溶かした。これ
に５mlのブロモ酢酸エチルを10分間かけて添加
し、更に２時間攪拌した。これを減圧下で蒸留
し、生成物を100mlの1N水酸化ナトリウムに溶か
し、２時間後塩酸でPHを２とし、これをクロロホ
ルムで抽出し、相当する酢酸エーテルを得た。こ
の酢酸エーテル15ｇを130mlの無水ジオキサンに
溶かし、3.5ｇのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド
を加え、更に６ｇのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを加えて、室温で一夜反応させた。得られた
沈澱物を過後、液にヘキサン500mlを加えて
生成物を得た。これをベンゼン100mlに溶かし、
更にヘキサンで沈澱させる精製操作をくりかえ
し、目的の酢酸こはく酸イミドエステルエーテル
を得た。 ２ メトキシポリオキシエチレンメトキシカルボ
ニルで修飾されたリパーゼの製造 シユードモナス・フルオレツセンスから得たリ
パーゼ10mgを２mlのほう酸緩衝液（PH9.0）に溶
かし、１で得た酸イミドエステルエーテル誘導体
500mgを加え、37℃で12時間反応させた。反応終
了後PM−30を用いた限外過によつて精製し、
目的の修飾リパーゼを製造した。 ３ 修飾リパーゼの活性 上記２で得た修飾リパーゼは、水飽和ベンゼン
溶液中でステアリン酸とラウリルアルコールから
相当するエステルを合成することが確認された。
図１及び図２は、本発明の修飾リパーゼによる
エステルの合成を示す。
エステルの合成を示す。
１ 式、
−（CH2）ｎ−Ｘ
（式中、Ｘは水酸基、メチル基、水酸基で置換
されていてもよいフエニル基またはアミノ基を、
ｎは３〜10の整数を示す）で表わされる基をリガ
ンドとして有する水不溶性の担体にウロキナーゼ
を吸着させ、さらに少なくとも２個のアミノ基を
有する化合物又はその塩にて溶出することを特徴
とするウロキナーゼの精製法。
されていてもよいフエニル基またはアミノ基を、
ｎは３〜10の整数を示す）で表わされる基をリガ
ンドとして有する水不溶性の担体にウロキナーゼ
を吸着させ、さらに少なくとも２個のアミノ基を
有する化合物又はその塩にて溶出することを特徴
とするウロキナーゼの精製法。
Claims (1)
- 第５項の修飾リパーゼ。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59006129A JPS60156395A (ja) | 1984-01-17 | 1984-01-17 | 修飾リパーゼ |
| US06/687,635 US4645741A (en) | 1984-01-17 | 1984-12-31 | Modified lipase |
| DE8585300102T DE3583947D1 (de) | 1984-01-17 | 1985-01-07 | Modifizierte lipase. |
| EP85300102A EP0149520B1 (en) | 1984-01-17 | 1985-01-07 | Modified lipase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59006129A JPS60156395A (ja) | 1984-01-17 | 1984-01-17 | 修飾リパーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60156395A JPS60156395A (ja) | 1985-08-16 |
| JPH0536029B2 true JPH0536029B2 (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=11629888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59006129A Granted JPS60156395A (ja) | 1984-01-17 | 1984-01-17 | 修飾リパーゼ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4645741A (ja) |
| EP (1) | EP0149520B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60156395A (ja) |
| DE (1) | DE3583947D1 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4999289A (en) * | 1986-04-10 | 1991-03-12 | Amano Pharmaceutical Co. Ltd., | Lipase, its production and use for assay of triglycerides |
| JPS62248495A (ja) * | 1986-04-23 | 1987-10-29 | Mihama Hisaharu | ビタミンａエステルの製法 |
| US4814098A (en) * | 1986-09-06 | 1989-03-21 | Bellex Corporation | Magnetic material-physiologically active substance conjugate |
| ATE87036T1 (de) * | 1986-11-28 | 1993-04-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Verfahren zur herstellung von carbonsaeureestern. |
| JPS63202391A (ja) * | 1987-02-19 | 1988-08-22 | Sapporo Breweries Ltd | テルペンアルコ−ルエステルの製造法 |
| JPS63245671A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Kanebo Ltd | 修飾ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ |
| JP2632518B2 (ja) * | 1987-08-28 | 1997-07-23 | 天野製薬株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体 |
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