LU82569A1 - Nouveaux tripeptides,leur preparation et les medicaments qui les contiennent - Google Patents

Description

»* Λ

La présente invention concerne de nouveaux tripeptides de formule générale :

R - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R

I I 1 OHj 0¾¾ - 00 - MH - OH - Rj ^ (0¾ )3 R - NH - CH - R2 * éventuellement leurs sels non toxiques, leur préparation et les medica- 5 ments qui les contiennent.

Les parois bactériennes, par exemple les parois de mycobactéries, sont constituées essentiellement d’un peptidoglycane formé d’acide N-acétyl- muramique sur lequel sonc fixés des pepcides renfermant l’enchaînement L Ala- / D Glu-DAP. Par ailleurs, les parois bactériennes sont très riches en lipides . 1° dont certains sont libres et extraccibles et d'autres sonc liés à la structure de la paroi ec sont constitués par des acides mycoliques (acides gras, géants, α-ramifiés et ß-hydroxyies). L’ensemble des constituants de la paroi cellulaire forme une structure covalence composée d’un peptidoglycane et d’un mycoiate d'arabinogalactane liés encre eux par des liaisons phosphodiesters.

15 Ces parois bactériennes présentent U plupart des propriétés biologiques des cellules entières lorsqu’elles sonc associées à une huile minérale ou végétale et administrées après mise en suspension dans du soluté physiologique·

Dans les brevecs belges 321 335, 852 348 et 852 349 sont décrits des pepcides, couplés avec l'acide N-acécyImuramique, qui contiennent l’enchaî-20 nement L Ala-D Glu ou L Ser-D Glu et qui sonc efficaces comme adjuvants immuno- logiques et comme agents antiinfectieux.

Dans le brevet français 75.24440, publié sous le numéro 2 320 107, sont décrits des produits de couplage entre un acide gras et un saccharide l.epcapeptide isolé à partir d’une mycobactérie contenant une cire "D” ec qui 25 peuvent être représentés par la formule suivante :

' MAC - N^M-----NAG - NAM

Ala , Ala

Glu Glu (R COOH) , (II) 7 i / DAP ' s /

Jm // 2 » JL J* dans laquelle, en particulier : NAG = N-acétylglucosamine ; NAM = acide N-acécylmuramique R = radical alcoyle contenant 9 à 17 atomes de carbone.

Ces produits sont des adjuvants immunologiques de la production 5 d’anticorps et de l'hypersensibilité retardée capables d'agir seuls, c'est-à-t dire sans qu'il soit nécessaire de les administrer en solution huileuse.

Tous ces produits se caractérisent par la présence d'acide -ï N-acétylmuraraique qui, d'après KASUMOTO et al., Tetrahedron Leiters, 49, 4899 (1978), est considéré comme lié à l'activité immunologique.

10 II a maintenant été trouvé que les peptides de formule générale (I) présentent, malgré l'absence d'acide N-acétylmuramique, des propriétés adjuvantes et immunostimulantes remarquables. Par ailleurs ces composés, qui sont bien définis, peuvent être obtenus aisément avec la pureté suffisante requise pour l'emploi en thérapeutique.

15 Dans la formule générale (i), les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, le symbole R^ représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy dont la 20 partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, et les symboles Rg et R^, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement 25 substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu que les symboles R_ et R, ne peuvent pas représenter simultanément un atome 2 d'hydrogène, et étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous ► ' forme D, la lysine, lorsque l'un des symboles R2 ou représente un JO atome d'hydrogène, est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélique ou ses dérivés, lorsque les symboles R^ et R_ identiques ou différents 2 .5 représentent un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle, est sous forme D,D; L,L; DD,LL (rapémique) ou D,L (méso). / ' (f

Vf 3 m ^ «

Par reste d’acide gras, il faut entendre un radical aleanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical hydroxy, phényle ou cyclohexyle ), un radical alcénoyle contenant 3> à 50 atomes de carbone et pouvant contenir plus d'une double liaison ou 5 un reste d'acide mycolique tel que rencontré dans la structure de la paroi bactérienne des mycobactéries, des Nocardia ou eorynébactéries.

Selon la présente invention, les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus selon les méthodes généralement utilisées en synthèse peptidique. Les différentes réactions sont mises en jeu après 10 blocage par des groupements protecteurs convenables des fonctions amines * ou acides qui ne doivent pas participer dans les réactions, et suivies du déblocage de ces fonctions.

Plus particulièrement, les nouveaux tripeptides de formule générale (I) peuvent être obtenus par action d'un dipeptide de formule 15 générale : R_ - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R,.

5 I I (m)

CH_ CHLCIL - COOH

3 d d dans laquelle R- représente un reste d'acide gras ou un groupement b protecteur de la fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t,-butyloxycarbonyle et R^ représente un radical amino ou un radical 20 alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ), sur un aminoacide de formule générale ; H^N - CH - R, I 5 - (w) R5 - NH - CH - R2 dans laquelle et R^, identiques ou différents, représentent un atome 25 d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alooyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle, étant entendu / que Rg et R^ ne peuvent pas représenter simultanément 14η atome d'hydro- sy gène et R^ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur/^?' I# ; * de fonction amine tel que le radical benzyloxycarbonyle ou t,-butyloxy-carbonyle, étant entendu que l'un au moins des symboles des formules (III) et (IV) représente un reste d'acide tiras, suivie éventuellement du remplacement : 5 - du radical R_, lorsqu'il représente un groupement protecteur de fonction 5 amine par un atome d'hydrogène, - du radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle ) par vin radical bydroxy, et 10 - des radicaux R_ et R_, lorsqu'ils représentent un radical aleoyloxy- 2 p carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical carboxy.

Généralement il est nécessaire d'activer la fonction acide libre 15 du dipeptide de formule générale (ill) préalablement à son action sur l'aminoacide de formule générale (IV). De préférence le dérivé activé du dipeptide de formule générale (ill) est un anhydride mixte, préparé in situ par action d'un halogénoformiate d'alcoyle (tel que le chloro-formiate d'isobutyle) sur le dipeptide de formule générale (JIl). La 20 condensation du dérivé activé s'effectue dans un solvant organique tel que le dioxanne, le tétrahydrofuranne, le chloroforme, le toluène ou le diméthylformamide ou dans un milieu hydroorganique en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthy-lamine), à une température comprise entre -10 et +30 °C.

25 Le remplacement éventuel du radical par un atome d'hydro gène et des radicaux par un radical hydroxy et R2 et par un radical carboxy peut être effectué selon les méthodes connues suivant la nature des groupements protecteurs. Il est particulièrement avantageux de choisir les radicaux R^, R^, R^ et R^ de telle manière que leur 30 remplacement par vin radical hydroxy ou carboxy, selon les cas, ou un atome d'hydrogène puisse s’effectuer en une seule phase. A cet effet, il convient de choisir le radical parmi les radicaux benzyloxy ou nitrobenzyloxy et les radicaux R2, R^ et R,_ parmi les radicaux benzyloxy-carbonyle ou nitrobenzyloxycarbonyle. Dans ces conditions le remplacement 35 de ces radicaux s'effectue par hydrogénolyse en opérant dans un solvant / organique approprié tel que l'acide acétique (éventuellement en mélange/j / avec un autre solvant tel que le méthanol) ou dans un solvant hydro- j-J / organique en présence d'un catalyseur tel que le palladium, par exemple le palladium sur noir, à une température voisine de 20°C et sous une pression voisine de J6ù mm de mercure.

Le dipeptide de formule générale (ill) peut être obtenu par 5 action d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale : R- NH - CH - COOH 5 I (V) CH3

dans laquelle R._ est défini comme précédemment, sur un dérivé de l'acide D

- D glutamique de formule générale : H„N - CH - CO - R., 2 | 4 (VI)

CHgCHg - COOH

10 dans laquelle R^ est défini comme précédemment, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipepti.de de formule générale (III) sur un aminoacide de formule générale (iv).

Le dipeptide de formule générale (III) dans laquelle R,, repré- u sente un reste d'acide gras peut être obtenu par action d'un dérivé 15 activé d'un acide gras de formule générale : R' - CO - OH (VII) dans laquelle R1-CO- représente un reste d'acide gras tel que défini précédemment, sur un dipeptide de formule générale ; ^ | I 4 (VIII)

CH^ CH2CH2 - COOH

20 dans laquelle R^ est défini comme précédemment.

Comme dérivé activé'de l'acide de formule générale (Vil), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halogénure d'acide ou un anhydride mixte qui est généralement préparé in situ par action d'un / halogénoformiate d'alcoyle, tel que le chloroformiate d'isobutyle, suh -îr Λ b l’acide de formule générale (vil), en présence d'une base.

Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (Vil) sous forme d'un halogénure d'acide, plus particulièrement le chlorure, la réaction s'effectue dans un solvant organique tel que l'éther diéthy-5 lique ou le chlorure de méthylène, en présence d'une base (minérale, telle que la soude, ou organique, telle que la triéthylamine), à une température comprise entre O et 50°C. Généralement le dipeptide de formule générale (VIII) est utilisé sous forme d'un sel tel que le chlorhydrate, 10 Lorsque l'on utilise l'acide de formule générale (Vil) sous forme d'anhydride mixte, la réaction s'effectue dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (ill) sur l'aminoacide de formule générale (IV). Généralement le dipeptide de formule générale (VIII) est utilisé sous forme d'un sel 15 tel que le chlorhydrate.

L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle ïb> représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical carboxy et représente un radical benzyloxycarbonyle, c'est-à-dire le (D)-mono-amide de l'acide benzyloxycarbonyl (D)-méso-diamino-2,6 pimélique, 20 peut être préparé selon le procédé décrit dans le brevet belge 821 565· L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle Rg représente un radical carbamoyle, R_ représente un radical carboxy et R,.

7 5 représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sous forme racémique, D,D ou L,L peut être préparé à 25 partir de l'acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet, on prépare selon les méthodes connues l'ester benzylique de l'acide dibenzyl- oxycarbonylamino-2,6 pimélique, qui est mono-saponifié selon la technique décrite par A. ARENDT et eoll., Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum, 48, 1505 (1974), [Chem. Abstr., 82, 51497 S (l975)]> Puis transformé, 50 par action du méthanol ammoniacal, en monoamide de formule générale : Z - NH - CH - C00H j (0¾)5 (UC) /J.

Z - NH - CH - CO - NHg \Jp ί Λ 7 s (dans laquelle Z représente un radical benzyloxycarbonyle) qui, après hydrogénolyse en présence de palladium sur noir, fournit l'acide diami-no-2,6 pimélarnique. Par action d'un sel de cuivre, tel que le bromure cuivrique ou le carbonate basique de cuivre, sur l'acide diamino-2,6 5 pimélarnique, il se forme un complexe qui peut être représenté par la formule : H„N - CH - CO - NH0 2 | d (çh2)^ PLN - CH - C00 • / (x)

y/ N

0C0 - CH - NH- I 2 (ch2)3 H2N - CO - CH - NHg dans lequel le reste amino en du groupement carbamoyle peut être acylé par action d'un dérivé activé d'un acide de formule générale (VII) 15 (de préférence un halogénure tel que le chlorure) ou protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène sulfuré pour donner l'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle Rp représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical carboxy et est défini précé-20 demment.

; L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle Rg représente un radical carboxy, représente un radical carbamoyle et : R_ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la 5 fonction amine sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso) 25 peuvent être préparés à partir de l'acide diamino-2,6 pimélique correspondant. A cet effet, on prépare le complexe cuivrique de formule générale (x) dans lequel le reste amino en a du groupement carbamoyle peut être protégé par action d'un halogénoformiate d'alcoyle ou de benzyle. Le complexe ainsi formé est déplacé par action de l'hydrogène s 50 sulfuré pour donner l'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle-/ Rg représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical earboxv/ /,

Jr i o b et R r.> pré sente un groupement protecteur de la fonction amine. Le

J

reste amine en ^ du groupement carboxy peut être protégé par un reste a1acide gras ou par un groupement protecteur de la fonction amine différent de R . Après élimination du groupement protecteur représenté 5 par R , on obtient le produit de formule générale (IV) dans laquelle R_ représente un radical carboxy, R représente un radical carbamoyle 2 5 et R,_ représente un groupement protecteur de la fonction amine.

5 L'aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle les symboles Rg et R^ sont identiques et représentent chacun un radical 10 carboxy, carbamoyle ou aleoyloxyearbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle ) et R représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso) peut être préparé à partir d'un aminoacide de formule 15 générale (IV) dans laquelle R2 et Ry étant définis comme cl-dessus, R représente un atome d'hydrogène par monoblocage d'une des deux 5 fonctions amines selon la méthode décrite par E. BRICAS et eoll,, Biochemistry, 9, 825 (1970)· L* aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle les 20 symboles Rg et Ry qui sont différents, représentent un radical carbamoyle ou aleoyloxyearbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle) et R,, représente un groupement protecteur de la fonction amine 5 sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso) peut être obtenu 25 à partir d'un aminoacide de formule générale (IV) dans laquelle les symboles R„, R, et R_ sont définis comme ci-dessus et la fonction amine 2 p 5 en a du symbole R, est protégée par un groupement protecteur de fonction 5 amine différent de R_, par élimination de ce groupement protecteur, 5 sans toucher à R_.

5 50 Le produit de formule générale (IV) dans laquelle la fonction

amine en a du symbole R, est protégée par un groupement protecteur de la fonction amine est obtenu, après estérification d un produit de formule générale (IV) dans laquelle l'un des symboles ou repré-sente un radical carboxy et l'autre représente un radical carbamoyle^ / 55 par blocage de la fonction amine dans les conditions habituelles. /M

I

-1.Jr 9 L'aminoaeide de formule générale (iv) dans laquelle R repré- 5 sente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, et - R2 représente un atome d'hydrogène et R^ représente un radical carboxy, 5 carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), ou bien - R0 représente un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement 10 substitue par un radical phényle ou nitrophényle ) et R^ représente un atome d'hydrogène, peut être préparé selon les méthodes connues à partir de la lysine.

Le dérivé de la L alanine de formule générale (V), dans laquelle ft représente un reste d'acide gras, peut êtx*e obtenu par action d'un 5 15 acide de formule générale (Vil) ou d'un dérivé activé de cet acide sur la L alanine dont la fonction acide est éventuellement protégée sous forme d'ester, suivie le cas échéant de l'élimination du groupement protecteur de la fonction acide.

Lorsque la fonction acide de la L alanine est protégée, la 20 condensation de l'acide de formule générale (Vil) est effectuée généralement en présence d'un agent de condensation tel que le dicyclohexyl-carbodiimide en opérant dans un solvant organique tel que le chlorure de méthylène ou le diméthylformamide à une température comprise entre -10 et +30 °C.

25 Lorsque la fonction acide de la L alanine est libre, il est nécessaire d'activer l'acide de formule générale (VII) préalablement à son action sur la L alanine. Comme dérivé activé de l'acide de formule générale (Vil), il est particulièrement avantageux d'utiliser un halo-génure d'acide ou un anhydride mixte. On opère alors dans les conditions 30 décrites précédemment pour l'action d'un acide de formule générale (Vil) sur le dipeptide de formule générale (VIII).

Le dipeptide de formule générale (VIII ) peut être obtenu par condensation de la L alanine dont la fonction amine est protégée sur l'acide D glutamique ou ses dérivés selon les méthodes habituelles / 35 utilisées en chimie peptidique, suivie de l'élimination du groupement} protecteur de la fonction amine. / Jj/

X

10

Plus particulièrement, les nouveaux tripeptid.es cle formule générale (i) peuvent être obtenus par action d'un dérivé activé de la L alanine de formule générale (V) sur un dipeptide de formule générale : H2N - CH - CO - R4 CH2CH2 - CO - NH - CH - R^ ^ (çp^)5

Rc - NH - CH - R0 5 à 5 dans laquelle Ry Ry et sont définis comme précédemment, étant entendu que l'un au moins des symboles R,_ des formules (V) et (XI) représente un reste d'acide gras, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d'un dipeptide de formule générale (III) sur un amino-acide de formule générale (IV), suivie éventuellement du remplacement : 10 - du radical R-, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la 5 fonction amine, par un atome d'hydrogène, - du radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitro phényle), par ναι radical hydroxy, et .

15 - des radicaux R0 et/ou R , lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy- carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical carboxy, selon les méthodes connues, sans toucher au reste de la molécule.

20 Le dipeptide de formule générale (Xi) peut être obtenu par action d'un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale : Y - NH - CH - CO - Ru | 4 (XII)

CHgCHg - COÛH

dans laquelle R^ est défini comme précédemment et Y représente un groupement protecteur de la fonction amine tel que le groupement t.-butyl-25 oxycarbonyle, sur un aminoacide de formule générale (IV), suivie du ^ remplacement du groupement protecteur Y sans toucher au reste de la / / molécule.

II

Plus particulièrement, les nouveaux tripeptides de formule générale (i) peuvent être obtenus par action d'un acide de formule générale (VII) sur un tripeptide de formule générale : 6 I I 11 CH-, OïLCiL· - CO - NH - ÇH - R, ^ ^ ^ I ^ (XIII) (çh2)3 R6 - NH - CH - R2 5 dans laquelle les symboles R^, et R^ sont définis comme précédemment et les symboles Rg, identiques ou différents, représentent un atome d’hydrogène ou le radical défini précédemment, l’un au moins des symboles Rg représentant un atome d'hydrogène, dans les conditions décrites ci-dessus pour l'action d’un acide de formule générale (VII) 10 sur le dipeptide de formule générale (VIII), suivie éventuellement du remplacement : - du radical Rg, lorsqu’il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d’hydrogène, - du radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 15 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical hydroxy, et - des radicaux R^ et/ou R^, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy-carbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle) par un radical carboxy sans 20 toucher au reste de la molécule.

La présente invention concerne également un procédé de préparation des tripeptides de formule générale (i) par synthèse peptidique de Merrifield en phase solide.

Ce procédé consiste essentiellement à fixer sur un support 25 approprié l'aminoacide de formule générale : R^ - NH - CH -*R^ ,

(XIV) A J

R_ - NH - CH - R0 [ j/ 5 «= y7 v 12 dans laquelle l’un des symboles R^ et R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitro- 5 phényle), R_ représente un reste d'acide gras ou un groupement protec-5 teur de la fonction amine et représente un groupement protecteur de la fonction amine étant entendu que lorsque Rc et R représentent chacun j ( un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine 10 protégée par le radical R , à condenser : - soit l'acide D glutamique dont les fonctions amine et a-carboxy sont convenablement protégées, c'est-à-dire le produit de formule générale : 7 | 4 (XV) CH0CH - C00H d d dans laquelle R est défini comme ci-dessus et représente un radical 7 ^ 15 amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R^ - soit un dérivé de la L alanine de formule générale :

R_ - NH - CH - C00H

' | (XVI) CH^ 20 dans laquelle R^ est défini comme précédemment, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, éventuellement l'acide gras de formule générale (Vil), - soit un dérivé de la L alanine de formule générale :

R - NH - CH - C00H

j (XVII) / CH? " /7 25 dans laquelle R représente un reste d'acide gras, iJ' - soit le dipeptide de formule générale : / *

J

13 Rü - NH - GH - CO - NH - CH - CO - R;, b ] ] 4 (XVIII)

CH_ CiLCiL - COOH

j 2 2 dans laquelle est défini comme précédemment et Rg représente un reste cl'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque Rc représente un groupement protecteur de la fonction o 5 amine celui-ci est différent du groupement protecteur R,_ du produit de 5 formule générale (XIV) et que dans ce cas, on fait ensuite éventuellement réagir l'acide de formule générale (Vil) après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R^, puis à séparer le produit obtenu de son support et à éliminer si nécessaire les groupements protecteurs 10 des fonctions amines et carboxy.

Selon une variante du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié le dipeptide de formule générale : R^ - NH - CH - CO - Rh

CtLCH0 - CO - NH - CH - R_ 22 | 5 (xxï) R_ - NH - CH - R_ 5 2 dans laquelle R^, Ry R^ et R^ sont définis comme ci-dessus et 15 représente un groupement protecteur de la fonction araine, étant entendu que lorsque R et R représentent chacun un groupement protecteur de 5 y , la fonction amine, ces groupements protecteurs sont differents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^, de condenser : , - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XYl), puis, 20 après déblocage de la fonction amine protégée par B. éventuellement l'acide gras de formule générale (Vil), - soit un dérivé de la L alanine de formule générale (XVÏl), puis a séparer le produit obtenu de son support et à éliminer si nécessaire, / les groupements protecteurs dès fonctions amines et carboxy.

. 14

Selon une autre variante du procédé, il est possible de fixer sur un support approprié, le tripeptide de formule générale : R , - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R., 10 j | 4 CH CH0CH0 - CO - NH - CH - R, -5 22 | ^ (xx) (CH„), I 3 R,_ - NH - CH - R0 5 2

dans laquelle R2, R , R^ et R^ sont définis comme ci-dessus et R^Q

5 représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque R_ et RJ^ représentent chacun un groupement protecteur 5 lü de la fonction amine , ces groupements sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^Q, de condenser l'acide de formule générale (Vil), 10 puis de séparer le produit obtenu de son support et d'éliminer, si nécessaire, les groupements protecteurs des fonctions amines et carboxy.

Les supports qui conviennent particulièrement bien sont les copolymères styrène-divinylbenzène ehloromethylés ou hydroxyméthylés, 15 De préférence, le copolymère styrène-divinylbenzène (98-2 ou 99“l) chlorométbylé est utilisé.

La fixation de l'aminoacide de formule générale (XIV) ou du dipeptide de formule générale (XIX) ou du tripeptide de formule générale (XX) sur le support ehlorométhylé s'effectue selon les méthodes 20 habituelles, en particulier, en faisant réagir l'aminoacide, le dipeptide ou le tripeptide en solution dans un solvant organique tel que . ' l'éthanol et en présence d'un accepteur d'acide tel que la triéthylamine.

Il est particulièrement avantageux de chauffer le mélange réactionnel jusqu'à une température voisine de la température d'ébullition 25 du solvant.

Dans les procédés décrits ci-dessus la condensation des amino-acides, peptides ou acides sur un aminoacide ou un peptide fixé sur un / support approprié s'effectue selon les méthodes habituelles utilisées / en chimie peptidique. Il en est de meme en ce qui concerne le blocage' // 30 des fonctions qui ne doivent pas participer aux réactions, suivi éventuellement de leur déblocage. f -* 15 ~r·

Les groupements protecteurs des fonctions amines de l'amino- acide de formule générale (XIV), du dipeptide de formule générale (XIX) ou du tripeptide de formule générale (XX) doivent être choisis de telle manière que leur élimination s'effectue sans toucher à la liaison 5 aminoaeide-support. En particulier les radicaux R^., Rg, R^ et doivent être différents du radical R,. lorsque ce dernier représente un groupement protecteur de la fonction amine et être tels que leur élimination s'effectue sans toucher au groupement protecteur R_ et 5 à la liaison peptide-support, 10 Généralement, lorsque les radicaux R^, R^ ou R^ représentent des fonctions esters, ils sont choisis de telle manière que, lors de la coupure de la liaison peptide-support, ils peuvent être soit conservés, soit transformés en radicaux carboxy ou carbamoyle selon que la coupure sera une hydrolyse acide, une alcoolyse ou une ammonolyse.

15 Plus particulièrement, la liaison peptide-support, qui est de nature benzylique, est coupée par traitement au moyen d'un mélange acide bromhydrique-aeide trifluoroacétique.

Les nouveaux tripeptides de formule générale (i) peuvent être éventuellement purifiés par des méthodes physiques (telles que la 20 cristallisation ou la chromatographie) ou chimiques (telles que formation d'un sel, cristallisation de celui-ci puis décomposition).

Les nouveaux produits selon l’invention peuvent être transformés en sels d'addition avec les acides ou en sels métalliques ou en eels d'addition avec les bases organiques selon la nature des substi-25 tuants.

Les sels d'addition avec les acides peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur des acides dans un solvant approprié. Généralement on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique d'acide puis on lyophilise la solution obtenue.

r/ ** *" ·. *

Les sels métalliques ou les sels d'addition avec les bases organiques peuvent être obtenus par action des nouveaux composés sur des bases dans un solvant approprié. Généralement, on solubilise le produit dans l'eau par addition de la quantité théorique de base puis on lyophi-5 lise la solution obtenue.

Les nouveaux composés selon la présente invention sont des adjuvants et des stimulants de l'immunité : ils augmentent les réactions d'hypersensibilité et/ou la production d'anticorps circulants vis-à-vis des antigènes avec lesquels ils sont administrés et ils stimulent de manière 10 non spécifique des réactions de défense contre certaines infections (par exemple l'infection de la souris par la bactérie intracellulaire Listeria monocytogenes).

In vitro, ils sont actifs à des concentrations molaires géné-râlement comprises entre 10et 10~ °, en particulier dans les tests 15 suivants : - stimulation de la synthèse de l'ADN (pouvoir mitogène) selon la technique de G. MARCHAL, Ann. Immunol. (inst. Pasteur), 125 C, 519 (197*0 -stimulation.de la réaction allogénique (réaction d'histo-incompatibillté) selon la technique de R.W, DUTTON, J. exp. Med., 122, 759 (1966) et 20 A.B. FECK et F.H. BACH, J. Immunol. Methods, 3, 1*7 (1973) - stimulation de la production d'anticorps selon la technique de P.H. KIESIUS, Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N.Y.), 135, 155 (197°) et H. VAN DIJK et N. BLOKSMA, J. Immunol. Methods, l4, 325 (1977) - augmentation du nombre de macrophages phagocytaires selon la technique 25 de J. MICHL et coli., J. exp. Med., lM, 1^65 (1976) - stimulation de l'activité phosphatase acide et N-acétylglucosamidinase (enzymes lysosomiales des macrophages) en l'absence d'une augmentation de la deshydrogénase lactique selon la technique de P. DAVIES et coli., J. exp. Med., 139, 1262 (197*0.

30 In vivo, chez la souris, à des doses comprises entre 1 et 30 mg/kg, ils augmentent l'hypersensibilité retardée et la production d'anticorps en particulier selon la technique de T.E. MILLER et coll., J. Nath. Cancer Inst., 51, 1669 (1973).

Chez le cobaye, ils augmentent la réaction d'hypersensibilité·^/ 35 et de production d'anticorps contre la gammaglobuline bovine couplée/^ 17 avec l'haptène dinitrophénul selon la technique de P. PK)C'H et coll,, Immunol, Communie., 7> 4l (1978).

Chez la souris, ils stimulent les réactions de défense contre l'infection de la souris à Listeria monocytogenes à des doses comprises 5 entre 1 et 100 mg/kg selon la technique de R.M. FAUVE et B. HEVIN, C, R, Acad. SC. (d), 285, 1589 (l977).

„ Chez la souris, ils stimulent le pouvoir d'élimination du carbone colloïdal par le système réticulo-endothélial selon la technique de B.N. Halpern et coll., Ann. Inst. Pasteur, 80, 582 (1951 ).

: 10 Chez le lapin, à des doses généralement comprises entre 0,1 et 5 mg/kg, ils stimulent la formation d'anticorps sériques anti-virus grippal selon la technique de G.H. WERNER et coll., Biomedicine, 22, 440 (1975).

D'un intérêt tout particulier sont les tripeptides de formule 15 générale (i) dans laquelle R^ représente un radical hydroxy ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, R0 représente un atome d'hydrogène L.

ou un radical carbamoyle, représente un radical carboxy ou alcoyloxy-carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone, le symbole R, lié au reste L alanyl, est un radical alcanoyle contenant 8 à 20 16 atomes de carbone et le symbole R, lié à la fonction amino en ot du radical R^ est un atome d'hydrogène. Plus particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (i) dans laquelle R^ représente un radical hydroxy, R^ représente un radical carbamoyle, R^ représente un radical carboxy et les symboles R sont définis comme ci-dessus.

25 Les exemples suivants, donnée à titre non limitatif, montrent comment l'invention peut être mise en pratique.

. ' Les nouveaux produits de formule générale (i) peuvent former des complexes avec les métaux alcalins ou alcalinoterreux. Il en resuite que les résultats de l'analyse élémentaire peuvent s'écarter sensiblement 50 des valeurs théoriques. Cependant, les produits sont identifiés par leur teneur en aminoacides, par le rapport C/N et par leur homogénéité en chromatographie sur couche mihce de silicagel. / / Λ 4 l8 Λ0

Exemple 1 -

On ajoute 1,88 cm3 de chioroformiato d'Isobutyle à une solution, maintenue à 10°C, de 7,03 g de N-lnuroyl L alnnyl-α-Π glutamate de bentyle dans un mélange de 280 cm3 de dioxanne et 2,0 cml de t ri éthylamtne. Le mélange est ^ agité pendant 20 minutes à 10°C puis on ajoute une solution de 4,04 g de N e-benzyloxycarbonyl L lysine dans un mélange de 30 cm3 de dioxanne et de ' 14,4 cm3 de soude IN* Le mélange réactionnel est agité pendant 20 heures h 18eC

environ· L'insoluble formé est dissous par addition de 280 cm3 d'eau. La solution obtenue est agitée encore pendant 1 heure, puis acidifiée à pH 3 par -; ^0 addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. L'1nsoluble formé est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'eau et séché sous pression réduite. (0,3 mm de mercure) à 20®C. On obtient ainsi 7,7? g d'un solide blanc que l'on chromatographie sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 230 g de gel de silice neutre. On élue successivement par 700 cml d'un mélange acétone-cyr.lohexane 15 (9-1 en volumes), 1,1 litre d'acétone et 1,7 Utre dp méthanol en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 35 sont, réunies, concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 0„ obtlent alnsl 5,97 g de B n-Co -benzyl B-(H-leuroyl L al»nyI)-y_D RllltOTy1, „ „.benzylozycarbonyl L lysine· 20 R£ * °’84 t'Ulcagal -, n.hutanol -pyrldlne-acide acétlque-eau (50-20-6*24 en volumes)].

m dissout 1,77 g do N o-lo'-benzyl B-(B-l.uroyl L alanyD-y-B glutamyl] N ,-benzyloxycarbonyI L lysine d», „3 ,,, „éthanol. 0« .Joute 1,77 g de pallsdiun sur oolt (i Π a» Palladio™) put. on f.lt passer un léger 25 courant d'hydrogène pendant 4 heures. mtr<tlln, „„contraction à sec do filtrat, l'huile résiduelle est reprise p„r 20 em3 d'acétone. On obtient ainsi 1,06 g d'on solide blanc recrlstaU.se dans on mélange d'éthanol (12 Ctn3) at d'acétone (24 cml). On obUdn, 0-„ g d„ „ „.[„.(buanroyl L .l.nyl>-y-D glutamyll L lysine fond*,, j (fils„m 3° Rf = 0,29 Isl'lrogel ; n. I,,,, ! d i n o-I rlc acétlque-eau (50-20-6-24 en volumes)|.

Analyse Cale. % C, 54,07 II „ )0>60 / ΤΓ· SR'4 B,B 10,0 Æ'

V

19

Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants :

Ala : 1,02 (théorie = 1)

Glu : 1,00 (théorie = 1) 5 Lys : 0,89 (théorie = 1) - Le N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé

Selon l’une des deux méthodes suivantes : a) A une solution de 12,75 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 75 cm3 de soude ΙΝ,οη ajoute simultanément en 37 minutes, 10 8 g de chlorure de lauroyle dissous dans 75 cm3 d’éther et 37,4 cm3 de soude lfl de façon à maintenir le pH du mélange réactionnel compris entre 8 et 9· Le mélange est agité pendant 1 heure 20 minutes. Après décantation, la phase aqueuse est acidifiée à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique IN (60 cm3), extraite 3 fois par 300 cm3 au total d’acétate d’éthyle. Les extraits organiques 15 réunis sont lavés par 25 cm3 d’eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°G· On « obtient ainsi 7,4 g d’un solide blanc que l’on chromatographie sur 80 g de gel de silice neutre contenus dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue successivement par 100 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (8-2 en 20 volumes) et 200 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-méthanol (1-1 en volumes), en recueillant des fractions de 50 cm3. La fraction 1 est concentrée à sec /* sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C· On obtient ainsi 2 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 130°C. Les fractions 2 à 4 sont de même concentrées à sec et chromatographiées sur 100 g de gel de contenus 25 silice neutre (0,063-0,20 mm)/dans une colonne de 2 cm de diamètre. On élue par 250 cm3 d’acétone en recueillant des fractions de 25 cm3. Les fractions 1 et 2 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C· On obtient ainsi 4,07 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 130°C dont les caractéristiques sont les suivantes : 30 - 0,9 [ Silicagel ; n.butano1-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes))

Analyse Cale. % C 66,10 H 8,63 N 5,7l Tr. 66,3 8,8 5,6 b) On ajoute 31 cm3 de chloroformiate d’isobutyle à une solution, 35 maintenue à une température voisine de 10°C, de 47,75 g d’acide laurique dans 3 litres de dioxanne et 33,3 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant / 20 minutes à 10°C, puis on ajoute en 10 minutes une solution, refroidie à tÖ°ßy

V

20 * ë de 88,95 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle, dans un mélange de 1 litre de dioxanne, de 476 cm3 d'eau et de 476 cm3 de soude 1 N·

Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 10°C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20°C î il est ensuite dilué par addition de 5 4 litres d'eau, acidifié à pH 2 par addition d'acide chlorhydrique IN (environ 475 cm3) et conservé pendant 2 heures à 0°G· Le précipité obtenu est séparé par filtration, lavé successivement par 500 cm3 d'eau et 500 cm3 d'éther, puis séché SOUS pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C· Le produit est mis en • suspension dans 800 cm3 d'éther, agité pendant 1 heure, séparé par filtration 10 et lavé 2 fois par 200 cm3 au total d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°G, on obtient 71,79 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle fondant à 130°C.

Rf =0,77 tsilicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (4-1 en volumes)].

Le chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être 13 préparé de la façon suivante :

On dissout 97,16 g de N-t.butyloxycarbonyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 970 cm3 d'une solution anhydre d'acide chlorhydrique 1,7 N dans l'acide acétique· On agite pendant 2 heures, puis on ajoute rapidement 3,8 litres d'éther anhydre et on laisse reposer pendant 2 heures à 0°G. Le précipité 20 huileux qui s'est formé} séparé du surnageant par décantation, est dissous dans 500 cm3 d'acétone ; la solution ainsi obtenue est concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 88,9 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle.

Le N-t»butyloxycarbonyi L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être 25 préparé selon la méthode de E. BRICAS et coli·, Biochemistry 9, 823 (1970)·

La N g-benzyloxycarbonyl L lysine peut être préparée selon la méthode de A· Heuberger et coli·, Biochem. J., 37, 515 (IQ43).

Exemple 2 -

On ajoute 0,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, •30 maintenue à -10°C, de 2,45 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 80 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,70 cm3 de triéthylamine·

Le mélange est agité pendant 20 minutes à -10°C puis on ajoute une solution, refroidie à -10°G, de 2,24 g de ;:chlorhydrate de N e-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans un mélange de 40 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,77 cm3 de 35 ttiéthylamine* Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à -10°G, puis pendant 2 jours à 20°C environ. On concentre ensuite le mélange réactionnel / à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C. Le solide blanc «- 21 est repris dans 100 cm3 d'acétate d'éthyle à 40°C, trituré jusqu'à pulvérisation, séparé par filtration, trituré à nouveau dans 50 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure)· On obtient ainsi 2,69 g de N a-[N-(0*-benzyl N-lauroyl L alanyl)-y-D 5 glutamyl] N e-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle.

Rf =* 0,80 tsilicagel ; acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volumes)]# r 1

On dissout 2,65 g de N α-LO -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] N g-benzyloxycarbonyl L lysinate de benzyle dans 265 cm3 d'acide ’ acétique. On ajoute 2,65 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on 10 fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C» on obtient 1,81 g de N a-ÜN-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamyl] L lysine identique au produit obtenu à l'exemple 1.

Le N e-benzyloxycarDonyl L lysinate de benzyle peut être préparé 15 selon la méthode de T. Shiba et coll., Bull. Chem. Soc. Japan, 33, 1721 (I960)·

Exemple 3 -

On ajoute 3,17 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue vers 10°C, de 11,96 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 490 cm3 de dioxanne et de 3,43 cm3 de triéthylamine. La 20 solution est agitée pendant 20 minutes vers 10°C, puis on ajoute une solution de 8,87 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique à

R

88,8 % (dosage perchlorique) dans un mélange dé 219 cm3 d'eau et de 24,4 cm3 de soude lN«Le mélange Réactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 10°C puis pendant 15 heures à une température voisine de 20°C î il 25 est ensuite filtré. Au filtrat, on ajoute 360 cm3 d'eau et on sépare par filtration un léger insoluble formé. Le filtrat est acidifié à pH 2 par addition de 49 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 750 cm3 au total d’eau et séché. On obtient ainsi 16,3 g d'une poudre blanche que l'on chromatographie sur 800 g de. gel de silice 30 neutre (0,0635-0,20 mm) contenus dans une colonne de 6 cm de diamètre. Pour cela on dissout les 16,3 g de poudre dans 800 cm3 de méthanol et à la solution obtenue, on ajoute 160 g de sable de Fontainebleau. On évapore à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à fio°C et le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne de silice. On élue successivement avec 1 litre d'acétate/ 35 d'éthyle, 4 litres d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (9-1 en volun^s^^/ / L , 4» ï 22 7 litres d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (85-15 en volumes) et 4 litres d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (1-1 en volumes) en recueillant des fractions de -250 cm3· Les fractions 45 à 60 sont réunies et concentrées à sec^sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 9,4 g 5 d*acide N -£o -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D glutamylj -benzyloxycarbo-nyl DO,LL diamino-2,6 pimélamique.

llf =0,53 [silicagel î n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)].

2 1

On dissout 4,07 g d'acide N -ÎO -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-y-D

g iû glutamyl] is; -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 200 cm3 d*acide acétique. On «joute 4 g de palladium sur noir (a 3 % de palladium) et on fait passer an léger courant d'hydrogène pendant 7 heures. Après filtration at concentration a sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°O» in meringue obtenue est reprise par 45 cm3 a total de méthyIcyclouex ane 15 et amenee cnaque rois a sec sous pression réduite (2G mm de mercure) à 6û°G·

La poudre ainsi obtenue est séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) » 2

a 50°G· On obtient 2j76 g d'acide N -(N-lauroyl L alanyl-y-D glutamyl) DD,LL

diamino-2,6 pimélamique.

ilf = 0,49 (silicagel ; acide acétique) 2û Analyse : Cale σ/α 56,72 H 8,64 ï 12,25

Cr. 53,4 0,5 10,9

Apres hydrolyse totale, .*analyse sur autoanalyseur Technicon révèle la présence des acides aminés suivants : Aîa 1,00 (théorie =1) 2 5 Dap 0,99 (théorie — l)

Glu 1,05 (théorie = i).

L'acide Kl^-benzyioxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 9,7 g de dichlorhydrate de ï^acide DD,LL diamiûo-2,v 50 pimélamique dans 63 cm3 d'eau amenée à pH 10 par addition de 37 cm3 de soude iU, on ajoute 4,35 g de bromure cuivrique dissous daty* 44 cm3 d'eau. On agite la rué lange réactionnel pendant 2 heures à 2G°C environ. On sépare par filtration un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise entre -3°C et 0°C* On ajoute 9,2 g de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte 55 à goutee en 30 minutes, 7,9 cm3 de chloroformiate de benzyle.Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures h une température voisine de 20°G * Le précipité bleu formé est séparé par filtration lavé par 15 cm3 d'eau, 2 fois /)/ par 30 cm3 au total d'éthanol et *5 cm3 d'éther. Après séchage sous pressioï^çr 2? όΟ απ3 d’acide chlorhydrique IN. Cn agite pendant 2 heure è> une température vûtoinû û6 «.u®o. IL» *ι·^οΛύιβ eût ueparé par filtration» Au tiAtrat, on ajoute 30 cmô de méthanol puis on iait passer un courant d'hydrogène sulfuré pendant 1 heure 1/2» un laisse reposer pendant Ιό heures* La bouillie noire 5 obtenue est filtrée, lavée 4 fois par 160 cm3 au total d'eau. Les filtrats reunis sont concentrés jusqu'à un volume de 30 cm3 sous pression réduite ,{20 mm de mercure) à 50°C, amenés à pn 9 par addition de 7,5 cm3 de triéthyl-amine, dilues par addition de 20 cm3 d’eau et amenés à pH 6 par addition de 5,5 cîïUi d’acide chiornydrique 11;· La bouillie blanche ainsi obtenue est iiû conservée a 0°G per.&ant 2 heures* Le produit qui se sépare par filtration est fc«*ve successiv«mei.w par ru cm3 o’eau et 20 cm3 d’etlianol et seche sous pression réduite* On obtient ainsi 5,8 g d’acide N^-benzyloxycarbonyl DD,LL cis*&iio-2,o pluielarâique à 96 Ί» (dosage perchlorique).

Le dicnlorhydrate de l’acide DD,LL di smir.o-2,6 pimélamique peut être 15 préparé de la façon suivante :

On dissout 33 g d’acide DD,LL dîbenzyioxycarbonylaiaino-2,6' piméi ami que dans un mélange de 1,6 litre de méthanol et de 14,6 cm3 d’acide chlorhydrique concentre (d — 1,19)· On ajoute 63 g de palladium sur no-ir (à 3 % de palladium) et on fait passer un courant d’hydrogène pendant 10 heures· Après filtration 20 et concentration à sac du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C, on obtient 40,5 g de dichlorhydrate de l’acide DD,LL diamino-2,6 pîmélsmique sous forme de meringue.

L’aciae DD,LL dibenzyloxycarbônyiamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 25 On dissout 168 g d’ester monobenzylique de l’Acide DD,LL dibenzyloxy- carbonylamino-2,6 piméiique dans 1,68 litre de méthanol. On refroidit cette solution vers 0°C et on la sature d’ammoniac. Dès qu’elle est saturée, on la transvase dans 3 autoclaves de 1 litre. Après avoir fermé ces autoclaves, on les conserve pendant 40 heures à 20°C environ. Après dégazage, la solution 30 ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm de mercure) à &0ÛC.

Le résidu est dissous dans 2 litres d’eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition d’acide chlorhydrique 4N. Il se forme un précipité gommeux qu’on isole par décantation, triture avec 2 litres d’éther, sépare par filtration, lave 2 fois par 400 cm3 au total:'d*éther et 2 fois par 400 cm3 au total d’eau.

35 Après séchage, on obtient 83,5 g d’acide DD,LL dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique fondant à 145-150°C· /

Rf = 0,69 [silicagel ; n.butanol-éthanol-eau-ammoniaque concentréeys (4-4-1-1 en volumes)}.

2k • -dt*: a « «·.

Le monoester benzylique de l'acide DD,LL dibenzyioxycarbonylamino-2,6 pimélique peut être préparé selon la méthode de A. ARENDT et coll,, Roczniki Chemii Ann. Soc. Chim. Polonorum 48, 1305 (1974) ]Chem. Abstr., 82, 31497 g (1975)].

5 Exemple 4 -

On ajoute 0,Ç1 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à -5°G, de 2,5 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine dans 15{Χ·αη3 de diméthylformamide et 0,87 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à + 2°C, de 2,02 g 10 d'acide N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 62,5 cm3 d'eau et 6,25 cm3 de soude 1 N. Le mél ange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°C puis pendant 18 heures à 20°C environ, et est ensuite filtré.

Le filtrat, dilué par addition de 300 cm3 d'eau, est acidifié à pH 1 par addition de 15 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité apparu est séparé par 15 filtration, lavé 3 fois par 30 cm3 au total d'eau puis séché. On obtient ainsi 2,03 g d'un solide blanc auquel on ajoute 680 mg d'un produit obtenu dans des conditions analogues. Le mélange est dissous dans 30 cm3 d'acide acétique contenant 5 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec puis on dépose le résidu sur une colonne de 2 cm de diamètre contenant 60 g de gel 20 de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7-3 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) et 480 cm3 d'acide acétique en recueillant des 25 fractions de 40 cm3. Les fractions 17 à 49, sont réunies et concentrées à sec, 2

On obtient ainsi 1,78 g d'acide N -(N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] 6 + . ' N -benzyloxycarbonyl DD, LL dl.amino-2,6 pimélamique

Rf — 0,65 [Silicagel ; acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 en volumes)] 30 On dissout 1,76 g d'acide N2-[N-(N-Iauroyl. L alanyl)-D isogluta minyl] N^-benzyloxycarbony! DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 1,76 g de palladium sur noir (a 3 % de palladium) puis on fait passer un courant d'hydrogène pendant 2 heures et de.mie. Apres Filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ et dilué par addition de 100 cm3 d'éthpr» 35 Le précipité formé est séparé par 1 i 11 ra! ion, lave 2 fois par 40 cm3 au total/ 1/ 4 25 « 2 d’éther et séché. On obtient ainsi 1,37 g d’acide N -[N-(N-lauroyl L alanyl)-D isoglutaminyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique.

Rf = 0,40 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-20-6-24 en volumes)] 5 Le N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine peut être préparé de la façon suivante :

On dissout 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle dans 330 cm3 d’acide acétique. On ajoute 6,6 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant d’hydrogène pendant 2 heures.

10 Après filtration du mélange réactionnel, on verse le filtrat dans 3 litres dfeau.

* Après 2 heures de repos à 0°C, le précipité apparu est séparé par filtration, lavé 2 fois par 80 cm3 au total d’eau, puis séché. On obtient ainsi 5,16 g de produit auquel on ajoute 0,5 g d'un produit obtenu dans des conditions analogues.

Ce mélange est dissous dans 90 cm3 de méthanol bouillant et à la solution 15 obtenue on ajoute 45 cm3 d’eau. Après 2 heures de repos à une température voisine de 20°C, les cristaux apparus sont séparés par filtration, lavés 2 fois par 60 cm3 au total d'eau et séchés sous pression réduite (20 mm de mercure). On obtient ainsi 5,1 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutamine fondant à 163°C.

20 Rf =0,18 [silicagel. ; acétate d ’ éthyle -méthanol (4-1 en volumes)]

Analyse : Cale. % ~ C 60,12 H 9,33 N 10,52

Tr. = 60,2 9,5 10,9

Le N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle peut être préparé de la façon suivante : 25 On ajoute 2,54 cm3 de chloroformiate d’isobutyle dans une solution» maintenue â 0°C, de 3,9 g d’acide laurique dans 156 cm3 de toluène anhydre et 2,7 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes è 0°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 6,7 g de chlorhydrate de L alanyl-D isoglutaminate de benzyle clans 52 cm3 d’eau et 2,7 cm3 de triéthyl-30 amine. Le mélange réactionnel est agité pendant 65 heures à une température voisine de 20°C. On obtient une masse réactionnelle d'aspect gélatineux à laquelle on ajoute 150 cm3 d’acétate d’éthyle. Iæ précipité est séparé par filtration, lavé par 30 cm3 d'eau puis séché. On obtient 7,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle sous forme d’une poudre blanche. La phase aqueuse du 35 filtrat précédent est extraite 2 fois par 100 cm3 au total d'acétate d’éthyle, cette phase acétate d'éthyle est réunie avec la phase organique du filtrat, / lavée par 125 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 120 cm3 d'eau, séchée sur sulfaeft/ 26 de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50 °C. On obtient à nouveau 1,5 g de N-lauroyl b alanyl-D isoglutaminate de benzyle. Le produit (7,6 g et 1,5 g) est recristallisé dans 120 cm3 de méthanol. On obtient ainsi 6,6 g de N-lauroyl L alanyl-D isoglutaminate de benzyle fondant 5 à 169°G,

Rf =0,13 [silicagel ; acétate d'éthyle]

Le chlorhydrate de L alanyl-D isoglutaminate de benzyle peut être préparé selon le procédé de S. KUSUMOTO, Bull. Chem. Soc. Japon 49, 533 (1976).

Exemple 5 - 10 On ajoute 0,91 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à 0°C, de 3,04 g de N-oc-tanoyl I, alanyl-q-D glutamate de benzyle dans 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,08 cin3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on a joute une solution, refroidie à 2°C, de 2,26 g d'acide N^-benzyioxycarbony 1 Di),LL diamino-2,6 pimélamtque dans un 15 mélange de 70 cm3 d'eau et île 7 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°C, puis pendant 20 heures à une température voisine de 2Q°C. Le tétrahydrofuranne est ensuite évaporé sous pression réduite (20 n*n de mercure) â 50°C» Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité 20 blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau puis séché. On obtient ainsi 4,73 g d'un solide blanc qui est chromatbgraphié sur une colonne de 2,2 cm de*diamètre contenant 100 g de gel de Silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, Je produit est dissous dans 20 cm3 d'acide acétique.

A la solution obtenue, on ajoute 10 g de gel de silice neutre et concentre à 25 sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 280 cm3 d'acetate d'ethyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes), 160 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1-1 en volumes) en recueillant des 30 fractions de 40 cm3. Les fractions 13 à 23 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) a 50°C. On obtient une huile qui se solidifie dans l'éther. Après séparation par filtration et séchage, on obtient 2,84 g d'acide N^-[0^-benzyl N-(N-octaooy 1 L alanyl)y-D glut.avnyl] N -benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique. / 35 Rf = 0,68 [silicagel ? acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 ea- / volumes) ]

A

27 - * 2 1

On dissout 2,82 g d'acide N -[O -benzyl N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D

glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diâmino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,82 g de palladium sur noir (h 3 % de palladium) puis on fait passer un courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2. 'Après filtration, le 5 filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et dilué par addition do 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé par 20 cm3 d'éther puis séché. On obtient ainsi 2 2,0 g d'acide N -[N-(N-octanoyl L alanyl)-y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique fondant à 160-164°C (fusion piteuse).

10 Rf = 0,30 [s iliçagel ; n.butanol-pyrldine-acide acétique-eau » (50-20-6-24 en volumes)]·

Analyse : Cale. %=C53,58 H 8,02 N 13,58 Tr. = 53,OS 8,17 13,06

Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon révèle 15 la présence des acides aminés suivants :

Ala 1,00 (théorie ~ 1)

Dap 0,95 (théorie = 1)

Glu 1,02 (théorie = 1)

Le N-octanoyl L alanyl-oc-D glutamate de benzyle peut être préparé 20 de la façon suivante :

On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue à -1°C, de 3,95 g d'acide octanol'que dans 140 cm3 de têtrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -1°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 0°C, de 9,45 g de chlorhydrate de 25 L alanyl-ût-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à -1°G puis pen» dant 20 heures à 20°C environ. Tl est ensuite acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique 1 N. Le têtrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C, puis le concentrât est extrait par 100 cm3 d'acétate 30 d'êthyle. La phase organique ainsi obtenue est 1avéo 2 Fois par 50 cm3 au total d'acide chlorhydrique 1 N eL par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C.

On obtient ainsi 10 g d'une huile jaune pâle qui est chromatographlée sur une / Ψ / « 28 - ·» colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue avec de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 7 à 9 réunies sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. Le résidu obtenu est trituré dans 100 cm3 5 d'un mélange éther-éther de pétrole (P.E. = 35-6Ô°C) (1-4 en volumes),'séparé par filtration et séché. Ôn obtient ainsi 3,27 g de N-octanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle sous forme iune poudre blanche.

Rf = 0,56 [silicagel ; acétate d'éthyle-methanoï (8-2 en volumes)]

Exemple 6 -

On ajoute 0,70 cm3 de chloroformiate d'isobutyle dans une solution, maintenue â 2°G, de 2,91 g de N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans 120 cm3 de tétrahydrofuranne et 0,75 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 2eC, puis on ajoute une solution, refroidie à 2°G, de 1,726 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 53,4 cm3 d'eau et de 5,34 cm3 de soude 1 N. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 2°C, puis pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le tétrahydrofuranne est évaporé sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G* Le concentrât est dilué par addition de 50 cm3 d'eau et acidifié à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité 20 blanc obtenu est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 4,15 g d'un solide blanc qui est chromatographie sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 85 g de gel( de silice neutre (0,04-0,063 mm). Pour cela, le produit est dissous dans de l'acide acétique à 60^0. A la solution obtenue on ajoute 10 g de gel de silice neutre puis on 25 concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°G. Le résidu ainsi obtenu est chargé sur la colonne et on élue successivement par 320 cm3 d'acétate d'éthyle, 360 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9-1 en volumes), 320 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8-2 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 14 à 22 réunies sont concentrées à 30 sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

Le résidu obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther, séparé par filtration, et séché. On obtient ainsi 2,20 g d'acide N -[0 -benzyl N-(N-palmitoyl L alanyl)-y-D glutamyf ] N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,.6 pimélamique · .

55 Rf — 0,75 [silicagel j acétate d'éthyle-acide acétique (3-1 m / volumes)] / J/ 29

On dissout 2,14 g d'acide N «[0 -benzyl N(N-palmitoyl L alanyD-γ-D glutamyl] N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 80 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,14 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) puis on fait passer un lent courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2* Après 5 filtration, le filtrat est concentré à 5 cm3 environ sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C puis est dilué par addition de 100 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total d'éther et séché. On obtient ainsi 1,58 g d'acide N ~[N-(N-palmitoyl L alanyOy-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique.

10 Rf =0,30 [silicagel ; n.butanol-pyridine-acide acétique-eau (50-'0-6-24 en volumes)].

Le N-palmitoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 3,6 cm3 de chloroformiate d'isobutyie dans une solution, 15 maintenue a 0°C, de 7,03 g d'acide palmitique dans 140 cm3 de tétrahydrofuranne et 3,8 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une Solution, refroidie à 0°G, de 9,45 g de chlorhydrate de L alanyl-ot-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude 1 N et de 30 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à 0°C, puis 20 pendant 18 heures à 20°C environ ; il est ensuite acidifié â pH 1 par addition de 70 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N. Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 5 fois par 200 cm3 au total d'eau et séché. On obtient ainsi 12,11 g d'une poudre blanche qui est chromatographie sur une colonne de 2,5 cm de diamètre contenant 200 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement 25 par 200 cm3 d'acétate d'éth’'e, 300 cm3 d*un mélange acétate d'éthyle-methanol (9-1 en volumes), 1,6 litte d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (8-2 en volumes), 400 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-méthanol (6-4 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 5 à 23 réunies sont concentrées â sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 30 5,18 g d'un solide que l'on triture dans 50 cm3 d'éther bouillant pendant 1/2 heuri

Après refroidissement à une température voisine de 20°G, l'insoluble est séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 c.m3 au total d'éther puis séché. On obtient/ ainsi 2,94 g de N-palmitoyl L alanyl -α-D glutamate de benzyle. j /

Rf = 0,77 [silicagel ; acétate d'éthyle] />f . Λ » »

Exemple *7 -

On ajoute 1,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 4,91 g de N-lauroyl L alanyl-a-0 glutamate de ben-zyle dans un mélange de 250 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,4 cm3 de c triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0eC 3,32g de chlorhydrate de N £-benzyloxy-carbonyl L lysinate de méthyle dans un mélange de 10 cm3 de soude IN et 10 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -5°C, puis pendant 4 Jours à une température voisine de 20 "C. Ensuite, le mélange réactionnel est acidifié à pH 1 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure ) à 45 °C. Le concentrât est extrait 5 fols par 150 cm3 au total de chloroforme. Les phases chloroformiques, réunies, sont lavées par 40 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1N et £5 séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50eC, on obtient une huile Jaune pale que l'on dissout dans 60 cm3 de chloroforme contenant 15 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colonne de 3 cm de diamètre contenant 150 g de gel 20 de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 2,5 1 d'acétate d'éthyle et 4û0 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 6 à 27, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°0. On obtient ainsi 3,4γ g de N «-[o^bcnzyl N-(N-lauroyl 25 L alanyl)-Y-D glutamylj N £-benzyloxycarbonyl L lysinate de méthyle sous forme de poudre blanche.

Rf = 0,70 jcilicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes )j

Rf = 0,40 ^silicagel; acétate d'éthylej 30 On dissout 3,43 ß de N tt-jo^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)- Y-D glutamylj N E-benzyloxycarbonyl L lysinate de méthyle dans 70 cm3 d'acide acétique. On ajoute 3^3 £ de palladium sur noir (à 3 # de palladium) puis on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures.

Le catalyseur est séparé par filtration, lavé 2 fois par 20 cm3 au total 35 d'acide acétique, les filtrats réunis sont concentrés à sec sous près- / sion réduite (20 mm de mercure) à 50°C* Le résidu ainsi obtenu est / /.

trituré dans 50 cm3 d'éther. On obtient ainsi une poudre que l'on sépareL^ 31 • <'*!·'«r Λ par filtration et que l'on sèche à l'air. On obtient ainsi 1,89 E de Na-[k-(M-lauroy 1 L alanyl)-Ύ -D gluUmyl]L lysinate de méthyle.

Rf - 0,50 (silioagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes )J

5 Rf - 0,29 (silicagel; acide acétique)

Exemple 8 -

On ajoute 1,6 cmjj de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 6,07 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 280 cm3 de tétrahydrofuranne et de 1,74 cmj5 10 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C; puis on ajoute une solution refroidie à 3°0 de 4 g d'acide N6 -benzyloxy-carbonyl méso diamino-2(L)j6(D) pimélamique dans un mélange de 12,4 cm3 de soude IN et 124 cmp d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant 70 heures vers 20°C environ. le mélange 15 réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Dans le concentrât, on a un précipité blanc que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 150 cm3 au total d'acide chlorhydrique 0,1 N et 3 fois par 150 cm3 au 20 total d'eau et sèche sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C.

On obtient ainsi 9,15 g de poudre blanche que l'on dissout dans 100 cm3 d'acide acétique contenant 20 g de gel de silice neutre (0,04-0,003 mm).

On concentre à sec le mélange et on charge l'ensemble sur une colnnne de 5 cm de diamètre contenant 400 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 nun).

25 On élue successivement par : 1,6 1 d'acétate d'éthyle, 9OO cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (97,5/2,5 en volumes) 1200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes) 9OO emj d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (92,5/7,5 en volumes) 30 9OO cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (90/10 en volumes) 3OO cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (85/15 en volumes) 3200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (80/20 en volumes) en recueillant des fractions de 100 crn3. Les fractions 6l à 90,réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

35 Le solide blanc obtenu est lavé 2 fois avec 100 cm3 au total d'éther , et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 60°C. On obtient p / ainsi 6,3 g d'acide N^jo^-benzy 1-N-(N-lauroyl L alanyl) -T-D glutamyl] / J/ 52 N°-benzyloxycarbonyl méso dianiino-2(L), 6(D) pimélamique.

Rf = 0,77 jsilicage 1; acétate d'éthyle-acide acétique (5/1 en volumes)]

On dissout 8,2 g d'acide - [θ^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-5 T-D glutamyl] N -benzyloxyearbonyl méso diamino-2(L),6(D) pimélamique dans 225 cm;5 d'acide acétique. On ajoute 8,2 g de palladium sur noir (à 3$ de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures 1/2. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile obtenue 10 est triturée dans 100 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 50°C, On obtient ainsi 5,9 g de poudre. 0,9 g de cette poudre est mis en solution dans de l'acide acétique et filtré sur une colonne de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) de 2 cm de diamètre et de 2 cm de hauteur.

15 Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le résidu obtenu est repris par 50 crn3 d'éther, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 55°C. On obtient ainsi 0,75 g d'acide - (h- (N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl^j méso diamino-2(L),6(D) pimélamique.

20 Rf = 0,38 jsilicagelj n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)]

Analyse Cale. # = C = 56,72 H = 8,64 N = 12,25 Tr. = 52,8 8,1 11,6

Cendres sulfuriques = 6,9 # 25 Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technieon révèle la présence des acides aminés suivants :

Ala = 1,02 (théorie = l) ï‘èP =0,96 (théorie = l)

Glu = 1,00 (théorie = i) 30 L'acide -benzyloxyearbonyl méso diamino-2(L),6(D) pimélamique peut être préparé selon le procédé décrit dans le brevet belge 821 585· / f s* 35 *

Exemple 9 -

On ajoute G,65 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 2,363 g de M-undéoanoyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 100 em3 de tétrahydrofuranne et de 0,7 cm3 de 5 triéthylamine. Le mélange est agité pendant 30 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C 1,617g d'acide N*-benzyloxycarbonyl IlyLLi diamlno-2,6 pirnélamique dans un mélange de 5 cm3 de soude IN et 50 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers 0°C, puis pendant 40 heures vers 20°C environ. Le mélange réactionnel 10 est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 10 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Dans le concentrât, on a un précipité que l'on sépare par filtration, lave 3 fois par 60 cm3 au total d'acide chlorhydrique N/lO et 20 cm3 d'eau. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de 15 mercure) a 20°C, on obtient 3,66 g de solide blanc que l'on dissout dans 20 om3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 3,5 cm de diamètre contenant 75 g de gel de silice neutre (0,04- 0,063 mm).

20 On élue successivement par : 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (i/l en volumes), 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-cyclohexane (3/1 en volumes), 400 cm3 d'acétate d'éthyle, 600 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes), 25 500 cm3 d'un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9/l en volumes), 1200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (85/15 eu volumes), en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 22 à 32, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

Le solide amorphe obtenu est repris par 80 cm3 d'éther, trituré jusqu'à 30 pulvérisation totale, séparé par filtration et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 2,58 g d'acide N^-[ß^-ben-zyl N-(N-undécanoyl L alanyl)-Y-D glutamyl] -benzyloxycarbonyl LL,DD-diarnino-2,6 pirnélamique r. s

Rf - 0,62 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique */ 35 (9/i en volumes)]. /// / \ i \ Λ ·Λ , è' .r* &

On dissout 2,55 g d'acîde N^-fo^-benzyl N-(N-undécanoyl L alanyl)-Y-D glutamylj N^-ben:;:yloxyoarbonyI LL,DD diamino-2,6 pimélamique dans 55 cm5 d'acide acétique. On ajoute 2,55 Z de palladium sur noir (à 5$ de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures 5 1/2. Le catalyseur est séparé par filtration et lavé 5 fois par 30 cm3 au total d'acide acétique. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe est repris par 50 cm3 d'éther, filtré et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 1,87 E d'acide N^-[n-(N-undécanoyl L alanyl)-Y-10 D glutamyljLL,DD diamino-2,6 pimélamique.

Rf * 0,75 (silieagel; acide acétique).

Le N-undécanoyl L alanyl-ot-D glutamate de benzyle peut être préparé de la façon suivante :

On ajoute 3,56 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, 15 maintenue à -5°C, de 5,1 g d'acide undécanofque dans un mélange de l40 cm3 de tétrahydrofuranne et de 3,84 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 9,4-5 g de chlorhydrate de L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 54,8 cm3 de soude IN et 30 cra3 d'eau. Le mélange 20 réactionnel est agité pendant 10 minutes vers -5°0, puis pendant 20 heures vers 20°C environ. Le mélange réactionnel est acidifié ensuite à pH 1 par addition de 60 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 2 fois par 80 cm3 au total d'acétate 25 d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 40 cm3 d'eau et séchées sur du sulfate de sodium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 11,89 g d'huile que l'on chromatographie sur une colonne de 4,5 cm de diamètre contenant 25Ο g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On 30 élue par de l'acétate d'éthyle en recueillant des fractions de 100 cm3.

Les fractions 3 à 5, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 5,85 6 d'un solide pâteux que l'on chromatographie sur fine colonne de 3,2 cm de diamètre contenant 115 S de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par / / \!ί λ *- t‘ 35 Λ Λ: 1 I d'un mélange acétate d'éthyle-cyelchexane (l/l en volumes), 1,7 1 d'acétate d'éthyle et 600 crn3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (99/1 en volumes) en recueillant des fractions de 100 crrij.

Les fractions il à 30, réunies, sont concentrées à sec sous pression 5 réduite (20 mm de mercure) à 50 °C. On obtient ainsi 2,47 g de N-undéca-noyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle sous forme d'un solide blanc,

Rf e 0,71 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (SA en volumes )] .

Exemple 10 - 10 On ajoute 0,69 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 2,57 g de N-lauroyl L alanyl-u-D glutamate de benzyle dans un mélange de 120 cmjj de tétrahydrofuranne et de 0,74 cm3 de triéthylamine. Le mélange .est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 1,7 g d'acide iP-benzyloxy-15 carbonyl LL dlamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 5>25 cmj5 de soude IN et 35 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 20 minutes vers -3°C, puis pendant 22 heures vers 20°C environ. Ensuite, on l'acidifie à pH 2 par addition de 20 cm3 d'acide chlorhydrique IN.

Le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 60 cm3 20 au total d'acide chlorhydrique 0,1 N et 3 fois par 60 cm3 au total d'eau.

Après séchage à l'air libre, on obtient 3,97 g de poudre blanche que l'on chromatographie sur 200 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm) contenus dans une colonne de 3>8 cm de diamètre.

On élue successivement par : 25 600 cn»3 d'acétate d'éthyle, 500 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes), 800 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/1 en volumes) en recueillant des fractions de 50 cm3. Les fractions 24 à 30, réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

30 L'huile obtenue est reprise par 100 cm3 d’éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm de mercure). On obtient ainsi 1,24 g d'acide îP-(o^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-^-D glutamylj lP-benzyloxycarbonyl LL dlamino-2,6 pimélamique / 35 Rf «= 0,85 [silicagel; n-butanol-pyridine-aeide acétique-eau// (50/20/6/24 en volumes Jj {/? 3ό ϋ»..

Λ *·

Rf = 0,76 [silicagel; acétate d'éthyle-aej.de acétique (3/1 en volumes )J .

L'acide N^-[N-(N-lauroyl L alanyl)-*-D glutamyl] LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 5 On dissout 1,36 g d'acide N2-[o^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)- ï-D glutamylj -benzyloxycarbonyl LL diamino-2,6 pimélamique dans 40 cmfj d'acide acétique. On ajoute 1,4 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 4 heures»

Apres filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite 10 (20 mm de mercure) à 55°C, l'huile obtenue est reprise par 100 craj5 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation totale, séparée par filtration et séchée à l'air. On obtient ainsi 0,96 g d'acide N2-£n-(N-lauroyl L ala-nyl)-Y-D glutamylj LL diamino-2,6 pimélamique

Rf = 0,38 jsllicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau 15 (50/20/6/24 en volumes )J .

ë L'acide N-benzyloxycarbonyl LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 5 g de dichlorhydrate de l'acide LL diamino-2,6 pimélamique dans 15 cmj d'eau amenée à pH 10 par addition de 20 45 cmjj de soude IN, on ajoute 2,l4 g de bromure cuivrique dissous dans 20 cm3 d'eau. On agite le mélange réactionnel pendant 2 heures à 20°C environ. On sépare par filtration un léger insoluble, puis on refroidit le filtrat à une température comprise entre -3°C et 0°C. On ajoute 4,8 S de bicarbonate de sodium et ensuite, goutte à goutte en 30 minutes, 25 4,1 cm3 de chloroformiate de benzyle. Le mélange réactionnel est agité pendant 18 heures à une température voisine de 20°C. Le précipité bleu formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 90 οπ>3 au total d'eau, 3 fois par 90 cm3 au total d'éthanol et 3 fois par 90 GI43 au total d'éther. Apres séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, 30 on obtient 4,18 g de complexe euivrique de l'acide -benzyloxycarbonyl LL diamino-2,6 pimélamique que l'on ajoute à 28 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On agite pendant 1 heure à une température voisine de 20°C, Un insoluble est séparé par filtration. Au filtrat, on ajoute 14 cm3 de méthanol puis on fait passer un courant d'hydrogène sulfuré pendant 6 heures.

35 On laisse reposer pendant 16 heures. La bouillie noire obtenue est / filtrée, lavée 3 fois par 15 cm3 au total d'eau. Les filtrats réunis // sont concentrés jusqu'à un volume de 10 cm3 sous pression réduite (20 mm/^

JJ

de mercure) à 50°C, amenés à pH 7 par addition de 5 cm3 de triéthylamine, et amenés à pl-l 6,8 par addition de 5 cm3 d’acide chlorhydrique IN. La bouillie blanche ainsi obtenue est conservée à Ü°C pendant 2 heures.

Le produit qui. se sépare par filtration est lavé successivement 3 fois 5 par 30 cmjj au total d'eau, 3 fois par 30 cmj5 au total d'éthanol et 3 fois par 30 cm3 au total d'éther. Après séchage à 60°C sous pression réduite (0,3 mm de mercure),on obtient 1,78 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl L,L diamino-2,6 pimélamique [a]2D° = +11° = lj HC1 1N) 10 Rf = 0,45 [silicagelj n-butanol-pyridine-aclde acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le dichlorhydrate de l'acide L,L diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :

On dissout 17 g d'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 15 pimélamique dans un mélange de 300 cm3 de méthanol et de 5,9 cm3 d'acide chlorhydrique concentré (d = 1,19). On ajoute 17 g de palladium sur noir (à 3 fi de palladium) et on fait passer un courant d'hydrogène pendant 4 heures. Après filtration et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 55°C, on obtient 8,8 g de 20 dichlorhydrate de l'acide L,L diamino-2,6 pimélamique sous forme de meringue.

L'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante :

On dissout 19 g de L,L N^,l/’-dibenzyloxyearbonyl diamino-2,6 25 pimélate acide de benzyle dans 190 cm3 de méthanol. On refroidit cette solution vers 0°C et on la sature d'ammoniac. Dès qu'elle est saturée, on la transvase dans un autoclave de 1 litre. Après avoir fermé cet autoclave, on le conserve pendant 6 jours à 20°G environ. Après dégazage, la solution ainsi obtenue est concentrée sous pression réduite (20 mm 30 de mercure) à 50°C. Le résidu est dissous dans 250 cm3 d'eau et la solution obtenue est amenée à pH 2 par addition de 30 om3 d'acide chlorhydrique 4N, extraite 3 fois par 300 cm3 au total d'acétate '/· d'éthylej cette phase organique est lavée par 100 cn»3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de sodium et concentrée / 35 à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi / / * 17 g d'acide L,L dibenzyloxycarbonylamino-2,6 pimélamique sous forme /jy » 4 38 * d'hui le.

Hf » o , ô·; (sillcagel* n-butanol — pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le L,L N2, if'-dibenzyloxyoarbony1 diamino-2,6 pimélate acide 5 de benzyle peut être préparé de la façon suivante : p 6 -

On dissout 55 g de L,L ΙΓ,N -dibenzyloxyoarbony1 diamino-2,6 pimélate de benzyle dans 400 omj5 d'alcool benzylique tiédi à 40°CL Ensuitej on coule sur cette solution maintenue à 40°C pendant 1 heure environ, une solution de 4,8 g de potasse en pastilles à 86 ^ dans 10 400 cm3 d'alcool benzylique en 6 heures 1/2. On continue d'agiter le milieu réactionnel à 20°C environ pendant 16 heures, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (0,5 mm de mercure) à 90°C. On obtient ainsi une huile que l'on dissout dans 1 litre d'eau, extrait 3 fois par 900 cm3 au total d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse ainsi extraite 15 est acidifiée à pH 2 par addition de 45 cm3 d'acide chlorhydrique 4n, extraite 3 fois par 1,5 1 au total d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle ainsi obtenue est lavée avec 500 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchée sur sulfate de sodium anhydre. Après séparation par filtration du sulfate de sodium, on ajoute 17 cm3 de 20 dicyclohexylamine et on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 40°C. On obtient une liuile jaune que l'on dissout dans 100 cm3 d'éthanol auquel on ajoute 100 cm3 d'eau. Après 20 h de repos à 0°C on obtient un solide blanc que l'on sépare par filtration, lave 2 fois par 100 cm3 au total d1 eau et reprend dans un mélange de 200 em3 25 d'acétate d'éthyle et 200 cm3 d'eau. On acidifie la phase aqueuse par addition de 40 cm3 d'une solution normale d'acide méthanesulfonique.

Après décantation, la phase organique est lavée 2 fois par 100 cm3 au total d'eau, séchée sur sulfate de sodium anhydre et concentrée à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 15 g 30 de L,L N2,N6 -dibenzyloxycarbonyl diaraino-2,6 pimélate acide de benzyle sous forme d'huile.

Rf =- 0,76 [silicagel, n-butanol-pyrldine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)].

Le L,L N2, N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélate de diben- / 35 zyle peut être préparé de la façon suivante : // . D ···. -uff.

39

*.1 S

Dans un tricol de 500 01113, muni d'une agitation centrale et d'un appareil Dean Stark, on ajoute un mélange de 44,7 g d'acide L,L t^N^-dibenzyloxyoarbonyl diarnino-2,6 pimélique, 3 g d'acide p-toluène-sulfonique, 30 cra3 d'alcool benzylique et 300 cm3 de toluène. On porte 5 le milieu réactionnel au reflux, pendant 5 heures. Ensuite, après 16 heures d'agitation à 20°C, on sépare l'insoluble blanc par filtration, le lave 2 fois par 400 cm3 au total d'une solution à 5 % de carbonate de sodium et 2 fois par 400 em3 au total d'eau. Après séchage à l'air libre, on obtient 55,4 g de L,L N2,N6 -dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 10 pimélate de dibenzyle fondant à ll8°C.

Rf = 0,53 [silicagelj acide aeétique-acétate d'éthyle (8/2 en volumes)].

L'acide L,L N2,N^-dibenzyloxycarbonyl diamino-2,6 pimélique peut être préparé selon la méthode de A. ARENDT et coll., Rocgniki 15 Chemii Ann. Soc. Chim, Polonorum 48, 635 (1974).

Exemple 11 -

On ajoute 0,9i cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à 0°C,de 3,l4 g de N-(triméthyl-3>5,5 hexanoyl)L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 150 cm3 de tétrahydrofuranne et 20 de 0,98 cm3 de triéthylamine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à 0°C, puis on ajoute une solution refroidie à 0°C de 2,263 g d'acide N^-benzyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 7 cm3 de soude IN et 70 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure vers 0°C, puis pendant 20 heures vers 22°C environ.

25 Ensuite, on élimine un léger insoluble par filtration, on acidifie à pH 1 par addition de 12 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 3 fois par 150 cm3 au total d'acétate d'éthyle.

Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 20 em3 d'acide 30 chlorhydrique 0,1N, séchées sur sulfate de sodium. Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient 5.»l4 g de solide amorphe que l'on dissout dans 60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (l/l en volumes) contenant 10 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression 35 réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l’ensemble sur une colonne / de 3 cm de diamètre contenant 100 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 nw)/

On élue successivement par ; /j? 4ο , Μ '· . .'x · τ 400 cmj5 d’acétate d'éthyle 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/1 en volumes) 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8/2 en volumes) l60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (6/4 en volumes) 5 240 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (1/1 en volumes) en recueillant des fractions de 40 cnfj. Les fractions 15 à 25, rémies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, L'huile obtenue est reprise par 50 01x13 d'éther, triturée jusqu'à pulvérisation, séparée par filtration et séchée sous pression réduite (0,3 mm 10 de mercure). On obtient ainsi 2,85 S d'acide ï^-^O^-benzyl N-[N-(trimé-thyl-3,5,5 hexanoyl)L alanylJ-y-D glutamyl} N^-benzyloxycarbonyl-DD, LL diamino-2,6 pimélamique

Rf = 0,32 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (3/1 en volumes)].

15 On dissout 2,76 g d'acide ^-[o^-benzyl N-[N-(triméthyl-3,5i5 hexanoyl)L alanyl]-Y-D glutamyl}N^-benzyloxycarbonyl-DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 2,76 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydrogène pendant 2 heures 1/2. Après filtration et concentration à 20 sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, l'huile est triturée dans 50 cm3 d'éther. On obtient un précipité qui est séparé par filtration, et séché sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 2,07 g d'acide N^-|N-i}i-(triméthyl-3,5>5 hexa-noyl)L alanyl]-Y-D glutamyl}DD,LL diamino-2,6 pimélamique 25 Rf = 0,32 [silicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (50/20/6/24 en volumes)]

Rf = 0,31 [silicagel; acide acétique]. „

On ajoute 4,3 em3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -6°C, de 7*59 g de N- (triméthyl-3,5» 5 hexanoyl) L alanine 30 dans un mélange de 400 cm3 de tétrahydrofuranne et 4,63 cm3 de triéthyl-amine. Le mélange est agité pendant 20 minutes à -6eC, puis on ajoute une solution refroidie à 3°C de 9,06 g de chlorhydrate de α-D glutamate de benzyle dans ion mélange de '66,2 cm3 de soude IN et 14 cm3 d'eau.

Le mélange réactionnel est agité pendant 15 minutes vers ~5°C» puis 35 pendant 66 heures vers 18 °C environ; il est ensuite acidifié à pH 1 / par addition de 75 cm3 d'acide chlorhydrique IN. On évapore le tétraW hydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 5°°C. Le fjf/ 4i Μ j. , concentrât est extrait 5 fois par 200 cmj5 au total d'acétate d'éthyle.

Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 40 cnfj d'acide chlorhydrique 0,1N et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, 5 on obtient l4,8 g d'huile que l'on dissout dans 50 ci113 d'acétate d'éthyle contenant JO g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l'ensemble sur une colonne de 2,8 cm de diamètre contenant 280 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par 2 1 10 de cyclohexane, 1 1 d'un mélange eyclohexane-acétate d'éthyle (95/5 en volumes), 1,5 1 d'un mélange cyclohexane-aeétate d'éthyle (90/10 en volumes), 5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20 en volumes), 1,5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (70/50 en volumes) et 3,5 1 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50/50 en volumes) 15 en recueillant des fractions de 500 cm3. Les fractions 23 à 29 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 10,86 g de N-(triméthyl-3,5,5 hexanoyl) L alanyl-a-D glutamate de benzyle sous forme d’huile qui cristallise.

Rf = 0,37 [silicagel; acétate d'éthyle] 20 La N-(triméthyl~3,5,5 hexanoyl) L alanine peut être préparée de la façon suivante .

On ajoute 6,5 cm3 de chloroformiate d'isobutyle à une solution, maintenue à -5°C, de 7,912 g d'acide trlméthyl-3»5»5 hexanoique dans un mélange de 125 cm3 de tétrahydrofuranne et de 7 cm3 de triéthylamine. Le 25 mélange est agité pendant 20 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution, refroidie à 5°C, de 4,495 g de L alanine dans 5° cm3 de soude IN. Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes vers 0°C, puis pendant 18 heures à 25°C environ. On évapore ensuite le tétrahydrofuranne sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Ls concentrât est extrait 2 30 fois par 40 cm3 au total d'éther, acidifié à pH 1 par addition de 55 cm3 d'acide chlorhydrique IN. Le précipité huileux qui se forme est extrait 5 fois par 250 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle sont réunies, lavées par 25 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium et séchées sur sulfate de magnésium. Après filtration et concentra-35 tion à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C» on obtient / 11,79 g d'huile que l'on dissout dans 40 cm3 d'acétate d'éthyle contenant / .s' 42 20 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge l’ensemble sur une colonne de 5 cm de diamètre contenant 120 g de gel de silice neutre (0,063-0,20 mm). On élue successivement par 600 cro3 de 5 oyelohexane, 300 cm^ d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (95/5 en volumes), 300 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (90/10 en volumes), 300 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20 en volumes), 700 cm3 d'un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (50/50 en volumes), 300 cm3 d'acétate d'éthyle et 3°Û cm3 d'un mélange acétate 10 d'éthyle-méthanol (90/lO en volumes) en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 17 à 28 réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 45°C. On obtient ainsi 10,16 g d'huile que l'on dissout dans 25 cm3 d'éther. Par addition de 150 cm3 d'éther de pétrole, on obtient une huile que l'on sépare par décantation.

15 Après séchage sous vide (0,2 mm de mercure), on obtient 7*59 6 de N-(triméthyl-3,5*5 hexanoyl) L alanine.

Rf = 0,^3 [silicagelj acétate d'éthyle]

Exemple 12 -

On ajoute 0,56 cm3 de chloroforrniate d'isobutyle à une solution, 2Ô maintenue à -5°C, de 2,12 g de N-lauroyl L alanyl-a-D glutamate de benzyle dans un mélange de 86 cm3 de tétrahydrofuranne et de 0,6 cm3 de triéthylamine. Le mélapge est agité pendant 30 minutes à -5°C, puis on ajoute une solution refroidie à 2°C de 1,25 g d'acide ^-t.-butyloxy-carbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 4,32 cm3 de 25 soude IN et 43 cm3 d'eau. Le mélange réactionnel est agité pendant quelques minutes vers -5°C, puis pendant 18 heures vers 20°C environ.

Ensuite, on l'acidifie par addition de 50 cm3 d'une solution saturée d'acide citrique. On évapore le tétrahydrofuranne par concentration sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le concentrât est extrait 30 5 fois par 200 cm3 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate d'éthyle, réunies, sont lavées par 25 cm3 d'eau, séchées sur sulfate de sodium.

Après concentration à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient une huile que l'on dissout dans un mélange de 50 cm3 d'acétate d'éthyle et 10 cm3 d'acide acétique contenant 10 g de gel de 55 silice neutre (0,04-0,063 mm). On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et cm charge l'ensemble sur une colonne / de 2 cm de diamètre contenant 50 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm/. L· Μ 43 ,ί

Un élue successivement par : 200 cm3 d'acétate d'éthyle 280 cmß d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes) 320 omji d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/l en volumes) 5 en recueillant des fractions de 40 cm3. Les fractions 5 à 13,réunies, sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

On obtient ainsi 2,23 g d'acide N^-[θ^-benzyl N-(W-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl] .-butyioxyearbonyl LL,DD diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile.

10 Rf = 0,39 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique (9/1 en volumes )] .

On dissout 2,19 g d'acide N^-[o^-benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl] tf-t,-butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 22 cm3 d'une solution saturée anhydre d'acide acétique chlorhydrique. On 15 laisse en contact pendant 3 heures à 20°C, ensuite on concentre à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 1,7^ g de chlorhydrate de l'acide N -[O -benzyl N-(N-lauroyl L alanyl)-Y-D glutamyl] DD,LL diamino-2,6 pimélamique sous forme d'huile partiellement cristallisée 20 Rf = 0,4-7 [silicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau 50/20/6/24 en volumes)]

Rf = 0,26 [silicagel; acide acétique].

L'acide N^-t.-butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique peut être préparé de la façon suivante : 25 On dissout 4 g d'acide l^-t,-butyloxycarbonyl N^-benzyloxy- carbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 100 cm3 d'acide acétique. On ajoute 4 g de palladium sur noir (à 3 % de palladium) et on fait passer ’ un léger courant d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est séparé par filtration, lavé par 10 cm3 d'acide acétique, les filtrats réunis, 30 sont concentrés à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

Le résidu huileux ainsi obtenu est trituré dans 50 cm3 d'éther jusqu'à pulvérisation totale. On obtient ainsi après filtration et séchage 3g/ d'acide N^-t.-butyloxycarbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique f'J

Rf = 0,34 [silicagel; acide acétique]. j If 44

Exemple 13 - cl 5

On ajoute en 20 minutes, 1 g d'acide (0 -benzyl 0 -succinimido N- [jN-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyljj D glutamique dissous dans 10 cmj de diméthoxy-1,2 éthane à une solution maintenue à 8°C, de 6 5 0,52 g d’acide DD,LL N -benayloxycarbonyl diamino-2,6 pimélamique dans un mélange de 1,6 cm3 de soude IN et 5 cm3 d'eau. le milieu réactionnel est agité pendant 24 heures à 20°C, ensuite est acidifié à pH 1 par addition de 2 em3 d'acide chlorhydrique IN. Après 3 heures d'agitation à 20°C, le précipité formé est séparé par filtration, lavé 3 fois par 10 30 crï>3> aU total d'eau et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 1,1 g de poudre blanche que l'on chromatographie sur une colonne de 1,7 cm de diamètre contenant 22 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par : 110 cm3 d’acétate d’éthyle, 15 60 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (95/5 en volumes), 180 cm3 d’un mélange acétate d’éthyle-acide acétique (9/1 en volumes), 80 cm3 d'acide acétique. Les fractions 24 à 38, réunies,sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C. Le solide amorphe obtenu est repris dans 10 cm3 d'éther, séparé par filtration, lavé par 20 10 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure) à 2Û°C, on obtient 0,4 g d'acide N^-^O^-benzyl N-{jtf-(n-pentyl-2 hydro-xy-3 nonanoyl) L alanylj-V-D glutamylj N^-benzyloxyearbonyl DD,LL diamino- ‘ 2,6 pimélamique.

Rf = 0,72 [silicagel; acétate d'éthyle-acide acétique 25 (9/1 en voliames )]}.

On ajoute 0,4 g d'acide N^-fo^-benzyl N-[N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanylj-Y-D glutamylj N-benzyloxyearbonyl DD,LL diamino-2,6 pimélamique dans 10 cm3 d’acide acétique. On ajoute 0,4 g de palladium sur noir (à 3 # de palladium) et on fait passer un léger courant d'hydro-30 gène pendant 1 heure 1/4. Après filtration du milieu réactionnel et concentration à sec du filtrat sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, on obtient une huile que l'on reprend par 20 cm3 d'oxyde d'iso-propyle, triture jusqu'à pulvérisation totale et sépare par filtration . a Après séchage sous pression réduite (20 mm de mercure), on obtient /

35 280 mg d'acide N^-£n-[n-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyl]-Y-iy^V

glutamylj DD,LL diamino-2,6 pimélamique (jf 45 L'acide jcA-benzyl 05-succinimido N-|n-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyljj* û glutamique peut être préparé de la façon suivante î

On ajoute en 10 minutes 7,4 s de dieyoiohexyloarbodiimide dissous dans 85 cm3 de dimethoxy-i,2 éthane à une solution, maintenue à 5 0 °C,de 17,4 g de N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyl-u-D glutamate de benzyle et de 3,86 g de N-hydroxysuccinimide dans 170 cmj5 de dimétho-xy-1,2 éthane. Le milieu réactionnel est agité à 0°C pendant 3 heures l/2, puis conservé à 4°C pendant io heures. Ensuite, on y ajoute 2 cmjS d'acide acétique et on agite pendant i heure a 20°C. le précipité formé est 10 séparé par filtration, lavé 3 fois par 75 cm3 au total de diméthoxy-i,2 éthane. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C. le concentrât est repris par 300 cm3 d'acétate d'éthyle. Après i heure de repos à 20 °C, le précipité formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 50 cm3 au total d'oxyde d’isopropyle. Le filtrat 1 15 est concentré à sec sous pression réduite (20 rnm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 22,8 g d'acide io1-benzyl O^-succinimido N-[n-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyljlD glutamique sous forme d'huile orangée.

Rf = 0,77 [sïlicagelj acétate d'éthyle]]

Le N-(n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoyl) L alanyl-d-D glutamate 20 de benzyle peut être préparé de la façon suivante ;

On ajoute en 1 heure lO minutes 27,5 g de n-pentyl-2 hydroxy-3 nonanoate de succinimide dissous dans 644 cm3 de diméthoxy-1,2 éthane à une solution, maintenue à 7°C, de 27,8 g de chlorhydrate de h alanyi-ô-D glutamate de benzyle dans un mélange de 245 cm3 d'eau et 22,9 cnfj de 25 triéthylamine. Le mélange réactionnel est conservé à 20°C pendant 20 heures puis à 60°C pendant 5 heures. On évapore ensuite le dimét*noxy-i,2 éthane sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C; le concentrât est acidifié à pH i pur addition de 150 cm3 d'acide chlorhydrique IN et extrait 5 fois par î,5 1 au total d'acétate d'éthyle. Les phases acétate 30 d'éthyle réunies sont lavées 3 fois par 750 cm3 au total d'eau, séchées / / 4 b sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C. On obtient ainsi 38,6 g d'huile que l'on dissout dans 200 cm} d'acétate d'éthyle. On y ajoute 1} g de dicyclohexylamine. Après un repos de 20 heures à 4°C, le solide blanc formé est séparé par fil-5 tration, lavé 2 fois par 40 cm} au total d'acétate d'éthyle et 2 fois par 200 cm} au total d'éther et séché sous pression réduite (20 mm de mercure) à 20°C. On obtient ainsi 22,4 g de poudre blanche auxquels on ajoute 1,9 g obtenus dans une opération similaire. On dissout ce mélange dans 500 cm3 d'eau; on ajoute à la solution aqueuse 200 cm} d'acétate 10 d'éthyle et 150 cm} d'une solution saturée d’acide citrique. On sépare la phase organique, extrait la phase aqueuse 2 fois par 400 cm} au total d'acétate d'éthyle. les phases acétate d'éthyle réunies sont lavées 2 fois par 200 cm} au total d'eau, séchées sur sulfate de sodium et concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 60°C. On obtient 15 ainsi 17,4 g de N-(n-pentyl-2 hydroxy-} nonanoyl) L alanyl-^-D glutamate de benzyle sous forme de pâte beige.

Rf = 0,25 (sllicagel; acétate d'éthyle]

Le n-pentyl-2 hydroxy-} nonanoate de suecinimide peut être préparé de la façon suivante : 20 On ajoute en 40 minutes, 27 g de dicyclohexylcarbodiimide dissous dans 300 cm} de diméthoxy-i,2 éthane à une solution, maintenue à 0°C, de 29,i g d'acide n-pentyl-2 hydroxy-} nonanoi'que et de l4,l g de N-hydroxysuccinimide dans }00 cm} de diméthoxy-i,2 éthane. Le mélange réactionnel est agité à 0°C pendant } heures, puis conservé à 4eC 25 pendant 21 heures. le précipité formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 100 cm} au total de diméthoxy-1,2 éthane. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C, Le concentrât est repris par un mélange de }00 cm} d'oxyde d'isopropyle et } cm} d'acide acétique. Après 2 heures de repos à 20°C, le précipité }0 formé est séparé par filtration et lavé 2 fois par 40 cm} au total d'oxyde d'isopropyle. Le filtrat est concentré à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 42,6 g de n-pentyl-2 / hydroxy-} nonanoate de suecinimide sous forme d'huile Jaune. ^ / L'acide n-pentyl-2 hydroxy-} nonanoïque pèut être préparé / }5 selon la méthode de E. LEDERER et coll., Bull. Soc. Chim. 1952 , 4l}.jj/ { v 47 ρ ή

Exemple 14 - A une solution de 25 g de Na-t.-butyloxycarbonyl N£-benzyloxy-carbonyl L lysine dans 250 cmjj d'éthanol, on ajoute 150 g de copolymère styrène-divinylbenzène (98/2) chlorométhylé contenant 1 milliéquivalent 5 de chlore par gramme. On agite le milieu réactionnel pendant 3 minutes à 20°C, ensuite, on ajoute 9>2 cm3 de triéthylamine et on agite le milieu réactionnel pendant 48 heures à 78°C. Le polymère est filtré, lavé successivement par 3 fois 750 cm3 au total d'éthanol et 3 fois 750 cm3 au total de chlorure de méthylène, puis séché sous pression réduite (20 mm 10 de mercure) à 50°C. On obtient ainsi 160,9 g de N«-tbutyloxycarbonyl N£-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère.

L'acide D glutamique est accroché sur le dérivé L lysyl-polymère en effectuant la suite d’opérations suivante dans un réacteur muni d'un agitateur et à sa base d'un verre fritté.

15 l) On effectue 5 lavages successifs du polymère par 100 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. Chaque addition de solvant est suivie d'une agitation de 3 minutes, puis d'un essorage.

2) Le groupement protecteur t.-butyloxycarbonyle de la lysine est ensuite éliminé par addition de 100 cm3 d'un mélange acide trifluoro- 20 acétique-chlorure de méthylène (l/l en volumes), agitation pendant 20 minutes puis essorage.

3) La résine est alors lavée successivement par : a) 3 fois 100 crn3 de chlorure de méthylène b) 3 fois 100 cm3 de méthanol 25 c ) 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.

4) On neutralise alors le polymère par addition de 100 cm3 d'un mélange chlorure de méthylène-N-méthylmorpholine (9/1 en volumes), agitation 3O pendant 10 minutes puis essorage.

5) La résine est lavée ensuite par : 3 fois 100 cm3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition'de solvant et en essorant à chaque fois.

6) On ajoute alors successivement : 35 a) 5,4 g de N-t.-butyloxycarbonyl «C-D glutamate de benzyle / en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant // 10 minutes, / ÿ Λ ...t, ,. À '‘c b) 3,3 £ de dieyelohexyl.earbofj 1 on solution dans 50 crajî de chlorure de rnéi.hylène et on agite ^ndant 20 heures et essore.

7) On lave la résine stieoesei .-/emunt par : a) 3 fuis 100 cm3 de chlorure de méthylène 5 b) 3 fois 100 t;rn3 d’acide acétique c) 3 fois 100 ert)3 de chlorure de méthylène en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de solvant et en essorant à chaque fois.

Λ

On obtient ainsi le Nû-(0 -berxzyl N-t. -butyloxycarbonyl f*-D 10 glutamyl) N£-benzyloxycarbonyl L lysy1-polymère.

L’alanine est accroché sur le dipeptide-polymère en répétant les opérations l, 2, 3, 4, 5, 6 et 7. L’opération n°6 est modifiée comme suit :

On ajoute successivement : 15 a) 3,03 g de N-t.-butyloxycarbonyl L alanine en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b) 3,3 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 heures et essore.

On obtient ainsi le Na-Co1-benzyl N-(N-t.-butyloxycarbonyl 20 L alanyl)-ï-D glutamyl] N£-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère.

L’acide palmitique est accroché sur le tripeptide-polymère en répétant les opérations 1, 2, 5, 4, 5, 6 et 7· L’opération n°6 est modifiée comme suit :

On ajoute successivement : 25 a) 4,2 g d’acide palmitique en solution dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 10 minutes b) 3,3 g de dicyclohexyicarbodiimide en solution dans 50 Gtn3 de chlorure de méthylène et on agite pendant 20 heures et essore.

On obtient ainsi le Na- [(/ benzyl N-(N-palmitoyl L alanyl)-Y-D 30 glutamyl] Nt-benzyloxycarbonyl L lysyl-polymère.

Ce polymère est rais en suspension dans 13Ο cm3 d’acide trifluo-roacétique contenu dans un réacteur muni d’un agitateur et à sa base d’un filtre en verre fritté. Dans cette suspension, on fait passer un courant d’acide bromhydrique pendant 90 minutes. Ensuite, on essore la 35 résine et on la lave 3 fois par 300 cm3 au total d’acide acétique en agitant pendant 3 minutes après chaque addition de l’acide acétique et / en essorant à chaque fois. Les filtrats sont réunis et concentrés à sec// sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C. L’huile ainsi obtenu^ 49 ».•.st reprise dans 90 cm3 d'acétate d'éthyle. Un précipité se forme que l'on sépare par filtration et lave 2 fois par 60 cmjj au total d'éther.

Il est hygrcscopique et est dissous dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 7 g de gel de silice neutre (0,04-0,06-3 mm). On concentre à sec sous 5 pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et on charge sur une colonne de 2,6 cm de diamètre contenant JO g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mn) · On élue successivement par : 7OO cmj d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (9/l en volumes) 1700 cm;5 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (8/2 en volumes) 10 oOO cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7/3 eu volumes) 2400 cnf5 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (l/l en volumes) 600 om3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (2/8 en volumes) et 1100 om3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 100 cmjj. Les fractions 53 à JO réunies, 15 sont concentrées à sec sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C.

On obtient ainsi 1,28 g de solide amorphe que l'on dissout dans 50 cm3 d'acide acétique contenant 2,4 g de gel de silice neutre (0,04-0,063 mm).

On concentre à sec le mélange sous pression réduite (20 mm de mercure) à 50°C et charge sur une colonne de 1,5 cm de diamètre contenant 24 g de 20 gel de silice neutre (0,04-0,063 mm). On élue successivement par : 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (7/3 en volumes) 150 cmj d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (6/4 en volumes) 300 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (l/l en volumes) 250 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-aciae acétique (4/6 en volumes) 25 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (3/7 en volumes) 350 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (2/8 en volumes) 200 cm3 d'un mélange acétate d'éthyle-acide acétique (l/9 en volumes) et 200 cm3 d'acide acétique en recueillant des fractions de 50 cnÇ.

Les fractions 25 à 42, réunies, sont concentrées à sec sous pression 30 réduite (20 mm de mercure) à 50°C. Le solide amorphe obtenu est repris dans 30 cm3 d'acétate d'éthyle, séparé par filtration, lavé par 20 cnfj d’acétate d'éthyle et 20 cm3 d'éther. Après séchage sous pression réduite (0,3 mm de mercure) à.-50°C, on obtient 0,52 g de N** -[n-(N-pal-mitoyl L alanyl)-Y-D glutamyl] L lysine / 35 Rf - 0,30 [silicagel; n-butanol-pyridine-acide acétique-eau // (5Ο/2Ο/6/24 en volumes)j /^// 50

Analyse cale. % =* C => 54,12 H =3 8,62 N “ 8,42 tr. % « 5>i,9 8,6 8,7 cendres sulfuriques - 1,7 fi

Après hydrolyse totale, l'analyse sur autoanalyseur Technicon 5 révèle la présence des acides aminés suivants ;

Ala 0,99 (théorie = l)

Glu 1,00 (théorie » l) I

lys 1,02 (théorie = l) A ,

Claims (10)

1. 51
2. 1. Un nouveau tripeptide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale : R - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R I I 1 CH5 CHgCHg - CO - NH - ÇH - R - NH - CH - R2 5 dans laquelle les symboles R, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras, étant entendu que l'un au moins des symboles R représente un reste d'acide gras, le symbole R^ représente un radical hydroxy, amino ou alcoyloxy dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par 10 un radical phényle ou nitrophényle, les symboles Rg et Ry identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone et est éventuellement substituée par un radical phenyle ou nitrophényle, étant entendu que les symboles Rg et ne peuvent pas 15 représenter simultanément un atome d'hydrogène, et étant entendu que l'alanine est sous forme L, l'acide glutamique est sous forme D, la lysine, lorsque l'un des symboles Rg ou représente un atome d'hydrogène est sous forme L et l'acide diamino-2,6 pimélique ou ses dérivés, lorsque les symboles Rg et Ry identiques ou différents, représentent 20 un radical carboxy, carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle, est sous forme D,D; L,L; DD,LL (racémique) ou D,L (méso), ainsi que ses sels.
3. 2. Un nouveau tripeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le reste d'acide gras est un radical alcanoyle contenant 1 à 45 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical hydroxy, 25 phényle ou cyclohexyle), un radical alcénoyle contenant 3 à 30 atomes / de carbone et pouvant contenir plus d’une double liaison, OU un restai]/ d'acide mycolique. / jf T'. f , . 'à 52 * * Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dipeptide de formule générale : Rp. - NH - CH - CO - NH - CH - CO - Lij CHgCHg - COOH 5 dans laquelle R_ représente un reste d'acide gras ou un groupement P protecteur de fonction amine et représente un radical amino ou un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement , substitué par un radical benzyle ou nitrobenzyle, sur un aminoacide de formule générale s f %n-çh-r3 10 <jV5 R- NH - CH - R0 5 C dans laquelle Rg et sont définis comme dans la revendication 1, et R représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de 5 fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R^ des formules du dipeptide et de 1'aminoacide définis ci-dessus représente 15 un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace - le radical R,., lorsqu'il représente un groupement protecteur de 5 fonction amine, par un atome d hydrogène - le radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle 20 ou nitrophényle), par un radical hydroxy - les radicaux Rg et R^, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy-carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical carboxy, et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme 25 de sel, _ „ ,
4. 4, Procédé de préparation d'un produit selon les revendication^/ 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé de la L L alanine de formule générale : j 11 y, l 53 ί Rr - NH - CH - CÛOH 5 1 CH, J dans laquelle R._ représente un reste d'acide gras ou un groupement 5 protecteur de fonction amine, sur un dipeptide de formule générale : H^N « CH - CO - R4 CHgCHg -CO-NH-ÇH-Rj (CIL·), I 23 R- NH - CH - FL 5 5 dans laquelle Rg et sont définis comme dans la revendication 1, représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, ' et R_ représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de 5 la fonction amine, étant entendu que l'un au moins des symboles R^ 10 des formules du dérivé de l'alanine et du dipeptide définis ci-dessus représente un reste d'acide gras, puis éventuellement remplace - le radical R..., lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d hydrogène, - le radical R^, lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 15 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical hydroxy et - les radicaux R~ et/ou R_, lorsqu'ils représentent un radical alcoyloxy-carbonyle dont la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substituée par un radical phényle ou nitrophényle), par un 20 radical carboxy, et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
5. 5, Procédé de préparation d'un produit selon les revendica- / tions 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on fait réagir un acide de formule/j/ générale : " (Ji
6. 25 R' - CO - OH (y . 54 dans laquelle R'-CO- représente un reste d'acide gras, ou dérivé activé de cet acide, sur un tripeptide de formule générale : , FL- - NH - CH - CO - NH - CH - CO - Rk 6 ( | 4 CHj CH2CH2 - CO - NH - CH - R5 <{«2>3 B, - NH - OH - Rg dans laquelle et R_ sont définis comme dans la revendication 1, Rk 2 5 * 5 représente un radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle, et les symboles R^, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de fonction amine, l'un au moins des symboles Rg représentant un atome 10 d’hydrogène, puis éventuellement remplace - le radical Rg, lorsqu'il représente un groupement protecteur de la fonction amine, par un atome d'hydrogène, - le radical lorsqu'il représente un radical alcoyloxy contenant 1 , à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle 15 ou nitrophényle), par un radical hydroxy, et - les radicaux R0 et/ou R,, lorsqu’ils représentent un radical alcoyloxy- 2 5 carbonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), par un radical carboxy, et isole le produit obtenu, éventuellement sous forme de sel.
7. 6. Procédé de préparation d’un produit selon les revendica tions 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié l'aminoacide de formule générale : - NH - CH ~ Rj IL - SH - CH - Iî2 dans laquelle l'un des symboles Rg et représente un radical carboxy i\j 25 et l'autre représente un atome d'hydrogène ou un radical carbamoyle / jf ou alcoyloxycarbonyle dont la partie aleoyle contient 1 à 4 atomes de / U / 55 carbone (éventuellement substituée par un radical phénylc ou nîtro-phényle), Rr représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et R^ représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que lorsque R^. et R,^ représentent chacun 5 un groupement protecteur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R^, on condense : - soit un dérivé de l'acide D glutamique de formule générale : Ry - NH - j!H - CO - CHgCHg - COOH 10 dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus et R^ représente un radical amino ou aleoyloxy contenant 1 à atomes de carbone (éventuellement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), puis, après déblocage de la fonction amine protégée par le radical R^, on condense : - soit un dérivé de la L alanine de formule générale s Ry - NH - ÇH - COOH CIL 15 dans laquelle R^ est défini comme ci-dessus, puis après déblocage de la fonction amine protégée par R^, l'acide gras de formule générale ï R* - COOH dans laquelle R'-CO- représente un reste d'acide gras tel que défini dans les revendications 1 ou 2 20. soit un dérivé de la L alanine de formule générale s R - NH - CH - COOH . . 0¾ fj dans laquelle R représente un reste d'acide gras, / Jj - soit le dipeptide de formule générale s / £ V r 56 ί fi,, - Mi - CH - CO - NH - CH - CO - IL 6 | | 1 CH., CILClL - COOH J G c dans laquelle est défini comme ex-dessus et Rg représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, étant entendu que, lorsque représente un groupement protecteur de la 5 fonction amine celui-ci est différent du groupement protecteur R^ défini précédemment, puis après déblocage de la fonction amine protégée par IL, l’acide de formule générale R'-CO-OH défini précédemment, O puis sépare le produit obtenu de son support, élimine éventuellement les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy et isole le 10 produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
8. 7· Procédé de préparation d'un produit selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que l’on fixe sur un support approprié le dîpeptide de formule générale : - MH - GH - CO - R., 9 j 4 CHgCHg - CO - NH - CH - R^ f2h R - NH - CH - R„ 5 2 15 dans laquelle l'un des symboles R2 et représente un radical carboxy et l'autre représente un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont " la partie alcoyle contient 1 à 4 atomes de carbone (éventuellement * substituée par un radical phényle ou nitrophényle), R^ représente un radical amino ou alcoyloxy contenant là1! atomes de carbone (éventuel- 20 lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), R_ représente 5 un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine et Rn représente un groupement protecteur de la fonction amine, étant y entendu que lorsque R_ et R,, représentent chacun un groupement protecteur , 5 9 / de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, puisy*l 25 après déblocage de la fonction amine protégée par R^, on condense t ( li/ - soit un dérivé de la L alanine de formule générale i I If ' * ' i ? A i Ÿ 57 Αγ - Nil - CU - COOH CH.. dans laquelle représente un reste d'acide gras ou un groupement protecteur de la fonction amine, puis après déblocage de la fonction amine protégée par ft., éventuellement l'acide gras de formule générale : -5 R' - CO - OH ' ! dans laquelle R'-CO- représente un reste d'acide gras tel que défini dans les revendications 1 ou 2, - soit un dérivé de la L alanine de formule générale : R - NH - CH - COOH CH, j 10 dans laquelle R représente un reste d'acide gras, puis sépare le produit obtenu de son support, élimine éventuellement les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
9. 8. Procédé de préparation d’un produit selon les revendioa-15 tions 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on fixe sur un support approprié le tripeptide de formule générale i R,, - NH - CH - CO - NH - CH - CO - R.. - 10 | j 4 CHj CHgCftj - CO - NH - CH - (0¾ )3 R, - NH - CH - R„ 5 2 ' dans laquelle l'un des symboles et R^ représente un radical carboxy et l'autre représente un radical carbamoyle ou alcoyloxycarbonyle dont i 20 la partie alcoyle contient 1 à 4 atonies de carbone (éventuellement , substituée par un radical phényle ou nitrophényle), représente un [\j radical amino ou alcoyloxy contenant 1 à 4 atomes de carbone (éventuel- / jf t lement substitué par un radical phényle ou nitrophényle), représente J J * Ί * l: 58 un reste d'acide gras ou un groupement protecteur* de la fonction amine, et R ^ représente un groupement protecteur de la .fonction amine, étant entendu que, lorsque Rc et R.représentent chacun un groupement protec- 5 1U teur de la fonction amine, ces groupements protecteurs sont différents, 5 puis, après déblocage de la fonction amine protégée par R^Q, on condense l'acide de formule générale : R' - CO - OH ; dans laquelle R*-CO- représente un reste d'acide gras tel que défini dans les revendications 1 ou 2, 10 puis sépare le produit obtenu de son support, élimine éventuellement les groupements protecteurs des fonctions amine et carboxy, et isole le produit obtenu éventuellement sous forme de sel.
10. 9· Médicament caractérisé en ce qu'il est constitué par un produit selon la revendication 1 à l'état pur ou en présence d'un ou 15 plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables, Dessins : —- planches . «T* Daaes dont .......i........Pa9e de 9arde pag JS......pages de description g........pages de revendications /_________abrégé descriptif Luxembourg, le Le : "—'Charles München »