JPH0539368A - 絹フイブロイン膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 絹フィブロイン膜をポリオール類、またはポ
リエーテル類の水溶液中に浸漬した後、乾燥させること
を特徴とする。 【効果】本発明の方法によって処理された絹フィブロイ
ン膜は、可撓性，平滑性に優れ、強度面においても良好
なものである。更に、本発明の処理を施して得られる抗
体固定化絹フィブロイン膜は、可撓性があり取扱い性に
優れると共に、以下の試験結果に示すとおり、長期保存
安定性にも優れており、ＥＩＡの免疫センサーに使用す
る場合も、予め水洗処理を施しているので、第１回目か
ら正確な測定結果が得られ、測定時間を大幅に短縮でき
る。同様に本発明の処理を施して得られる酵素固定化絹
フィブロイン膜は、以下の試験結果に示すとおり、処理
前の膜に比べて酵素活性の低下は認められず、処理法と
しても温和なものである。本発明の絹フィブロイン膜の
処理方法は、膜の成型加工上の一工程として、また該膜
を装着したセンサーやリアクターの使用を一時停止する
際の保存方法としても有用な手段を提供するものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、絹フィブロイン膜の新
規な処理方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】絹フィブロイン膜は、酵素や抗体を固定
化した膜としてバイオセンサーやバイオリアクターへの
利用が計られている他、医用材料としても注目されてい
る。絹フィブロイン膜の製造法としては、従来から絹フ
ィブロイン自体の構造転移を利用した様々な製造法が研
究されている。絹原料からセリシンを除去した後、アル
カリ金属塩やアルカリ土類金属塩等の水溶液に溶解し、
さらに透析することによって得られる絹フィブロイン水
溶液は、やや不安定な状態にあり、ずり応力を加えた
り、乾燥させたり、メタノール等の水溶液に浸漬するこ
とにより容易にゲル化することが知られている。そし
て、この性質を利用し、絹フィブロイン水溶液に酵素を
混入し、得られた混合物を板上に流延風乾、更にホルム
アルデヒド等の水溶液に浸漬することにより酵素固定化
絹フィブロイン膜を製造する方法が開示されている（特
開昭５２−５７３９２号公報）。しかしながら、この様
にして得られた膜は、いったん乾燥してしまうと硬化
し、可撓性がなくなってしまうため水溶液として保存せ
ざるをえず、取扱い性に欠けることから、この改良が望
まれていた。

【０００３】一方、本発明者らは、酵素を添加した絹フ
ィブロイン水溶液に予めグリセリン等を混合し、これを
板上に流延し風乾，剥離することにより不溶性の酵素固
定化絹フィブロイン膜を提案した（特公昭５６−３８１
９３号公報）。また、予め抗体を板上に流延風乾してお
き、その上に予めグリセリン等を添加した絹フィブロイ
ン水溶液を流延し風乾，剥離し、免疫計測に有用な抗体
固定化絹フィブロイン膜が提案されている（特公平３−
２２９４４号公報）。この様にして得られた膜は、乾燥
状態でも保存安定性が良く、しかも可撓性，平面性に優
れており、取扱い性の良いものである。ところで、抗体
固定化絹フィブロイン膜は、膜表面に固定化されていな
い抗体が付着しており、このまま免疫計測に使用した場
合、この付着抗体が測定誤差の原因となる。そこで、該
膜センサーに利用するに際しては、膜を電極に装着後、
一定時間水洗処理して取り除いておく必要があり、商品
性を下げる要因となっていた。予めこの処理を行った場
合、再乾燥させると膜が硬化し柔軟性を失うため、水溶
液中に保存せざるをえず、膜装着上の取扱い性が悪くな
るといった問題点があった。そこで、上述のこうした問
題点を解消するため、可撓性，平面性に優れ保存安定性
も良好な膜を与える処理方法の開発が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、既存の
絹フィブロイン膜の有する上記諸問題点に鑑み、鋭意研
究を続けた結果本発明を完成したものであって、その目
的とするところは、可撓性且つ平滑性に優れ、強度面に
於いても良好な絹フィブロイン膜並びに生理活性物質固
定化絹フィブロイン膜の製造方法を提供するにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、絹フィブ
ロイン膜をポリオール類、またはポリエーテル類の水溶
液中に浸漬した後、乾燥させることを特徴とする絹フィ
ブロイン膜並びに生理活性物質固定化絹フィブロイン膜
の製造方法により達成される。

【０００６】本発明に用いるポリオール類化合物または
ポリエーテル類化合物としては、水溶性のものであっ
て、例えば、エチレングリコール，プロピレングリコー
ル，ブタンジオール等の脂肪族二価アルコール類、グリ
セリン，ペンタエリスリトール，ソルビット等の多価ア
ルコール類、ポリエチレングリコール，ポリプロピレン
グリコール等の脂肪族ポリエーテル類のほか、エチレン
グリコールモノメチルエーテル，エチレングリコールモ
ノエチルエーテル等のエーテルアルコール類を挙げるこ
とができる。なかでも分子量が１０００以下のポリエチ
レングリコール，ポリプロピレングリコールや、エチレ
ングリコール，グリセリン，ブタンジオール等が好まし
い。かかる化合物は蒸気圧が低く、温和な乾燥条件では
乾燥によって膜から失われる量は僅かである。

【０００７】また、本発明に用いるこれら水溶液の物質
濃度は、その化合物の分子量，物性等によって異なる
が、一般的に１５〜９０重量％程度であることが好まし
く、３０〜８０重量％が特に好ましい。これらの水溶液
に絹フィブロイン膜を浸漬する時間も、加えるポリオー
ル類化合物やポリエーテル化合物の性質や分子量によっ
て、また処理する膜が乾燥しているか含水しているか、
膜の状態によって異なるが、一般に３０秒以上であるこ
とが好ましく、更に好ましくは１分間以上である。浸漬
温度は特に限定されないが、生理活性物質、例えば酵
素，抗体，抗原等が固定化された絹フィブロイン膜の場
合、それらの物質が失活しないように適宜条件を選択す
ることが必要であり、４〜４０℃とすることが好まし
い。本発明の方法は極めて穏和な処理であるが、それで
も失活がある場合は、効果の失われない範囲で処理時間
を出来るだけ短くすることが必要である。

【０００８】本発明に適用される絹フィブロイン膜は、
特にその製造方法や履歴によって限定を受けるものでは
なく、酵素，抗体，菌体等の生理活性物質が混合され、
包括法や化学結合法で固定化されたものについても有効
に用いられるものである。例えば、特開昭５２−５７３
９２号公報に示されているような成膜後メタノール等の
水溶液に浸漬して不溶化させた酵素固定化絹フィブロイ
ン膜と、特公昭５６−３８１９３号公報に示されている
ような予めグリセリン等を混合して乾燥製膜した酵素固
定化絹フィブロイン膜とではその結晶形態は異なるがい
ずれも本発明を適用できる。また特公平３−２２９４４
号公報に示されているような表面に抗体を固定化した絹
フィブロイン膜、あるいは化学結合により酵素や抗体等
を固定化した絹フィブロイン膜にも同様に適用できる。
これらの膜は直接或いは水溶液中で水洗処理や化学処理
を施した後の含水した状態、更にこれを乾燥した状態の
何れの状態でも本発明の方法に適用することができる。
かかる膜の含水状態も処理効果に影響するため、最適条
件を選択することが好ましい。

【０００９】浸漬処理後の膜を乾燥させるに先立ち、膜
の表面に付着した水溶液を濾紙等に吸収させ除去してお
くことが乾燥後の平滑性を確保する点で好ましい。固定
化された生理活性物質の失活を抑制するため、乾燥温度
は４〜４０℃とすることが好ましい。この一連の処理を
施すことにより、可撓性，平面性，且つ形態面及び固定
化された生理活性物質の活性面での保存安定性に優れた
膜を得ることが出来る。

【００１０】

【発明の効果】本発明の方法によって処理された絹フィ
ブロイン膜は、可撓性，平滑性に優れ、強度面において
も良好なものである。更に、本発明の処理を施して得ら
れる抗体固定化絹フィブロイン膜は、可撓性があり取扱
い性に優れると共に、以下の試験結果に示すとおり、長
期保存安定性にも優れており、ＥＩＡの免疫センサーに
使用する場合も、予め水洗処理を施しているので、第１
回目から正確な測定結果が得られ、測定時間を大幅に短
縮できる。同様に本発明の処理を施して得られる酵素固
定化絹フィブロイン膜は、以下の試験結果に示すとお
り、処理前の膜に比べて酵素活性の低下は認められず、
処理法としても温和なものである。本発明の絹フィブロ
イン膜の処理方法は、膜の成型加工上の一工程として、
また該膜を装着したセンサーやリアクターの使用を一時
停止する際の保存方法としても有用な手段を提供するも
のである。

【００１１】

〔実施例１〕

フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ml中に浸漬し、８０℃で３時間精練した。水洗
後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５０００
mlに浸漬して８０℃で３時間精練し、セリシン等を実質
的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。水１００
ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダー中に塩化
カルシウム１５０ｇを溶解し、７５℃に昇温後、上記の
フィブロイン原料７０ｇを投入し、１時間攪拌下に溶解
した。次いで、１８０ｇの温水（７５℃）を加えて希釈
した。これを冷却した後、ホローファイバー型の透析器
を用いて、流水に対して透析脱塩し、５．７重量％のフ
ィブロイン水溶液１２００mlを得た。塩化カルシウムの
残存量は０．０８％であった。

【００１２】上記フィブロイン水溶液にグリセリンをフ
ィブロインに対して３０重量％加え、その溶液を四方を
区切ったガラス板に流延し、２０℃で１０時間乾燥する
ことによって皮膜化させ、剥離することにより絹フィブ
ロイン膜（試料Ｓ−１）を得た。上記フィブロイン水溶
液にグリセリンをフィブロインに対して３０重量％加
え、その溶液を四方を区切ったアクリル板に流延し、２
０℃で１０時間乾燥することによって皮膜化させ、剥離
した。次いで、この膜を８０％メタノール水溶液中に室
温で３分間浸漬させることにより不溶性の絹フィブロイ
ン膜（試料Ｓ−２）を得た。試料Ｓ−１及び試料Ｓ−２
を０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中
２５℃で１時間浸漬し、次いで下記表１に示す各種水溶
液に２５℃で１時間浸漬した。更に、膜表面に付着した
水溶液を濾紙で十分拭き取り、２５℃，６０％ＲＨで３
日間乾燥した。得られた膜の可撓性を折り曲げ試験で、
平滑性を目視により評価した。結果を表１に示す。

【００１３】

【表１】 １）；０．０１Ｍのリン酸生理緩衝食塩水（ｐＨ７．
２）中２５℃で１時間浸漬した後、２５℃，６０％ＲＨ
で３日間乾燥 ＊印 比較例

【００１４】〔実施例２〕実施例１で得られた試料Ｓ−
１を０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）
中２５℃で１時間浸漬し、次いで６０重量％グリセリン
水溶液に２５℃で下記表２に示す時間浸漬した。更に、
膜表面に付着した水溶液を濾紙等で十分拭き取り、２５
℃，６０％ＲＨで３日間乾燥することによって得た絹フ
ィブロイン膜の可撓性を折り曲げ試験で、平滑性を目視
により評価した。結果を表２に示す。

【００１５】

【表２】

【００１６】〔実施例３〕抗ヒトＡＦＰマウスモノクロ
ーナル抗体（１ｇＧ）を生理食塩水に溶解し、２５０μ
ｇ／mlの抗体溶液を調製した。次に、この溶液を四方を
区切ったガラス板上に抗体量が２０μｇ／ｃｍ² となる
ように流延し、１５℃で３時間乾燥した。実施例１と同
様のフィブロイン水溶液にグリセリンをフィブロインに
対して３０重量％加え、その溶液を抗体が塗布されたガ
ラス板に流延し、２０℃で１０時間乾燥することによっ
て皮膜化させた後、剥離した。これを直径８ｍｍの円形
に裁断し、厚さ６０μｍの標記抗ヒトＡＦＰマウスモノ
クローナル抗体固定化絹フィブロイン膜（試料Ｓ−３）
を得た。

【００１７】上記抗体固定化絹フィブロイン膜（試料Ｓ
−３）を０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
２）中３７℃で１０分間浸漬し、次いで０．１Ｍグリシ
ン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５，食塩２重量％含有）中３
７℃で１０分間浸漬することにより膜表面に固定化され
ずに付着している抗体を洗浄除去した。更に、この膜を
蒸留水中で十分洗浄し、６０重量％濃度のグリセリン水
溶液中に２５℃で１時間浸漬した。次いで、この膜の表
面に付着した水溶液を濾紙等で拭き取り、２５℃，６０
％ＲＨの条件下で４８時間乾燥することにより、抗ヒト
ＡＦＰマウスモノクローナル抗体固定化絹フィブロイン
膜の洗浄処理膜（試料Ｓ−４）を得た。試料Ｓ−３及び
Ｓ−４を図１に示す様な大きさ及び型に打ち抜き、ゲー
ジ長５．２ｃｍになるように引張試験機に装着し、引っ
張り速度５０ｍｍ／ｍｉｎの条件下で強伸度を測定し
た。結果を表３に示す。

【００１８】

【表３】

【００１９】上表から、本発明の処理を施して得られる
抗体固定化絹フィブロイン膜（試料Ｓ−４）の機械的物
性は、成膜上がりのグリセリン含有膜（試料Ｓ−３）に
比較して、低下は認められないことがわかる。次に試料
Ｓ−３及びＳ−４（直径８ｍｍ）を６０℃（６５％Ｒ
Ｈ）の雰囲気中に放置し、経時的にサンプリングして、
標準試料とした１０００ｎｇ／mlのヒトα−フェトプロ
テイン（以下、ヒトＡＦＰと略記する。）及び０．５％
の牛血清アルブミンを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生
理食塩水中で免疫反応量を測定する方法で膜固定化抗体
の活性を評価した。即ち、サンプリングした試料Ｓ−３
及びＳ−４を０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．２）で十分洗浄し、濾紙で拭き取り、次いで内径
１．３ｍｍのガラス試験官に入れ、以下の試験を行っ
た。

【００２０】ヒトＡＦＰ（抗原）１０００ｎｇ／mlを含
有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％の牛
血清アルブミン含有）０．５mlを前記のガラス試験官に
入れ、３７℃で２時間免疫反応を行った。次に、蒸留水
３mlで３回洗浄後、カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウス
モノクローナル抗体５．５μｇ／mlを含有するリン酸緩
衝生理食塩水（０．５％の牛血清アルブミン含有）０．
５mlを同試験官に入れ、３７℃で２時間免疫反応を行っ
た。更に、蒸留水３mlで３回洗浄後、０．０２Ｍ過酸化
水素−０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水１．０mlを加
え、１０分間酵素反応を行った後、１規定硫酸１mlを加
えて反応を停止させ、過酸化水素に基づく２４０ｎｍの
吸光度（Ａ２４０）を測定した。結果を図２に示す。図
２に示す通り、本発明の処理を施して得られる抗体固定
化絹フィブロイン膜（試料Ｓ−４）の保存安定性は、成
膜上がりのグリセリン含有膜（試料Ｓ−３）に比較し
て、低下は認められないことがわかる。

【００２１】次に示す酸素検出型免疫センサー（図３）
とフロー式の測定装置（図４）を用い、下記のヒトＡＦ
Ｐ標準溶液について以下のようにして繰り返し測定を行
った。図３は、酸素検出型免疫センサーの説明図であ
る。同図において（１）は反応セル、（２）は抗体固定
化膜、（３）は酸素透過膜、（４）はＯ−リング、
（５）はガルバニ型酸素電極を表わす。

【００２２】使用した酸素検出型免疫センサーは、特開
昭６３−１１７２５３号公報の記載に準じ反応セル
（１）（容量０．２ml）に、抗体固定化膜（２），酸素
透過膜（３），Ｏ−リング（４）及びガルバニ型酸素電
極（５）（ＡＮ型，オリエンタル電気株式会社製）を図
の様に順次装着して構成されている。図４はフロー式の
測定装置の説明図である。同図において（１０）は洗浄
液、（１１）は解離液、（１２）は酸素基質溶液、（１
３），（１３′），（１３″）はコック、（１４），
（１４′）はポンプ、（１５）はサンプル供給口、（１
６）は免疫センサー、（１７）は記録計である。抗体固
定化膜の繰り返し測定試験は図４の装置を使用し次の様
にして行った。即ち、ヒトＡＦＰ１００ｎｇ／mlを含有
する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清
アルブミン含有）をヒトＡＦＰの標準溶液とした。そし
てカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗
体５．５μｇ／mlを含有する同標準溶液０．５mlを反応
セル（容量０．２ml）に導入し、７分間静置して免疫反
応を行った後、１０ml／分の流速で２分間蒸留水を流し
て反応セルを洗浄した。次いで、２６．５ｍＭの過酸化
水素を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
０．２mlを反応セルに導入し、酸素電極の酸素濃度に比
例した電流値を求め、この値をＡＤ変換器により、電位
値に変換した。続いて、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液
（ｐＨ２．５，食塩２重量％含有）を２０ml／分の流速
で１分間流した後、２分間静置して結合したヒトＡＦＰ
とカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗
体を解離させ、更に２０ml／分の流速で１分間蒸留水を
流して反応セルを洗浄した。操作はすべて３０℃で行
い、酵素反応時以外はすべて攪拌を行った。結果を図５
及び図６に示す。同図から、本発明の処理を施して得ら
れる抗体固定化絹フィブロイン膜（試料Ｓ−４（図
６））を免疫センサーに使用した場合、成膜上がりのグ
リセリン含有膜（試料Ｓ−３（図５））に比較して、第
１回目から正確な測定結果が得られることがわかる。

【００２３】〔実施例４〕実施例１に記載のフィブロイ
ン水溶液にグリセリンをフィブロインに対して３０重量
％加え、次いでグルコースオキシターゼをフィブロイン
に対して１重量％加えて混合した。その溶液をガラス板
に流延し、２０℃で１０時間乾燥することによって皮膜
化させ、剥離した。これを直径８ｍｍの円形に裁断し、
厚さ６０μｍのグルコースオキシターゼ固定化絹フィブ
ロイン膜（試料Ｓ−５）を得た。

【００２４】上記試料Ｓ−５（グルコースオキシターゼ
固定化絹フィブロイン膜）を０．０１Ｍのリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．２）中３７℃で１時間浸漬し、膜表
面に固定化されずに付着している酵素を洗浄除去した。
次に、この膜を蒸留水中で十分洗浄し、６０重量％濃度
のグリセリン水溶液中に２５℃で１時間浸漬した。引き
続き、この膜の表面に付着した水溶液を濾紙等で拭き取
り、２５℃，６０％ＲＨの条件下で４８時間乾燥するこ
とにより、グルコースオキシターゼ固定化絹フィブロイ
ン膜の洗浄処理膜（試料Ｓ−６）を得た。試料Ｓ−５及
びＳ−６（直径８ｍｍ）を下記表４に示すグルコース量
を含有する０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に浸
漬し、一定の攪拌速度で２分間反応させ、グルコースオ
キシターゼの酸化反応によって減少する溶液中の酸素濃
度をポーラ口型酸素電極（セントラル科学株式会社製）
を用いてグルコースオキシターゼ固定化絹フィブロイン
膜の活性を測定した。結果を表４に示す。

【００２５】

【表４】 上表から、本発明の処理を施して得られる酵素固定化絹
フィブロイン膜（試料Ｓ−６）の酵素活性は、成膜上が
りのグリセリン含有膜（試料Ｓ−５）に比較して、低下
は認められないことがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３における引伸度測定に用いる試験片の
形状を示す説明図。

【図２】本発明の処理を施した抗体固定化絹フィブロイ
ン膜（●印本発明例）と、処理前の抗体固定化絹フィブ
ロイン膜（○印比較例）との安定性試験結果を示す線図
であり、縦軸は過酸化水素に基づく２４０ｎｍの吸光
度、横軸は時間（ｈｒ）を表わす。

【図３】膜の繰り返し測定試験に使用した酸素検出型免
疫センサーの説明図。

【図４】図３の免疫センサーを組み込んだフロー式測定
装置の説明図。

【図５】本発明の処理を施さない抗体固定化絹フィブロ
イン膜の測定精度。

【図６】本発明の処理を施した抗体固定化絹フィブロイ
ン膜の測定精度を表わす線図であり、縦軸はセンサー出
力（ｍＶ）、横軸は回数を示す。

【符号の説明】

１ 反応セル ２ 抗体固定化膜 ３ 酸素透過膜 ４ Ｏ−リング ５ ガルバニ型酸素電極 １０ 洗浄液 １１ 解離液 １３，１３′，１３″ コック １４，１４′ ポンプ １５ サンプル供給口 １６ 免疫センサー １７ 記録計

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絹フィブロイン膜をポリオール類、また
   はポリエーテル類の水溶液中に浸漬した後、乾燥させる
   ことを特徴とする絹フィブロイン膜の製造方法。
2. 【請求項２】 絹フィブロイン膜が生理活性物質固定化
   絹フィブロイン膜である特許請求の範囲第１項記載の製
   造方法。