JPH054070B2

JPH054070B2 -

Info

Publication number: JPH054070B2
Application number: JP14858383A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Shinohara; Hideo Ueno
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-08-13
Filing date: 1983-08-13
Publication date: 1993-01-19
Also published as: JPS6041497A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は甘味を有する食品を製造する分野に使
用される。更に具体的にはいわゆる健康食品を製造する分
野に使用される。本発明は、オウレオバシデイウム属
（Aureobacidium・sp、FERM−ＰNo.4257、
ATCCNo.20524菌）に菌体内転移酵素を生成させ、
この菌体内転移酵素であるフラクトシルトランス
フエラーゼ（fructosyl transferase）を利用して
庶糖から庶糖にフラクトースが１〜３個結合した
１−ケストース（１−Kestose）、ニストース
（nystose）を主成分とするフラクトオリゴ糖
（Fructo−oligo糖）を製造する固定化菌体による
フラクトオリゴ糖の製造方法に関する。庶糖（シユクロース）にフラクトース
（Fructose）がβ−1.2結合したイヌリン型のフラ
クトオリゴ糖、即ち１−ケストース、ニストース
は、植物、例えばタマネギ、ニラ、キクイモ、カ
ラスムギ等に含有されており、料理におけるまろ
やかな甘味料として使用されているが、単独の甘
味料剤としては使用されていない。微生物の生産
する転移酵素を利用してのオリゴ糖生産に関して
はサイクロデキストリン・グルコサイル・トラン
スフエラーゼによるグルコ・オリゴ糖（商品名；
カツプリング−シユガー）があり、又パラチノー
ス等についても研究されている。しかし、オウレ
オバシデイウム属のフラクトシルトランスフエラ
ーゼ含有菌体による庶糖からフラクトオリゴ糖、
即ち１−ケストース、ニストースの生成について
は未だ提案されていないがアスペルギルス・オリ
ーゼ（Asp.oryzae）等によるニストースについ
ては研究報告がある。本発明は、オウレオバシデイウム属
（Aureobacidium・sp、FERM−ＰNo.4257、
ATCCNo20524菌）を、炭素源として庶糖のみを
使用した培地で培養すると培養初期において庶糖
は、グルコースとフラクトースに分解されずに庶
糖の60％以上が庶糖にフラクトースがβ−1.2で
結合した１−ケストース、ニストースになり、培
養経過時間と共にフラクトオリゴ糖は減少してグ
ルコース、フラクトースが増加してき、フラクト
ースの増加につれてフラクトースの２量体、３量
体、即ちイヌロビオース、イヌロトリオースが増
加し、96時間以上ではフラクトオリゴ糖は微量に
なることを見出した。更に詳しくは、本発明者はオウレオバシデイウ
ム属による多糖即ちプルラン又はβ−１，３−
１，６−グルカンの生合成酵素の研究を目的とし
ており、培養培地中のグルコース、フラクトース
の増加は本菌による可溶性インベルターゼと判断
し、培養初期に検出されるグルコースが庶糖から
フラクトオリゴ糖が生成するときに副成するグル
コースであることに気付かなかつた。また分析手法として培養培地中の糖をペーパー
クロマト、還元糖で調べているために非還元糖で
あるフラクトオリゴ糖は検出できなかつた。本発明の動機は、多糖即ちにプルラン又はβ−
１，３−１，６グルカン培養時に培養培地に生成
する糖、詳しくはマンニトールを培養経時的に調
べるために高速液体クロマト（HLPC）で培養培
地を分析した際、三糖、四糖が検出されるピーク
位置に未知糖のピークを検出したことである。この糖を液体クロマト、ゲルクロマトで分別し
定量した結果、フラクトオリゴ糖であることが明
らかになつた。第１図に本菌の培養初期における培養培地を高
速液体クロマトで分析した結果を示す。更には本菌は炭素源として庶糖を使用すると、
他の培地組成条件を変動しても培養初期には必ず
培養培地にフラクトオリゴ糖を検出した。この事実からオウレオバシデイウム属菌が庶糖
からフラクトオリゴ糖を生成する転移酵素である
フラクトシルトランスフエラーゼを生成すること
を見い出し本発明を成すに至つた。更には、このフラクトシルトランスフエラーゼ
は菌体内酵素であることが明確になつた。この事は庶糖を炭素源としてオウレオバシデイ
ウム属菌を培養し、培養培地から菌体を物理的に
分離することにより極めて容易に目的とする酵素
が生産できることを示し、更には庶糖溶液に分離
菌体を一定力価添加することにより庶糖からフラ
クトオリゴ糖が容易に生産できることである。更には菌体内酵素であるために固定化菌体とし
て連続的に庶糖からフラクトオリゴ糖を生産でき
るものである。（発明の構成）オウレオバシデイウム属（Aureobacidium・
sp）の微生物の液体培養で得られるβ−１，３−
１，６グルカンと硫酸アルミニウムでフラクトシ
ルトランスフエラーゼ活性菌体を固定化し、この
固定化菌体で庶糖を連続的に１−ケストース（１
−Kestose）とニストース（nystose）を主成分
とするイヌリン型のフラクトオリゴ糖（Fructo
−oligo糖）に変える、フラクトオリゴ糖の製造
方法であつて、上記液体培養の培養培地組成は、米糖、ビタミ
ンＣ及び庶糖のみよりなる培地組成で、24時間以
上通気撹拌した培養液は、β−１，３−１，６グ
ルカンを含有し、かつフラクトシルトランスフエ
ラーゼが活性な菌体を含む培養液であり、上記フラクトシルトランスフエラーゼ活性菌体
の固定化に際して、オウレオバシデイウム属の微
生物を液体培養して得られたβ−１，３−１，６
グルカン培養液を遠心分離して米糖糠の粗粒子を
除去し、60℃以下で濃度が３％以下になるように
濃縮し、これに、上記した培養培地組成で培養し
て分離したフラクトシルトランスフエラーゼ活性
を有する乾燥菌体を添加して充分に混合した後、
水分が50％になるように硅藻土又はカオリンを添
加して混合し、その後この混合物を加圧して細穴
より0.1〜1.0％硫酸アルミニウム溶液に押し出し
30分前後浸漬し、これを取り出して水洗した後、
PH6.0のリン酸緩衝液に浸漬してPH調整後、これ
を取出して60℃以下で熱風乾燥する、固定化菌体
によるフラクトオリゴ糖の製造方法である。本発明で用いるオウレオバシデイウム属は、
FERM−ＰNo.4257、ATCCNo.20524菌として既に
登録されている。オウレオバシデイウム属（Aureobacidium・
sp）の微生物（FERM−ＰNo.4257）の菌学的性
質は次の通りである。Ａ分離菌の菌学的特徴。コロニーは、初め表面平滑で灰白色、粘液性
光沢ある油滴状（脂肪様）の酵母様に発育し、
その周縁から糸状の菌体が、放射状に成長し、
ちぢれた様な糸状で丁度樹枝状発育をする。こ
の糸状菌体は、培地表面のみならず、培地中に
もよく発育する。しばらくすると、コロニー表面に淡暗褐色の
斑点が点々と現れ、次第に黒色の斑点になり遂
に全面が暗黒色となる。この糸状菌体に淡褐色
の楕円又卵形の多数の分生子を側生する。この
分生子は容易にばらばらになる。一方油滴状の
コロニーの表面にも点々と分生子をつける。糖類を含んだ培養液は非常に粘稠性となり、
液面に厚いコロニーで皮革の黒色培苔を生ず
る。最適発育温度は20〜25℃で、ブドウ糖、シ
ヨ糖などの糖類から、アルコール類、有機酸類
を生成し又特有の芳香を有する。Ｂ培養的特徴固体培地：バレイシヨ、グルコース寒天培地上、最初
コロニーは表面平滑、透明、光沢ある油滴
状、粘稠の灰白色の酵母様で、コロニーの周
縁から放射状にちぢれた糸状様の、丁度樹枝
状の菌体が発育し、この糸状様菌体は培地表
面のみならず、培地中にもよく発育する。や
がてその樹枝様のところどころ部分が黒褐色
になる。培養して３〜４日たつと、コロニー
表面に淡暗褐色の斑点が点々と表れるが、以
後次第に淡暗黒色になり全面が広がり、遂に
全体が黒色になる。（培養７日）尚、ツアペツク寒天培地上では発育が遅い
が、コロニー表面が全面黒色になるのに３週
間くらいかかる。液体培養：バレイシヨ、グルコース培地中、点々と浮
遊状態に菌体が発育し（培養３日）、次第に
コロニーが増え、やがて（培養７日）液中に
粘性のコロニーが充満する。そして管壁に暗
黒色の菌苔が現われ、次第に液面にも出来る
（培養15日）。この菌蓋はゼラチナスな粘性のある厚いも
のである。尚、ツアペツク培地中にも同様に発育する
が非常におそく、菌体も少なく、約３週間培
養で液面にかなりの黒色菌苔をつくる。Ｃ形態的特徴若い細胞は透明な糸状のちぢれた樹枝状で、
菌体（糸状様）は、ところどころから黒く、卵
形の胞子様のものが側生する。又油滴状のコロ
ニーはその中に点々と黒色胞子様のものが着生
する。これは衝撃をあたえるとばらばらにな
る。Ｄ生理的特徴最適発育温度は20〜25℃、グルコース、シユ
ークロースなどから粘性物を生成、又グルコー
スなどの糖類から、アルコール類、有機酸類を
生ずる。また、特有の芳香を有する。（注）文献として George SMITH著応用菌学指針（An
introduction to industrial mycology）（P.68〜
97）応用微生物学各論（P.83〜87）に準拠この菌体を液体培養して、培養菌体または菌体
を含む培養液を得る。培養液の、培養培地組成として硝酸ナトリウム
（NaNo₃）0.2〜1.0重量％、粉末酵母0.2〜1.0重量
％、第１リン酸ソーダ（K₂HPO₄）0.05〜0.1重量
％、庶糖5.0〜20.0重量％を使用し、24時間以上
通気撹拌培養するとβ−１，３−１，６グルカン
を含有しないフラクトシルトランスフエラーゼが
活性な菌体を含む培養液が得られる。このオウレオバシデイウム属を庶糖を炭素源と
して液体培養すると、主として菌体内にフラクト
シルトランスフエラーゼ酵素、更に詳しくは庶糖
を供与体および受容体として庶糖にフラクトース
を１分子づつ庶糖のフラクトースにβ−1.2結合
で転移する酵素、即ち下記の転移反応式を触媒す
る酵素で、反応生成物であるフラクトオリゴ糖も
庶糖の受容体となり、フラクトースが１分子多く
結合したフラクトオリゴ糖になる。この場合、いずれも必ず１モルのグルコースが
生成される。２（Ｇ−Ｆ）＋酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ＋ＧＧ−Ｆ＋Ｇ−Ｆ−Ｆ＋酵素→Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｆ＋ＧＧ−Ｆは庶糖Ｇ−Ｆ−Ｆは１−ケストースＧはグルコースＧ−Ｆ−Ｆ−Ｆニストースで
ある。オウレオバシデイウム属は、庶糖を炭素源とし
て液体培養すると、培養培地中の庶糖を、フラク
トオリゴ糖即ち１−ケストース、ニストース等に
変化させると同時に菌体内に転移酵素、即ちフラ
クトシルトランスフエラーゼ酵素を含有した菌体
ができるため、菌体を粗酵素として利用できる。しかし、炭素源として、フラクトース、グルコ
ース、澱粉等を使用する場合はフラクトシルトラ
ンスフエラーゼは菌体内に含有されない。第１は炭素源を庶等のみとし、他の培地組成を
変えて培養した際の培養培地の糖組成と菌体中の
フラクトシルトランスフエラーゼ活性を示してい
る。

【表】シユークロース＋＋＋

Claims

【特許請求の範囲】１オウレオバシデイウム属
（Aureobacidium・sp）の微生物の液体培養で得
られるβ−１，３−１，６グルカンと硫酸アルミ
ニウムでフラクトシルトランスフエラーゼ活性菌
体を固定化し、この固定化菌体で庶糖を連続的に
１−ケストース（１−Kestose）とニストース
（nystose）を主成分とするイヌリン型のフラクト
オリゴ糖（Fructo−oligo糖）に変える、フラク
トオリゴ糖の製造方法であつて、上記液体培養の培養培地組成は、米糠、ビタミ
ンＣ及び庶糖のみよりなる培地組成で、24時間以
上通気撹拌培養した培養液は、β−１，３−１，
６グルカンを含有し、かつフラクトシルトランス
フエラーゼが活性な菌体を含む培養液であり、上記フラクトシルトランスフエラーゼ活性菌体
の固定化に際して、オウレオバシデイウム属の微
生物を液体培養して得られたβ−１，３−１，６
グルカン培養液を遠心分離して米糖等の粗粒子を
除去し、60℃以下で濃度が３％以下になるように
濃縮し、これに、上記した培養培地組成で分離し
たフラクトシルトランスフエラーゼ活性を有する
乾燥菌体を添加して充分に混合した後、水分が50
％になるように硅藻土又はカオリンを添加して混
合し、その後この混合物を加圧して細穴より0.1
〜1.0％硫酸アルミニウム溶液に押し出し30分前
後浸漬し、これを取り出して水洗した後、PH6.0
のリン酸緩衝液に浸漬してPH調整後、これを取出
して60℃以下で熱風乾燥する、固定化菌体によるフラクトオリゴ糖の製造方法。