JPH0542259B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野 本発明は殿粉の酵素分解に関する。特に本発明
は、殿粉、特に液化殿粉の糖化に有用な新規酵素
製品およびその製造方法を提供する。 技術の状態 天然殿粉はグルコース単位からなる２つの型の
高分子を含むことが知られている。アミロースと
呼ばれる第１の型の分子は線状であり、もつぱら
α−１，４−結合グルコース単位からなる。殿粉
は約25％のアミロースを含む。アミロペクチンと
呼ばれる第２の型の分子は高度に枝分かれしてい
てα−１，４ならびにα−１，６結合グルコース
単位を含む。α−１，６結合の全含量は一般に５
％以下である。 殿粉からの濃デキストロースシロツプの形での
糖の生産は現在(1)固体殿粉のα−アミラーゼによ
る平均重合度約７〜10のデキストリンへの液化
（または粘度低下）と(2)得られた液化殿粉（すな
わち殿粉加水分解物）のアミログルコシダーゼに
よる糖化に基づく高グルコース含量（全固形分92
〜96重量％）のシロツプの生成とを含む２段階酵
素触媒方法によつて毎年数百万トンの割合で行わ
れている。商業的に製造されたデキストロースシ
ロツプの大部分は次に酵素作用下に異性化されイ
ソシロツプとして知られるデキストロース／フラ
クトース混合物となる。 使用する２種の酵素、α−アミラーゼとアミロ
グルコシダーゼとは２つの重要な面で異なつてい
る。第一にいわゆるエンド酵素であるα−アミラ
ーゼはでたらめに高分子を攻撃する。一方、アミ
ログルコシダーゼはいわゆるエキソ酵素であり、
澱粉加水分解物中のデキストリン分子の非還元性
末端から順次にグルコース単位を分解する。第二
に、α−アミラーゼはもつぱらα−１，４−結合
を攻撃するがアミログルコシダーゼはα−１，６
結合をも分解する。 アミログルコシダーゼの推せん名はエキソ−
１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ、エンザイムコ
ミツテイ（Enzyme committee）番号3.2、1.3
で、組織名α−１，４−グルカングルコヒドロラ
ーゼである。アミログルコシダーゼはAGまたは
グルコアミラーゼとも呼ばれ、以下に用いられる
用語アミログルコシダーゼ、AGおよびグルコア
ミラーゼは同義語であると理解されるであろう。 アミロペクチンはもつぱらα−１，４結合を攻
撃するα−アミラーゼによつて部分的にしか分解
されないけれども速度はα−１，４結合よりも相
当に低いがα−１，６グルコシド結合をも加水分
解をするアミログルコシダーゼによつて触媒され
る次工程での糖化工程では枝わかれオリゴ糖の実
質的な加水分解が起こる。 上述の工業的方法の糖化段階に幾つかの点で欠
陥があることはずつと以前から知られていた。特
に、現在入手可能なアミログルコシダーゼは糖化
とレバーシヨン反応（例えばテキストロースのイ
ソマルトースへの転化）との両方を、基質濃度に
依存する速度で、触媒する。この方法では副生成
物が生成するので、殿粉のデトキストロースへの
加水分解の糖化は、少なくとも33重量％の乾燥固
形分を含むシロツプ状で、乾燥固形分基準で約95
重量％以下のデキストロース（以下DXと称す）
に限定されていた。 基質を乾燥固形分約15％へ希釈すると共に比較
的高濃度のアミログルコシダーゼを用いると、レ
バーシヨン反応による副生成物の生成を約50％に
まで抑えると共に殿粉転化を約１−２％だけ増加
させ得る（米国特許第4017363号参照）ことは真
実であるが、得られたデキストロース溶液を通常
の高乾燥固形分濃度へ濃縮するためにエネルギー
を消費しなければならない。 DX値をさらに増加させる努力に於て、液化殿
粉中に存在する枝分かれオリゴ糖（α−１，６グ
ルコシド結合を含む）をより有効に加水分解させ
るため、アミログルコシダーゼと共に脱枝わかれ
（debranching）酵素の使用が提案された。 ヨーロツパ特許出願第82302001.1号広告第
0063909号明細書は、バシルス・アシドプルリチ
クス（Bacillus acidopullulyticus）と呼ばれる
バシルスによつて産生されるプルラナーゼ型の脱
枝わかれ酵素を記載している。この明細書によれ
ばこの脱枝分かれ（debranching）酵素は3.5〜
5.5の範囲のPHで最適活性を示し、PH４〜５に於
ける最適熱活性は少なくとも約60℃である。PH
５、60℃に於ける72時間後の残留活性は50％又は
それ以上である。この酸プルラナーゼは糖化酵素
の１つ、アミログルコシダーゼまたはβ−アミラ
ーゼ、と共に用いられる。この酸プルラナーゼと
アミログルコシダーゼとの併用により同様な条件
下でアミログルコシダーゼだけを用いて得られる
デキスタロースレベルと比較して約１％高いデキ
ストロースレベルが得られると報告されている。
別法では、約半分量のアミログルコシダーゼを用
いて同じデキストロースレベルが得られる。 米国特許第4335208号明細書はアミグルコシダ
ーゼと別の脱枝分かれ酵素、すなわちプセウドモ
ナス・アミロデラモサ
（Pseudomonasamyloderamosa）からのイソア
ミラーゼとの併用を記載している。この参考文献
によればこのイソアミラーゼはアミログルコシダ
ーゼの至適PH付近に至適PHをもつもので、アミロ
グルコシダーゼのみの場合と同じかもしくは高い
デキストロースレベルを得るのにアミログルコシ
ダーゼの量をかなり減少させることができる。し
かしながらこの方法にはイソアミラーゼが熱に不
安定という重大な欠点がある。このことは次のこ
とを意味する。即ちアミログルコシダーゼそのも
のは通常、殿粉加水分解物の糖化に於て60℃で用
いられるが、イソアミラーゼの存在下での糖化は
約55℃以上に於て技術上実施できないことを意味
する。さらに、プセウドモナス（Pseudomonas）
属の微生物はいわゆるGRAS〔一般的に安全とみ
なされた（Generally Regarded As Sefe）〕微
生物ではないので、かかる微生物の産生した酵素
は米国内で食品および食品処理には不許可であ
る。 米国特許第3897305号明細書はアミログルコシ
ダーゼとアエロバクテル・アエロゲネセス
（Aerabacter aerogenes）〔グレブシエラ・プネ
ウモニエ（Klebsiella pneumoniae）〕からのプ
ルラナーゼとの併用によつて少なくとも30％乾燥
固形分を含むシロツプの形で、２％までのDXの
増加が得られると記載している。しかし、K.プ
ネウモニエからの酵素の至敵PHは好ましくない
5.5〜6.0であり、このためアミログルコシダーゼ
の活性がひどく低下する比較的高いPHで糖化を行
わねばならないので、アミログルコシダーゼの節
約は実際上得られない。 マーシヤル（Marshall）ら〔フエブスレター
ズ（Febs Letters）、vol.9、No.２、1970年７月、
85−88頁〕はアスペルギルス・ニゲル
（Aspergillus niger）から得られるアミログルコ
シダーゼが殿粉のグルコースへの安全な加水分解
に明らかに必須なα−アミラーゼ様不純物を含む
と報告している。しかしこの不純物の性質測定ま
たは単離の試みはなされていない。 発明の目的 本発明の１つの目的は、アミログルコシダーゼ
製剤から誘導され得ると共に実用的なα−１，４
−グルコシド結合分解活性を有する新規な酸アミ
ラーゼを提供することである。本発明の新規酵素
製品は酸性PHに於てα−グルコシド結合分解活性
を有しており、殿粉および好ましくは液化殿粉の
糖化に使用されることができる。 本発明のもう１つの目的は殿粉を高デキストロ
ース含量のシロツプに転化させる新規方法を提供
することである。 発明の開示 本発明はその第１の面に於て、アミログルコシ
ダーゼから得られ、かつ実質的なα−１，４−グ
ルコシド結合分解活性を有する微生物源の酸アミ
ラーゼを提供する。この酸アミラーゼはPH3.5〜
5.0、温度約60〜約75℃に於て最適糖化を行い、
通常の貯蔵条件下では数か月間安定である。 本発明の酸アミラーゼはアミログルコシダーゼ
製剤中の１成分として存在し、好ましい分離方法
として高速液体クロマトグラフイのような適当な
分離技術を用いてかかる製剤から実質的に純粋な
形で得られる。 以下に記載する新規酸アミラーゼは微生物アス
ペルギルス・ニゲルから誘導された市販のアミロ
グルコシダーゼから得られ、かつこのアミログル
コシダーゼが好ましいアミログルコシダーゼであ
るけれども多くの微生物属はアミログルコシダー
ゼを産生することが知られている種を包含してい
るものであつて、これは言うまでもないことであ
る。かかるアミログルコシダーゼのいずれかおよ
び全部を本発明の新規酸アミラーゼ源として使用
することができる。しかしながら真菌のアミログ
ルコシダーゼをアミログルコシダーゼ源として用
いることが好ましい。 アスペルギルス・ニゲルから誘導される酸アミ
ラーゼの熱安定性はA.ニゲルのアミログルコシ
ダーゼの熱安定性よりも良好である。該酸アミラ
ーゼの安定性および残留活性も該アミログルコシ
ダーゼの安定性および残留活性より優つている。 本発明は、酸性PHに於てα−１，４およびα−
１，６の両結合の分解活性を有していてアミログ
ルコシダーゼと新規酸アミラーゼとを、後で定義
するAGIの１単位につき少なくとも0.16AAUの
比で含む新規酵素製品をも提供する。 この製品は、既知のアミログルコシダーゼ製剤
に本発明の新規の酸アミラーゼを添加して該アミ
ログルコシダーゼ製剤の酸アミラーゼ含量を増加
させることによつて得られる。 好ましくはアミログルコシダーゼはアスペルギ
ルス・ニゲルのアミログルコシダーゼでありかつ
該アミログルコシダーゼをやはりアスペルギル
ス・ニゲルから誘導される新規酸アミラーゼで強
化する。 本発明の新規酵素生成物は、新規酸アミラーゼ
を、好ましくは実質的に純粋な形で、アミログル
コシダーゼへ添加することによつて製造される。
別法では、好ましくはアスペルギルス属に属し、
より好ましくはA.ニゲル種に属し、技術上公知
の、アミログルコシダーゼと比較してアミラーゼ
含量の高いアミログルコシダーゼを産生するアミ
ログルコシダーゼ産生株、またはその変種または
突然変異株を見いだすことが可能であり、この場
合には、該微生物を炭素源と窒素源と無機塩とを
含む適当な栄養培地で該微生物を培養することに
よつて酵素製品を得ることができる。新規酵素製
品は、酸アミアーゼの発酵条件を選択的に改良す
るかあるいは現在製剤中のアミログルコシダーゼ
を部分的に不活性化することによつても製造され
る。 トランスグルコシダーゼは望ましくない副生成
物を生成するので、本発明のアミログルコシダー
ゼも新規酵素製品もトランクグルコシダーゼを含
まないことが好ましい。このことは、例えばトラ
ンスグルコシダーゼ陰性株でアミログルコシダー
ゼを産生させることによるかあるいは使用するア
ミログルコシダーゼ製剤から例えばベントナイト
によつてトランスグルコシダーゼを除去すること
によつて達成され得る。 本発明の新規酵素製品はAGIの１単位につき少
なくとも0.16AAUの酸アミラーゼを含む。本明
細書中で用いる１単位の酸アミラーゼ活性
（AAU）は、標準条件（PH４、２、60℃）で１分
につき1.0mgの可溶性殿粉（100％乾燥物）を、既
知強度のヨウ素溶液との反応後、下記のヨウ素殿
粉アミラーゼ試験中に記載されている色標準の光
学密度と等価の620nｍに於ける光学密度を与え
る生成物に加水分解する酵素の量である。本明細
書中で用いる１単位のアミログルコシダーゼ活性
（AGI）は、後述する最適殿粉分解条件下で、60
℃に於て、可溶性殿粉（100％乾燥物）から毎分
1μモルのデキストロースを放出する酵素の量と
定義されている。好ましくは本発明の新規酵素製
品はAGIの１単位につき約0.2〜約4.5AAU、より
好ましくはAGIの１単位につき約0.3〜約
3.0AAU、特にAGIの１単位につき約0.7〜約
1.5AAUの酸アミラーゼを含む。 酸アミラーゼで強化したアミログルコシダーゼ
製剤はこれを液化殿粉の糖化に用いたときにより
短い糖化時間で予想外にしかも著しく高いデキス
トロースレベルを与えるという驚くべき事実が発
見された。この結果は、同様な条件下で上記ヨー
ロツパ特許出願公告第006309号明細書に記載され
ているアミログルコシダーゼと酸プルラナーゼと
の作用によつて得られる結果と匹敵し得る。 従つて本発明は、随意にかつ好ましくは殿粉加
水分解物を生成させる液化工程の後に、上記定義
の新規酵素製品の存在下で殿粉を糖化することか
らなる殿粉のシロツプの形のデキストロースへの
転化方法をも提供する。本発明の方法に於ける新
規酵素製品の使用は、殿粉加水分解物の糖化のた
めに実質的により低い量のアミログルコシダーゼ
を用いて、より高い酵素１単位（AGI）当たり収
量を得ることができるという利益を有する。新規
酵素製品は殿粉および殿粉加水分解物の糖化に於
てより高い基質濃度を使用し得るという大きな利
益をも有している。より高い基質濃度を用いると
蒸発費が実質的に減少する。 糖化は2.5〜６、好ましくは約３〜約５、より
好ましくは約4.0〜約4.5の範囲のPHで行われるこ
とが適切である。本発明の方法は、最高収量を得
らため、適当なのは40〜70℃、好ましくは約50〜
約65℃の範囲の温度に於て15〜96時間の範囲の反
応時間で行われる。 殿粉加水分解物の糖化のために好ましいアミロ
グルコシダーゼの比率は、通常、乾燥固形分１ｇ
当たり約８〜約30AGI、好ましくは約14〜約
22AGIの範囲である。 殿粉または殿粉加水分解物の糖化は、本発明の
方法を有効量の酸プルラナーゼをも含む上記定義
の新規酵素製品の存在下で行われるとき、さらに
改良させることも発見された。本発明の目的に使
用され得る適当な酸プルラナーゼは例えばヨーロ
ツパ特許出願公告第0063909号記載の酸プルラナ
ーゼである。新規酵素製品と共に使用され得る酸
プルラナーゼの好ましい量は0.005〜５プルラナ
ーゼ単位（PU）（この単位は該ヨーロツパ特許出
願明細書中で定義されている）である。本発明の
方法に於て酸プルラナーゼと共に新規酵素を用い
ると予想外にかつ顕著により高いデキストロース
レベルが短い糖化時間で得られるという利点があ
る。 酵素製剤中の酸アミラーゼの量のもう１つの適
当な測定方法は下記の修正されたフアデバシアミ
ラーゼ試験（Phadebas Amylase Test）であ
る。本明細書中で用いる１単位の酸アミラーゼ活
性（AAU′）は、下記の修正フアデバスアミラー
ゼ試験条件下で620nｍに於て１単位の吸光度を
与える酵素量と定義される。前文中に定義したヨ
ウ素殿粉アミラーゼ試験（lodine Starch
Amylase Test）条件下でAGIの１単位につき少
なくとも0.16AAUの酸アミラーゼの値は修正フ
アデバスアミラーゼ試験条件下でAGIの１単位に
つき少なくとも0.12AAU′の酸アミラーゼの値に
相当する。後者の方法の欠点はアミログルコシダ
ーゼが存在するときに起こる共同効果である。さ
らに、この方法を自動化することは極めて困難で
あり、あるいは不可能でさえある。 特に断らない限り本明細書中でAAU値という
ときにこの値は修正ヨウ素殿粉アミラーゼ試験法
による単位で示されたものである。 以下の試験方法および実施例によつて本発明を
説明する。 ヨウ素殿粉アミラーゼ試験 本試験法は、アミログルコシダーゼ抑制剤の存
在下に於けるヨウ素殿粉錯体の光学密度の測定に
基づく。アミログルコシダーゼ抑制剤としてアカ
ルボース、ベイg5428（Acarbose、Bay g5421）
を用いた〔シユミツト（Schmidt）ら、ナツール
ビツセンシヤフテン（Naturwissenshaften）64
（1977）535参照〕。 試 薬 (1) クエン酸塩緩衝液（0.013M、PH4.2）中の可
溶性殿粉〔リントナー、J.T.ベーカー社
（Lintner、J.T.Baker Co.）〕の２％溶液 (2) 蒸留水１中にヨウ素22ｇとヨウ化カリウム
44ｇとを含むヨウ素貯蔵溶液 (3) 希ヨウ素溶液：４mlのヨウ素貯蔵溶液と40ｇ
のヨウ化カリウムとに蒸留水を加えて溶かして
１にしたもの (4) 塩化第一コバルト６水化物250ｇと重クロム
酸カリウム38.4ｇとを0.01N HCl1中に含む
色標準 操 作 殿粉溶液（20ml）を60℃で20分間予熱し、この
基質溶液に、正確に０時に、10mlの酵素試料
（1.4〜1.8AAU／ml含量；室温）を添加して開始
した。酵素試料中にアミログルコシダーゼが存在
すると思われる場合にはアミログルコシターゼ抑
制剤ベイg5421をAGIの１単位当たり1μｇの濃度
で酵素試料へ前以て添加する。20分間のインキユ
ベーシヨン後に１mlの溶液を５mlの希ヨウ素溶液
へ移し、直ちに蒸留水をプランクとして用いて１
cmキユベツト中で620nｍの光学密度を測定した。
この移行および測定の操作を、光学密度が色標準
の光学密度以下になるまで、１分間融で繰返し
た。 吸光度が等しくなるに要する時間Ｔをグラフか
ら求めた。 インキユベーシヨン溶液中に存在する酸アミラ
ーゼ活性単位（AAU）を400／Ｔから計算した。
但し400はインキユベーシヨン溶液中の可溶性殿
粉のmg数であり、Ｔは所要反応時間（分）であ
る。 修正フアデバスアミラーゼ試験 標準フアデバスアミラーゼ試験（standard
Phadebas amylase test〔マルシニアク
（Marciniak）ら、スターチ（Starch）36、442
（1982）〕を酸性PHおよび温度60℃の条件に修正し
て次のように行つた。ねじ込みキヤツプ付きガラ
スバイアルに、10AGIを含む酵素試料１mlと酢酸
緩衝液（0.3M、PH4.0）4.0mlとをピペツトで入れ
た。次にフアデバス錠剤（フアルマシア
（Pharmacia）、バツチNo.HE74112〕を添加し、
15秒間ボーテクシング（vortexing）を行つた後
に管を密閉し、60℃の水浴に入れた。錠剤添加か
ら正確に15分後に0.3NのNaOH（５ml）を添加し
振とうして反応を停止させた。遠心分離後に上澄
液をとり１cmキユベツト中で蒸留水に対して
620nｍに於ける光学密度（OD）を測定（0.2〜
2.0の範囲で）した。ブランク（蒸留水）を同じ
方法で測定した。△ODは酸アミラーゼ活性の尺
度である。１単位の酸アミラーゼ活性（AAU′）
はこれらの試験条件下で620nｍに於ける１単位
の吸光度（△OD＝１）を与える酵素の量と定義
される。 アミログルコシダーゼ分析 酢酸塩緩衝液（0.04M、PH4.3）１中16ｇの
濃度の可溶性殿粉（２ml；リントナースターチ
（Lintner Starch）、J.T.ベーカー社（J.T.Baker
Co.）〕を60℃で５分間予熱した後に２mlの酵素溶
液（0.15−0.55AGl／ml）を添加した。混合後に
懸濁液を60℃でインキユベーシヨンした。15分後
に20mlNaOH（0.005N）を添加することによつて
反応を停止させ、グルコースオキシダーゼ法でグ
ルコース濃度を測定した。 糖化方法 デキストロース当量（DE）16.5のマルトデキ
ストリンMDO3〔ロケツト フレール（Roquette
Fre′res）〕について本発明の糖化方法を行つた。
この基質は、糖化工程に於てそれから0.4〜0.5％
ぐらいの二糖マルチユロース（maltulose）が生
成されるフルクトシル末端基を有するオリゴ糖を
幾らか含んでいる。この基質溶液（乾燥固形分33
％）に対して2100AGl／100ｇ乾燥固形分を添加
した。1N酢酸でPHを4.20に調節し、混合物を水
溶中60℃でインキユベーシヨンした。0.1mlずつ
を16、24、48、64、72、80、92時間後に反応混合
物から取り出して密閉試験管中の３mlの蒸留水へ
添加した。 各希釈試料を、直ちに10分間沸騰水溶中に入れ
て酵素を不活化させた。冷後、HPLC妨害塩を除
去するために各試料に乾燥アンバーライトMB−
３樹脂（BDH）約150mgを添加した。１時間放置
後に樹脂を除去し、Bio−Rad HPX−87C 300
mmカラムを使用する点で修正したスコベル
（Scobell）らの方法〔Cereal Chem.、54(4)、
（1977）905−917〕によるグルコース定量のため
に40μの試料をHPLC上へ注入した。この分析
の正確度および精度は、90−96％の範囲のグルコ
ース濃度に於てそれぞれ0.1％および0.2％絶対値
であることがわかつた。 これらの条件下で、マイルズ（Miles）〔ダイ
アザイム（DIAZYME）およびオプテイデツク
ス（OPTIDEX）〕、ノボ（Novo）（AMG）、ギ
スト・ブロカデス（Gist−Brocades）〔アミガー
ゼ（AMIGASE）GM〕からの現市販アミログル
コシダーゼ製剤を用いて94.6−94.8％のグルコー
スのピークレベルが得られた。 例 １ 酸アミラーゼの単離および同定 アミログルコシダーゼ製剤中に存在する殿粉分
解成分を単離、同定するため、A.ニゲルのトラ
ンスグルコシダーゼ陰性株によつて産生されるア
ミログルコシダーゼ酵素製剤アミガーゼGM
（Amigase GM）（ギスト・ブロカデス製）を高
速液体クロマトグラフイにかけた。このクロマト
グラフイ系は直列に連結させた陰イオン交換カラ
ムとゲル過カラムとからなつていた。AG製剤
の一部分をイオン交換カラム上へ注入後、PH4.0
の0.05M酢酸ナトリウム緩衝液である溶媒を、正
荷電および非荷電成分がゲルカラムに達するま
で、両カラムを通して送つた。イオンカラムに吸
着された分子を塩勾配（0.05〜1.65M酢酸ナトリ
ウム緩衝液、PH4.0）で溶出させた後にゲルカラ
ムに結合している分子を元の溶媒で溶出させた。 この方法は第１図に見られるように、殿粉分解
酵素間の優れた分離を示し、両アミログルコシダ
ーゼ異性体およびα−アミラーゼは、流出物を分
取し、捕集した各分画を適当な基質すなわちマル
トースおよび可溶性殿粉（10％乾燥固形分）と共
にインキユベーシヨンすることによつて固定され
た。単離されたアミログルコシダーゼ成分は殿粉
およびマルトースからグルコースを生成したが、
単離されたα−アミラーゼは殿粉から典型的なオ
リゴ糖パターンを生成した。 α−アミラーゼの特にPHおよび温度に関する特
性を、基質として可溶性殿粉を用いて測定した。
生成した主生成物（二糖および三糖類）の量はPH
3.5〜5.0で最適を示し、この酵素が真の酸アミラ
ーゼ（AA）であることを示した。温度の影響を
PH4.0で研究したところこの酸アミラーゼは、生
成した三糖類の挙動から決定されるように、その
至適温度が65〜70℃であることを示した。これら
の結果は、この酸アミラーゼが60℃の標準糖化温
度で十分に安定であることを示している。その活
性が３カ月間以上も安定であるAAを含む分画を
強化実験に用いた。 例 ２ 酸アミラーゼ強化試料による糖化 デキストロース当量（DE）16.5のマルトデキ
ストリンMDO3について糖化を行つた。この基
質の溶液（乾燥固形分33％）に対し2100AGl／
100ｇ乾燥固形分を添加した。また、前以て上記
フアデバス法でその活性を測定してある酸アミラ
ーゼの種々の量を添加した。糖化中に殿粉加水分
解物をPH4.0−4.2、温度60℃に保つた。これらの
条件下で糖化度すなわちグルコース生成度を17〜
91時間にわたつて測定した。トランスグルコシダ
ーゼを全く含まない酸アミラーゼ強化試料につい
ての実験は、表１の結果からわかるように、グル
コース収率が増加しかつ糖化時間が短縮されるこ
とを示した。

【表】 表１の結果は、酸アミラーゼがこれらの条件下
でグルコース収率を94.7％から95.1％に増加し、
同時に最適収率のための糖化時間を70時間から24
時間へ短縮することを示す。このことは酸アミラ
ーゼの使用を商業的に重要にするものであり、プ
ルラナーゼ使用の際に得られる結果と等価であ
る。アミログルコシダーゼの一部分を酸アミラー
ゼで置換しても経済的に魅力あるグルコース収率
および糖化時間を得ることができる。 例 ３ 例１の糖化方法を用い、正規量および正規量の
半分のアミログルコシダーゼ並びに酸アミラーゼ
とヨーロツパ特許出願公告第0063909号明細書記
載のプルラナーゼとの単独または組合わせで強化
した正規量の半分のアミログルコシダーゼで試験
を行つた。１プルラナーゼ単位（PU）は標準条
件下でプルランから毎分1μモルの還元糖を生成
するために必要な酵素の量と定義される。結果を
表２に示す。

【表】 (a) 元のアミログルコシダーゼ製剤中に存在する量
〓修正フアデバス法で測定〓
(b) 添加酸アミラーゼのAAU′〓修正フアデバス法で
測定〓
(c) AAU(ヨウ素殿粉アミラーゼ試験で前に定義した)
へ換算した酸アミラーゼ活性
表２の結果は、正規量の半分のアミログルコシ
ダーゼ（AG）と酸アミラーゼ（AA）強化因子
とを用いるとグルコースレベルは約80時間後にピ
ークに達し、これは正規量のアミログルコシダー
ゼを用いるときの糖化時間70時間より僅かに長い
がピークレベルは94.7％から95.5％に増加するこ
とを示しており、この増加はアミログルコシダー
ゼ使用量が少ないためイソマルトースの生成が少
なくなるためかも知れない。 同様な結果はプルラナーゼとアミログルコシダ
ーゼとを一緒に用いるときに得られたが、短い糖
化時間に於てグルコース生成に顕著な差違が認め
られた。酸アミラーゼとプルラナーゼと半分量の
アミログルコシダーゼとの併用は、より迅速な糖
化を示し、酵素活性（AGI）１単位当たり毎時グ
ルコースの高収率をもたらした。 これらの結果は、酸アミラーゼが糖化工程に於
て殿粉の加水分解に実質的に貢献することを示し
ている。この驚くべき効果は酸性プルラナーゼの
効果と競合するが、両酵素は基本的に異なる機構
で作用するものである。プルラナーゼはエンドα
−１，６結合分解酵素と考えられるが、酸アミラ
ーゼはα−１，４結合分解活性を有する。 例 ４ 殿粉の糖化に新規酸アミラーゼを用いるとグル
コースピークレベルの増加、糖化時間の短縮およ
び必要なアミログルコシダーゼ／乾燥固形分
（DS）比の減少が可能になる。液化殿粉の糖化に
酸アミラーゼを用いることのもう１つの利点は、
基質濃度を上げることができること、従つて蒸発
費用を実質的に減少できることにある。 種々の乾燥固形分含量で基質（MDO3）を含
む溶液のPHを4.2に調節し、60℃に加熱した。正
規量の半分のAG（10.5AGl／ｇDS）と９倍量の
酸アミラーゼとを添加した。種々の時間間隔で一
定量をとり、例１記載のようにして分析した。酸
アミラーゼを添加しない正規量および半分量の
AGについての対照実験も行つた。結果を表３に
示す。

【表】

【表】 表３のデータは、アミログルコシダーゼを新規
酸アミラーゼと共に使用するとき乾燥固形分含量
（DS）を上げること、市販のアミログルコシダー
ゼ製剤を用いて同様条件下で得られるレベルより
も高い最高グルコースレベルが得られることを示
す。例えば、市販アミログルコシダーゼでは33％
DSに於て94.7％のグルコースピークレベルを得
たが、同じ時間のインキユベーシヨンの下で10倍
の酸アミラーゼの添加と半分量のAG使用とで
は、37％DSに於て同じ最高グルコースレベルが
得られた。 例 ５ 酸性PH範囲および60℃に於て活性な他の酵素源
すなわち細菌酵素からの酸アミラーゼもアミログ
ルコシダーゼで生起される糖化の改良に用いるこ
とができる。かくしてα−アミラーゼ活性を含む
細菌ATCC31199（英国特許第1539694号明細書、
CPCインターナシヨナル参照）の粗製発酵試料
をアミログルコシダーゼによる糖化実験に用い
た。AAU／AGl＝0.74の比の粗製試料を用いる
と対照実験のアミログルコシダーゼのみで得られ
るレベルより顕著に高いグルコースレベルを与え
たがその値は真菌の酸アミラーゼの対応量で得ら
れるレベルより低かつた。結果を表４に示す。

【表】 例 ６ 前記と同じ方法で糖化実験を行つた。基質を含
む溶液（MDO3、33％DS）を3.5〜5.0のPH値に調
節し60℃に加熱した。アミログルコシダーゼ
（21AGl／ｇDS）を９倍量のAA（AG製剤中に存
在する量と比較して）と共に添加した。種々の時
間間隔で一定量をとり分析した。対照実験も行つ
た。表５の結果が得られた。

【表】 かようにして過剰の酸アミラーゼの使用により
3.5〜5.0のPH範囲で匹敵できるグルコースピーク
レベルが得られた。 例 ７ 基質含有溶液（MDO3、33％DS）をPH4.2に調
節し、種々の温度に加熱した。アミログルコシダ
ーゼ（21AGl／ｇDS）９倍量の酸アミラーゼと
を添加した。一定量をとつて例２記載のように分
析した。対照（余分のAAを加えないAG量）実
験も行つた。結果を表６に示す。

【表】

【表】 これらの結果は、酸アミラーゼが少なくとも65
℃までの温度に於て安定であり、比較的高い糖化
温度に於てアミログルコシダーゼと共に用いるの
に非常に適していることを確認させるものであ
る。65℃でグルコース値が低くなるのは、AAに
対してAG酵素の熱安定性が低いために生じるも
ののようである。酸アミラーゼの存在は、より高
温でのグルコース生成に有利な影響を与える。

【図面の簡単な説明】

第１図はアスペルギルス・ニゲルのトランスグ
ルコシダーゼ陰性株によつて産生されるアミログ
ルコシダーゼ酵素製剤の高速液体クロマトグラフ
イ分析に於けるクロマトグラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アミログルコシダーゼと、実質的にα−１、
   ４−グルコシド結合分解活性を有しPH3.5〜5.0、
   温度60〜75℃の下で糖化反応の間最適活性を示す
   酸α−アミラーゼとを、1AGI（アミログルコシダ
   ーゼ単位）当たり少なくとも0.16AAU（酸アミラ
   ーゼ単位）の比で含み、 トランスグルコシダーゼを実質的に含まないこ
   とを特徴とする酵素製品。 ２ 1AGI当たり0.2〜4.5AAUを含む特許請求の
   範囲第１項に記載の酵素製品。 ３ アミログルコシダーゼがアスペルギルス・ニ
   ゲル由来である特許請求の範囲第１項または２項
   に記載の酵素製品。 ４ 酸α−アミラーゼがアスペルギルス・ニゲル
   由来である特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
   １項に記載の酵素製品。 ５ 有効量の酸プルラナーゼをも含む特許請求の
   範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の酵素製
   品。 ６ 酸プルラナーゼがバチルス・アシドプルリチ
   クスから産生される特許請求の範囲第５項に記載
   の酵素製品。 ７ アミログルコシダーゼと、実質的にα−１、
   ４−グルコシド結合分解活性を有しPH3.5〜5.0、
   温度60〜75℃の下で糖化反応の間最適活性を示す
   酸α−アミラーゼとを、1AGI（アミログルコシダ
   ーゼ単位）当たり少なくとも0.16AAU（酸アミラ
   ーゼ単位）の比で含み、トランスグルコシダーゼ
   を実質的に含まないことを特徴とする酵素製品の
   存在下で、澱粉または澱粉加水分解物を糖化させ
   ることを含む澱粉をシロツプ状のデキストロース
   へ転化させる方法。 ８ 少なくとも30重量％の乾燥固体を含む澱粉加
   水分解物を糖化させる特許請求の範囲第７項に記
   載の方法。 ９ PH３〜５、温度40〜70℃の下で糖化を行う特
   許請求の範囲第７または８項に記載の方法。 １０ PH４〜4.5、温度50〜65℃の下に糖化を行
   う特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １１ アミログルコシダーゼの使用量が全乾燥固
   体１ｇにつき８〜30AGIである特許請求の範囲第
   ７〜１０項のいずれかに記載の方法。 １２ アミログルコシダーゼの使用量が全乾燥固
   体１ｇにつき14〜22AGIである特許請求の範囲第
   １１項に記載の方法。 １３ 糖化を酸プルラナーゼの存在下で行う特許
   請求の範囲第７〜１２項のいずれか１項に記載の
   方法。