JPH0699403B2

JPH0699403B2 - アミノアンチピリン誘導体及びその使用法

Info

Publication number: JPH0699403B2
Application number: JP7545486A
Authority: JP
Inventors: 信雄久江; 龍彦田中; 慎二室賀
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 1986-04-03
Filing date: 1986-04-03
Publication date: 1994-12-07
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: JPS62234070A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、新規な発色剤化合物に関し、分析、とりわけ
臨床診断の検査法に関するものである。

［従来の技術］臨床検査に多用される発色系として、４−アミノアンチ
ピリン（以下4AAと略す。）とフェノール又はフェノー
ル誘導体、或いは4AAとアニリン又はアニリン誘導体と
の組合わせが知られている。従来、フェノール及びアニ
リン誘導体に関する研究は、多く見られるが、4AA誘導
体に関しては少ない。4AA誘導体に関するものとして
は、特開昭56-125373、特開昭58-12477等がある。前者
は4AAにより形成される色素の不安定性による定量誤差
を4AAの代わりに低級アルキル基又はアミノ基置換した
フェニル基を有する4AA誘導体を用いることにより解決
したものであり、後者は、湿式法で行なわれてきた反応
を4AAの代わりにクロロフェニル基又はトルクロロフェ
ニル基を有する4AA誘導体を用いることにより乾式法に
も適用できるようにしたものである。

又、4AA誘導体に関する他の報告としては、鎮痛剤とし
ての使用を目的とするハロゲン置換したフェニル基又は
エトキシ基を有する4AA誘導体に関するもの〔金沢大学
薬研報、28頁、1957年．〕があるが、そこには、発色剤
としての検討はない。

［発明が解決しようとする問題点］従来、4AAを酵素反応系に用いた場合、4AAの酵素阻害作
用という問題があった。例えば、4AAによるコリンエス
テラーゼの阻害があり、コリンエステラーゼをパーオキ
シダーゼ／H₂O₂/4AA系反応で測定すると4AAの阻害によ
って真の活性値が得られないという事実があり、問題に
なっていた。〔日本臨床検査自動化学会誌、７、324、1
982.〕。本発明はこの点に着目し、なされたものであっ
て、測定に際し、酵素を阻害しない発色剤を提供しよう
とするものである。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、4AAに代わる酵素を阻害しない発色剤を
種々検討した結果、一般式：［式中、R₁はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R₂は低級アルキル基を示す。ただし、
R₁がフェニル基でかつR₂がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物及びその塩の合成
に成功すると共にこれらの誘導体が酵素の活性を阻害し
ないことを見い出だし、本発明を完成した。

本発明に係る化合物の合成方法の一例を次に示す。

本発明の化合物は、下記の反応式で示す方法によって収
率よく得ることができる。

式［Ｉ］の化合物の酸化付加塩は、常法に従って、酸を
作用させることにより製造が可能である。

いずれの化合物においても、酸付加塩を構成する酸の例
として、塩化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、
過塩素酸、硫酸等の無機酸、及び酢酸、蓚酸、酒石酸、
ｐ−トルエンスルホン酸等を挙げることができる。

又、R₁とR₂の組合わせは、例えば次の様にすることが可
能である。

このようにして、合成される化合物の例を挙げると、ｐ
−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−
ピラゾロン、１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン、１−フェニル−
２−プロピル−４−ミアノ−５−ピラゾロン等である。

次に本発明のもう一つの目的である分析法について以下
に述べる。

本発明で得られる化合物は、特にコリンエステラーゼ活
性の測定に適しているが、分析しようとする酵素活性が
4AAにより阻害を受ける時、本発明で得られる化合物を
用いると、従来4AA系で生じた酵素阻害の影響のない正
確な測定が期待できる。

例えば、本発明の化合物を用いるコリンエステラーゼの
比色法による測定は、以下のような反応である。

他に、ｍ−トルオイルコリン、ｏ−トルオイルコリン等
の基質を用いて測定することも可能である。

又、本発明の化合物は、従来、発色剤として用いられて
きた4AAに置き換えて用いることができる。例えば、公
知のカプラーと本発明の化合物とをパーオキシダーゼ及
び過酸化水素の存在下で酸化縮合させ、又は公知の酸化
剤の存在下で酸化縮合させて、発色させる方法に用いる
ことができる。

このような方法で分析できる物質としては、例えば、過
酸化水素、コレステロール、グルコース、尿酸、トリグ
リセライド等を挙げることができる。

公知の酸化剤としては、過ヨウ素酸塩、過硫酸カリウ
ム、フェリシアン化カリウム等を用いることができる。
公知のカプラーとして、フェノール系カプラーの例を挙
げると、フェノール、ｐ−クロロフェノール、ｐ−ヒド
ロキシベンゾエート、ジクロロフェノール、ジクロロク
レゾール、ジブロムフェノール等があり、アニリン系カ
プラーとしては、N,N−ジメチルアニリン、N,N−ジエチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
−アニリン、ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スル
ホプロピル−アミノ）フェノール等があり、トルイジン
系カプラーとしては、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−
Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、N,N−ジエチル−ｍ
−トルイジン、N,N−ジメチル−ｍ−トルイジン、N,N−
ジエタノール−ｍ−トルイジン、３−メチル−Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−ヒドロキシ−エチルアニリン等があり、アニ
シジン系カプラーとしては、N,N−ジメチル−ｍ−メト
キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、アセトアミノ−
N,N−ジエチルアニリン等があり、ナフタレン系カプラ
ーとしては、1,7−ジヒドロキシナフタレン等がある。

尚、本発明の化合物の溶解性を高めるためにアルコール
又は、界面活性剤等を系に加えることも、それが酵素を
阻害しない場合には効果的である。

［作用］本発明の4AA誘導体の使用により、従来、阻害のため正
確に測定できなかった酵素を正確に定量することが可能
となった。

以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれに
よって何ら限定されるものではない。

実施例１ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５
−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成ｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
の合成ｐ−ニトロフェニルヒドラジン25gを200mlエタノール50
mlの水を加えた溶液に加え、80℃前後に加熱して溶解さ
せた。アセト酢酸エチルエステル22gを滴下して加え90
〜130℃にて、４時間加熱還流した。放冷後一晩放置し
たところ結晶が析出した。これを濾取して乾燥させたと
ころ33gの結晶が得られた。

ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピラゾ
ロンの合成で得たｐ−ニトロフェニル−３−メチル−５−ピラゾ
ロン8gにｐ−トルエンスルホン酸メチル12gを加えて160
℃〜180℃で４時間加熱攪拌を行なった。その後25％水
酸化ナトリウム溶液を用いて中和し、クロロホルム100m
lで２回抽出を行なった。クロロホルム層を分離留去
後、酢酸エチルにて再結晶を行なったところ5gのｐ−ニ
トロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンの粗生
成物が得られた。

ｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）の合成で得たｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル−５−ピ
ラゾロン5.0gに酢酸30ml、水15mlを加え、更に塩酸3ml
を加え溶解した。５℃に氷冷したのち亜硝酸ナトリウム
1.5gを冷水8mlで溶解したものを加え30分放置したのち
緑色結晶を濾取したところ3.7gの生成物が得られた。こ
の生成物2gに水30mlを加え硫化ナトリウム0.1gを加え硫
化水素を緑色が消失するまで通じた。酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチルを留去したのちメタノールにて再結晶を
行なって約0.5gのｐ−ニトロフェニル−2,3−ジメチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物Ｉ）を得た。

融点:155〜157℃ NMR（CDCl₃，δ）:2.15（3H,s）、2.75（5H,s）、7.6
（7H,m）。

実施例２１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−ピラ
ゾロン（化合物II）の合成１−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロンの合成１−ナフチルヒドラジン塩酸塩8.5gとアセト酢酸エチル
エステル6.0gをエタノール80mlに水20ml加えた溶媒に加
え、120℃〜140℃にて２時間加熱還流を行なった。溶媒
を留去したのち酢酸エチルを15ml加え数日間冷蔵にて放
置したところ約9.4gの１−ナフチル−３−メチル−５−
ピラゾロンの粗生成物が得られた。

１−ナフチル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンの
合成で得た１−ナフチル−３−メチル−５−ピラゾロン3.
2gにｐ−トルエンスルホン酸メチル5mlを加え140〜160
℃の油浴上で80〜10時間加熱攪拌を行なった。100℃前
後に放冷したのち25％水酸化ナトリウム溶液35mlを加え
た。後に濃塩酸を加えて中和したのち水50mlを加えてク
ロロホルム50mlで２回抽出を行なった。クロロホルム層
を濃縮したのちシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶媒：酢酸エチル）にて単一物質の約1.0gの１−ナフ
チル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロンが得られた。

１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−
ピラゾロン（化合物II）の合成で得た１−ナフチル−2,3−ジメチル−５−ピラゾロ
ン1.0gに酢酸6.0ml、水3.0mlを加え溶解させた後、５℃
以下に氷冷した。亜硝酸ナトリウム0.5gを冷水1.5mlに
溶解したものを滴下して加え、析出した緑色結晶を乾燥
したところ0.6gの粗生成物が得られた。この生成分0.6g
をエタノール8ml、水1.5mlに溶解させ10℃以下に冷却し
た。ヒドロスルフィドナトリウム2.0gを冷水8mlに溶解
したものを加えて室温で２時間放置したのちクロロホル
ムで抽出したところ単一の油状の0.44gの１−ナフチル
−2,3−ジメチル−４アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
I）が得られた。

NMR（CDCl₃，δ）:2.15（3H,s）、2.85（5H,s）、8.0
（4H,m）。

残渣をテトロヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−ナフチル−2,3−ジメチル−４−アミノ−５−ピ
ラゾロン（化合物II）の塩酸塩を得た。収量は0.45gで
あった。

分解融点:238℃。

実施例３１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−
５−ピラゾロン（化合物III）の合成１−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラ
ゾロンの合成１−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−ピラゾロ
ン10.4gにｐ−トルエンスルホン酸エチル18gを加えて、
油浴上で180℃、８時間加熱した。この反応混合物を放
冷した後に25％水酸化ナトリウム溶液を加え中和した。
次に水を50ml加えた後にクロロホルムで抽出を行なっ
た。クロロホルム層分離後濃縮を行ない、酢酸エチルに
て再結晶を行ない１−フェニル−２−エチル−３−メチ
ル−５−ピラゾロンが5.0g得られた。

１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−ニト
ロソ−５−ピラゾロンの合成で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−５−
ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解したの
ち濃塩酸0.6mlを加え２〜４℃に冷却した。冷水3mlの中
に亜硝酸ナトリウム1gを溶かし、これを少量ずつ滴下
し、析出した緑色結晶を濾別した。これをエーテルで洗
浄し、乾燥して1.0gの１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。

１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物III）の合成で得た１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−
ニトロソ−５−ピラゾロン1.0gにエタノール7.0ml、水
2.0mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2
gのヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し20
℃以下で３時間攪拌したのちクロロホルムで抽出した。
濃縮し、0.8gの１−フェニル−２−エチル−３−メチル
−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）を得た。

NMR（CDCl₃，δ）:2.15（3H,s）、2.85（5H,s）、8.0
（4H,m）。

残渣をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物III）の塩酸塩0.8gを得た。

分解融点:217℃。

実施例４１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピ
ラゾロンの合成１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン3.0gにｐ−
トルエンスルホン酸プロピル3.5gを加え、油浴上で180
℃12時間加熱した。この反応混合物に水30mlを加えて放
冷した。25％水酸化ナトリウムを加え中和した。この溶
液をクロロホルムで抽出を行ないクロロホルム層を分離
後、濃縮を行なった。酢酸エチルから再結晶を行ない１
−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５−ピラゾロ
ンが2.0g得られた。

１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−ニ
トロソ−５−ピラゾロンの合成で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−５
−ピラゾロン2.0gに酢酸12mlと水6.0mlを加え溶解した
のち濃塩酸0.6mlを加え、５℃以下に冷却した。次い
で、亜硝酸ナトリウム1gを冷水3.0mlに溶解したのち滴
下した。析出した結晶を濾別し、エーテルで洗浄ののち
乾燥して、0.8gの１−フェニル−２−プロピル−３−メ
チル−４−ニトロソ−５−ピラゾロンを得た。

１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−ア
ミノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の合成で得た１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４
−ニトロソ−５−ピラゾロン0.8gにエタノール7ml、水2
mlを加え冷却して10℃以下とした。この反応混液に2gの
ヒドロスルフィドナトリウムを3mlの冷水に溶解し、20
℃以下で攪拌したのちクロロホルムで抽出した。クロロ
ホルム層を濃縮し、0.5gの１−フェニル−２−プロピル
−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物I
V）を得た。

NMR（CDCl₃，δ）:0.75（3H,t）、1.15（2H,m）、2.10
（3H,s）、3.25（4H,m）、7.40（5H,m）。

残渣をテトラヒドロフラン（THF）20mlに溶解し、塩化
水素を通し、生じた沈澱を濾取してTHFにて洗浄を行な
い１−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）の塩酸塩0.4gを得た。

分解融点:218℃。

比較例 4AAと本発明の4AA誘導体とによる酵素反応阻害の比較（１）試薬の調製イ．基質緩衝液ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩1.0mMを含
有する。pH8.2の50mMホウ酸緩衝液を調製する。

ロ．色素液 1.4−アミノアンチピリン30mMを含有するpH8.2、50mMホ
ウ酸緩衝液を調製する。

2.1−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ
−５−ピラゾロン（化合物III）を30mM含有するpH8.2、
50mMホウ酸緩衝液を調製する。

3.1−フェニル−２−プロピル−３−メチル−４−アミ
ノ−５−ピラゾロン（化合物IV）を50mM含有するpH8.
2、50mMホウ酸緩衝液を調製する。

ハ．反応停止液 50mMネオスチグミンを含有する水溶液を調製する。

ニ．発色液過ヨウ素酸カリウム10mM、ｐ−クロルベンゼンスルホン
酸2mMを含有するpH9.8、50mMホウ酸緩衝液を調製する。

（２）測定操作法測定１（色素液の共存なしで酵素反応を行なった場合）基質緩衝液1.0mlを３本の試験管に分注し、血清0.05ml
を加えよく混和し、37℃で５分間加温した。次いで、そ
れぞれの試験管に反応停止液を0.2mlずつ加え酵素反応
を停止させた。３本の試験管のうち１本目に色素液１を
２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管には色素
液３をそれぞれ0.1mlずつ加え、次いで発色液2.0mlを加
え試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500nmで
測定した。

測定２（色素液の共存下で酵素反応を行なった場合）基質緩衝液1.0mlを３本の試験管に分注し、１本目に色
素液１を２本目の試験管に色素液２を、３本目の試験管
には色素液３をそれぞれ0.1mlずつ加えた。これら３本
の試験管に測定１で用いた血清0.05mlを加えよく混和
し、37℃で５分間加温した。次いでそれぞれの試験管に
反応停止液0.2mlを加え更に発色液2.0mlを加えて発色を
行ない試薬ブランクを対照として試料液の吸光度を500n
mで測定した。

（３）結果測定１及び２で行なった結果は、表１に示す通りであ
る。

4AA共存下では、表１にあるように、コリンエステラー
ゼへの阻害は認められた。ところが本発明の4AA誘導体
では、このような阻害は見られず、正確な測定が行なわ
れることを確認した。

実施例５コリンエステラーゼの測定（１）試薬の調製イ．基質緩衝液ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨード塩1.0mM、１
−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５
−ピラゾロン（化合物III）3.0mMを含有するpH8.2の50m
Mホウ酸緩衝液を調製する。

ロ．発色液過ヨウ素酸カリウム10mM、ネオスチグミン5mM、ｐ−ク
ロルベンゼンスルホン酸2mMを含有するpH9.8の50mMホウ
酸緩衝液を調製する。

（２）測定操作法基質緩衝液1.0mlを試験管に分注し、各段階に純水で希
釈した既知単位（Ch−ＥオートセットＦ“シノテスト”
により測定）血清0.05mlに加え、これらを37℃で５分間
加温した。次いで、それぞれの試験管に発色液2.0mlを
加えて酵素反応を停止し、発色させた。試薬ブランクを
対照として試料液の吸光度を500nmで測定した。この時
の血清の希釈度と吸光度との関係を第１図に示す。

（３）結果吸光度は、血清中コリンエステラーゼ活性に比例して増
大しており、本発明の4AA誘導体は、コリンエステラー
ゼの定量にも有効に利用し得ることが認められた。

実施例６過酸化水素の定量（１）反応試液の調製１−フェニル−２−エチル−３−メチル−４−アミノ−
５−ピラゾロン（化合物III）1.0mM、パーオキシダーゼ
30U/ml、フェノール5mMを含有する50mMリン酸緩衝液pH
7.8を調製した。過酸化水素濃度を０、４、８、12、1
6、20mMの各々に調製した。

（２）測定操作法上記反応試液3.0mlに過酸化水素溶液20μｌを加えて攪
拌し、37℃で５分間加温した。

室温まで冷却し、波長500nmで各々の吸光度を測定し
た。過酸化水素濃度を横軸に、吸光度を縦軸にとり検量
線を作成した。この時の吸光度と過酸化水素濃度の関係
を第２図に示す。

（３）結果吸光度は、過酸化水素濃度に比例して増大しており、本
発明の4AA誘導体は過酸化水素の定量に有効に利用でき
ることが判明した。

実施例７グルコースの測定（１）反応試液の調製パーオキシダーゼ0.07U/ml、グルコースオキシダーゼ1.
7U/ml、リン酸6.7mM、１−フェニル−２−エチル−３−
メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（化合物III）3.0
mM、コール酸ナトリウム0.08mM、フェノール0.07（W/
V）％を含有する溶液を調製する。

（２）測定操作法上記反応試液3.0mlに血清20μｌを加え、37℃で20分間
反応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照
として500nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光
度との関係を第３図に示す。

（３）結果吸光度は、血清中のグルコースの量に比例して増大して
おり、本発明の4AA誘導体をグルコースの測定に適用で
きることが確認された。

実施例８コレステロールの測定（１）反応試液の調製コレステロールオキシダーゼ0.3U/ml、パーオキシダー
ゼ0.3U/ml、コール酸ナトリウム0.3mM、１−フェニル−
２−エチル−３−メチル−４−アミノ−５−ピラゾロン
（化合物III）3.0mM、非イオン系界面活性剤0.17（V/
V）％、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム1.3mMを含有
する溶液を調製する。

（２）測定操作法上記反応試液3.0mlに血清0.1mlを加え、37℃で20分間反
応させ、室温下に10分間放置後、試薬ブランクを対照と
して555nmで比色する。この時の血清の希釈度と吸光度
との関係を第４図に示す。

（３）結果吸光度は、血清中のコレステロールの量に比例してお
り、本発明の4AA誘導体はコレステロールの定量にも有
効に利用できることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例５、第２図は実施例６、第３図は実施例
７及び第４図は実施例８における血清試料の希釈度と吸
光度との関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式：［式中、R₁はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R₂は低級アルキル基を示す。ただし、
R₁がフェニル基でかつR₂がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物、又はその塩。
【請求項２】一般式：［式中、R₁はナフチル基、フェニル基又はニトロ基を有
するフェニル基、R₂は低級アルキル基を示す。ただし、
R₁がフェニル基でかつR₂がメチル基の場合を除く。］で
表わされるアミノアンチピリン化合物、又はその塩を用
いることを特徴とする分析方法。