JPS61275227A - ソーマチン物質の製造法 - Google Patents
ソーマチン物質の製造法Info
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- JPS61275227A JPS61275227A JP61041331A JP4133186A JPS61275227A JP S61275227 A JPS61275227 A JP S61275227A JP 61041331 A JP61041331 A JP 61041331A JP 4133186 A JP4133186 A JP 4133186A JP S61275227 A JPS61275227 A JP S61275227A
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換えＤＮＡ技術で可能となったプレプロソー
マチン及び関連化合・物の微生物学的製造法に関する。
マチン及び関連化合・物の微生物学的製造法に関する。
いずれも１９８２年６月２３日に公告されたヨーロッパ
特許出願（Ａ２）０ ０５４３３０号及び０ ０５４
３３１号明ＩＩ書にはプレプロソーマチンの種々の対立
型、プレソーマチン、プロソーマチン及びソーマチンの
様なその成熟型及びそれ等の誘導型をコードするＤＮＡ
配列又そのＤＮＡ配列より成るクローニングビークル、
又微生物特に大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ）を形質転換す
るための使用及びソーマチン様タン白質の製造法が記載
されている。
特許出願（Ａ２）０ ０５４３３０号及び０ ０５４
３３１号明ＩＩ書にはプレプロソーマチンの種々の対立
型、プレソーマチン、プロソーマチン及びソーマチンの
様なその成熟型及びそれ等の誘導型をコードするＤＮＡ
配列又そのＤＮＡ配列より成るクローニングビークル、
又微生物特に大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ ）を形質転換す
るための使用及びソーマチン様タン白質の製造法が記載
されている。
商業的に魅力ある生産のためには、大腸菌について得ら
れる収量は充分でないので、ソーマチン様タン白質をは
るかに高い量で生産出来る微生物系の必要性が存在する
。ソーマチン様タン白質とは、プレプロソーマチン、そ
の種々の対立型又は修飾型及びブレソーマチン、プロソ
ーマチン及びソーマチンの様なそれ等の成熟型を意味す
る。
れる収量は充分でないので、ソーマチン様タン白質をは
るかに高い量で生産出来る微生物系の必要性が存在する
。ソーマチン様タン白質とは、プレプロソーマチン、そ
の種々の対立型又は修飾型及びブレソーマチン、プロソ
ーマチン及びソーマチンの様なそれ等の成熟型を意味す
る。
上記のヨーロッパ特許出願に記載された構造遺伝子はク
ルイベロミセス ラクテイス （Ｋｌｕ ｖｅｒｏｍ ｃｅｓ １ａｃｔｉｓ） （
いわゆるＫＡＲＳ）起源の自律的に複製する配列、撰択
マーカ、及びプラスミド中への酵母レギユロンと組み合
わせ、そのプラスミドをクルイベロミセス属の酵母細胞
中に導入し次いでソーマチン様タン白質を生産し得る様
になることが分った。この方法で酵母細胞にてソーマチ
ン様タン白質を発現させることが成功した。
ルイベロミセス ラクテイス （Ｋｌｕ ｖｅｒｏｍ ｃｅｓ １ａｃｔｉｓ） （
いわゆるＫＡＲＳ）起源の自律的に複製する配列、撰択
マーカ、及びプラスミド中への酵母レギユロンと組み合
わせ、そのプラスミドをクルイベロミセス属の酵母細胞
中に導入し次いでソーマチン様タン白質を生産し得る様
になることが分った。この方法で酵母細胞にてソーマチ
ン様タン白質を発現させることが成功した。
従って、本発明は：
（ｉ） プレプロソーマチン又はその各種の対立型、
又は修飾型又はそれ等の成熟型を暗号づける構造遺伝子
、 （ｉｉ） にＩｕｙｖｅｒｏｍ ｃｅｓ ＋ａｃｔｔ
ｓ （いわゆるＫＡＲＳ）起源の自律的複製配列、 （ｉｉｉ）サツカロミセス セレビシェ−５ａｃｃｈａ
ｒｏｓｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝
子から誘導された酵母レギユロン及び（ｉｖ） ｔ
ｒ ｐ−１又はＩａｃ−４遺伝子の様な撰択マーカ より成る組換えＤ−Ｎ Ａプラスミドを含むクルイベロ
ミセス属の酵母を培養しそしてソーマチン様タン白質を
製造する方法を提供するものである。
又は修飾型又はそれ等の成熟型を暗号づける構造遺伝子
、 （ｉｉ） にＩｕｙｖｅｒｏｍ ｃｅｓ ＋ａｃｔｔ
ｓ （いわゆるＫＡＲＳ）起源の自律的複製配列、 （ｉｉｉ）サツカロミセス セレビシェ−５ａｃｃｈａ
ｒｏｓｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝
子から誘導された酵母レギユロン及び（ｉｖ） ｔ
ｒ ｐ−１又はＩａｃ−４遺伝子の様な撰択マーカ より成る組換えＤ−Ｎ Ａプラスミドを含むクルイベロ
ミセス属の酵母を培養しそしてソーマチン様タン白質を
製造する方法を提供するものである。
この方法で、希望するタン白質の発現が大きく改良され
、商業的応用はずっと近付いて来ている。
、商業的応用はずっと近付いて来ている。
このプラスミドは酵母より誘導された転写ターミネータ
及び／又は動原体及び／又は酵母由来の複製領域を含む
ことが望ましい。
及び／又は動原体及び／又は酵母由来の複製領域を含む
ことが望ましい。
に、 Ｉａｃｔｉｓ酵母について良い結果が得られてい
るが、その他のクルイベロミセスの種も同様に効果的で
ある可能性は充分である。構造遺伝子は上記ヨーロッパ
特許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群から
選択されたものが望ましい。
るが、その他のクルイベロミセスの種も同様に効果的で
ある可能性は充分である。構造遺伝子は上記ヨーロッパ
特許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群から
選択されたものが望ましい。
以下に記載する様に、満足すべきＫＡＲＳ−配列は野生
株に、１ａｃｔｉｓ ＣＢ５２３６０から単離された。
株に、１ａｃｔｉｓ ＣＢ５２３６０から単離された。
に、 ＩａＣｔｉＳにて形質転換するために、例えばＳ
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のトリプトファン遺伝子
（ｔｒｐ−１）及びに、 １ａｃｔｉｓ由来のラクター
ゼ遺伝子（ｌ ａｃ −４）の様なベクター上の選択可
能なマーカの使用が訃ましい。此等のＤＮＡ配列は選択
マーカとして有効であるだけでなく、其の後の増殖中に
おいて系中に選択圧力を働かせる点においても効果的で
ある。
、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のトリプトファン遺伝子
（ｔｒｐ−１）及びに、 １ａｃｔｉｓ由来のラクター
ゼ遺伝子（ｌ ａｃ −４）の様なベクター上の選択可
能なマーカの使用が訃ましい。此等のＤＮＡ配列は選択
マーカとして有効であるだけでなく、其の後の増殖中に
おいて系中に選択圧力を働かせる点においても効果的で
ある。
もし転写ターミネータを使用する場合、ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅの２ミクロンＤＮＡベクターのＨｉｎｄ
１ｌ−Ｅｃｏ ＲＩ断片由来のターミネータ配列及
ｙ ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＰＤＨ遺伝子由
来のターミネータ配列より成る群から選ぶのが望ましい
。
ｖｉｓｉａｅの２ミクロンＤＮＡベクターのＨｉｎｄ
１ｌ−Ｅｃｏ ＲＩ断片由来のターミネータ配列及
ｙ ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＰＤＨ遺伝子由
来のターミネータ配列より成る群から選ぶのが望ましい
。
例えばｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はに、 １ａｃｔ
ｉｓの様な、酵母染色体から誘導された動原体又は複製
領域が存在することにより本発明に係るプラスミドの安
定性が改良される。
ｉｓの様な、酵母染色体から誘導された動原体又は複製
領域が存在することにより本発明に係るプラスミドの安
定性が改良される。
本発明を以下に詳述する。
クルイベロミセス属の酵母を選んだ理由は、食品や医薬
品の製造に使用出来る多くの無害な微生物を含むからで
ある。例えば、Ｋｌｕ ｖｅｒｏｍ ｃｅｓｌａｃｔｉ
ｓ及びクルイベロミセス フラジリス（ＫＩＬＩｙＶｅ
ｒＯＩ ＣｅＳ ｆｒａｇｉｌｉｓ）はアメリカ合衆国
ＦＤＡのグラスリスト（ＧＲＡＳ−一般的に安全と認め
られる）に記載されている安全な種である。
品の製造に使用出来る多くの無害な微生物を含むからで
ある。例えば、Ｋｌｕ ｖｅｒｏｍ ｃｅｓｌａｃｔｉ
ｓ及びクルイベロミセス フラジリス（ＫＩＬＩｙＶｅ
ｒＯＩ ＣｅＳ ｆｒａｇｉｌｉｓ）はアメリカ合衆国
ＦＤＡのグラスリスト（ＧＲＡＳ−一般的に安全と認め
られる）に記載されている安全な種である。
１１１Ｍ工程におけるに、 １ａｃｔｉｓの行動は大Ｓ
菌よりもよく知られており、十分管理可能である。醗酵
液から酵母を分離する場合例えば、大腸菌の場合より有
利であり、酵母はしばしば大腸菌よりも多聞の（細胞外
又はベリブラスム）タン白質を産生ずる。従ってクルイ
ベロミセス属の酵母は大腸菌よりも工業生産に好適であ
る。
菌よりもよく知られており、十分管理可能である。醗酵
液から酵母を分離する場合例えば、大腸菌の場合より有
利であり、酵母はしばしば大腸菌よりも多聞の（細胞外
又はベリブラスム）タン白質を産生ずる。従ってクルイ
ベロミセス属の酵母は大腸菌よりも工業生産に好適であ
る。
現在迄のところ、タルイベロミセスのためのベクターは
全く知られていない。
全く知られていない。
広汎な研究と実験の結果、ホスト微生物に、 １ａｃｔ
ｉｓを形質転換させ更に形質転換した細胞中で自律的に
複製する新しいベクターが発見された。
ｉｓを形質転換させ更に形質転換した細胞中で自律的に
複製する新しいベクターが発見された。
新しいに、 １ａｃｔｉｓのベクターはに、 １ａｃｔ
ｉｓにおける複製と維持の機能を制御する。此等の複製
配列はに、 １ａｃｔｉｓ （ＫＡＲＳ）由来の自費
的複製配列である。
ｉｓにおける複製と維持の機能を制御する。此等の複製
配列はに、 １ａｃｔｉｓ （ＫＡＲＳ）由来の自費
的複製配列である。
その高い形質転換頻度の故にＫＡＲＳ型のベクターを使
用する。
用する。
最も好適な代表は既知ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉｃｅのプ
ラスミドＹ ＲＩ） ７ （５ｔｒｕｈ１等Ｐｒｏｃ、
Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ラスミドＹ ＲＩ） ７ （５ｔｒｕｈ１等Ｐｒｏｃ、
Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７６．１０３５−１０３９）中に挿入したＫＡ
Ｒ３−２配列を含むに、 １ａｃｔｉｓ ＤＮＡ断片よ
り成るバイブリドプラスミドであるｐＫＡＲＳ−２であ
る。
Ｒ３−２配列を含むに、 １ａｃｔｉｓ ＤＮＡ断片よ
り成るバイブリドプラスミドであるｐＫＡＲＳ−２であ
る。
このベクターには更に遺伝子クローニングを可能にする
ための適切な制限部位がある。
ための適切な制限部位がある。
大腸菌も又好適なホストである。その場合アンピシリン
耐性遺伝子（ＡｒｒｌＲ＞もベクター上の選択可能なマ
ーカである。プラスミドを増殖しそして大腸菌の細胞中
に貯蔵するのが望ましい。形質転換した株はアンピシリ
ンを含む（１００マイクログラム／ｄ）Ｌ−ブロスで選
択的に生育する。
耐性遺伝子（ＡｒｒｌＲ＞もベクター上の選択可能なマ
ーカである。プラスミドを増殖しそして大腸菌の細胞中
に貯蔵するのが望ましい。形質転換した株はアンピシリ
ンを含む（１００マイクログラム／ｄ）Ｌ−ブロスで選
択的に生育する。
形質転換した株の１つ即ち大腸菌ＪＡ２２１（ｐＫＡＲ
Ｓａ）はオランダのＳＫ Ｂａａｒｎ３７４２ 、０ｏ
ｓｔｅｒｓｔｒａａｔ １にあるＣｅｎｔｒａｌＢｕ
ｒｌＢａｎ ＶＯＯｒ ＳＣれ１１１１１ｅｌｃＬ
ｌｌｔ（ＩｒｅＳにＣＢ５３５３゜８２ （＝ＬＭＤ８
２．２０）の番号で１９８２年５月１９日に寄託した。
Ｓａ）はオランダのＳＫ Ｂａａｒｎ３７４２ 、０ｏ
ｓｔｅｒｓｔｒａａｔ １にあるＣｅｎｔｒａｌＢｕ
ｒｌＢａｎ ＶＯＯｒ ＳＣれ１１１１１ｅｌｃＬ
ｌｌｔ（ＩｒｅＳにＣＢ５３５３゜８２ （＝ＬＭＤ８
２．２０）の番号で１９８２年５月１９日に寄託した。
プラスミドは例えば［。
ＫａｔＺ等の方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｏｌ、 １１４
（１９７３）５７７）によりこの菌体から分離出来る
。
（１９７３）５７７）によりこの菌体から分離出来る
。
酵母ホストのプロトプラストはトリス、塩化カルシウム
及び分子量が２，０００から６．０００の範囲好ましく
は４．０００のポリエチレングリコールを含む通常の培
地中上記ベクターにより形質転換させる。
及び分子量が２，０００から６．０００の範囲好ましく
は４．０００のポリエチレングリコールを含む通常の培
地中上記ベクターにより形質転換させる。
ＫＡＲＳ−型プラスミドを使用すると、形質転換体にト
リプトファン原栄養体を選択する可能性がある。
リプトファン原栄養体を選択する可能性がある。
形質転換細胞中のＫＡＲＳ含有プラスミドの自律的存在
はＤＮＡ分析により証明された。形質転換体の未消化微
小溶解物はｐＫＡＲＳプラスミドの細菌部である標識ｐ
ＢＲ３２２とのハイブリダイゼーションによりサザーン
法に従って分析した。
はＤＮＡ分析により証明された。形質転換体の未消化微
小溶解物はｐＫＡＲＳプラスミドの細菌部である標識ｐ
ＢＲ３２２とのハイブリダイゼーションによりサザーン
法に従って分析した。
未形質転換のに、 Ｉａｃｔｉｓ Ｉ ａｃ −４変異
株の微小溶解物と精製プラスミド調製物を比較電気泳動
の結果、形質転換体にのみ、形質転換に使用したプラス
ミドの高次コイル及び開環型に相当する電気泳動移動度
を持つハイブリッド形成バンドが存在することが分った
。
株の微小溶解物と精製プラスミド調製物を比較電気泳動
の結果、形質転換体にのみ、形質転換に使用したプラス
ミドの高次コイル及び開環型に相当する電気泳動移動度
を持つハイブリッド形成バンドが存在することが分った
。
形質転換細胞中のプラスミドの存在は、大腸菌を酵母形
質転換体由来のＤＮＡで形質転換しそして同じプラスミ
ドを生成した大腸菌形質転換体から分離することにより
更に確認した。
質転換体由来のＤＮＡで形質転換しそして同じプラスミ
ドを生成した大腸菌形質転換体から分離することにより
更に確認した。
特に有用なホストはに、 １ａｃｔｉｓの変異株５Ｄ１
１ １ａｃ−４ｔｒｐ−１及び５Ｄ６９１ａｃ−４であ
り、これ等は野生株ＣＢ５２３６０から誘導され、オラ
ンダＱ ３２４２ Ｓ Ｋ Ｂａａｒｎ。
１ １ａｃ−４ｔｒｐ−１及び５Ｄ６９１ａｃ−４であ
り、これ等は野生株ＣＢ５２３６０から誘導され、オラ
ンダＱ ３２４２ Ｓ Ｋ Ｂａａｒｎ。
０ｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ １のＣｅｎｔｒａａｌ
Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃｈｉｎｍ ｃｌｃｕｌｔｕ
ｒｅ に夫々寄託番号ＣＢ５８０９２及びＣＢ５８０
９３で１９８２年５月１９日に寄託されている。
Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒＳｃｈｉｎｍ ｃｌｃｕｌｔｕ
ｒｅ に夫々寄託番号ＣＢ５８０９２及びＣＢ５８０
９３で１９８２年５月１９日に寄託されている。
通常、形質転換するプラスミドはポスト細胞中に自律的
に複製及び発現可能な独立した存在としである。しかし
ながら、ここでプラスミド（複製配列はあってもなくて
も）に存在する遺伝子は続いて細胞の染色体ＤＮＡ中に
も組み込むことができることが指摘される。
に複製及び発現可能な独立した存在としである。しかし
ながら、ここでプラスミド（複製配列はあってもなくて
も）に存在する遺伝子は続いて細胞の染色体ＤＮＡ中に
も組み込むことができることが指摘される。
本発明をプレプロソーマチンの生産に関して詳細な記述
により例示する。然し、本発明方法はソーマチン一様タ
ン白質をコードするその他の遺伝子のクローニングと発
現にも適用出来る。
により例示する。然し、本発明方法はソーマチン一様タ
ン白質をコードするその他の遺伝子のクローニングと発
現にも適用出来る。
本発明の菌株を大量生産に適用する時は、ベクタープラ
スミドからすべての細菌ＤＮＡ配列を除去することが望
ましい。
スミドからすべての細菌ＤＮＡ配列を除去することが望
ましい。
遺伝子は細胞に導入した後、自律的に複製するプラスミ
ドにあるか又はホスト細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込む
ことができる。
ドにあるか又はホスト細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込む
ことができる。
八、 組み換えｐＫＡＲＳプラスミドの１プラスミドＹ
Ｒｐ７（Ｓｔｒｕ旧等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ｒｐ７（Ｓｔｒｕ旧等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７６、１０３５−３９．
１９７９）５マイクログラムを制限酵素５ａｌＩで消化
した。
１９７９）５マイクログラムを制限酵素５ａｌＩで消化
した。
野生株に、Ｉａｃｔｉｓ ＣＢ５２３６０由来のＤＮＡ
Ｉ４マイクログラムを酵素ＸｈＯＩで消化した。プラス
ミドの断片とに、 １ａｃｔｉｓのＤＮＡをモル比１：
３の割合で混合し、［）ＮＡ断片混合物を得た。
Ｉ４マイクログラムを酵素ＸｈＯＩで消化した。プラス
ミドの断片とに、 １ａｃｔｉｓのＤＮＡをモル比１：
３の割合で混合し、［）ＮＡ断片混合物を得た。
制限酵素を失活後、溶液をＤＮＡ１１度２５マイクログ
ラム／ａｉ！にし、標準条件（ベーリンガー）下でＩ４
−リガーゼと共にインキュベートした。
ラム／ａｉ！にし、標準条件（ベーリンガー）下でＩ４
−リガーゼと共にインキュベートした。
通常条件下で、リガーゼ処理混合物による大腸菌ＤＧ７
５の形質転換により、４゜５Ｘ１０５Ａｍ ｐＲ形質転
換体の混合物を生じ、そのテトラサイクリンに対する感
受性から推論して、その中９×１０３はに、 ＩａＣｔ
ｉＳインサートを含んでいた。
５の形質転換により、４゜５Ｘ１０５Ａｍ ｐＲ形質転
換体の混合物を生じ、そのテトラサイクリンに対する感
受性から推論して、その中９×１０３はに、 ＩａＣｔ
ｉＳインサートを含んでいた。
テｉ・ラサイクリンー感受性細胞の割合はサイクロセリ
ン処理により８５％迄増加させ得る（Ｂｏｌｉｖａｒ
Ｆ、及びＢａｃｌｖａｎに、、Ｈｅｔｈｏｄ １ｎＥｎ
ｚｙ＋＋＋ｏｌｏｏｙ、 ６８ 、１９７９ 、２４５
〜２６７ ）。
ン処理により８５％迄増加させ得る（Ｂｏｌｉｖａｒ
Ｆ、及びＢａｃｌｖａｎに、、Ｈｅｔｈｏｄ １ｎＥｎ
ｚｙ＋＋＋ｏｌｏｏｙ、 ６８ 、１９７９ 、２４５
〜２６７ ）。
ＫａｔＺ等の方法により（例１参照）、１４種のプラス
ミドを単離し、これをＤＫＡＲＳ１−１４と称する。こ
れ等のすヘテはに、 Ｉａｃｔｉｓ ５Ｄ１１１ａ
ｃ−４、ｔｒｐ−１株をＤＮＡマイクログラム当り１０
３〜１０４の頻度でＴｒｐ＋表現型に形質転換する能力
があった。プラスミドｐＫＡＲＳ−ａはＤＮＡマイクロ
グラム当り３Ｘ１０’の形質転換最高頻度を示したが、
プラスミドｐＫＡＲＳ−２の方がその後のプロセッシン
グにおいて一層便利であることが分った。
ミドを単離し、これをＤＫＡＲＳ１−１４と称する。こ
れ等のすヘテはに、 Ｉａｃｔｉｓ ５Ｄ１１１ａ
ｃ−４、ｔｒｐ−１株をＤＮＡマイクログラム当り１０
３〜１０４の頻度でＴｒｐ＋表現型に形質転換する能力
があった。プラスミドｐＫＡＲＳ−ａはＤＮＡマイクロ
グラム当り３Ｘ１０’の形質転換最高頻度を示したが、
プラスミドｐＫＡＲＳ−２の方がその後のプロセッシン
グにおいて一層便利であることが分った。
得られた組み換えプラスミドは大腸菌ＪＡ２２１ （ｔ
ｒｐＥ５．ＩｅｕＢ６．Ｉａｃ ｙ。
ｒｐＥ５．ＩｅｕＢ６．Ｉａｃ ｙ。
ｒｅｃＡ、ｈｓｄＭ＋ 、ｈｓｄＲ−）にも転移するこ
とが出来る。
とが出来る。
８、 ブラスミ゛１）ＫＡＲＳ−ａによりＴｒｐ＋に、
ＩａｃｔｉｓＳＤｌｌ Ｉａｃ−４ｔｒｐ−１株の菌
体を酵母エキス１％、ペプトン２％及びグルコース２％
を含む生育培地（ｐＨ６，８＞中に懸濁させた。指数用
（３〜５．１０７細胞／ｄ）に達する迄生育を続けた。
ＩａｃｔｉｓＳＤｌｌ Ｉａｃ−４ｔｒｐ−１株の菌
体を酵母エキス１％、ペプトン２％及びグルコース２％
を含む生育培地（ｐＨ６，８＞中に懸濁させた。指数用
（３〜５．１０７細胞／ｄ）に達する迄生育を続けた。
酵母菌体を遠沈により集め、水洗し、１．２モル／１の
ソルビトール、２５ミリモル／１のＥＤＴＡ及び０．２
モル／１の新しいメルカプトエタノールを含む溶液（ｐ
ｌ＋８．０）中に再懸濁した。
ソルビトール、２５ミリモル／１のＥＤＴＡ及び０．２
モル／１の新しいメルカプトエタノールを含む溶液（ｐ
ｌ＋８．０）中に再懸濁した。
１０分間３０℃でインキュベートした後、゛菌体を遠沈
、１．２モル／！のソルビトール溶液で２度洗滌し、１
．２モル／ｉのソルビトール、１０ミリモル／１のＥＤ
ＴＡ、０．１モル／１のクエン酸ソーダ及び１０■のヘ
リカーゼを含む溶液（＋）Ｉ５．８）２０ｍｉｔ中に懸
濁した。
、１．２モル／！のソルビトール溶液で２度洗滌し、１
．２モル／ｉのソルビトール、１０ミリモル／１のＥＤ
ＴＡ、０．１モル／１のクエン酸ソーダ及び１０■のヘ
リカーゼを含む溶液（＋）Ｉ５．８）２０ｍｉｔ中に懸
濁した。
プロトプラストが生じ、１５〜２０分後、これ等を遠沈
し、１．２モル／１のソルビトールで３回洗滌し、１０
ミリモル／１のＣａＣｊ！２と１．２モル／ｌのソルビ
トールを含む溶液０．１−中に−当り約５．１０”菌体
の濃度で再懸濁した。
し、１．２モル／１のソルビトールで３回洗滌し、１０
ミリモル／１のＣａＣｊ！２と１．２モル／ｌのソルビ
トールを含む溶液０．１−中に−当り約５．１０”菌体
の濃度で再懸濁した。
１０マイクログラムのｐＫＡＲＳ−ａＤＮＡを加え、混
合物を２５℃で１５分間インキュベートした。その後、
１０ミリモル／ｉのトリス、１０ミリモル／１のＣａＣ
ｌ２及び２０％（Ｗ ／Ｖ ）のポリエチレングリコー
ル４０００を含む溶液０．５−を加え、続いて２０分間
インキュベートした。
合物を２５℃で１５分間インキュベートした。その後、
１０ミリモル／ｉのトリス、１０ミリモル／１のＣａＣ
ｌ２及び２０％（Ｗ ／Ｖ ）のポリエチレングリコー
ル４０００を含む溶液０．５−を加え、続いて２０分間
インキュベートした。
プロトプラストを遠心沈澱させ、７ミリモル／ｌのＣａ
Ｃｊ！ 、１．２モル／ｉのソルビトール、０．５１
１１ｆｌ／ｌｄの酵母エキス、１η／−のペプトン及び
２■／ｌｄのグルコースを含む溶液（ｐＨ６，８）中に
−当り約５．１０”プロトプラスト濃度で再懸濁させた
。
Ｃｊ！ 、１．２モル／ｉのソルビトール、０．５１
１１ｆｌ／ｌｄの酵母エキス、１η／−のペプトン及び
２■／ｌｄのグルコースを含む溶液（ｐＨ６，８）中に
−当り約５．１０”プロトプラスト濃度で再懸濁させた
。
３０℃で６０分インキュベーションした後、プロトプラ
ストを遠沈し、０．６モル／Ｉ ＫＣＩ溶液で洗い、
０．６モル／Ｉ ＫＣＩ溶液に再懸濁させた。
ストを遠沈し、０．６モル／Ｉ ＫＣＩ溶液で洗い、
０．６モル／Ｉ ＫＣＩ溶液に再懸濁させた。
Ｔｒｐ＋形質転換体を選択可能にするため、１．１０９
プロトプラストをグルコース２％、ＫＣＪ！０．６モル
／ｌを含む２％寒天最小平板培地（３％の寒天重層）上
に移した。
プロトプラストをグルコース２％、ＫＣＪ！０．６モル
／ｌを含む２％寒天最小平板培地（３％の寒天重層）上
に移した。
４〜５日中にコロニーが現れた。グルコースを炭素源と
する０、６モル／１のＫＣ１平板上でのプロトプラスト
の再生は通常０．５〜１．５％である。ｐＫＡＲＳａＤ
ＮＡのマイクログラム当り、３．４ｘｌＯ’ Ｔｒｐ＋
形質転換体が得られた。
する０、６モル／１のＫＣ１平板上でのプロトプラスト
の再生は通常０．５〜１．５％である。ｐＫＡＲＳａＤ
ＮＡのマイクログラム当り、３．４ｘｌＯ’ Ｔｒｐ＋
形質転換体が得られた。
ＤＮＡの調製は５ｔｒｕ旧等（Ｐｒｏｃ、 Ｈａ口、
Ａｃａｄ。
Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７６．１０３５〜１０３９．１
９７９）に従った。
９７９）に従った。
Ｂに記載された方法と類似した方法により、他のＫＡＲ
Ｓ−型プラスミドについての形質転換実験を行うことが
できる。実験結果を以下の表に要約する。
Ｓ−型プラスミドについての形質転換実験を行うことが
できる。実験結果を以下の表に要約する。
ｐＫＡＲＳプラスミドの分子量はＥＣＯＲＩ及び）ｌｉ
ｎｄ ［［エンドヌクレアーゼで消化後、０．８％の
アガロースゲルと通常の分子量マーカを用いて測定した
。
ｎｄ ［［エンドヌクレアーゼで消化後、０．８％の
アガロースゲルと通常の分子量マーカを用いて測定した
。
以下の詳述はＧＡＰＤＨレギユロンの単離と、プレプロ
ソーマーチンをコードするプラスミドへの導入について
説明する。
ソーマーチンをコードするプラスミドへの導入について
説明する。
Ｄ、 Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）オペ
ロンを含むクローンの単離 特に別記しない限り、すべての酵素インキュベーション
は供給者の指示する条件で実施した。酵素はアマ−ジャ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ） 、ベーリンガ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎａｅｒ） 、Ｂ ＲＬ又はバイオラプス（Ｂｉｏｌ
ａｂｓ ）より入手した。
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）オペ
ロンを含むクローンの単離 特に別記しない限り、すべての酵素インキュベーション
は供給者の指示する条件で実施した。酵素はアマ−ジャ
ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ） 、ベーリンガ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎａｅｒ） 、Ｂ ＲＬ又はバイオラプス（Ｂｉｏｌ
ａｂｓ ）より入手した。
酵母ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡプールをＨｌ
ＣａｒｌＳＯｎおよびり、 Ｂｏｓｔｅｉｎ （Ｃｅｌ
ｌ ２８．１４５−１５４．１９８２）が記載したの
と類似の方法により、雑種大腸菌−酵母プラスミドｐＦ
１１（Ｈ，ＲＣｈｅｖａｌｌｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ 上
ユ、１１〜１９゜１９８０）中に調製した。精製した酵
ｆｆ１ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ ５ａｕ３Ａで
部分消化し、生じたＤＮＡ断片（平均長さ５にｂ）をｐ
Ｆｌ １の脱燐酸化３ａｍ ＨＩ部位において゛ｒ４
ＤＮＡリガーゼで連結した。ＣａＣｌ２処理した大腸菌
細胞を上記連結断片で形質転換した後、約３０，０００
のアンピシリン耐性クローンのプールを得た。
ＣａｒｌＳＯｎおよびり、 Ｂｏｓｔｅｉｎ （Ｃｅｌ
ｌ ２８．１４５−１５４．１９８２）が記載したの
と類似の方法により、雑種大腸菌−酵母プラスミドｐＦ
１１（Ｈ，ＲＣｈｅｖａｌｌｉｅｒ等、Ｇｅｎｅ 上
ユ、１１〜１９゜１９８０）中に調製した。精製した酵
ｆｆ１ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ ５ａｕ３Ａで
部分消化し、生じたＤＮＡ断片（平均長さ５にｂ）をｐ
Ｆｌ １の脱燐酸化３ａｍ ＨＩ部位において゛ｒ４
ＤＮＡリガーゼで連結した。ＣａＣｌ２処理した大腸菌
細胞を上記連結断片で形質転換した後、約３０，０００
のアンピシリン耐性クローンのプールを得た。
此等のクローンはコロニーバイブリド法（Ｒ，Ｅ。
Ｔｈａｙｅｒ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、、
９８．６０−６３．１９７９）により化学合成し、 Ｐ
−標識したオリゴマー（５’ ＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣ
ＣＡＡＣＴＴ ３ ’の配列を有する）を使ってスクリ
ーンした。
９８．６０−６３．１９７９）により化学合成し、 Ｐ
−標識したオリゴマー（５’ ＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣ
ＣＡＡＣＴＴ ３ ’の配列を有する）を使ってスクリ
ーンした。
Ｊ、 Ｐ、 Ｈｏ１ｌａｎｄ及びＨ，Ｊ、 Ｈｏ１ｌａ
ｎｄ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
ｎｄ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
ＣｈｅＩｌ、 ２５５ 、２５９６−２６０５ 、１
９８０ ＞が発表したデータによれば、このオリゴマー
はＧＡＰＤＨ遺伝子のアミノ酸３０６〜３１０（最後の
アミノ酸のゆらぎ塩基はオリゴマーから省略した）をコ
ードするＤＮＡ配列と相補的である。
９８０ ＞が発表したデータによれば、このオリゴマー
はＧＡＰＤＨ遺伝子のアミノ酸３０６〜３１０（最後の
アミノ酸のゆらぎ塩基はオリゴマーから省略した）をコ
ードするＤＮＡ配列と相補的である。
Ｒ，Ｂ、 Ｗａｌｌａｃｅ等により記載されたバイブリ
ド条件（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、９．８
７９−８９４．１９８１）を用いて、６個の正の形質転
換体が同定出来る。此等の一つはプラスミドｐＦ１ １
−３３を収容した。後者のプラスミドはそのプロモータ
／調節領域及び転写停止／ボリアデニール化領域を含む
ＧＡＰＤＨ遺伝子を含有した。約９にｂの長さのｐＦｌ
１−３３のインサートが制限酵素分析（第１図）と
部分ヌクレオチド配列分析（第２及び３図）により特徴
づけられた。
ド条件（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、９．８
７９−８９４．１９８１）を用いて、６個の正の形質転
換体が同定出来る。此等の一つはプラスミドｐＦ１ １
−３３を収容した。後者のプラスミドはそのプロモータ
／調節領域及び転写停止／ボリアデニール化領域を含む
ＧＡＰＤＨ遺伝子を含有した。約９にｂの長さのｐＦｌ
１−３３のインサートが制限酵素分析（第１図）と
部分ヌクレオチド配列分析（第２及び３図）により特徴
づけられた。
Ｅ、 ＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域の単離および
プレプロソーマチンをコードするプラスミドへの入（，
４図） 制限酵素分析及びプラスミドｐＦＩ １−３３のイン
サートのヌクレオチド配列データに基づいて、ＧＡＰＤ
Ｈ遺伝子のＲＮＡ開始／調節領域を８００ヌクレオチド
長の［）ｄｅ■断片として単離した。このプロモータ断
片を同定するため、プラスミドＩ）Ｆｌ １−３３を
Ｓａｌ Ｉで消化し、得られた３つのＤＮＡ断片を化
学合成したオリゴマーを使ってサザーンハイプリドテス
ト（Ｅ、 Ｈ。
プレプロソーマチンをコードするプラスミドへの入（，
４図） 制限酵素分析及びプラスミドｐＦＩ １−３３のイン
サートのヌクレオチド配列データに基づいて、ＧＡＰＤ
Ｈ遺伝子のＲＮＡ開始／調節領域を８００ヌクレオチド
長の［）ｄｅ■断片として単離した。このプロモータ断
片を同定するため、プラスミドＩ）Ｆｌ １−３３を
Ｓａｌ Ｉで消化し、得られた３つのＤＮＡ断片を化
学合成したオリゴマーを使ってサザーンハイプリドテス
ト（Ｅ、 Ｈ。
５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｈｏ１． Ｂｉｏｔ、、
９８．５０３−５１７．１９７５）に供した。正にバ
イブリドする４、３Ｋｂ長の制限断片を０．７％アガロ
ースゲルから電気溶出により分取スケールで単離し、次
いでこれをＤｄｅＩで切断した。得られたＤｄｅ■断片
中、最大のもののみがＧＡＰＤＨレギユロン領域（第１
図）中に位置する切断部位であるＰｖｕ ＩＩの認識
部位を持っていた。最大の［）ｄｅ Ｉ断片を単離し
、これをフレナラＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴ
Ｐ’ ｓ （Ａ、Ｒ。
９８．５０３−５１７．１９７５）に供した。正にバ
イブリドする４、３Ｋｂ長の制限断片を０．７％アガロ
ースゲルから電気溶出により分取スケールで単離し、次
いでこれをＤｄｅＩで切断した。得られたＤｄｅ■断片
中、最大のもののみがＧＡＰＤＨレギユロン領域（第１
図）中に位置する切断部位であるＰｖｕ ＩＩの認識
部位を持っていた。最大の［）ｄｅ Ｉ断片を単離し
、これをフレナラＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴ
Ｐ’ ｓ （Ａ、Ｒ。
ＤａＶｉＳ等、Ｇｅｎｅ、上０．２０５−２１８．１９
８０）とインキュベートし、平滑末端ＤＮＡ分子を得た
。反応混合物をフェノール／クロロホルム（５０１５０
ｖ／ｖ ）による抽出し、水性層をセファデックスＧ５
０カラムに通し、ボイドボリューム中に存在する物質を
エタノール沈澱させた後、ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼと共にインキュベーションして３２ｐ−標識Ｅｃｏ
ＲＩクリンカ５ ’ ＧＧＡＡＴＴＣＣ３’と結合
させた。フレナラＤＮＡポリメラーゼ反応及び引き続＜
Ｅｃｏ ＲＩクリンカの連結により、元のＤｄｅＩ部
位はレギユロン断片の末端で再構築した。リガーゼを失
活させるため、反応混合物を６５℃で１０分間加熱し、
次いで塩化ナトリウムを加え（Ｒ終濃度５０ミリモル／
１）、全体の混合物をＥＣＯＲＩと共にインキュベート
した。インキュベーションはフェノール／クロロフォル
ムで抽出して停止し、ＤＮＡをエタノールで２度沈澱さ
せ、再懸濁させ、ついで好適なベクター分子に連結した
。Ｄｄｅ■レギユロン断片はＥＣＯＲＩ部位に結合した
ので、酵母レギユロンが７レプロンーマチンをコードす
る構造遺伝子に隣接しているプラスミドを得るために、
容易にｐＵＲ５２８（イーブン等、［Ｇｔ３ｎｅＪ上８
．１−ａ （１９８２））のＥＣｏＲＩ部位に導入する
ことが出来る。後者のプラスミドは、ｐＬＩＲ５２８を
ＥＣＯＲＩで切断し、直線化プラスミド分子をアルカリ
ホスファターゼ（子牛腸）で処理して自己連結を防止し
そしてこれらのベクター分子各々ならびに精製［１ｄｅ
Ｉプロモータ断片を−ｒ４ ＤＮＡリガーゼと共
にインキュベーションして得られる。
８０）とインキュベートし、平滑末端ＤＮＡ分子を得た
。反応混合物をフェノール／クロロホルム（５０１５０
ｖ／ｖ ）による抽出し、水性層をセファデックスＧ５
０カラムに通し、ボイドボリューム中に存在する物質を
エタノール沈澱させた後、ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼと共にインキュベーションして３２ｐ−標識Ｅｃｏ
ＲＩクリンカ５ ’ ＧＧＡＡＴＴＣＣ３’と結合
させた。フレナラＤＮＡポリメラーゼ反応及び引き続＜
Ｅｃｏ ＲＩクリンカの連結により、元のＤｄｅＩ部
位はレギユロン断片の末端で再構築した。リガーゼを失
活させるため、反応混合物を６５℃で１０分間加熱し、
次いで塩化ナトリウムを加え（Ｒ終濃度５０ミリモル／
１）、全体の混合物をＥＣＯＲＩと共にインキュベート
した。インキュベーションはフェノール／クロロフォル
ムで抽出して停止し、ＤＮＡをエタノールで２度沈澱さ
せ、再懸濁させ、ついで好適なベクター分子に連結した
。Ｄｄｅ■レギユロン断片はＥＣＯＲＩ部位に結合した
ので、酵母レギユロンが７レプロンーマチンをコードす
る構造遺伝子に隣接しているプラスミドを得るために、
容易にｐＵＲ５２８（イーブン等、［Ｇｔ３ｎｅＪ上８
．１−ａ （１９８２））のＥＣｏＲＩ部位に導入する
ことが出来る。後者のプラスミドは、ｐＬＩＲ５２８を
ＥＣＯＲＩで切断し、直線化プラスミド分子をアルカリ
ホスファターゼ（子牛腸）で処理して自己連結を防止し
そしてこれらのベクター分子各々ならびに精製［１ｄｅ
Ｉプロモータ断片を−ｒ４ ＤＮＡリガーゼと共
にインキュベーションして得られる。
ＣａＣｌ２−処理した大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞にて各種の
連結混合物を形質転換すると、数種のアンピシリン耐性
コロニーを得た。此等コロニーのあるものから、プラス
ミドＤＮＡを単離しくＨ，Ｃ。
連結混合物を形質転換すると、数種のアンピシリン耐性
コロニーを得た。此等コロニーのあるものから、プラス
ミドＤＮＡを単離しくＨ，Ｃ。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＪ、 Ｄｏｌｙ、 Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ 。
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７ 。
１５１３−１５２３．１９７９）そしてインサートの配
向をテストするためＰｖｕ ＩＦとインキュベートシ
た。
向をテストするためＰｖｕ ＩＦとインキュベートシ
た。
命名法においては、正しい配向（即ち
ＧＡＰＤＨレギユロンから転写が下流にある構造遺伝子
の方向におこる）のＥＣＯＲＩ（ＯｄｅＩ ）ＧＡＰＤ
Ｈレギユロン断片を含むプラスミドはプラスミドの元の
コードに対して付加（ａｄｄｅｎｄｕｉ＋） −０１と
して示す（例えばｐＵＲ５２８はｐＵＲ５２８−０１に
変化する：第４図参照）。
の方向におこる）のＥＣＯＲＩ（ＯｄｅＩ ）ＧＡＰＤ
Ｈレギユロン断片を含むプラスミドはプラスミドの元の
コードに対して付加（ａｄｄｅｎｄｕｉ＋） −０１と
して示す（例えばｐＵＲ５２８はｐＵＲ５２８−０１に
変化する：第４図参照）。
Ｅｃｏ ＲＩレギユロン断片を含むプラスミドの操作
を容易にするため、２つのＥＣＯＲＩ部位の１つを破壊
した。２μ９のプラスミドＤＮＡ（例えばｐＵＲ５２８
−０１）をＥＣＯＲ１で部分消化し次いで０．０５モル
／１酢酸ソーダ（ｐＨ５，Ｏ）、０．０５モル／１塩化
ナトリウム及びｏ、ｏｏｉモル／１塩化亜鉛亜存在下総
量２００μｌ中５ユニット緑豆ヌクレアーゼ（Ｐ、 Ｌ
。
を容易にするため、２つのＥＣＯＲＩ部位の１つを破壊
した。２μ９のプラスミドＤＮＡ（例えばｐＵＲ５２８
−０１）をＥＣＯＲ１で部分消化し次いで０．０５モル
／１酢酸ソーダ（ｐＨ５，Ｏ）、０．０５モル／１塩化
ナトリウム及びｏ、ｏｏｉモル／１塩化亜鉛亜存在下総
量２００μｌ中５ユニット緑豆ヌクレアーゼ（Ｐ、 Ｌ
。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｉｎｃ、 ）により室温で３０分間
インキュベートして、粘着性末端を除去した。ヌクレア
ーゼを最終濃度０．１％になる様にＳＯ８を加えて失活
させ（Ｄ、にｏｗａ Ｉ ｓｋ ｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙｌ ５ 。
インキュベートして、粘着性末端を除去した。ヌクレア
ーゼを最終濃度０．１％になる様にＳＯ８を加えて失活
させ（Ｄ、にｏｗａ Ｉ ｓｋ ｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙｌ ５ 。
４４５７−４４６３．１９７６）、ＤＮＡを２容のエタ
ノールを加えて沈澱させた（この場合３モル／ｊ！酢酸
ソーダ０．１容の添加は省略した）。
ノールを加えて沈澱させた（この場合３モル／ｊ！酢酸
ソーダ０．１容の添加は省略した）。
直線化ＤＮＡ分子を次いでＴ４ＤＮＡリガーゼとインキ
ュベートして再連結し、ＣａＣｊ！２処理大腸菌細胞の
形質転換に使用した。アンピシリン耐性コロニーから分
離したプラスミドＤＮＡをプレプロソーマチン遺伝子に
隣接する単−ＥＣ０ＲＩ部位の存在をみるためＥＣＯＲ
１とＭＩｔＪ工で切断してテストした（第４図参照）。
ュベートして再連結し、ＣａＣｊ！２処理大腸菌細胞の
形質転換に使用した。アンピシリン耐性コロニーから分
離したプラスミドＤＮＡをプレプロソーマチン遺伝子に
隣接する単−ＥＣ０ＲＩ部位の存在をみるためＥＣＯＲ
１とＭＩｔＪ工で切断してテストした（第４図参照）。
ＧＡＰＤＨ断片を含むが下流位置構造遺伝子のＡＴＧ開
始コドンに隣接する単−ＥＣＯＲ１認識部位のみを持つ
プラスミドを一０２型プラスミドと称する（例えば：ｐ
ＵＲ５２８−０１はｐｔＪＲ５２８−０２に変化する、
第４図参照）。
始コドンに隣接する単−ＥＣＯＲ１認識部位のみを持つ
プラスミドを一０２型プラスミドと称する（例えば：ｐ
ＵＲ５２８−０１はｐｔＪＲ５２８−０２に変化する、
第４図参照）。
Ｆ、 合成りＮＡ断片の導入によるプレプロソーマチン
をコードするプラスミド中の元の ＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域の再構成（第５．６図
〉 第２図に示したヌクレオチド配列にある通り、Ｅｃｏ
ＲＩ （Ｄｄｅ Ｉ）ＧＡＰＤＨプロモータ断片は
元のＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域のヌクレオチド−
８５０から−３９を含む。このプロモータ断片に含まれ
ていないものはＧＡＰＨＤをコードする遺伝子のＡＴＧ
開始コドンに先立つ３８のヌクレオチドである。後者の
３８ヌクレオチド長の断片は数種の酵母遺伝子に見出さ
れるＰｕＣＡＣＡＣＡ配列を含んでいる。このＰｕＣＡ
ＣＡＣＡ配列は翻訳開始部位の約２０ｂｐ上流に位置し
ているが（Ｈ，Ｊ、 Ｄｏｂｓｏｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、±０．２６２５−２６３７゜１
９８２）、タン白質開始にとって最適であるＡＴＧコド
ンの上流のヌクレオチド配列を供する（Ｈ，にｏｚａｋ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ 、
５２３３−５２５２．１９８１）。更に、第７図に示す
様に、此等３８のヌクレオチドはＧＡＰＤＨ遺伝子の発
現の調節に関与しているであろうループ構造を生成させ
る。上記の議論に基づいて、３８ヌクレオチドを［）ｄ
ｅ Ｉプロモータ断片と下流位置構造遺伝子のＡＴＧ
コドンの間に導入するのは、ブＯモータ活性および翻訳
開始の改良のために必要であると考えられた。
をコードするプラスミド中の元の ＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域の再構成（第５．６図
〉 第２図に示したヌクレオチド配列にある通り、Ｅｃｏ
ＲＩ （Ｄｄｅ Ｉ）ＧＡＰＤＨプロモータ断片は
元のＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域のヌクレオチド−
８５０から−３９を含む。このプロモータ断片に含まれ
ていないものはＧＡＰＨＤをコードする遺伝子のＡＴＧ
開始コドンに先立つ３８のヌクレオチドである。後者の
３８ヌクレオチド長の断片は数種の酵母遺伝子に見出さ
れるＰｕＣＡＣＡＣＡ配列を含んでいる。このＰｕＣＡ
ＣＡＣＡ配列は翻訳開始部位の約２０ｂｐ上流に位置し
ているが（Ｈ，Ｊ、 Ｄｏｂｓｏｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、、±０．２６２５−２６３７゜１
９８２）、タン白質開始にとって最適であるＡＴＧコド
ンの上流のヌクレオチド配列を供する（Ｈ，にｏｚａｋ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ 、
５２３３−５２５２．１９８１）。更に、第７図に示す
様に、此等３８のヌクレオチドはＧＡＰＤＨ遺伝子の発
現の調節に関与しているであろうループ構造を生成させ
る。上記の議論に基づいて、３８ヌクレオチドを［）ｄ
ｅ Ｉプロモータ断片と下流位置構造遺伝子のＡＴＧ
コドンの間に導入するのは、ブＯモータ活性および翻訳
開始の改良のために必要であると考えられた。
第５図に示す様に、欠けているＤＮＡ断片は２つの部分
的に重複するオリゴマーの化学合成により得られた。２
つのオリゴヌクレオチドの重複部に存在する３ａＣＩ部
位が２つの理由により導入された二（ｉ）ポリへ−尾部
酵母発現ベクターの構築を含むＡＴＧコドンのすぐ上流
のヌクレオチド配列の操作を可能にするため。（ｉｉ）
４つのｄＮＴＰの存在下で７４ ＤＮＡポリメラーゼ
と共にインキュベートすることにより容易かつ再現的に
除去出来る酵素により生じた３′−突出末端のだめに切
断部位を与えるため。等モル聞の２つの精製オリゴマー
をその５′−末端で燐酸化し、バイブリドしく Ｊ、Ｊ
、 ＲＯ３Ｓｉ等、１９８２、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅＩｌｌ、、 ２５７．９２２６−９２２９）そして
フレナラＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰと共に
、二本鎖ＤＮＡ合成のために記載されている条件下でイ
ンキュベートすることにより二本鎖ＤＮＡ分子に変換し
た（Ａ、Ｒ，Ｄａｖｉｓ等、Ｇｅｎｅ、 １０ 、２
０５−２１８ 、１９８０ ） 、反応生産物を１３％
アクリルアミドゲルにより電気泳動し次いでオートラジ
オグラフィーにより分析した結果、最初の一重鎖オリゴ
ヌクレオチドの８０％以上が二本鎖物質に変換されたこ
・とを示した。
的に重複するオリゴマーの化学合成により得られた。２
つのオリゴヌクレオチドの重複部に存在する３ａＣＩ部
位が２つの理由により導入された二（ｉ）ポリへ−尾部
酵母発現ベクターの構築を含むＡＴＧコドンのすぐ上流
のヌクレオチド配列の操作を可能にするため。（ｉｉ）
４つのｄＮＴＰの存在下で７４ ＤＮＡポリメラーゼ
と共にインキュベートすることにより容易かつ再現的に
除去出来る酵素により生じた３′−突出末端のだめに切
断部位を与えるため。等モル聞の２つの精製オリゴマー
をその５′−末端で燐酸化し、バイブリドしく Ｊ、Ｊ
、 ＲＯ３Ｓｉ等、１９８２、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅＩｌｌ、、 ２５７．９２２６−９２２９）そして
フレナラＤＮＡポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰと共に
、二本鎖ＤＮＡ合成のために記載されている条件下でイ
ンキュベートすることにより二本鎖ＤＮＡ分子に変換し
た（Ａ、Ｒ，Ｄａｖｉｓ等、Ｇｅｎｅ、 １０ 、２
０５−２１８ 、１９８０ ） 、反応生産物を１３％
アクリルアミドゲルにより電気泳動し次いでオートラジ
オグラフィーにより分析した結果、最初の一重鎖オリゴ
ヌクレオチドの８０％以上が二本鎖物質に変換されたこ
・とを示した。
ＤＮＡは反応混合物をセファデックスＧ５０カラムに通
し、ついで排出液中に存在する物質をエタノールを沈澱
することにより単離した。ＤＮＡは次いでポリヌクレオ
チドキナーゼと共にインキュベートして燐酸化し、□ｃ
ｊｅ Ｉで消化した。後者の反応中に切断したヌクレ
オチドを除去するため、反応混合物をエタノールにより
２回沈澱させた。
し、ついで排出液中に存在する物質をエタノールを沈澱
することにより単離した。ＤＮＡは次いでポリヌクレオ
チドキナーゼと共にインキュベートして燐酸化し、□ｃ
ｊｅ Ｉで消化した。後者の反応中に切断したヌクレ
オチドを除去するため、反応混合物をエタノールにより
２回沈澱させた。
第６図に示す様に、生じた合成りＮＡ断片のクローニン
グは、この断片とベクター分子中のＢＯＩ ＩＩ−Ｄ
ｄｅ Ｉ ＧＡＰＤＨプロモータ調節断片の同時連
結により実施した。このベクター分子からＡＴＧ開始コ
ドンに先行するＥＣｏＲＩ部位を緑豆ヌクレアーゼ消化
により除いた（Ｅ参照）。
グは、この断片とベクター分子中のＢＯＩ ＩＩ−Ｄ
ｄｅ Ｉ ＧＡＰＤＨプロモータ調節断片の同時連
結により実施した。このベクター分子からＡＴＧ開始コ
ドンに先行するＥＣｏＲＩ部位を緑豆ヌクレアーゼ消化
により除いた（Ｅ参照）。
Ｂｇｌ ＩＩ−Ｄｄｅ Ｉプロモータ／調節断片は
プラスミドｐＬＩＲ５２８−０２をＤｄｅ ＩとＢＩ
ＩＩで消化して得た。生じた正弦断片を２％アガロ
ースゲル電気泳動と続くゲルから断片を分離して、精製
７９３ヌクレオチド長プロモ一タ／調節断片を得た。プ
ラスミド１）ＵＲ５２８−０２中でＡＴＧコドンに先行
するヌクレオチド配列は５ ’ −ＧＡＡＴＴＣ（Ｔ）
ＡＴＣ−３’（ＥＰ−ＰＡ５４３３０とＥＰ−ＰＡ５４
３３１’）であり、これはＨ，Ｋｏｚａｋ （Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
プラスミドｐＬＩＲ５２８−０２をＤｄｅ ＩとＢＩ
ＩＩで消化して得た。生じた正弦断片を２％アガロ
ースゲル電気泳動と続くゲルから断片を分離して、精製
７９３ヌクレオチド長プロモ一タ／調節断片を得た。プ
ラスミド１）ＵＲ５２８−０２中でＡＴＧコドンに先行
するヌクレオチド配列は５ ’ −ＧＡＡＴＴＣ（Ｔ）
ＡＴＣ−３’（ＥＰ−ＰＡ５４３３０とＥＰ−ＰＡ５４
３３１’）であり、これはＨ，Ｋｏｚａｋ （Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
９．５２３３−５２５２．１９８１）により得られた好
ましいヌクレオチド配列とは異なっている。 。
ましいヌクレオチド配列とは異なっている。 。
本発明の目標とするところはもとのＧ Ａ Ｐ Ｄ Ｈ
プロモータ／調節／タン白質開始領域を出来るだけ正確
に再構成することにあるので、Ｅｃｏ ＲＩ部を合成
りＮＡ断片を生成平滑末端に連結するためにＥＣＯＲＩ
部位を除去した。ＥＣＯＲＩ部の除去はＥＣＯＲＩ−切
断ｐＵＲ５２８−０２ＤＮＡ （Ｅ参照）の緑豆ヌクレ
アーゼ消化により成しとげた。
プロモータ／調節／タン白質開始領域を出来るだけ正確
に再構成することにあるので、Ｅｃｏ ＲＩ部を合成
りＮＡ断片を生成平滑末端に連結するためにＥＣＯＲＩ
部位を除去した。ＥＣＯＲＩ部の除去はＥＣＯＲＩ−切
断ｐＵＲ５２８−０２ＤＮＡ （Ｅ参照）の緑豆ヌクレ
アーゼ消化により成しとげた。
引き続いて、プラスミドＤＮＡをＢＱＩ Ｉ［で消化
し、ホスファターゼと共にインキュベートした。０．７
％アガロースゲルで電気泳動して２つのＤＮＡ断片を分
離した後、最大の断片を分離し、ＢＧＩ ＩＦ−Ｏｄ
ｅ Ｉプロモータ断片及びＯｄｅ Ｉ処理台成りＮ
Ａ断片を連結するベクターとして使用した。
し、ホスファターゼと共にインキュベートした。０．７
％アガロースゲルで電気泳動して２つのＤＮＡ断片を分
離した後、最大の断片を分離し、ＢＧＩ ＩＦ−Ｏｄ
ｅ Ｉプロモータ断片及びＯｄｅ Ｉ処理台成りＮ
Ａ断片を連結するベクターとして使用した。
［）ｄｅ Ｉプロモータ／調節断片が合成りＮＡ断片
を含む３ａｃ Ｉ認識部位と共に導入したプラスミド
は付加−０３により示す（例えば：ｐＵＲ５２８−０２
はｐＵＲ５２８−０３に変えられる）。
を含む３ａｃ Ｉ認識部位と共に導入したプラスミド
は付加−０３により示す（例えば：ｐＵＲ５２８−０２
はｐＵＲ５２８−０３に変えられる）。
Ｇ、 ２μｍＤＮＡ複製起源と酵母Ｉｅｕ−２３Ｉｆ
伝子のプレプロソーマチンをコードするプラスミドへの
導入 ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＧＡＰＤＨレギユロン
の機能性をテストするため、プラスミド１）ＵＲ５２８
−０２とｐＬＩＲ５２８−０３を酵母２ｔｔｍＤＮＡか
ら得られた複製起源と選択可能なマーカに結合させた。
伝子のプレプロソーマチンをコードするプラスミドへの
導入 ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＧＡＰＤＨレギユロン
の機能性をテストするため、プラスミド１）ＵＲ５２８
−０２とｐＬＩＲ５２８−０３を酵母２ｔｔｍＤＮＡか
ら得られた複製起源と選択可能なマーカに結合させた。
両方の機能をプラスミドｐＭＰ８１から切り取り、２つ
のプレプロソーマチンをコードするプラスミドに導入し
た。大腸菌−酵母シャトルベクターｐＭＰ８１ （第８
図、ｃ、 ｐ。
のプレプロソーマチンをコードするプラスミドに導入し
た。大腸菌−酵母シャトルベクターｐＭＰ８１ （第８
図、ｃ、 ｐ。
Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ 、ｒ微生物学と免疫学におけ
る最近の話題Ｊ９６．１１９−１４４．１９８２）はプ
ラスミドｌ） ＣＲＩ （Ｃ，Ｃｏｖｅｙ等、ＭＧＧ、
１４５゜１５５−１５８．１９７６）および１ｅｕ−２
遺伝子と酵母２μｍＤＮＡ複製起源の両者を有するＤＪ
ＤＢ２１９ （Ｊ、Ｄ、 Ｂｅａｇｓ、 Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７５゜１０４−１０９．１９７８）の二重ＥＣＯ
ＲＩ断片より成っている。最後に述べた２つの機能をｐ
ＭＰ８１からＨｉｎｄ ｍとＳａｌ Ｉで消化さ才
て切除した。生じた４、４Ｋｂ長の制限断片をプレプロ
ソーマチン遺伝子を含むｐＵＲ５２８−０２又はｐＵＲ
５２８−０３誘導体及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域とプラスミドを作るた
めに結合させた。これはこのプラスミドをＨｉｎｄ
ｍ及び３ａｌ Ｉ（第６．９図参照）で切断し、続い
て生じた断片をホスファターゼで処理して行なった。１
％アガロースゲルの電気泳動により断片を分離後、最大
の断片を分離し、ｐＭＰ８１から得られた精製Ｈｉｎｄ
Ｉ［ｌ−８ａｔ Ｉ断片と混合し、Ｔ２ＣＮ Ａ
リガーゼで連結しそしてＣａＣＩ２−処理大腸菌細胞に
形質転換した。アンピシリン−耐性形質転換体のある物
からプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素分析に供した
。正しいインサート（ｐ（ＪＲＹ ５２８−０２又は
ｐＵＲＹ５２８−０３、ｃＢＳ８１５５）を含むプラス
ミドをＣｓＣ１−臭化エチジウム密度勾配遠沈により精
製し、Ｊ、Ｄ、Ｂｅａａｓ （Ｎａｔｕｒｅ、 ２７
５ 、 １０４−１を形質転換するのに使用した（Ａ、
１ロｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７５ １９２９−１９３３．１９
７８）。
る最近の話題Ｊ９６．１１９−１４４．１９８２）はプ
ラスミドｌ） ＣＲＩ （Ｃ，Ｃｏｖｅｙ等、ＭＧＧ、
１４５゜１５５−１５８．１９７６）および１ｅｕ−２
遺伝子と酵母２μｍＤＮＡ複製起源の両者を有するＤＪ
ＤＢ２１９ （Ｊ、Ｄ、 Ｂｅａｇｓ、 Ｎａｔｕｒｅ
、 ２７５゜１０４−１０９．１９７８）の二重ＥＣＯ
ＲＩ断片より成っている。最後に述べた２つの機能をｐ
ＭＰ８１からＨｉｎｄ ｍとＳａｌ Ｉで消化さ才
て切除した。生じた４、４Ｋｂ長の制限断片をプレプロ
ソーマチン遺伝子を含むｐＵＲ５２８−０２又はｐＵＲ
５２８−０３誘導体及びＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域とプラスミドを作るた
めに結合させた。これはこのプラスミドをＨｉｎｄ
ｍ及び３ａｌ Ｉ（第６．９図参照）で切断し、続い
て生じた断片をホスファターゼで処理して行なった。１
％アガロースゲルの電気泳動により断片を分離後、最大
の断片を分離し、ｐＭＰ８１から得られた精製Ｈｉｎｄ
Ｉ［ｌ−８ａｔ Ｉ断片と混合し、Ｔ２ＣＮ Ａ
リガーゼで連結しそしてＣａＣＩ２−処理大腸菌細胞に
形質転換した。アンピシリン−耐性形質転換体のある物
からプラスミドＤＮＡを分離し、制限酵素分析に供した
。正しいインサート（ｐ（ＪＲＹ ５２８−０２又は
ｐＵＲＹ５２８−０３、ｃＢＳ８１５５）を含むプラス
ミドをＣｓＣ１−臭化エチジウム密度勾配遠沈により精
製し、Ｊ、Ｄ、Ｂｅａａｓ （Ｎａｔｕｒｅ、 ２７
５ 、 １０４−１を形質転換するのに使用した（Ａ、
１ロｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７５ １９２９−１９３３．１９
７８）。
Ｈ，ＫＡＲＳ−２及びｔｒｐ−１遺伝子ノフレフロソー
マチンをコードするプラスミドへの導入大腸菌酵母シャ
］−ルベクタ−１）ＥＫ２−７は１．２にｂのＫＡＲ３
−２断片を含むプラスミドＹ Ｒｐ７ （Ｄ、Ｔ、 Ｓ
ｔｉｎｃｈｂｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ、 ２８２ 。
マチンをコードするプラスミドへの導入大腸菌酵母シャ
］−ルベクタ−１）ＥＫ２−７は１．２にｂのＫＡＲ３
−２断片を含むプラスミドＹ Ｒｐ７ （Ｄ、Ｔ、 Ｓ
ｔｉｎｃｈｂｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ、 ２８２ 。
３９−４３．１９７９）より成っている。酵母ｔｒｐ−
１遺伝子の存在により、プラスミドｐＥＫ２−７はに、
ＩａｃｔｉｓＳＤｌｌ １ａｃ−４、ｔｒｐ−ｉ中に
保持することが出来る（ｐＥＫ２−７の調製はオランダ
特許出願８２０２０９１の優先権を主張するヨーロッパ
特許出願／ＰＣＴに記載されている）。
１遺伝子の存在により、プラスミドｐＥＫ２−７はに、
ＩａｃｔｉｓＳＤｌｌ １ａｃ−４、ｔｒｐ−ｉ中に
保持することが出来る（ｐＥＫ２−７の調製はオランダ
特許出願８２０２０９１の優先権を主張するヨーロッパ
特許出願／ＰＣＴに記載されている）。
Ｋ、 ＋ａｃｔ＋ｓにてＧＡＰＤＨをコードする遺伝子
のプロモータ／調節領域の機能性を示すため、プラスミ
ドｐＵＲ５２８−０３（第９図）をＫＡＲＳ−２断片と
ｔｒｌ）−１３１伝子の両者に結合した。最後に述べた
２つの機能をＢｇｌ ■で消化し続いて０．７％アガロ
ースゲルから生成最小断片を単離して切り出した。この
精製断片を次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼとインキュベ
ートしてｐＵＲ５２８−０３の脱リン酸化８ｏｌ Ｉ
ｔ切断部に挿入した。ＣａＣｌ２−処理した大腸菌細胞
中の連結混合物の形質転換によりプラスミドρＬＪＲＫ
５２８−０３ （第１０図）を生じた。後者のプラスミ
ドをオランダ特許出願Ｎｏ、８２０２０９１号朗細書に
記載されている方法でに、 １ａｃｔｉｓ Ｓ Ｄ １
１細胞に導入して得た形質転換体はソーマチン様タン白
質（第１１図）を合成することが分った。
のプロモータ／調節領域の機能性を示すため、プラスミ
ドｐＵＲ５２８−０３（第９図）をＫＡＲＳ−２断片と
ｔｒｌ）−１３１伝子の両者に結合した。最後に述べた
２つの機能をＢｇｌ ■で消化し続いて０．７％アガロ
ースゲルから生成最小断片を単離して切り出した。この
精製断片を次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼとインキュベ
ートしてｐＵＲ５２８−０３の脱リン酸化８ｏｌ Ｉ
ｔ切断部に挿入した。ＣａＣｌ２−処理した大腸菌細胞
中の連結混合物の形質転換によりプラスミドρＬＪＲＫ
５２８−０３ （第１０図）を生じた。後者のプラスミ
ドをオランダ特許出願Ｎｏ、８２０２０９１号朗細書に
記載されている方法でに、 １ａｃｔｉｓ Ｓ Ｄ １
１細胞に導入して得た形質転換体はソーマチン様タン白
質（第１１図）を合成することが分った。
上述のものと同様の技法により、プラスミドｐＵＲＹ５
２８−０３ （Ｇ参照）をＫＡＲＳ−２断片と酵母ｔｒ
ｐ−１遺伝子に結合し、に、 １ａｃｔｉｓ ＳＤ １
１ （第１０図）に導入した。
２８−０３ （Ｇ参照）をＫＡＲＳ−２断片と酵母ｔｒ
ｐ−１遺伝子に結合し、に、 １ａｃｔｉｓ ＳＤ １
１ （第１０図）に導入した。
１、 Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンのプロモー
タ／調節領域の調節下プレプロソーマチンをコードする
遺伝子のに、 １ａｃｔｉｓ中の 坦同じ検出法を用い
、１）ＵＲＫ５２８−３３を持つに、 Ｉａｃｔｉｓ細
胞もソーマチン様タン白質（第１１図）を合成すること
が示された。しかし、１）ＵＲＫ５２８−３３を含む細
胞にてソーマチン様タン白質を生産するのはｐＵＲＫ５
２８−０３を含む細胞中におけるよりも約３倍も高かっ
た。
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンのプロモー
タ／調節領域の調節下プレプロソーマチンをコードする
遺伝子のに、 １ａｃｔｉｓ中の 坦同じ検出法を用い
、１）ＵＲＫ５２８−３３を持つに、 Ｉａｃｔｉｓ細
胞もソーマチン様タン白質（第１１図）を合成すること
が示された。しかし、１）ＵＲＫ５２８−３３を含む細
胞にてソーマチン様タン白質を生産するのはｐＵＲＫ５
２８−０３を含む細胞中におけるよりも約３倍も高かっ
た。
同様な観察が酵母ｕｒａ−３遺伝子の発現においてこの
遺伝子を２μｍＤＮＡをコードする領域「エーブル（Ａ
ｂｌｅ） Ｊ中に挿入したときにＣ，Ｇｅｒｂａｕｄ等
（Ｇｅｎｅ、５．２３３−２５３．１９７９）によりな
されているので、ｐＵＲＫ５２８−３３によるソーマチ
ン様タン白質の増強された発現は［エーブル（Ａｂｌｅ
）Ｊオペロンの転写／ボリアデニール化における効率的
な転写停止事実によるものであるらしい。この観察はＧ
ＡＰＤＨプロモータ／調節部により転写された構造遺伝
子の効率的転写の下流の効率的転写停止／ボリアデニー
ル化領域の存在が遺伝子発現の最適化における重要な要
素であることを示している。ＧＡＰＤＨ停止ボリアデニ
ール化部（第３図）によるエーブル（Ａｂｌｅ）−停止
暗号の代用は発現における少なくとも同様な改良をもた
らすことが期待される。
遺伝子を２μｍＤＮＡをコードする領域「エーブル（Ａ
ｂｌｅ） Ｊ中に挿入したときにＣ，Ｇｅｒｂａｕｄ等
（Ｇｅｎｅ、５．２３３−２５３．１９７９）によりな
されているので、ｐＵＲＫ５２８−３３によるソーマチ
ン様タン白質の増強された発現は［エーブル（Ａｂｌｅ
）Ｊオペロンの転写／ボリアデニール化における効率的
な転写停止事実によるものであるらしい。この観察はＧ
ＡＰＤＨプロモータ／調節部により転写された構造遺伝
子の効率的転写の下流の効率的転写停止／ボリアデニー
ル化領域の存在が遺伝子発現の最適化における重要な要
素であることを示している。ＧＡＰＤＨ停止ボリアデニ
ール化部（第３図）によるエーブル（Ａｂｌｅ）−停止
暗号の代用は発現における少なくとも同様な改良をもた
らすことが期待される。
第１図 酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼオペロンを含むプラスミドｐＦ１１−３３の領
域の制限エンドヌクレアーゼ切断マツプ。 第２図 ｐＦｌ １−３３にクローンされたグリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンのプ
ロモータ７ｍ節領域のヌクレオチド配列。ＴＡＴＡ及び
ＴＡＴＡＡＡ配列は実線のアンダーラインで示す。推定
転写停止信号は点線アンダーラインをした。カッコの間
のヌクレオチド配列は逆転反復を示す。３８アミノ酸長
ペプチドをコードするヌクレオチドの配列はボックスの
中に含まれている。 第３図 ｐＦｌ １−３３にクローンされたグリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンの転
写停止／ボリアデニール領域のヌクレオチド配列、ＡＡ
ＴＡＡ配列は実線アンダーラインで示す。推定転写停止
信号は点線アンダーラインをした。 第４図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
へのＥｃｏ ＲＩ （Ｄｄｅ Ｉ）ＧＡＰＤＨプロ
モータ／調節断片の挿入及び生じたプラスミドからのＥ
ｃｏ ＲＩ切断部位の除去の図式的表示。 第５図 プレプロソーマチンをコードするヌクレオチド
配列の上流のもとのＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域を
再構成するために使用する合成りＮＡ断片のｍ製に関与
する各段階の表示。 第６図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
への合成りＮＡ断片の導入の図式的表示。 第７図 可能な幹とループ構造を含むＧＡＰＤＨプロモ
ータ／調節領域の構造の図式的表示。推定転写停止信号
は斜線で示す。断片上の３８アミノ酸長ペプチドをコー
ドする配列の位置はＡＴＧ及びＴＡＡコドンで示される
。 第８図 プラスミドＩ）ＭＰ８１の図式的表示。 第９図 ）１ｉｎｄ ｍ及びＳａｔ Ｉによる分解
によりｐＭＰ８１から得られた２ミクロンの複製のＤＮ
Ａ起源とＩ ｅｎ２遺伝子のプレプロソーマチンをコー
ドするプラスミドへの導入の図式的表示。 第１０図 ＢｇＩ Ｉｆによる分解によりｐＥＫ２−
７から得られたＫＡＲＳ−２及びｔｒｐ１遺伝子のプレ
プロソーマチンをコードするプラスミドへの導入の図式
的表示。 第１１図 プラスミドｐＥＫ２−７（レーンａ）、プラ
スミドｐＵＲＫ５２８−０３ （レーンｂ）及びプラス
ミドｐＵＲＫ５２８−３３ （レーンＣ）を含むに、
Ｉａｃｔｉｓ Ｓ Ｄ １１細胞により合成された（３
５８）で標式したソーマチン様タン白質のフロログラム
。酵母形質転換体を３５８−システィンを含む最小培地
中で生育させた。菌体を遠沈により集め、これを１１ｄ
の２．０モル／ｌのソルビトール、０．０２５モル／Ｉ
ＮａＰＯ４（ｐＨ７，５）、１ミリモル／Ｉ Ｅ
ＤＴＡ１１ミリモル／１ １１１ｃｊ！ 、２．５％
β−メルカプトエタノール、１１ＩＦ！Ｊ／Ｉｄザイモ
リアーゼ６０，０００中に再懸濁し、３０分間３０℃に
インキュベートした。スフェロプラストを次いで遠沈し
、２７０μｌＨ２Ｏ，４μ７ １００ミリモル／ＩＰＭ
ＳＦ、８μｍ２５０ミリモル／Ｉ ＥＤＴＡ１４０１１
ａ９％ＮａＣｊ！及び８０μｉ ５×ＰＢＳＴＤＳ （
５０ミリモル／Ｉ Ｎ ａ ＰＯ４（ｐＨ７，２）、
５％Ｔｒｉｔｏｎｘ １００．２．５％デシキシマレー
ト、２．５％５ＤＳ）を加えて溶解させた。ソーマチン
様タン白質の免疫沈澱及び沈澱したタン白質の分析はり
、Ｅｄｅｎｓ等（Ｇｅｎｅｌ ８ 。 １−ａ．１９８２）の記載により行った。
ゲナーゼオペロンを含むプラスミドｐＦ１１−３３の領
域の制限エンドヌクレアーゼ切断マツプ。 第２図 ｐＦｌ １−３３にクローンされたグリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンのプ
ロモータ７ｍ節領域のヌクレオチド配列。ＴＡＴＡ及び
ＴＡＴＡＡＡ配列は実線のアンダーラインで示す。推定
転写停止信号は点線アンダーラインをした。カッコの間
のヌクレオチド配列は逆転反復を示す。３８アミノ酸長
ペプチドをコードするヌクレオチドの配列はボックスの
中に含まれている。 第３図 ｐＦｌ １−３３にクローンされたグリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンの転
写停止／ボリアデニール領域のヌクレオチド配列、ＡＡ
ＴＡＡ配列は実線アンダーラインで示す。推定転写停止
信号は点線アンダーラインをした。 第４図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
へのＥｃｏ ＲＩ （Ｄｄｅ Ｉ）ＧＡＰＤＨプロ
モータ／調節断片の挿入及び生じたプラスミドからのＥ
ｃｏ ＲＩ切断部位の除去の図式的表示。 第５図 プレプロソーマチンをコードするヌクレオチド
配列の上流のもとのＧＡＰＤＨプロモータ／調節領域を
再構成するために使用する合成りＮＡ断片のｍ製に関与
する各段階の表示。 第６図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
への合成りＮＡ断片の導入の図式的表示。 第７図 可能な幹とループ構造を含むＧＡＰＤＨプロモ
ータ／調節領域の構造の図式的表示。推定転写停止信号
は斜線で示す。断片上の３８アミノ酸長ペプチドをコー
ドする配列の位置はＡＴＧ及びＴＡＡコドンで示される
。 第８図 プラスミドＩ）ＭＰ８１の図式的表示。 第９図 ）１ｉｎｄ ｍ及びＳａｔ Ｉによる分解
によりｐＭＰ８１から得られた２ミクロンの複製のＤＮ
Ａ起源とＩ ｅｎ２遺伝子のプレプロソーマチンをコー
ドするプラスミドへの導入の図式的表示。 第１０図 ＢｇＩ Ｉｆによる分解によりｐＥＫ２−
７から得られたＫＡＲＳ−２及びｔｒｐ１遺伝子のプレ
プロソーマチンをコードするプラスミドへの導入の図式
的表示。 第１１図 プラスミドｐＥＫ２−７（レーンａ）、プラ
スミドｐＵＲＫ５２８−０３ （レーンｂ）及びプラス
ミドｐＵＲＫ５２８−３３ （レーンＣ）を含むに、
Ｉａｃｔｉｓ Ｓ Ｄ １１細胞により合成された（３
５８）で標式したソーマチン様タン白質のフロログラム
。酵母形質転換体を３５８−システィンを含む最小培地
中で生育させた。菌体を遠沈により集め、これを１１ｄ
の２．０モル／ｌのソルビトール、０．０２５モル／Ｉ
ＮａＰＯ４（ｐＨ７，５）、１ミリモル／Ｉ Ｅ
ＤＴＡ１１ミリモル／１ １１１ｃｊ！ 、２．５％
β−メルカプトエタノール、１１ＩＦ！Ｊ／Ｉｄザイモ
リアーゼ６０，０００中に再懸濁し、３０分間３０℃に
インキュベートした。スフェロプラストを次いで遠沈し
、２７０μｌＨ２Ｏ，４μ７ １００ミリモル／ＩＰＭ
ＳＦ、８μｍ２５０ミリモル／Ｉ ＥＤＴＡ１４０１１
ａ９％ＮａＣｊ！及び８０μｉ ５×ＰＢＳＴＤＳ （
５０ミリモル／Ｉ Ｎ ａ ＰＯ４（ｐＨ７，２）、
５％Ｔｒｉｔｏｎｘ １００．２．５％デシキシマレー
ト、２．５％５ＤＳ）を加えて溶解させた。ソーマチン
様タン白質の免疫沈澱及び沈澱したタン白質の分析はり
、Ｅｄｅｎｓ等（Ｇｅｎｅｌ ８ 。 １−ａ．１９８２）の記載により行った。
Claims (1)
- （１）ａ）プレプロソーマチン、 ｂ）プレソーマチン、 ｃ）プロソーマチン、 ｄ）ソーマチン、 ｅ）上記ａ）−ｄ）の天然由来の対立型又は変異型ｆ）
生成物の発現および性質に有意に悪影響を及ぼさない上
記ａ）−ｅ）の人工修飾型からなる群から選ばれたソー
マチン様物質の微生物的製造法において、 （ｉ）ａ）プレプロソーマチン、 ｂ）プレソーマチン、 ｃ）プロソーマチン、 ｄ）ソーマチン、 ｅ）上記ａ）−ｄ）の天然由来の対立型又は変異型ｆ）
生成物の発現及び性質に有意に悪影響を及ぼさない上記
ａ）−ｄ）の人工修飾型からなる群から選ばれたソーマ
チン様物質をコードする構造遺伝子、 （ｉｉ）クルイベロマイセス・ラクティス（所謂ＫＡＲ
Ｓ）、および （ｉｉｉ）サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ （ＧＡＰＤＨ）遺伝子由来の酵母レギユロンからなる組
み換えＤＮＡプラスミドを含むクルイベロマイセス属の
酵母を培養しそして得られたソーマチン様物質を採取す
ることを特徴とする、上記方法。
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