JPH0543349B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0543349B2 JPH0543349B2 JP58050184A JP5018483A JPH0543349B2 JP H0543349 B2 JPH0543349 B2 JP H0543349B2 JP 58050184 A JP58050184 A JP 58050184A JP 5018483 A JP5018483 A JP 5018483A JP H0543349 B2 JPH0543349 B2 JP H0543349B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fraction
- medium
- molecular weight
- cells
- royal jelly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、動物細胞または動物細胞由来の細胞
を培養する低タンパク質濃度の培地に関するもの
であり、胎盤血の分子量５−８万の画分を含有す
ることを特徴とする細胞培養用培地に関するもの
である。 動物細胞および動物細胞由来の細胞には、抗
体、インターフエロン、インシユリン、酵素など
の有効物質を産生するものが知られており、その
細胞を培養することによつてこれらの有効物質を
得ることの実施または試みがなされている。従来
よりこれらの細胞を培養するためには、ほとんど
の場合、培地に血清を添加することが必要であ
る。血清としては一般に牛胎児血清、小牛血清な
どが用いられており、添加量は通常10％程度であ
る。しかし、これらの血清は高価であること、品
質が一定しないこと、供給に制限があることなど
の難点がある。 本発明者らは、これらのことを解決すべく研究
を重ねた結果、低タンパク質濃度の培地で細胞増
殖が可能なことを見いだし、本発明を完成したも
のである。 胎盤はヒト、家畜（牛、馬など）からのもので
ある。胎盤血の分子量５−８万の画分（以下胎盤
血画分と略す）は、例えば胎盤から自然にしみ出
た血液を２万×ｇで遠心し、その上清を更にSe
−phadex Ｇ−200（Pharmacia Fine
Chemicals）、Cellulofine GC−700（生化学工業
株式会社）などを用いるゲルろ過法により分子量
分画して得ることができる。そのゲルろ過に用い
る平衡化および溶出用溶液は、例えばリン酸緩衝
化生理食塩水、100ｍＭ Na−Hepes緩衝液（PH
7.4）、水などである。本発明の細胞培養用培地
は、この胎盤血画分を通常の動物細胞の培養に用
いられる基礎培地（血清を含まない）に添加して
用いる。 また、これに乳および／または乳の成分、ロー
ヤルゼリーおよび／またはローヤルゼリーの成分
の中より１種以上を基礎培地に添加して用いるこ
ともできる。 乳の成分は、以下のようにして得る。乳を例え
ば２万×ｇで遠心して溶液画分（以下乳の遠心溶
液画分と略す）を得る。乳の分子量20万以上の画
分および分子量４−９万の画分は、胎盤血の分子
量分画と同様の方法で得ることができる。ラクト
フエリンは例えばLo¨nnerdalらの方法
（Lo¨nnerdal、B.、Carlsson、J.、and Porath、
Ｊ（1977）FEBS Lett.75、89−92）で精製する。 また、ローヤルゼリーの成分は、以下のように
して得る。ローヤルゼリーの分子量20万以上の画
分および分子量５−８万の画分は、胎盤血の分子
量分画と同様の方法で得ることができる。ローヤ
ルゼリーの分子量約58000のタンパク質（以下ロ
ーヤルゼリータンパク質と略す）は、例えば以下
のようにして精製する。ローヤルゼリーをリン酸
緩衝化生理食塩水で２倍に希釈後、それに対し透
析する。透析後、２万×ｇで遠心し、得られる上
清を胎盤血の場合と同様の方法で分子量分画し、
５−８万の分子量画分を得る。この画分を１ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）に透析後、同様の
緩衝液で平衡化しBlue Sepharose（Pharmacia
Fine Chemicals）にかけ、素通り画分すなわち
ローヤルゼリータンパク質を得る。 本発明培地の基礎培地としては、一般の動物細
胞の培養に用いられるものであればいかなるもの
も用いることができる。例えば、Dulbecco′s
Modified Eagle medium（以下D′MEMと略す）、
Ｆ−12、RPMI−1640などの基礎培地、また、こ
れら基礎培地にインシユリン（２−10μｇ／ml）、
セレニウム（10-11−10-8M）、トランスフエリン
（10−35μｇ／ml）、核酸前駆体（例えばチミジ
ン、ヒポキサンチンなど、10-6M程度）、血清ア
ルブミン（50−400μｇ／ml）などを添加した培
地も基礎培地として用いることができる。本発明
の培地に添加する胎盤血画分の最終タンパク質濃
度は50−300μｇ／mlであることが望ましい。そ
の他の乳および乳の成分については0.5−350μ
ｇ／ml、ローヤルゼリーおよびローヤルゼリーの
成分については10−200μｇ／mlが望ましい。 本発明培地は、繊維芽細胞、リンパ芽球細胞な
どの動物細胞の培養に用いることもできるが、リ
ンパ球由来細胞などの動物細胞由来の細胞の培養
に最も好適に用いられる。本発明の培地を用いれ
ば血清を大量に添加した従来の培地にほぼ匹敵す
る細胞増殖を得ることができ、しかも従来の培地
と比べコストダウンが期待できる。また、血清を
10％添加した場合の培地中のタンパク質濃度が３
mg／ml以上であるのに比べ、本発明培地は0.4
mg／ml以下と低タンパク質濃度であることから、
有効物質産生に本発明培地を用いることにより有
効物質の分離・精製が容易となる。更に、本発明
培地は分子量が５−８万の画分を添加することか
ら、有効物質の分子量が５−８万の範囲外の場合
には、有効物質の分離・精製が容易となる。例え
ば抗体（分子量15万以上）を産生する細胞を培養
する場合には、胎盤血画分と、ラクトフエリンお
よび／または乳の分子量４−９万の画分、ローヤ
ルゼリータンパク質および／またはローヤルゼリ
ーの分子量５−８万の画分を必要に応じ加え、用
いるなどのように行う。更に、ヒトの胎盤血画分
と、要すればヒトラクトフエリンなどの人乳成分
および／または人乳を添加した培地でヒトの細胞
を培養する場合には、培地中の成分がすべてヒト
由来であることから、培地中に産生した有効物質
を完全に精製しなくともヒトに投与可能であると
いう利点を有する。 次に実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 健康人の末梢リンパ球株細胞（Bir7）の105個
細胞を、D′MEM／Ｆ−12（１：１）に第１表に
示す添加物を添加した培地２mlに、植え込む。５
％CO2、37℃の条件下で３日間培養を行う。得ら
れた結果は第１表に示すとおりである。
を培養する低タンパク質濃度の培地に関するもの
であり、胎盤血の分子量５−８万の画分を含有す
ることを特徴とする細胞培養用培地に関するもの
である。 動物細胞および動物細胞由来の細胞には、抗
体、インターフエロン、インシユリン、酵素など
の有効物質を産生するものが知られており、その
細胞を培養することによつてこれらの有効物質を
得ることの実施または試みがなされている。従来
よりこれらの細胞を培養するためには、ほとんど
の場合、培地に血清を添加することが必要であ
る。血清としては一般に牛胎児血清、小牛血清な
どが用いられており、添加量は通常10％程度であ
る。しかし、これらの血清は高価であること、品
質が一定しないこと、供給に制限があることなど
の難点がある。 本発明者らは、これらのことを解決すべく研究
を重ねた結果、低タンパク質濃度の培地で細胞増
殖が可能なことを見いだし、本発明を完成したも
のである。 胎盤はヒト、家畜（牛、馬など）からのもので
ある。胎盤血の分子量５−８万の画分（以下胎盤
血画分と略す）は、例えば胎盤から自然にしみ出
た血液を２万×ｇで遠心し、その上清を更にSe
−phadex Ｇ−200（Pharmacia Fine
Chemicals）、Cellulofine GC−700（生化学工業
株式会社）などを用いるゲルろ過法により分子量
分画して得ることができる。そのゲルろ過に用い
る平衡化および溶出用溶液は、例えばリン酸緩衝
化生理食塩水、100ｍＭ Na−Hepes緩衝液（PH
7.4）、水などである。本発明の細胞培養用培地
は、この胎盤血画分を通常の動物細胞の培養に用
いられる基礎培地（血清を含まない）に添加して
用いる。 また、これに乳および／または乳の成分、ロー
ヤルゼリーおよび／またはローヤルゼリーの成分
の中より１種以上を基礎培地に添加して用いるこ
ともできる。 乳の成分は、以下のようにして得る。乳を例え
ば２万×ｇで遠心して溶液画分（以下乳の遠心溶
液画分と略す）を得る。乳の分子量20万以上の画
分および分子量４−９万の画分は、胎盤血の分子
量分画と同様の方法で得ることができる。ラクト
フエリンは例えばLo¨nnerdalらの方法
（Lo¨nnerdal、B.、Carlsson、J.、and Porath、
Ｊ（1977）FEBS Lett.75、89−92）で精製する。 また、ローヤルゼリーの成分は、以下のように
して得る。ローヤルゼリーの分子量20万以上の画
分および分子量５−８万の画分は、胎盤血の分子
量分画と同様の方法で得ることができる。ローヤ
ルゼリーの分子量約58000のタンパク質（以下ロ
ーヤルゼリータンパク質と略す）は、例えば以下
のようにして精製する。ローヤルゼリーをリン酸
緩衝化生理食塩水で２倍に希釈後、それに対し透
析する。透析後、２万×ｇで遠心し、得られる上
清を胎盤血の場合と同様の方法で分子量分画し、
５−８万の分子量画分を得る。この画分を１ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH8.0）に透析後、同様の
緩衝液で平衡化しBlue Sepharose（Pharmacia
Fine Chemicals）にかけ、素通り画分すなわち
ローヤルゼリータンパク質を得る。 本発明培地の基礎培地としては、一般の動物細
胞の培養に用いられるものであればいかなるもの
も用いることができる。例えば、Dulbecco′s
Modified Eagle medium（以下D′MEMと略す）、
Ｆ−12、RPMI−1640などの基礎培地、また、こ
れら基礎培地にインシユリン（２−10μｇ／ml）、
セレニウム（10-11−10-8M）、トランスフエリン
（10−35μｇ／ml）、核酸前駆体（例えばチミジ
ン、ヒポキサンチンなど、10-6M程度）、血清ア
ルブミン（50−400μｇ／ml）などを添加した培
地も基礎培地として用いることができる。本発明
の培地に添加する胎盤血画分の最終タンパク質濃
度は50−300μｇ／mlであることが望ましい。そ
の他の乳および乳の成分については0.5−350μ
ｇ／ml、ローヤルゼリーおよびローヤルゼリーの
成分については10−200μｇ／mlが望ましい。 本発明培地は、繊維芽細胞、リンパ芽球細胞な
どの動物細胞の培養に用いることもできるが、リ
ンパ球由来細胞などの動物細胞由来の細胞の培養
に最も好適に用いられる。本発明の培地を用いれ
ば血清を大量に添加した従来の培地にほぼ匹敵す
る細胞増殖を得ることができ、しかも従来の培地
と比べコストダウンが期待できる。また、血清を
10％添加した場合の培地中のタンパク質濃度が３
mg／ml以上であるのに比べ、本発明培地は0.4
mg／ml以下と低タンパク質濃度であることから、
有効物質産生に本発明培地を用いることにより有
効物質の分離・精製が容易となる。更に、本発明
培地は分子量が５−８万の画分を添加することか
ら、有効物質の分子量が５−８万の範囲外の場合
には、有効物質の分離・精製が容易となる。例え
ば抗体（分子量15万以上）を産生する細胞を培養
する場合には、胎盤血画分と、ラクトフエリンお
よび／または乳の分子量４−９万の画分、ローヤ
ルゼリータンパク質および／またはローヤルゼリ
ーの分子量５−８万の画分を必要に応じ加え、用
いるなどのように行う。更に、ヒトの胎盤血画分
と、要すればヒトラクトフエリンなどの人乳成分
および／または人乳を添加した培地でヒトの細胞
を培養する場合には、培地中の成分がすべてヒト
由来であることから、培地中に産生した有効物質
を完全に精製しなくともヒトに投与可能であると
いう利点を有する。 次に実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 健康人の末梢リンパ球株細胞（Bir7）の105個
細胞を、D′MEM／Ｆ−12（１：１）に第１表に
示す添加物を添加した培地２mlに、植え込む。５
％CO2、37℃の条件下で３日間培養を行う。得ら
れた結果は第１表に示すとおりである。
【表】
なおD′MEM／Ｆ−12に添加物としてヒト胎盤
血画分単独、ヒト胎盤血画分およびラクトフエリ
ン、ヒト胎盤血画分とラクトフエリンおよびロー
ヤルゼリータンパク質の３種をそれぞれ加えた培
地で30日間以上継代培養してもそれぞれの増殖速
度に変化がみられなかつた。このことは永続的に
継代培養することが可能であることを示してい
る。 実施例 ２ マウスのミエローマ（NS−１）とマウスＢ−
リンパ球（BALB／ｃ）が融合して生成したハ
イブリドーマについて植え込みの細胞数を0.5×
105個にへらし、実施例１と同様にして培養を行
う。得られた結果は第２表に示すとおりである。
血画分単独、ヒト胎盤血画分およびラクトフエリ
ン、ヒト胎盤血画分とラクトフエリンおよびロー
ヤルゼリータンパク質の３種をそれぞれ加えた培
地で30日間以上継代培養してもそれぞれの増殖速
度に変化がみられなかつた。このことは永続的に
継代培養することが可能であることを示してい
る。 実施例 ２ マウスのミエローマ（NS−１）とマウスＢ−
リンパ球（BALB／ｃ）が融合して生成したハ
イブリドーマについて植え込みの細胞数を0.5×
105個にへらし、実施例１と同様にして培養を行
う。得られた結果は第２表に示すとおりである。
【表】
％
Claims (1)
- １ 胎盤血の分子量５−８万の画分含有すること
を特徴とする細胞培養用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58050184A JPS59175876A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 細胞培養用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58050184A JPS59175876A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 細胞培養用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175876A JPS59175876A (ja) | 1984-10-04 |
| JPH0543349B2 true JPH0543349B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=12852096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58050184A Granted JPS59175876A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | 細胞培養用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175876A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59166079A (ja) * | 1983-03-14 | 1984-09-19 | Morinaga & Co Ltd | 細胞培養用培地 |
| JPS59173078A (ja) * | 1983-03-22 | 1984-09-29 | Morinaga & Co Ltd | 細胞培養用培地 |
-
1983
- 1983-03-25 JP JP58050184A patent/JPS59175876A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59175876A (ja) | 1984-10-04 |
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