JPH0543477A - ヒト免疫不全ウイルス増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 副作用ないヒト免疫不全ウイルス増殖抑制剤
の提供 【構成】 シコン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉ Ｒａｄｉ
ｘ）の水抽出物を有効成分とするヒト免疫不全ウイルス
増殖抑制剤 【効果】 ヒト免疫不全ウイルス増殖抑制剤の投与によ
り後天性免疫不全症候群（エイズ）の発症を予防あるい
はエイズを治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なヒト免疫不全ウイ
ルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉ−ｃｉｅｎｃ
ｙ ｖｉｒｕｓ，以下ＨＩＶという）増殖抑制剤に関す
る。本発明のＨＩＶ増殖抑制剤によると後天性免疫不全
症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，以下ＡＩＤＳという）の発
症を予防あるいはＡＩＤＳを治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】ＡＩＤＳはウイルスによる感染症であ
り、致死率が高いことから、その治療薬の開発が急がれ
ている。ＡＩＤＳ治療薬および、ＡＩＤＳの原因ウイル
スであるＨＩＶ感染者のＡＩＤＳ発症予防のために用い
られる薬剤はいくつかのものがすでに報告されている。
例えば、アジドチミジン、インターフェロン、グリチル
リチン、硫酸デキストランなどがあげられる。これらは
ＨＩＶの増殖抑制効果のあることが報告されている。と
くにアジドチミジンは、実際にＡＩＤＳ患者の治療に用
いられているが、毒性が強く、ＨＩＶ感染者のＡＩＤＳ
発症予防のために、長期間利用するには問題がある。こ
のため、より低毒性で、なおかつ抗ＨＩＶ作用をもつ薬
剤の開発が急務となっている。このために、合成した化
学物質、天然物質あるいは漢方薬についてＨＩＶ増殖抑
制効果が検討されている。特に、漢方薬については、投
与による副作用が少ないことから検討が進められてい
る。漢方薬として小柴胡湯、人参湯を臨床に用いた報告
もあるが、その有効性が評価されるに至っていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな現状下にあって、副作用がなく、抗ＨＩＶ作用をも
つ生薬成分を見出すべく、多数の生薬を用いて探索を行
なった。すなわち、本発明の課題は、抗ＨＩＶ作用が強
く、投与しても副作用がない生薬成分を見出し、これを
有効成分とするＨＩＶ増殖抑制剤を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を達
成するために、次に示される生薬４８試料（水抽出試料
３３、粉末のままの試料１５）の粉末あるいは水抽出物
を用いてＨＩＶ増殖抑制スクリーニング試験を行った。
その結果、シコン（ＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉＲａｄｉ
ｘ）の水抽出にのみ強いＨＩＶ増殖抑制作用があること
を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、シコン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉ Ｒａｄｉｘ）
の水抽出物を有効成分とするＨＩＶ抑制剤に関する。

【０００５】本発明者らのＨＩＶ増殖抑制スクリーニン
グに供した生薬試料は、次の生薬試料４８種類である。
水抽出物として用いた生薬；シコン、オウギ、クコシ、
ボウイ、ゴミシ、モクテンリョウ、ボウフウ、サイシ
ン、ジオウ、ブクリョウ、トチュウ、サイコ、バクモン
トウ、トウキ、タイソウ、ボタンピ、マオウ、テンモン
トウ、タンジン、ケイヒ、イカリソウ、ビャクゴウ、ト
ウジン、キンギンカ、カシ、カシュウ、サンヤク、サン
シュユ、ゴバイシ、ビャクジュツ、インチンコウ、レン
ギョウ、セイタカアワダチソウ。粉末のまま実験に供し
た生薬；ホコツシ、クセキ、ジョテイシ、バンランコ
ン、ソウキセイ、ヤクチニン、ギョクチク、レンジ、ジ
ュクジオウ、カンジュウ、ソウハクヒ、コロハ、バッカ
ツ、ウバイ、シャジン。

【０００６】その結果、シコンの水抽出物にのみＨＩＶ
の増殖を抑制する作用があることを見出した。シコン
（紫根Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉ Ｒａｄｉｘ）は、ムラ
サキ科のムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍａｍ ｅｒｙ
ｔｈｒｏｈｉｚｏｎ Ｓｉｅｂｏｌｄｅｔ Ｚｕｃｃａ
ｒｉｎｉ）の根を乾燥したものであって、シコニン、デ
オキシシコニン、アンヒドロシコニン等のナフトキノン
誘導体、ボメシトール、多糖類等を含有し、解熱、解毒
薬あるいは外用軟膏として用いられている。

【０００７】本発明で使用する水抽出物は、シコン生薬
粉末１重量部に対し水（冷水、温水あるいは熱湯）５〜
２０重量部を使用し、数時間〜数日間５〜１００℃で抽
出を行なって得られる抽出物を使用する。この抽出に水
性溶媒のメタノール、エタノールあるいはそれと水との
混液あるいはヘキサン等の脂溶性溶媒を使用してもＨＩ
Ｖ増殖抑制効果を得ることができなかった。

【０００８】得られた水抽出物は、これを凍結乾燥ある
いは噴霧乾燥等の乾燥手段を施して粉末としてもよい。
また、水抽出物を精製して用いてもよい。精製手段とし
ては、水抽出物にメタノール等の水溶性アルコールを添
加して生ずる沈澱等の不溶物を除去し、この残留液を乾
燥して粉末とする方法を例示することができる。本発明
では、このような抽出液、乾燥粉末を抽出物という。

【０００９】このようにして得られた抽出物を、後述す
るようなＨＩＶ増殖抑制スクリーニング試験、ＭＴ−４
細胞におけるＨＩＶ増殖抑制試験あるいは巨細胞形成抑
制試験等を行なったところ、他の生薬４７種にはＨＩＶ
増殖抑制作用がなく、このシコン抽出物だけがＨＩＶ増
殖抑制作用を示した。

【００１０】本発明ではシコン水抽出物を、経口剤、経
皮吸収剤、経鼻剤あるいは注射剤として投与することが
できる。経口剤は、シコン水抽出物と界面活性剤、賦形
剤、滑沢剤、佐剤等製剤成分として通常知られているも
のと混合し成形を行なって、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプ
セル剤、ドリンク剤等として用いることができる。ま
た、経皮吸収剤、経鼻剤も、これらの製剤を調製すると
きの通常知られている成分と混合し、通常の方法で経皮
吸収剤あるいは経鼻剤とすることができる。さらに、注
射剤は、蒸留水あるいは生理食塩水にシコン抽出物を溶
解し、これをアンプルに充填し、皮下、筋注、動注、静
注等として用いることができる。

【００１１】投与量は、使用目的、患者の症状、性別、
年令等によって異なるがＡＩＤＳの予防を目的とするさ
いは成人男子で乾燥物として１日０．０１〜０．１ｇ／
体重Ｋｇを、また治療を目的とするさいは０．０１〜
０．３ｇ／体重Ｋｇを１日２〜３回に分けて投与すると
よい。シコンは、従来、生薬として長期間使用されてお
り、現在までその毒性、特に急性毒性は報告されておら
ず、急性毒性は存在しない。また、従来、シコンは、解
毒、解熱剤あるいは外用軟膏として用いられているが、
本発明ではシコンの水抽出物を用い、その結果投与量が
多量である点で、従来の解毒解熱剤や外用軟膏とは適用
範囲を異にする。

【００１２】

【実施例】次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明す
る。なお、本発明の実施例においては、試験に供したシ
コン以外の生薬についても比較のために記載した。

【００１３】〔実施例１〕 水抽出物の調製 シコン及びその他の実験に供したその他の上記に生薬３
３試料について次の方法で抽出を行なった。また、他の
生薬については粉末として使用した。 （１） 冷水抽出 生薬末２５ｇに水２００ｍｌを加
え、振盪し、５℃で腐敗しないように２日間放置し、ガ
ーゼで漉したのち濾液を遠心分離し、その後上澄液を凍
結乾燥し試料とした。 （２） 熱水抽出 生薬末５０ｇに水５００ｍｌを加え
振盪し、弱火で約２時間加熱したのち、ガーゼで漉し、
濾液を４０〜５０℃で約１００ｍｌになるまで減圧濃縮
した。これを１０倍容量のメタノール中に加え、生ずる
沈澱を遠心分離し、７０〜８０℃、減圧下でメタノール
を留去した。残留物に、水５０ｍｌを加え、減圧下で約
１０分間加温して溶解したのち、遠心分離し、上澄液を
採取した。残留物に水少量を加え、同様の操作で得られ
た上澄を合わせ、凍結乾燥し試料とした。なお、生薬シ
コンの熱水抽出物をＡ−１、冷水抽出物をＡ−２と表示
した。

【００１４】使用した生薬の抽出率について表１に示
す。

【表１】

【００１５】〔実施例２〕 ＨＩＶ増殖抑制試験 Ａ．ＨＩＶ増殖抑制効果として次に示す（１）ＨＩＶ増
殖抑制スクリーニング試験、（２）ＭＴ−４細胞におけ
るＨＩＶ増殖抑制試験及び（３）巨細胞形成抑制試験を
行なった。 （１）ＨＩＶ増殖抑制スクリーニング試験 薬剤による抗ＨＩＶ増殖抑制効果をみるためのスクリー
ニング試験としてつぎのような方法で実験を行った。成
人Ｔ細胞性白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ，ＡＴＬＶ）
に持続感染している細胞系であるＭＴ−４細胞にＨＩＶ
を感染させると、４〜６日間の間に急速にＨＩＶが増殖
して、ＭＴ−４細胞は死滅することが報告されている。
この現象を利用して生薬のＨＩＶ増殖抑制作用を測定し
た。ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１株）を０．００１ＴＣＩＤ
₅₀／ｃｅｌｌ（ウイルス感染価：細胞１０００個あた
り、１個の感染性ＨＩＶ−１粒子を感染させた。）の割
合でＭＴ−４細胞に１時間感染させたのち、後述の培養
液を用いて１回洗浄した。このＨＩＶ−１感染ＭＴ−４
細胞を段階希釈した生薬抽出物を含むＲＰＭＩ−１０４
０培養液（１０％の牛胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／
ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含む）に
１×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で浮遊させ、５日間
９６穴の平底培養プレートにて１ウェルあたり２００μ
ｌ量で１ウェルずつ培養した。培養後、鏡検によりＨＩ
Ｖ−１感染によるＭＴ−４細胞のＣＰＥ（Ｃｙｌｏｐａ
ｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ；細胞変性効果）の有無を観察
した。

【００１６】（２）ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ増殖抑
制試験 スクリーニング試験で、細胞毒性を示さない濃度におい
て、ＣＰＥの抑制が見られた物質について、次のような
試験を行った。ＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１株）を０．００
１ ＴＩＣＤ₅₀／ｃｅｌｌの割合で、１時間感染させた
のち、洗浄した。このＨＩＶ−１感染ＭＴ−４細胞と非
感染ＭＴ−４細胞を種々の濃度で浮遊させ、５日間２４
穴の平底培養プレートにて、１ウェル当り１ｍｌの量で
培養した。培養後、トリパンブルー染色法により、生細
胞数をカウントした。

【００１７】（３）巨細胞形成抑制試験 ＨＩＶ感染細胞の周囲に非感染細胞が結合し、巨細胞が
形成されるが、この現象を利用して、薬剤のＨＩＶのエ
ンベロープ蛋白とＨｅｌｐｅｒ−Ｔ細胞表面上のＨＩＶ
レセプター（ＣＤ４分子）との結合を阻止する能力を測
定することができる。Ｍｏｌｔ−４細胞とＨＩＶ−１
（ＨＴＬＶ−III 株) に持続感染しているＭｏｌｔ−４
細胞を１：１の割合で混合し（細胞濃度５×１０⁵ ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ）、種々の濃度の薬剤と共に２４穴の平底
培養プレートにて２２時間培養した。形成される巨細胞
の有無を鏡検にて観察した。

【００１８】Ｂ．試験結果 （１）ＨＩＶ増殖抑制スクリーニング試験 表１に示した３２種類の生薬抽出物および１５種類の生
薬末について抗ＨＩＶ作用のスクリーニング試験を行っ
たところ、Ａ−１とＡ−２の２種類において、ＣＰＥの
抑制がみられた。

【００１９】（２）ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ増殖抑
制試験 Ａ−１およびＡ−２の、ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ増
殖抑制試験の結果を図１および図２に示した。Ａ−１に
ついて、図１で、生薬抽出物０μｇ／ｍｌの場合、ＨＩ
Ｖ−１非感染細胞では、９×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌま
でＭＴ−４細胞は増殖しているが、ＨＩＶ−１を感染さ
せたＭＴ−４細胞では、ＨＩＶ−１感染によって増殖が
抑制され、生細胞濃度は７×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで
あった。２５０μｇ／ｍｌ以上の濃度では、非感染細胞
の増殖抑制が示された。１２５μｇ／ｍｌにおけるＨＩ
Ｖ−１感染ＭＴ−４細胞濃度は、非感染ＭＴ−４細胞の
場合の７７％であり、ＨＩＶ−１の増殖が抑制されてい
た。２５０μｇ／ｍｌ以上でも、ＨＩＶ−１の増殖抑制
は顕著であるが、やや毒性がみられた。Ａ−２について
は、図２に示すように、２５０μｇ／ｍｌでＨＩＶ−１
の増殖を完全に抑制していた。１２５μｇ／ｍｌでも、
ほぼ５０％の抑制が認められた。この物質においては、
５００μｇ／ｍｌ以上で毒性が現れた。

【００２０】（３）巨細胞形成抑制試験 表２に示すとおり、Ａ−１、Ａ−２共に２５０μｇ／ｍ
ｌでＭｏｌｔ−４細胞と、ＨＩＶ−１感染Ｍｏｌｔ−４
細胞を混合培養した場合に認められる巨細胞形成を阻止
た。

【００２１】

【表２】 巨細胞形成抑制試験 ─────────────┬─────────────── 抽出物濃度（μｇ／ｍｌ）│ Ａ−１ Ａ−２ ─────────────┼─────────────── １０００ │ − − ５００ │ − − ２５０ │ ± − １２５ │ ＋ ＋ ６２．５ │ ++ ++ ０ │ ++ ++ ─────────────┴─────────────── −：巨細胞形成は認められず、＋：巨細胞細胞形成が認められた。

【００２２】Ｃ．考察 成人Ｔ細胞性白血病ウイルス（ＡＴＬＶ−１）に持続感
染しているＴ−ｃｅｌｌ株であるＭＴ−４細胞は少数の
ＨＩＶ粒子（１０００個の細胞当り１個のＨＩＶ粒子）
を感染させることにより、急速に感染が広がり、４日な
いし６日間でほとんどすべての細胞が死滅する。この性
質を利用して、薬剤の抗ＨＩＶ効果を判定する方法が開
発されている。この実験系は、ＨＩＶの細胞への吸着、
増殖の過程を抑制する作用を総合的に判断できる簡便な
方法であると思われる。今までに、いくつかの抗ＨＩＶ
作用を持った薬剤がこの方法で発見されている。今回、
生薬の抽出物Ａ−１とＡ−２が、ＭＴ−４細胞における
ＨＩＶ−１増殖を抑制することを見い出した。熱水抽出
であるＡ−１は、１２５μｇ／ｍｌ、冷水抽出であるＡ
−２は２５０μｇ／ｍｌでほぼ完全にＨＩＶ−１の増殖
を抑制した。またＨＩＶと細胞側のレセプターであるＣ
Ｄ４分子との結合を反映していると思われる巨細胞形成
において、Ａ−１、Ａ−２は、共に２５０μｇ／ｍｌで
抑制した。このことから、Ａ−１、Ａ−２のＨＩＶ抑制
作用は、ＨＩＶの細胞への結合を抑制することによって
生じている可能性が高い。なお、Ａ−１、Ａ−２の作用
を比較してみると、ＭＴ−４細胞におけるＣＰＥ抑制テ
ストでは、Ａ−１の方がやや抑制効果が高く、毒性も、
Ａ−２よりやや高い傾向がみられた。しかしながら、さ
れらは大差なく、薬理作用の本質はそれほど差はないも
のと考えられる。

【００２３】生薬由来の抗ＨＩＶ剤としては、グリチル
リチン（以下ＧＬと記す）が知られているが、抗ＨＩＶ
作用を示した濃度についてＡ−１及びＡ−２と比較して
みると、ＧＬが５００μｇ／ｍｌで作用が発現したのに
対し、Ａ−２は１２５μｇ／ｍｌ、Ａ−１は２５０μｇ
／ｍｌであり、その作用はＧＬよりも強かった。しか
も、Ａは、単一の物質である可能性が少なく、多種の物
質の混合体であると考えられるので、より抗ＨＩＶ作用
の強い物質が、生薬Ａの単離精製により同定される可能
性は高い。

【００２４】シコン水抽出物の示した抗ＨＩＶ作用のメ
カニズムに関しては、今回の実験からだけでは明らかで
はないが、Ｍｏｌｔ−４細胞と、ＨＩＶ感染のＭｏｌｔ
−４細胞を混合したときにみられる巨細胞形成を抑制し
たことから、ＨＩＶの細胞への吸着を阻害するために生
じているであろうと思われる。ＧＬの抗ＨＩＶ作用の機
序の主なものは、プロティンキナーゼＣの抑制と考えら
れていることから、シコン水抽出物の作用機序は、ＧＬ
と異なるものと考えられる。

【００２５】一般に、生薬は副作用が強くなく、長期間
の投与に適していると考えられている。本実施例の成績
から、シコン水抽出物の毒性は低いものと考えられ、免
疫賦活作用があることも考慮して、ＡＩＤＳ患者の治療
はもとより、無症状ＨＩＶ感染者（ウイルスキャリア
ー）のＡＩＤＳ発症予防にも利用できる。

【００２６】〔実施例３〕 製剤 （１）実施例１（１）で得られる凍結乾燥粉末０．６ｇ
に、コーンスターチ０．２ｇ及び乳糖０．２ｇを添加し
混練し、顆粒を製造した。この顆粒は経口的に投与する
ことができる。

【００２７】（２）実施例１（２）で得られた凍結乾燥
粉末０．５ｇに滅菌生理食塩１００ｍｌを加えて溶解
し、アンプルに５ｍｌ充填し、密封殺菌を行なって静注
剤を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】シコン熱水抽出物（Ａ−１）のＨＩＶ増殖抑制
効果を示す。

【図２】シコン冷水抽出物（Ａ−２）のＨＩＶ増殖抑制
効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山崎 勝弘 大阪府堺市鳳西町１−54−98 ハイネス鳳 403号 (72)発明者 阿部 慎一郎 埼玉県戸田市新曽南三丁目17番35号 日本 鉱業株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シコン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｉ Ｒａ
   ｄｉｘ）の水抽出物を有効成分とするヒト免疫不全ウイ
   ルス増殖抑制剤。
2. 【請求項２】 水抽出物が冷水抽出物である請求項１記
   載のヒト免疫不全ウイルス増殖抑制剤。
3. 【請求項３】 水抽出物が熱水抽出であって、それから
   メタノールを加えることによって生ずる沈澱を除去され
   た残留物である請求項１記載のヒト免疫不全ウイルス増
   殖抑制剤。