JPH0545233B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0545233B2 JPH0545233B2 JP21904085A JP21904085A JPH0545233B2 JP H0545233 B2 JPH0545233 B2 JP H0545233B2 JP 21904085 A JP21904085 A JP 21904085A JP 21904085 A JP21904085 A JP 21904085A JP H0545233 B2 JPH0545233 B2 JP H0545233B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- maltose
- glucose
- specificity
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は例えば臨床検査において血清のリパー
ゼ活性値、アミラーゼ活性値などを測定する場合
に共役酵素として使用しうるモノ、オリゴサツカ
ライドデヒドロゲナーゼに関するものである。
ゼ活性値、アミラーゼ活性値などを測定する場合
に共役酵素として使用しうるモノ、オリゴサツカ
ライドデヒドロゲナーゼに関するものである。
糖に作用するデヒドロゲナーゼとしては、例え
ばNAD+及びNADP+を電子受容体とするグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（King.T.E.、Meth.
Enzymol.、vol.9、p98（1966））、NAD+及び
NADP+を電子受容体とするマルトースデヒドロ
ゲナーゼ（Y.Kobayahi and K.Horikoshi、
Agric、Biol.Chem.、vol.44、p41（1980））、フエ
リサイアナイドを電子受容体とするグリコースデ
ヒドロゲナーゼ（M.Ameyama、E.Shinagawa、
K.Matushita and O.Odachi、Agric.Biol.
Chem.、vol.45、p851（1981））など数多くのもの
が知られている。
ばNAD+及びNADP+を電子受容体とするグルコ
ースデヒドロゲナーゼ（King.T.E.、Meth.
Enzymol.、vol.9、p98（1966））、NAD+及び
NADP+を電子受容体とするマルトースデヒドロ
ゲナーゼ（Y.Kobayahi and K.Horikoshi、
Agric、Biol.Chem.、vol.44、p41（1980））、フエ
リサイアナイドを電子受容体とするグリコースデ
ヒドロゲナーゼ（M.Ameyama、E.Shinagawa、
K.Matushita and O.Odachi、Agric.Biol.
Chem.、vol.45、p851（1981））など数多くのもの
が知られている。
一方、最近フエナジンメトサルフエートを電子
受容体としてマルトース、Ｄ−グルコース、マル
トトリオース、マルトペンタオースなどの基質に
作用する新規なモノ、オリゴサツカライドデヒド
ロゲナーゼをスタフイロコツカス属の微生物が産
生しうることも報告された（特開昭60−114193号
公報）。
受容体としてマルトース、Ｄ−グルコース、マル
トトリオース、マルトペンタオースなどの基質に
作用する新規なモノ、オリゴサツカライドデヒド
ロゲナーゼをスタフイロコツカス属の微生物が産
生しうることも報告された（特開昭60−114193号
公報）。
〔発明が解決しようとする問題点〕
グルコースオキシダーゼやマルトースオキシダ
ーゼを使つた臨床分析においては、他の分析法と
同様に、より一層検出感度を高めることが望まれ
ていた。
ーゼを使つた臨床分析においては、他の分析法と
同様に、より一層検出感度を高めることが望まれ
ていた。
また、アミラーゼの分解生成物にはグルコース
に加えて各種のオリゴサツカライドが含まれてい
ることから、各種アミラーゼの分析あるいは解析
のためにこれらを測定できる手段をより多く開発
することが望まれていた。
に加えて各種のオリゴサツカライドが含まれてい
ることから、各種アミラーゼの分析あるいは解析
のためにこれらを測定できる手段をより多く開発
することが望まれていた。
本発明者によりすぐれた新規なグルコースオキ
シダーゼやマルトースオキシダーゼを開発するべ
く鋭意検討の結果、土壌から分離した一微生物が
数々の優れた特性を有するモノ、オリゴサツカラ
イドデヒドロゲナーゼを産生することを見出し、
この酵素を用いることによつて前記問題点を解決
しうることを知つて本発明を完成することができ
た。
シダーゼやマルトースオキシダーゼを開発するべ
く鋭意検討の結果、土壌から分離した一微生物が
数々の優れた特性を有するモノ、オリゴサツカラ
イドデヒドロゲナーゼを産生することを見出し、
この酵素を用いることによつて前記問題点を解決
しうることを知つて本発明を完成することができ
た。
次に実施例で得られた本発明の酵素の理化学的
性質を示す。
性質を示す。
(1) 作用
本発明の酵素はフエナジンメトサルフエート
を電子受容体としてマルトース、Ｄ−グルコー
スを含む各種の単糖類、少糖類に作用し、脱水
素反応を行なう。
を電子受容体としてマルトース、Ｄ−グルコー
スを含む各種の単糖類、少糖類に作用し、脱水
素反応を行なう。
(2) 基質特異性
マルトースの代わりに下表の基質を用い、後
述する活性測定法に従つて測定を行なつたとこ
ろ次のような結果が得られた。基質 相対活性（％） マルトース 100 Ｄ−グルコース 100 Ｄ−ガラクトース 95 Ｄ−キシロース 94 Ｄ−マンノーマ 100 Ｄ−ソルビトール ０ Ｄ−フルクトース ０ Ｄ−グリセロール ０ マルトトリオース 29 マルトペンタオース 24 (3) 電子受容体に体する特異性 フエナジンメトサルフエート（PMS）の代
わりに下表の電子受容体を用い、後述する活性
測定法に従つて測定を行なつたところ次のよう
な結果が得られた。電子受容体 相対活性（％） PMS 100 NAD ０ NADP ０ NTB* ０ フエリサイアナイド ０ ＊ニトロブルーテトラゾリウム (4) 至適PH及び安定PH範囲 本酵素の至適PHは第１図に示すようにPH6.5
付近にある。同図において、PH４〜５は0.1M
酢酸緩衝液（三角）を、PH5.5〜８は0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（黒丸）をそしてPH７〜９
は0.1Mトリス−塩酸緩衝液（白丸）を用いて
測定を行なつた。
述する活性測定法に従つて測定を行なつたとこ
ろ次のような結果が得られた。基質 相対活性（％） マルトース 100 Ｄ−グルコース 100 Ｄ−ガラクトース 95 Ｄ−キシロース 94 Ｄ−マンノーマ 100 Ｄ−ソルビトール ０ Ｄ−フルクトース ０ Ｄ−グリセロール ０ マルトトリオース 29 マルトペンタオース 24 (3) 電子受容体に体する特異性 フエナジンメトサルフエート（PMS）の代
わりに下表の電子受容体を用い、後述する活性
測定法に従つて測定を行なつたところ次のよう
な結果が得られた。電子受容体 相対活性（％） PMS 100 NAD ０ NADP ０ NTB* ０ フエリサイアナイド ０ ＊ニトロブルーテトラゾリウム (4) 至適PH及び安定PH範囲 本酵素の至適PHは第１図に示すようにPH6.5
付近にある。同図において、PH４〜５は0.1M
酢酸緩衝液（三角）を、PH5.5〜８は0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（黒丸）をそしてPH７〜９
は0.1Mトリス−塩酸緩衝液（白丸）を用いて
測定を行なつた。
本酵素は第２図に示すようにPH５〜８におい
て、特にPH６〜７において安定である。測定に
用いた緩衝液は第１図の場合と同じであり、各
緩衝液中で37℃１時間処理した後の残存活性を
測定して求めた。
て、特にPH６〜７において安定である。測定に
用いた緩衝液は第１図の場合と同じであり、各
緩衝液中で37℃１時間処理した後の残存活性を
測定して求めた。
(5) 活性測定法
0.08μｍolフエナジンメトサルフエート、
0.3μｍolニトロブル−テトラゾリウム、0.2％ト
リトンＸ−100、0.1molマルトースを含む
20μmolリン酸ナトリウム緩衝液（PH6.5）１ml
に酸素液10μlを加え、37℃で10分間反応させ
る。0.1M塩酸１mlを加えて反応を停止させ、
530nｍにおける吸光度を測定して酵素活性を
求める。１分間に1μmolのニトロブルーテトラ
ゾリウムを還元する酵素量を２単位とする。
0.3μｍolニトロブル−テトラゾリウム、0.2％ト
リトンＸ−100、0.1molマルトースを含む
20μmolリン酸ナトリウム緩衝液（PH6.5）１ml
に酸素液10μlを加え、37℃で10分間反応させ
る。0.1M塩酸１mlを加えて反応を停止させ、
530nｍにおける吸光度を測定して酵素活性を
求める。１分間に1μmolのニトロブルーテトラ
ゾリウムを還元する酵素量を２単位とする。
(6) 分子量
ゲル過法により求めた分子量は約80000で
あつた。
あつた。
(7) 等電点
本酵素の等電点はPH4.4にある。
このような本酵素の理化学的性質を本酵素に最
も近い特開昭60−114193号公報記載の酵素と比較
すると、まず基質特異性ではこの酵素はフルクト
ースに作用するのに対し本酵素は作用しない点で
相違する。そのほか、この酵素は至適PHが7.0〜
8.0、安定PH範囲が7.5〜8.5、そして等電点がPH
9.5にあるのに対し、本酵素は至適PHが6.5、安定
PH範囲が５〜８、そして等電点がPH4.4である点
でも相違している。そこで、本酵素を新規酵素で
あると認定するに至つた。
も近い特開昭60−114193号公報記載の酵素と比較
すると、まず基質特異性ではこの酵素はフルクト
ースに作用するのに対し本酵素は作用しない点で
相違する。そのほか、この酵素は至適PHが7.0〜
8.0、安定PH範囲が7.5〜8.5、そして等電点がPH
9.5にあるのに対し、本酵素は至適PHが6.5、安定
PH範囲が５〜８、そして等電点がPH4.4である点
でも相違している。そこで、本酵素を新規酵素で
あると認定するに至つた。
このような本酵素は土壌から分離されたセラチ
ア・マルセツセンス（Serratia marcescens）No.
C886−２（FERM Ｐ−8370）から産生、取得す
ることができる。
ア・マルセツセンス（Serratia marcescens）No.
C886−２（FERM Ｐ−8370）から産生、取得す
ることができる。
セラチア・マルセツセンスNo.C886−２の蘭学
的性質を次に示す。
的性質を次に示す。
(a) 形態
細胞の形および大きさ、悍菌（0.8〜1.0×
1.3〜1.5μｍ） 細胞の多形性……なし 運動性の有無……有り 胞子の有無……なし ブラム染色性……陰性 (b) 各種培地での生育 肉汁寒天平板……コロニーは平板状で大き
さは直径2.0〜0.2mm全縁、表面は光沢があ
り、赤色色素産生、 肉汁寒天斜面……線状によく生育し、全縁
光沢がある凝縮水中でもよく生育する。
1.3〜1.5μｍ） 細胞の多形性……なし 運動性の有無……有り 胞子の有無……なし ブラム染色性……陰性 (b) 各種培地での生育 肉汁寒天平板……コロニーは平板状で大き
さは直径2.0〜0.2mm全縁、表面は光沢があ
り、赤色色素産生、 肉汁寒天斜面……線状によく生育し、全縁
光沢がある凝縮水中でもよく生育する。
肉汁ブイヨン……均一に混濁し被膜を形成
する沈渣を生ずる。
する沈渣を生ずる。
肉汁ゼラチン穿刺培養……上・中層部で良
く生育する。液化する。
く生育する。液化する。
リトマスミルク……凝固、ペプトン化す
る。
る。
(c) 生理学的性質
硝酸塩の還元……陽性
MRテスト……陰性
VPテスト……陽性
インドールの生成……陰性
硫化水素の生成……陰性
クエン酸の利用……陽性
色素産生……赤色色素産生
ウレアーゼ……陰性
オキシダーゼ……陰性
カタラーゼ……陽性
42℃での生育……生育
酸素に対する態度……好気的
OFテスト……醗酵的
ガスの生産（グルコース）……陰性
糖からの酸の産生
グルコース、ガラクトース、キンロース、マ
ンノース、アラビノース、フルクトース、から
酸を産生する。
ンノース、アラビノース、フルクトース、から
酸を産生する。
グリセロース、マルトース、トレパース、シユ
ークロース、イノシトール、マンニトール、ラフ
トース、ソルビトール、フルクトース、から酸を
産生しない。
ークロース、イノシトール、マンニトール、ラフ
トース、ソルビトール、フルクトース、から酸を
産生しない。
セラチア・マルセツセンスNo.C886−２の培養
方法はセラチア属の微生物を培養する常法によれ
ばよく、グルコース、マルトース、シユクロー
ス、グリセロールなどの炭素源、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの
窒素源、リン酸１カリ、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウムなどの無機塩類を含み、さらに酵母エ
キス、肉エキス、ペプトン、大豆蛋白加水分解物
等の有機栄養物などを適宜加えた培地に培養すれ
ばよい。培養温度は20〜35℃程度、PHは５〜８程
度でよく、20〜48時間程度通気撹拌培養すること
により、本酵素を主に菌体内に生成蓄積する。
方法はセラチア属の微生物を培養する常法によれ
ばよく、グルコース、マルトース、シユクロー
ス、グリセロールなどの炭素源、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの
窒素源、リン酸１カリ、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウムなどの無機塩類を含み、さらに酵母エ
キス、肉エキス、ペプトン、大豆蛋白加水分解物
等の有機栄養物などを適宜加えた培地に培養すれ
ばよい。培養温度は20〜35℃程度、PHは５〜８程
度でよく、20〜48時間程度通気撹拌培養すること
により、本酵素を主に菌体内に生成蓄積する。
培養物からの本酵素の分離精製方法も一般の菌
体内酵素を分離精製する一般的方法に準じて行な
えばよい。例えば、培養物から遠心法あるいは
過法により菌体を集めて、これを破壊する。菌体
の破壊方法にはダイノーミルなどによつて磨砕す
る方法、超音波を利用する方法などの物理的方法
あるいは酸素消化法、自己消化法、その他の化学
的方法が適宜利用される。菌体破壊後は遠心法な
どにより菌体残渣を除いて酵素抽出液を得、イオ
ン交換クロマトグラフイー、アフイニテイークロ
マトグラフイー、硫安塩析、遠心密度勾配法、ゲ
ル過、透析などを必要により適宜組み合わせて
精製すればよい。
体内酵素を分離精製する一般的方法に準じて行な
えばよい。例えば、培養物から遠心法あるいは
過法により菌体を集めて、これを破壊する。菌体
の破壊方法にはダイノーミルなどによつて磨砕す
る方法、超音波を利用する方法などの物理的方法
あるいは酸素消化法、自己消化法、その他の化学
的方法が適宜利用される。菌体破壊後は遠心法な
どにより菌体残渣を除いて酵素抽出液を得、イオ
ン交換クロマトグラフイー、アフイニテイークロ
マトグラフイー、硫安塩析、遠心密度勾配法、ゲ
ル過、透析などを必要により適宜組み合わせて
精製すればよい。
１％グルコース、0.2％硝酸ナトリウム、0.2％
酵母エキス、0.1％リン酸二カリウム、0.05％塩
化ナトリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.4％
炭酸カルシウム（PH7.0）より成る培地30を90
容ジヤーフアーメンタに入れ、120℃で20分間
滅菌した。冷却後Serratia marcescensNo.C886−
２（FERMP−8370）を接種し、28℃で20時間通
気撹拌培養を行なつた。
酵母エキス、0.1％リン酸二カリウム、0.05％塩
化ナトリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.4％
炭酸カルシウム（PH7.0）より成る培地30を90
容ジヤーフアーメンタに入れ、120℃で20分間
滅菌した。冷却後Serratia marcescensNo.C886−
２（FERMP−8370）を接種し、28℃で20時間通
気撹拌培養を行なつた。
その間の通気量は、0.5v.v.m.とし、撹拌羽根
の回転数は300rpmとした。培養終了後、培養液
を遠心して約500ｇの湿菌体を得た。この菌体を
10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）２ｇに
懸濁し、ダイノーミル（KDL型）を用いて
3000rpm流量30ml／mmで菌体を破砕した。遠心し
て菌体残渣を除き、酵素抽出液２を得た。この
酵素抽出液に１％になるようにトリトンＸ−100
を加え、６℃で２時間撹拌した後、10ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液で平衡化した。ジエチルアミノ
エチルセルロースカラムを通過させて不純タンパ
ク質を吸着させ、本酵素を素通り画分より、収率
80％で取得した。
の回転数は300rpmとした。培養終了後、培養液
を遠心して約500ｇの湿菌体を得た。この菌体を
10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）２ｇに
懸濁し、ダイノーミル（KDL型）を用いて
3000rpm流量30ml／mmで菌体を破砕した。遠心し
て菌体残渣を除き、酵素抽出液２を得た。この
酵素抽出液に１％になるようにトリトンＸ−100
を加え、６℃で２時間撹拌した後、10ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液で平衡化した。ジエチルアミノ
エチルセルロースカラムを通過させて不純タンパ
ク質を吸着させ、本酵素を素通り画分より、収率
80％で取得した。
本発明の酵素によりマルトース、グルコース等
との反応の発色濃度をモル吸光係数で約２倍に高
めることができ、これらの糖の検出感度を向上さ
せることができる。従つて、これらの糖を生成さ
せる反応を利用した各種の化合物、例えばリパー
ゼとかアミラーゼ活性を測定する方法の検出感度
をもそれにより向上させることができることはい
うまでもない。また、電子受容体にNADHや
NADPHを用いた場合と異なり発色域が可視部
になるところから、分光光度計に安価なものを使
用することができ、各所で簡便に測定を行なうこ
とができる。酵素の至適PHが６〜７であるところ
から臨床検査試料を最も好ましいPH域で安定して
測定を行なうことができる。また、多種の単糖
類、少糖類に作用するところからアミラーゼ活性
をより正確に評価できるなど新しい利用が可能で
ある。
との反応の発色濃度をモル吸光係数で約２倍に高
めることができ、これらの糖の検出感度を向上さ
せることができる。従つて、これらの糖を生成さ
せる反応を利用した各種の化合物、例えばリパー
ゼとかアミラーゼ活性を測定する方法の検出感度
をもそれにより向上させることができることはい
うまでもない。また、電子受容体にNADHや
NADPHを用いた場合と異なり発色域が可視部
になるところから、分光光度計に安価なものを使
用することができ、各所で簡便に測定を行なうこ
とができる。酵素の至適PHが６〜７であるところ
から臨床検査試料を最も好ましいPH域で安定して
測定を行なうことができる。また、多種の単糖
類、少糖類に作用するところからアミラーゼ活性
をより正確に評価できるなど新しい利用が可能で
ある。
第１図は本発明の酵素の至適PHを示す曲線を図
示したものであり、第２図はPH安定性を示す曲線
を図示したものである。
示したものであり、第２図はPH安定性を示す曲線
を図示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するモノ、オリゴサ
ツカライドデヒドロゲナーゼ基質特異性：電子受
容体としてフエナジンメトサルフエートの存在
下で少なくともマルトース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マン
ノース、マルトトリオース及びマルトペンタオ
ースに作用する。 電子受容体に対する特異性：マルトースを基質と
した場合にフエナジンメトサルフエートを電子
受容体として利用しうるが、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸、ニトロブルーテトラ
ゾリウム及びフエリサイアナイドは利用されな
い。 等電点：PH4.4付近 至適PH：PH6.5 安定PH範囲：PH５〜８ 分子量：約80000（ゲル過法）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21904085A JPS6279779A (ja) | 1985-10-03 | 1985-10-03 | モノ、オリゴサツカライドデヒドロゲナ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21904085A JPS6279779A (ja) | 1985-10-03 | 1985-10-03 | モノ、オリゴサツカライドデヒドロゲナ−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6279779A JPS6279779A (ja) | 1987-04-13 |
| JPH0545233B2 true JPH0545233B2 (ja) | 1993-07-08 |
Family
ID=16729313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21904085A Granted JPS6279779A (ja) | 1985-10-03 | 1985-10-03 | モノ、オリゴサツカライドデヒドロゲナ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6279779A (ja) |
-
1985
- 1985-10-03 JP JP21904085A patent/JPS6279779A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6279779A (ja) | 1987-04-13 |
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