JPS6050437B2 - クレアチニンアミドヒドロラ−ゼおよび／またはクレアチンアミジノヒドロラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクレアチニンアミドヒドロラーゼおよび／また
はクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法に関する。

クレアチニンおよびクレアチンは人体の血液中または尿
中に存在する物質てあつて、その量を正確に把握するこ
とは日常の健康管理に大いに寄与する。一般に健康な人
間の血液中には０．５〜１．５ｍ９１ｄｌのクレアチニ
ンが存在するが、筋ジストロフイー症や腎臓機能の疾患
のある人は血液中のクレアチニンの濃度が異常に高い値
を示し、また尿中にクレアチンの分泌が増加する。臨床
検査の分野ではクレアチニンの定量法としてピクリン酸
を用いるヤツフエ反応による方法が多く採用されている
が、近年クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレア
チンアミジノヒドロラーゼを用いる酵素的定量法が開発
されてきた。

酵素を用いる定量法の有利な点は試料中のクレアチニン
およびクレアチンの量を分別定量することができること
にある。そのためには通常クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラーゼが酵素活性
比で５：１〜１：５の割合で使用される。酵素を製造す
るにあたり、これらの酵素を同時に著量生産する微生物
に供給源を求めることが経済的に有利であり、現在、シ
ュードモナス属、フラボバクテリウム属、アクロモバク
ター属、ペニシリウム属、アルカリゲネス属の微生物が
これらの酵素を生産することが知られている。

しかし、その生産量においてクレアチニンアミドヒドロ
ラーゼのみが顕著に多かつたりして、両酵素ともに生産
量が満足されるものは少ない。特にアルカリゲネス属の
微生物、例えば特開昭４７−４３２８１号公報および特
開昭４７−４３２８３号公報に記載されるアルカリゲネ
ス・スペックＷＳ５１４００はクレアチニンアミドヒド
ロラーゼを多量に生産するが、クレアチンアミジノヒド
ロラーゼを少量しか生産しない。Ｊ 本発明者等はクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを顕著に生産する微生物を求めて種々鋭意
検討したところ、すでに工業技術院微生物工業研究所に
寄託されているアルカリゲネス属に属するＡＫ−２株ワ
（微工研菌寄第４１０５号）が所期の目的を達成するこ
とを見出し本発明に到達した。

すなわち本発明はアルカリゲネス属に属するＡＫ−２株
（微工研菌寄第４１０５号）を培養し、培養物からクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび／またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレ
アチニンアミドヒドロラーゼおよび／またはクレアチン
アミジノヒドロラーゼの製造法である。本発明に従えば
クレアチニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミ
ジノヒドロラーゼを酵素活性比で６：１〜１：２の割合
にて製造することが可能である。

本発明に用いるアルカリゲネス属に属するＡＫ−２株（
微工研菌寄第４１０５号）は次のような菌学的性質を有
する。

Ａ形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は桿状であり、
０．５−０．８×１−３μの大きさで、通常単独である
が、まれに２−４連をなす。

時に伸長した細胞もみられるが細胞の多形性はない。（
２）運動性あり、周鞭毛も有する。

（３） 胞子形成なし。

（４） グラム染色性は陰性 （５）抗酸性は陰性 Ｂ生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明灰白色又は灰黄色て、やや光沢を有する円形の
やや隆起したコロニーを生じ、周縁は円形で拡散性色素
は生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で、灰白色または灰黄色て拡幅状をなす。

（３）肉汁液体培地培養 生育は良好で表面に膜を形成
することなく、培地はやや濁り、下層に白色の菌体を沈
．澱する。

（４）肉汁寒天穿刺培養 上面および穿刺孔中に生育す
る。

（５）肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に生育しわずかに液化する。

（６）リトマスミルク 培養と共にＰＨはゆつくりアルカリ性となる。

わずかにリトマスを還元するが液化、凝固はしない。］
生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒素反応：陰性 （３）ＭＲテストニ陰性 （４）ＶＰテストニ陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陽性（微弱）（８）クエン
酸の利用：陽性 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩 陰性 アンモニウム塩 陽性（１０色素
の生成：キングＡ培地およびＢ培地では色素の生産はな
し、肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキストロース培
地では水溶性色素の生成は認められない。

（１１）ウレアーゼニ陰性 （１２）オキシダーゼニ陽性 （１３）カタラーゼニ陽性 （１４）生育ＰＨ：５〜９、特にＰＨ６．５〜７．５て
よく生育する。

（１５）生育温度：１５〜４０℃、特に２５〜５０゜Ｃ
で最もよく生育する。

（１６）好気性および嫌気性：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテストニ陰性 （１８）糖の利用：ヒユーライフソン培地を用いて糖の
利用を調べた。

下記いずれの糖からもガスの発生および酸の生成は認め
られない。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガ
ラクトース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ
−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、イノシトール、グ
リセロール、可溶性澱粉。

）その他の性質 （１）３−ケトラクトースの生成：陰性 上記の菌学的性質を「バージエイのマニュアル●オブ●
デイターミネイテイブ●バクテリオロジー（第８版、１
９７拝）」を参照して検討すると３−ケトラクトースを
生成せず、アミノ酸、アンモニア態窒素を利用するので
アグロバクテリウム属に属さない。

クエン酸を利用するのでリゾピウム属ではない。更に本
菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せず、水溶性およ
び非水溶性の顕著な色素を生成しないので、フラボバク
テリウム、クロモバクテリウム属にも属さず、アルカリ
ゲネス属に属するものと判定される。

次にアルカリゲネス属蔀−２株を用いてクレアチニンア
ミドヒドロラーゼおよび／またはクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを製造する方法について説明する。

アルカリゲネス属ΔＫ−２株をクレアチニンおよび／ま
たはクレアチンを含む培地で液体培養すると菌体内に上
記酵素が蓄積される。

次いでこの菌体から通常の方法により上記酵素を抽出し
、分離精製することにより、酵素粉末を同時に、または
別々に得ることができる。さらに具体的に説明すると、
アルカリゲネス属蔀−２株をクレアチニンおよび／また
はクレアチンを主たる窒素源および炭素源とし、さらに
適当な無機塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄およ
び有機微量栄養物質として酵母工キズ、麦芽工キズを添
加した培地で、中性付近のＰＨにて一般的な培養条件、
すなわち２５〜３５℃で１〜２日間通気攪拌培養すれは
、菌体の増殖とともに酵素か菌体内に生成蓄積される。
また本菌株を一般に菌体増殖のために用いる通常の窒素
源および炭素源、例えば窒素源としてポリペプトン、コ
ーンステープリカー、肉工，キズ、尿素を用い、また炭
素源としてブドウ糖、庶糖、グリセロールを用い、さら
に無機塩類および微量栄養物質を添加した液体培地で、
中性付近のＰＨにおいて、２５〜３５゜Ｃで１〜２日間
通気攪拌して培養した後、菌体の増殖終了時にクレアチ
ニン．および／またはクレアチンを培養液中に添加して
、さらに培養するか、または一旦集菌して洗浄した後、
クレアチニンおよび／またはクレアチンを含む溶液中て
、本菌株を通気攪拌して適応培養することにより菌体内
に酵素を生成蓄積せしめることができる。菌体内から酵
素を抽出し、分離精製するには通常の方法を用いること
ができる。

例えば菌体磨砕、超音波処理、自己消化法により無細胞
酵素液とした後、硫酸アンモニウム塩析、アセトン、ア
ルコール等による溶媒沈澱法により部分精製してクレア
チニンアミドヒドロラーゼおよびクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼを含む複合酵素標品とするか、あるいは硫安
分画法により低飽和濃度で沈☆化するクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼをまず昶取し、さらに硫安濃度を高飽和
度としてクレア「ンアミジノヒドロラーゼを沈澱させ回
収する方（などがある。さらに高度に精製した酵素標品
をＪるにはイオン交換クロマトグラフィーおよび分ｊ一
篩により精製することができる。本発明で得られた酵素
は次の性質を有してい３。

クレアチニンアミドヒドロラーゼ １作用 クレアチニンニクレアチン ２至適ＰＨはＰＨ７〜８てあり、安定ＰＨ範囲はＰＨ５
〜７．５と酸性側でも比較的安定てある。

この酵素の各ＰＨのクレアチンに対する活性度を第１図
に、また各ＰＨ条件下で２５゜Ｃ．．田時間放置したと
きの残存活性を第２図に示す。３至適温度は５０〜６０
℃で温度耐性のよい性質を有している。

４力価の測定法 Ｍ／５０燐酸緩衝液でＰＨ８．Ｏに調整した１００ミリ
モルのクレアチン溶液Ｌｍｌへ適当に稀釈した酵素液０
．１ｍ１を添加し、３７℃で１紛間反応させる。

反応混液からその０．１ｍ１をサンプリングし、１％ピ
クリン酸１ｍ１、１Ｎカセイソーダ１ｍ１および蒸留水
１ｍ１の中に注加し、２５℃、２紛間放置する。分光光
度計で酵素反応０分の時の試料を対照として５２０ｒ１
Ｔｎ．の吸光度を測定し、次の通り計算する。ＵＩｍＬ
＝Δ０ＤＸ６．４５×酵素稀釈倍率ここでクレアチニン
アミドヒドロラーゼ１単位は上記反応条件で１分間に１
マイクロモルのクレアチニンを生成する酵素量と定める
。

クレアチンアミジノヒドロラーゼ １作用 クレアチン→尿素＋ザルコシン ２至適ＰＨはＰＨ７〜８であり、安定ＰＨ範囲はＰＨ６
〜８である。

この酵素の各ＰＨのクレアチンに対する活性度を第１図
に、または各ＰＨ条件下で２５℃、川時間放置したとき
の残存活性を第２図に示す。３至適温度は４５℃付近で
あるが、５０℃以上では不安定である。

４力価の測定法 Ｍ／５０燐酸緩衝液でＰＨ８．Ｏに調整した１００ミリ
モルのクレアチン溶液１ｍｔに適当に稀釈した酵素液０
．１ｍ１を添加し、３７℃で１紛間反応させる。

反応混液１ｍ１に対してボ塩酸濃度に調製したジメチル
スルフオキシド溶液で２％濃度にしたＰ−ジメチルアミ
ノベンズアルデヒド溶液の２ｍ１を添加し、２５℃で２
紛間放置する。酵素反応０分の時の試料を対照として分
光光度計により４３５ｎＴｒ１．の吸光度を測定し、次
の通り計算する。ＵＩｍｌ＝Δ０Ｄ×６．４５×酵素稀
釈倍率ここでクレアチンアミジノヒドロラーゼ１単位は
上記反応条件で１分間に１マイクロモルの尿素を生成す
る酵素量と定める。

次に実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１クレアチン１％、酵母工キズ０．１％、麦芽工
キズ０．０３％、リン酸２カリウム０．７％、リン酸１
カリウム０．１５％及び１０−３Ｍ硫酸マンガン、１０
−４Ｍ塩化第二鉄を水道水に添加溶解し、ＰＨ７．４に
調整した培地を１００ｍＬずつ、５００ｍＬ容量の肩付
フラスコに分注して加圧殺菌した。この培地にアルカリ
ゲネス属ΔＫ−２株（微工研菌寄第４１０５号）を一白
菌耳、植菌して３０゜Ｃで２＠間振盪培養したところ培
地中のクレアチンはほぼ消失した。遠心分離により１．
５ｙの湿菌体を回収し、さらにＭ／２０リン酸緩衝液（
ＰＨ７．４）１００ｍ１で懸濁して１０ｍｔとした後、
超音波破砕装置で２紛間処理してから遠心分離により無
細胞抽出液を得た。残菌体を同一緩衝液て洗浄して合計
３０ｍＬの淡黄色透明な無細胞抽出液を回収した。本液
中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ全活性は１５弾位
であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ全活性は１４
弾位であつた。無細胞抽出液３０ｍ１へ硫酸アンモニウ
ム１４ｙを添加溶解したところ白濁した。これから遠心
分離により沈澱を回収した後、Ｍ／５０リン酸緩衝液（
ＰＨ６．Ｏ）１０ｍ１に懸濁溶解し、不溶物を遠心分離
により除去することにより淡黄色の粗酵素液１０ｍ１を
得た。Ｍ／５０リン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）に透析する
ことにより部分精製された複合酵素液１５ｍ１を得た。
なお、本液中のクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性は
１２弾位であり、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性
は９０＃ＦＬ位であつた。実施例２ ペプトン２％、酵母工キズ０．４％、麦芽工キズ０．１
％、リン酸２カリウム１．４％、リン酸１カリウム０．
３％および１０−３Ｍ硫酸マンガン、１０−４Ｍ塩化第
二鉄を含むＰＨ７．４に調整した培地５０ｍ１と４％ブ
ドウ糖溶液５０ｍｔとを別個に加圧殺菌してから混合し
た培地にアルカリゲネス属蔀−２株を一白金耳植菌し、
３０℃で２？間振盪培養したものを種菌とした。

同一培地１０ｅを含む２０ｅ容量のジヤーフアーメンタ
ーへ種菌を添加して３０℃で通気攪拌した。■時間後連
続遠心機にて湿菌体を回収し、こ″れをクレアチニン１
００９、酵母工キズ１０ｙ１麦芽工キズ３Ｖ１リン酸二
カリウム５０ｑ１リン酸一カリウム１０Ｖを水道水１０
ｅて溶解した培地へ添加して均一に懸濁したのち２８℃
で１満間２０ｅ容量のジヤーフアーメンター内で通気攪
拌培養した。連続遠心機で集菌して３２０ｙの湿菌体を
採取し、これをＭ／５０リン酸緩衝液（ＰＨ７．４）２
ｆで懸濁してから菌体磨砕機、ダイノミルＫＤ上にてガ
ラスビーズ磨砕により菌体内の酵素を抽出し、連続遠心
分離により不溶物を除去することによつて粗酵゛素液１
．８ｅを得た。この粗酵素液へ硫酸アンモニウム４３０
ｆを添加して塩析物１を回収した。次に濾液へ再び硫酸
アンモニウム３６０ｙを添加溶解して生ずる塩析物■を
回収した。塩析物１をＭ／５０リン酸緩衝液（ＰＨ６．
Ｏ）２００ｍ１で溶解し、不溶物を除去したのちセフア
デツクスＧ−２５カラムに通液して３００ｍ１の酵素画
分を回収した。

本液中にはクレアチニンアミドヒドロラーゼが４２００
弾位含まれていた。この溶液を凍結乾燥することにより
、１ｍｇ当り１弾位のクレアチニ”ンアミドヒドロラー
ゼの粉末２．８ｙを得た。一方、塩析物■を２ミリモル
のメルカプトエタノールを含むＭ／２０リン酸緩衝液（
ＰＨ８．Ｏ）３００ｍ１に溶解し、セフアデツクスＧ−
２５カラムで通液脱塩したのち凍結乾燥することにより
クレアチンアミジノヒドロラーゼを１ｍ９当り０．６単
位含む粉末２４．６ｙを得た。実施例３ 実施例２と同様にして得た塩析物１をＭ／５０リン酸緩
衝液（ＰＨ６．Ｏ）で溶解し、不溶物を除去したのち、
セフアデツクスＧ−２５カラムに通液した。

得られた１００ｍＬの酵素溶液を６０℃で３紛処理した
後、不溶物を遠心分離により除去し、次いで常法により
塩析、脱塩した。得られた溶液を凍結乾燥してクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼを１ｍ９当り４弾位含む粉末１
６３ｍｇを得た。この粉末にはクレアチンアミジノヒド
ロラーゼは含まれていなかつた。また実施例２と同様に
して得た塩析物■を２ミリモルのメルカプトエタノール
を含むＭ／２０リン酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）に溶解し、
セフアデツクスＧ−２５カラムで通液、脱塩した。

得られた１５０７ＴＬｔの酵素溶液を予めＭ／２０リン
酸緩衝液（ＰＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（２．８ｃｍ径×４０ｃｍ高）へ負荷し、同
一緩衝液で洗浄したのち、同一緩衝液とＭ／２塩化カリ
ウムを含む同一緩衝液との濃度勾配を作つて溶出した。
Ｍ／１０〜Ｍ／５の塩化カリウムを含む画分にクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼが含まれる。この画分２００ｍ
１を常法により塩析、脱塩し、次いで凍結乾燥し、１ｍ
９当り３．弾位の粉末６３０ｍ９を得た。なお、この粉
末にはクレアチニンアミドヒドロラーゼは含まれていな
かつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はクレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＣＮと略記
する）およびクレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＣＩと
略記する）の各ＰＨの基質に対する活性度を比較したも
のである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリゲネス属に属するＡＫ−２株（微工研菌寄
   第４１０５号）を培養し、培養物からクレアチニンアミ
   ドヒドロラーゼおよび／またはクレアチンアミジノヒド
   ロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミ
   ドヒドロラーゼおよび／またはクレアチンアミジノヒド
   ロラーゼの製造法。