JPH05500366A - 血液および血液物質中のウイルスの不活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液および血液物質中のウィルスの不活性化方法本発明は、処理すべき溶液ない しは懸濁液にフェノチアジン色素を加え、引き続き光を照射する、血液および血 液物質中のウィルスを不活性化する方法に関する。

光力学的物質が可視光またはＵＶ光と共にウィルス不活性化作用をしうることは 公知である。その原因は、ウィルス外部構造または核酸に対するこれらの物質の 親和力である。双方共、フェノチアジン色素についてあてはまる。該色素は、包 被ウィルスの膜構造と反応して、これを光の影響下に不可逆的に損傷し、これに よってウィルスはその感染力を失なう（５ｎｉｐｅｓ、　ｌ。

および協力者、１９７９年、“Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｐｈｏ−ｔｏｂ ｉａｌ、　”第２９巻、第７８５頁〜第７９０頁参照）。さらにこれらの物質は ウィルスのＲＮＡまたはＤＮＡ、殊にグアニン基と反応する。色素・核酸の錯体 の形成後、該錯体は光エネルギーによって励起され、その結果核酸は変性し、最 後にストランド破断が生じることとなる。さらに、フェノチアジン色素は分子状 酸素の酸素遊離基への変換を惹起し、該遊離基は高反応性で、種々にウィルス破 壊作用をしうる（　Ｈｉａｔｔ、　Ｃ。

Ｗ、、１９７２年：　”Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｃｅｌ ｌＢｉｏｌｏｇｙ”　、第５７頁〜第８９頁、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　；　Ｏｈ　Ｕｉｇｉｎおよび協力者、１９８７年、“Ｎｕ− ｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、”第１５巻、第７４１１頁〜第７４２７頁参照）。

ウィルス不活性化のための他の光力学的色素とは異なり、メチレンブルー、ニュ ートラルレッドおよびトルイジンブルーのようなフェノチアジン色素は、それが 既に可視光と共に一連のウィルスを不活性にすることができ、そのなかにはヒト の血漿中に存在し、たとえばポリオウィルスのようにリピド被膜を有しないもの も存在する。

これに加えて、たとえばメチレンブルー（ＭＢ）およびトルイジンブルー（ＴＢ ）自体は治療に、なかんずく−酸化炭素中毒の際の解毒薬としておよび精神病の 長期治療において適用される。この場合に、重要な副作用なしに、ウィルス不活 性化に必要であるよりもはるかに高い量のＭＢないしはＴＢが適用される（１〜 ２す／体重１　＆９）。ＭＢおよびＴＢの少ない毒性は、動物実験のデータによ っても立証される。

１９５５年以降、当業界においては、殊にトルイジンブルーの場合、２．５μＭ 以下の色素濃度はウィルス不活性化作用をしないことから出発する（　Ｆ、　Ｈ ｅ１ｎ■ｅｔｓおよび協力者、１９５５年、Ｎａｖａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｗａｉｔｅｒ　Ｒｅｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅ５−ｅａｒｃｈ、米国の共同報告参照）。

フェノチアジン色素を用いるウィルス不活性化の慣用法の場合、色素濃度は１０ μＭ〜１００μＭの間である。しかしこれらの濃度では、ウィルス不活性化だけ でな（、たとえば凝結因子のような血漿タンパク質の不活性化も生じるという欠 点がある。これが、フェノチアジン色素が従来血液および血液物質中のウィルス 不活性化の場合に重視されなかった理由である。

ところで本発明の課題は、種々の種類のウィルスを血漿タンパク質の機能妨害な しに撲滅する、ウィルス不活性化方法を開発することである。さらに、本発明の 課題は該方法を簡単にして、血液ないしは血液物質を直接市販の血液バッグ中で 処理し、場合により添加した色素を処理後に再び除去するようにすることである 。

この課題は本発明によれば、フェノチアジン色素を０．１〜１０μＭ、とくに０ ．１〜２μＭの濃度で使用し、照射を直接に、採血および保存のために使用され る、血液バッグのような透明な容器中で行なうことによって解決される。

照射は、十分な強さの昼光またはとくに、それぞれの色素の吸収最大の範囲内の 波長を有する冷光源の単色光を用いて行なわれる。さらに、血漿ないしは血漿タ ンパク質溶液中でのウィルス不活性化の場合には次の条件を維持すべきである。

作業温度は４〜２０℃の範囲内にあるべきである。不活性化時間は、殊に５分な いし５時間、とくに１０分ないし３時間であり、ｐＨ値はｐＨ５とｐＨ９の間、 と（にｐＨ６とｐＨ８の間であるべきである。

本方法の重要な利点は、それが簡単なことである。

ハインメッッ（Ｆ、　Ｈｅ１ｎＩｌｅｔｓ）および協力者（上記の記載参照）は 、たとえば血漿が通過しなければならない費用の高い装置を記載している。この 場合、保守、なかんず（容量の問題が生じる。ところで意外にも、著しく少量の 色素で十分でありかつ光活性化のための費用のかかる工業的装置は必要とされな いことが確かめられた。血漿中の生理的事情下では不活性化されないアデノウィ ルスのような包被されてないウィルスは凍結／解凍工程によって感光性にし、従 って不活性にすることができることを確認したことも予想外であった。この場合 、不活性化は、作業工程凍結／解凍および色素添加の順序とは独立に確かめるこ とができた。凍結とは、約−２０℃〜約８０にの温度における冷媒として液化ガ スを用いる深冷冷凍工程を表わす。通例、−３０℃で深冷冷凍される。

ウィルス不活性化は直接に血液バッグないしは血漿バッグ中で（これらは限られ た光透過性しか有しないが）実施することができる。たんに、色素を添加すれば よい。次いで、バッグを内容物と一緒に露光し、その後それぞれの生成物を引き 続いて処理することができる。

本方法は、大きい技術的費用なしに実施でき、血液バッグでとくに個々の給血者 を処置する際の作業経過中へ統合しつる。使用される少量の色素は処理される液 体中にとどまっていてもよ（、または吸着剤によって除去される。

血液ないしは血液物質としてはなかんずく次のものが挙げられるニ ー全血 一赤血球濃縮物 ｍｍ小板濃縮物 一低温沈殿物 一凝結因子の濃縮物 一阻害剤 一フィブロネクチン 一アルブミン 本発明方法の適用のためには、次の構造式のフェノチアジンが適当である。

ＸＲＲＲ ニュートラルレッド　Ｎ　ＣＲ３Ｎ１１２　Ｎ（ＣＨ３）２トルイジンブルー　 ５ＣＦＩ３Ｎ■２　Ｎ（ＣＨ３）２メチレンブ／ｌ／　−Ｓ　ＩＩ　Ｎ（ＣＨ３ ）２　Ｎ（ＣＨ３）２フエノチアジン　Ｓ　■　■　■ 例　ｌ メチレンブルー（ＭＢ）を用い、下記にヒト血漿中の水泡性口内炎ウィルス（Ｖ 　Ｓ　Ｖ）における光不活性化の依存性を示す。

ＶＳＶｌｍｌあたり約５Ｘ１０７ブラーク形成単位をヒト血漿中に懸濁させ、種 々の濃度のＭＢを加えた。

対照試料は色素を含有していなかった。試料体積は０゜５１１であった。対照試 料およびＭＢ含有試料の一方を室温で４時間可視光で照射し、他方を正確に同じ 時間暗所に貯蔵した。光源としては、１５０Ｗのハロゲンランプ（Ｏｓｒａｍ　 Ｘｅｎｏｐｈｏｔ）を備えたスライドプロジェクタ−を使用した。スライドプロ ジェクタ−の対物レンズ、つまり光出射口と試料との間の距離はこの実験および 他のすべての実験では３０ｃｍであった（血液バッグ中でのウィルス不活性化を 除く）。

照射の経過後、すべての試料においてプラーク検定法によりウィルス滴定濃度を 測定した。実験結果は第１表に掲載されている。

試料　ＭＢ−濃度　光　ウィルス （Ｍ）　不活性化係数 対照１　０　＋　４．８ 対照２　０　−　１ １　０．０１　＋　１１．８ ２　０．１　＋　２８．５ ３　０．５　＋　、＞１０６ ４　１　＋　＞１ｇ６ ５　１０　＋　＞　１０８ ６　５０　＋　＞　１０８ ７　１００　＋　＞　１０６ １０　５０　−　１１．８ 第１表：露光の有無によるヒト血漿中のｖｓｖの不活性化 露光時間＝４ｈ 第１表からの結果は、約０．５μＭのＭＢの濃度から、ｖＳＶの感染滴定濃度は １０６以上減少したことを示す。約５０μＭ以上の明瞭に高い濃度は、既に露光 なしでｖＳＶ滴定濃度の著しい減少を生じた。

例　２ 次の実験によって、低い色素濃度におけるウィルス不活性化を確認した。

ｖＳｖを血漿および種々のメチレンブルーの存在で、体積５００μｌのアリコー トで、冷却室中で夜どおし、３０ｃ厘の距離からスライドプロジェクタ−で照射 した。試料Ａ−Ｆは露光され、試料Ｇは未露光のままであった。

この実験の結果は第２表に示されている。表は上記の条件下で使用したｖＳＶは １０４よりも多く不活性化されたことを示す。これにはメチレンブルー０．５μ Ｍを要した。

恐らく、４℃で夜どおし温室することによってｖＳＶの滴定濃度は１０１〜１０ ２減少したが、これは原滴定濃度が比較的低いことを説明するものと思われる。

しかし、これは−緒に試験しなかった。

Ａ（露光）とＧ（暗所）の比較は、光単独はウィルスの感染性に対して明らかに 大きい影響を及ぼさないことを示す。

試料　ＪＩＢ最終濃度　滴定濃度／２００＋＋Ａ’　不活性化１　係数 Ａ　０　２　Ｘ　１０４　２．２ Ｂ　Ｏ，０１２，４Ｘ　１０４　１．８ＣＯ，０５２Ｘ１０４　２．２ Ｄ　Ｏ，２５３Ｘ　１０２　１４７ Ｅ　Ｏ，５’　＜　１　く　４．４Ｘ１０４Ｆ　１．０　＜　１　く　４．４Ｘ １０４Ｇ　Ｏ４，４Ｘ　１０４　１ 第２表：低い色素濃度におけるウィルス不活性化例　３ しかし、フェノチアジン色素の存在下でのウィルスにおける不活性化は、露光時 間に依存する。ｖｓｖの光不活性化のためにどの露光時間が十分であるかを調べ るために、血漿中に１ｍｌあたり１０Ｂプラ一ク形成単位（ＰＦＵ）を懸濁させ 、２２℃で種々の時間記載したように露光した。

第３表は得られた結果を示す。与えらえた実験条件下では、感染性ＶｓＶ滴定濃 度を１０８以上減少するためには１時間の露光時間で十分であることが認められ る。

試　料　露光時間　不活性化係数 （ｗｉｎ） 対照　０１ ３６０〉１０６ 第３表：　ＶＳＶのＭＢ仲介された光不活性化の動力学 例　４ 類似の実験を、ＭＢの代りに、他のフェノチアジン色素ＴＢＩμＭの存在で実施 した。第４表に示した結果は、ＴＢを用いてもＶｓｖを有効に不活性化しうるこ とを示す。

試　料　露光時間　不活性化 （ｗｉｎ）　係数 対照　０１ ２　６０　＞４Ｘ１０３ 第４表：ＨＳＶのＴＢ仲介された光不活性化の動力学 フェノチアジン色素の不活性化作用は単純ヘルペスウィルス（ＨＳ　Ｖ）の場合 ならびにヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）の場合でも立証された。

例　５ メチレンブルー（１μＭ）の存在で、ＨＳ　Ｖも不活性化する。第５表は、Ｈ３ ＶのＭＢ仲介された光不活性化の動力学を示す。

試　料　露光時間　不活性化 （Ｉｌｉｎ）　係数 対照　０１ ３　１８０　＞３Ｘ１０４ 第５表：　Ｈ８ＶのＭＢ仲介された光不活性化の動力学 例　６ エイズ病原体ＨＩＶ−１を用いて類似の実験を実施した。ウィルス滴定濃度は６ 　Ｘ　１０２Ｐ　Ｆ　Ｕ／ｍＩであった。指示細胞としてはＭＴ４細胞を使用し た。第６表は、ＨＩＶ−１が光不活性化に対してとくに敏感であるように思われ ることを示す、即ち既に１０分以内に、ウィルス滴定濃度は６００分の１以上減 少した。

試　料　露光時間　不活性化 （ｗｉｎ）　係数 対照　０１ １　１０　＞　６００ ２　’６０　＞６００ ３　１２０　＞　６００ 第６表：ＨＩＶ−１のＭＢ仲介された光不活性化の動力学 例　７ 包被されてないウィルスを８０％血漿の存在で通常の生理学的条件下で不活性化 する実験において、何の成果も得ることができなかった。アデノウィルスは、包 被されていないウィルスのモデルとして、色素メチレンブルー（ＭＢ）の１μ冨 の存在で長時間（４℃、暗所）予備温室した。その後、ハロゲン放射器（１５０ ０００Ｌｕｘ）での３０分間照射を行なった。その際、アデノウィルスの感染力 は不変のままであった。

試料　予備温室　色　素　滴定量 ＩＩ　Ｆ’ｌ−一一一一一一一一一一二±１」旦と対照　Ｏｈ　５．Ｑ ｌ　０ｈ　ＭＢ　６．０ ２　１ｈ　ＭＢ　５．５ ３　４ｈ　ＭＢ　６，０ ４　２４ｈ　ＭＢ　５．Ｑ 第７表：アデノウィルスの光不活性化に対する予備温室の影響 滴定濃度はＴＣＩＤ５０（計算方法：　ＳｐｅａｒｍａｎおよびＫａｅｒｂｅｒ による“組織培養感染量（Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ 　Ｄｏｓｉｓ、）″）として決定した。ウィルスは、ＦＬ細胞（定義された細胞 系はウィルス滴定に適当である）で滴定した。

実験条件を維持してトルイジンブルーを使用する場合、同様にウィルス滴定濃度 の減少は確認することができなかった。

アデノウィルスの不活性化を得るために、−３０℃に深冷冷凍下の凍結／解凍工 程（Ｆ／Ｔ）を実験経過中へ接続した。その際、Ｆ／Ｔの順序および色素（ＭＢ １μＭ）の添加は二義的重要性を有するにすぎない。試料の照射は、同様にハロ ゲン放射器を用いて行なった。１２００００　Ｌｕｘが測定された。

試料　試料の準備　滴定濃度 （１ｏ１０） 対照　７．５ Ａ　Ｆ／　Ｔ　７．　Ｏ Ｂ　Ｆ／Ｔ＋６０分照射　７．５ ＣＦ／　Ｔ＋　ＭＢ＋　６０分子備温温室６０分照射　２．５Ｄ　ＩＩＢ＋Ｆ／ Ｔ　７．５ Ｅ　ＭＢ十Ｆ／Ｔ＋１０分照射　５．ＯＦ　ＭＢ十Ｆ／Ｔ＋３０分照射　５．０ Ｇ　ＭＢ＋　Ｆ／　Ｔ＋　６０分照射　４．０第８表：接続されたＦ／Ｔ工程に 基づくアデノウィルスの光子活性化 ウィルス滴定の実施は第７表に記載したように行なった。

例　８ 高い色素濃度を使用する際の特別な問題は、血漿タンパク質に対するこの物質の 直接作用にある。従って、もう１つの実験において異なる色素濃度を凝固因子の 活性に対するその作用に関して調べた。

ヒト血漿（２ｍｌ−アリコート）に、種々の量のＭＢを加えた。その後直ちに、 凝固因子Ｖ、■および■の活性を測定した。第７表から明らかなように、該活性 は３つの場合すべてにおいて用量に依存して、因子■およびＶの場合には約１０ μＭから、因子■の場合には既に２．５μＭから阻止された。従って、高い濃度 ではＭＢは直接に、光が作用する必要なしに、タンパク質に作用する。

メチレンブルー　因子Ｖ　因子■　因子■（Ｍ、／ｌ）　Ｅ／ｍｌ　Ｅ／冒Ｉ　 Ｅ／翼１０　０．８０　０．３８　２．０ １　０．７６　０．４１　１．９ ２．５　０．７８　０．４１　１．６ ５　０．７４　０．３８　１．４５ １０　０．５４　０．３５　１．２０ ２０　０．４４　０．２８　１．１０ 第９表：凝固因子の活性に対するＭＢの影響例　９ 使用した色素濃度だけではな（、露光時間も凝固因子の活性に対して影響を及ぼ す。この時間依存性は、種々のメチレンブルー濃度において認められた。

ヒト血漿（２ｍｌ−アリコート）に、種々の量のＭＢを加え、１〜４時間（例１ に記載したと同様に）Ｎ光した。対照試料は光処理しなかった。

第８表が示すように、３つの凝固因子Ｖ、■および■の活性は、時間および用量 に依存して抑制された。

とくに因子■および■の場合、高いＭＢ濃度および２時間からの光曝露時間は血 小板崩壊活性の外見上の増加を惹起することが明らかになる。

露光　メチレンブルー　因子Ｖ　因子■　因子■時間　濃度μＭ／Ｉ　Ｅ／肩Ｉ 　Ｅ／肩Ｉ　Ｅ／富１０　０．８６　０．３３　１．２０ １　０．８６　０．４５　１．２０ ０ｈ　２．５　０，８２　０，３３　０．４６１０　０．７２　０．３０　０． ４４ ０　０．８４　０．４０　０．７６ １　０．７２　０．２４　０．９２ １ｈ　２．５　０．６８　０，２４　０．８２１０　０．４７　０．１６　０． ６８ ０　０．８２　０．４４　０．１０ １　０．６４　０，２３　０．９０ ２ｈ　２．５　０．６８　０．２２　０．７２１０　０．６０　０．１５　０． ７４ ０　０．７６　０．３８　０．９８ １　０．５６　０．１６　０．９４ ４　ｈ　２．５　’　０．４９　０．２９　０．８２１０　０．４２　０．２７ 　０．６４ 第１０表：凝固因子の活性に対する光およびＭＢの影響： 時間および用量依存性 例１０ 本発明の望ましい実施形により、ウィルスの光子活性化は直接血漿バッグ中で行 なうことができる。たんに、血液または血液物質に色素を必要量添加し、次にバ ッグを光で照射する。この簡単な方法で、個々の給血者からの血液物質を何時で も処理することができる１つの実験において、ヒトの保存血漿の３つの試料を解 凍し、血漿バッグ中にそれぞれ１．５Ｘ１０８　ＰＦＵのｖＳｖを加えた。２つ の試料に、ＭＢを１μＭないしは１０μＭの濃度で添加した。ＭＢなしの血漿か ら試料を取出し、陽性対照として暗所に４０℃で保存した。次いで、約２　、５ 　ｃｍのできるだけ均一な層厚を保証するため、３つのバッグを２つのフレキシ ブルガラス板の間に挟んだ。その後、バッグを約９９ｃｍの距離からスライドプ ロジェクタ−を用いて照射した。４時間後、ウィルス滴定濃度を測定するために 試料を取出し、これをＦＬ細胞でのプラーク検定法を用いて測定した。第９表の 結果は、血漿バッグ中で４時間の露光によりｖＳｖの感染滴定濃度を１０３以上 減少するためには、既にＭＨＩμＭで十分であることを示す。色素不在の場合で も、照射はウィルス滴定濃度の減少を生じたが、約５０％にすぎなかった。

試料　照射時間　ＭＢ濃度　バッグの　ｖＳｖ−滴定濃度（ｈ）　（Ｍ）　重量 （９）　（ＰＦＵ／　ｍＡ）対照　ｏ　Ｏ３２３５ｘ　１０３ １　４　０　３２３　２．５ｘｌＯ” 第１１表：血漿バッグ中でのＶＳｖの光子活性化ウイルス不活性化のために使用 したフェノチアジン色素は、殊に血液または血液物質中での１μＭまでの濃度に 、副作用が生じることなしに、とどまることができる。しかし、色素はあとで透 析、ゲル濾過または吸着によって再び除去できる。

しかし、幾つかの吸着剤、たとえばハイアット（１’１ｉａｔｔ；　”Ｃｏｎｃ ｅｐｔ　ｉｎ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第５７頁〜 第８９頁、＾ｃａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７２年 ）により挙げられたイオン交換体は、色素のほかに非常に強く血漿タンパク質、 なかんずく凝固因子を結合するので、明らかに不適当である。

意外にも、ＭＢおよび他のフェノチアジン色素は市場で入手しつる種々の分離ゲ ルに、その中でもタンパク質結合力を全（または僅かしか有しないようなものに 非常に強（結合することを確認することができた。

このような吸着剤は光オキシダントをあとで、除去するのにもと（に適当である 。試験した吸着剤のうち、次のものがＭＢおよび他のフェノチアジン色素の分離 のために挙げられる。

吸着剤　製造者ないしは供給者 Ｄａｒｔｏｓｉｌ　７５　５ｅｒｖａ、　ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳｔ　１００− Ｐｏｌｙｏｌ　ＲＰ１８　５ｅｒｖａ、　ｔｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇＫｉｅｓｅｌ ｇｅｌ　４０　Ｍｅｒｃｋ、　ＤａｒｍｓｔａｄｔＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　５０＾ 　Ｍａｃｈｅｒｙ＆　Ｎａｇｅｌ、　ＤｕｅｒｅｎＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　１００ ＾　Ｍａｃｈｅｒｙ＆　Ｎａｇｅｌ、　ＤｕｅｒｅｎＶｙｄａｃ　５Ｃ−２０１ ＲＰ　Ｍａｃｈｅｒｙ＆Ｎａｇｅｌ、　ＤｕｅｒｅｎＣＰＧ　４０　Ｐｉｅｒｃ ｅ　Ｅｕｒｏｐｅ（Ｇｅｂｒ、Ｆａｕｓｔ　（＋ｗｂＨ；　５０００Ｋｏｅｌｎ ）Ｂｉｏ　Ｂｅｅｄａ　Ｂｉｏ　Ｒａｄ、、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ＾−ｂｅｒｌｉｔ ｅ Ａｄｓｏｒｂｅｒｈａｒｚｅ　Ｒｏｈｍ＆　Ｂａａｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ多（ の場合に、ＭＢＩＯμＭの使用濃度では、色素を完全に（バッチに使用した場合 ）血漿タンパク質溶液から抽出するためには、それぞれの吸着剤２ｇで足りる。

次の２つの吸着剤タイプがとくに好適であることが立証された： １、血漿タンパク質はゲルマトリックス中へ侵入しつるが、低分子の色素分子は イオン、静電気および疎水性の交換作用のため結合されるような小さい（直径４ ０〜約１００オングストローム）孔径を有するシリカゲルないしはケイ酸ゲル。

このタイプの市場で入手しつる吸着剤の例はＭａｔｒｅｘ　５ｉｌｉｃａ　Ｇｅ ｌ　（Ａｍ−ｉｃｏｎ、ｆｉｔｔｅｎ）　、Ｄａｌｔｏｓｉｌ　（Ｓｅｒｖａ、 ｌｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＫｉｅｓｅｌ−Ｇｅｌ　（Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａ ｒｍｓｔａｄｔ）である。

２、ポリスチロール−ジビニルペンゾールないしはアクリルエステルを主体とす るゲル。該ゲルは同様に適当な孔径で製造される。

このタイプの市場で入手しうるゲルの例は、Ａｍｂｅｒ−１ｉｔｅ（とくにＲｏ ｈＩｌ＆　［Ｉａａｓ、　Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）およびＢｉｏ　Ｂｅａｄａ（Ｂ ｉｏ　Ｒａｄ、　Ｍｕｅｎｃｈｅｎ）である。これらは主として、水溶液から非 極性物質ないしは表面活性物質、たとえば洗剤を除去するために使用される。こ れらは極性を有しないかまたは弱い極性を有するにすぎない。

例１１ 新しい血漿にメチレンブルー（１０μＭ）を加えた。５ｗ＋１アリコートに、種 々の量のＤａｌｔｏｓｉｌ　（孔径７５オングストローム）ないしはＢｉｏ　Ｂ ｅａｄａ　５Ｍ１６　（孔径１４４オングストローム）を加え、３０分間混合し 、ゲルを沈積させた。血漿中の因子■ないしは因子Ｖの含量、６００ｎｍでの吸 光ならびに個々の試料のタンパク質含量を測定した。

Ｅ（６６０ｎｍ）タンパク因子■　因子Ｖ質（諺９／翼１＞　（Ｕ／冨１）　（ Ｕ／ｓｌ）新しい血漿　０．９０９　６６．８　１．１０　１．２０新しい血漿 ＋ＭＢ　１．４５０　６５．６　０，４２　０．９６ダルトシル （Ｄａｌｔｏｓｉｌ）５０ｔ９０．５７６　−　０．６０　１．０５１００肩９ 　０．５７１　１．１０　１．１０２５０萬９　０．４９１　１．１０　１．２ ０５００■９　０．４７７　６６．８　１．２５　１．２０バイオビーズ （Ｂｉｏ　Ｂｅａｄｓ） ３Ｍ１６５０真ｑ　Ｏ，６６６−０，８２１，０５１００寓ｑ　Ｏ，５７１−１ ，０５１，１０２５０１１９０，５７１−１，０５１，１０５００リ　０．５３ ０　？２．５　０．８０　１．１５第１２表：バッグ中のメチレンブルーの抽出 吸光値から、明らかに色素のほかに、なお他の物質が血漿から抽出されることが 明らかである。しかし、これは血漿タンパク質ではない。

５ｍｌあたり吸着剤１００〜２５０諺す、つまり２〜５重量％（％Ｗ　／　Ｖ　 ）で処理した血漿の吸光値は、吸着剤１０％Ｗ　／　Ｖで抽出したものとほとん ど区別されない。従って、双方の場合１０μＭのＭＢ濃度では、パッチ作業の場 合血漿から色素を除去するためには吸着剤２〜５％ｗ／ｖで十分であることが判 明する。色素の使用濃度が低い場合には相応に少ない吸着剤が必要となる。

例１２ もう１つの実験において、血漿の代りに、５％のヒト血清アルブミン溶液（５％ ｌ５Ａ）を使用した。ＭＢ濃度は同じく１０μＭであった。５冨ｌ−アリコート に、バッチで、次の吸着剤それぞれ１００　ｗｑ、つまり２％ｗ　／　ｖで種々 の時間抽出した：　Ｄａｌｔｏｓｉｌ　（孔径７５オングストローム）　、Ｋｉ ｅｓｅｌｇｅｌ　（孔径４０オングストローム）ならびにＢｉｏ　Ｂｅａｄｓ　 ５Ｍ１６　（孔径１４４オングストローム）。

図１が示すように、３つの場合すべてにおいて２０〜３０分内で６６０ｎｍにお ける吸光は一定値に低下する。つまり、この時間はバッチ作業の場合血漿タンパ ク質溶液から光オキシダントを除去するために十分である。また図１が示すよう に、Ｂｉｏ　Ｂｅａｄｓ　Ｓ　Ｍ　１６およびＫｉｅｓｅｌｇｅｌ　４０は、記 載された場合に、孔径７５オングストロームのＤａｌｔｏｓｉｌよりも若干良好 な吸着剤である。

６６０ｎｍ 時間　ｉ　（ＩＩｉｎ） 一３ｉｌ　１６　−Ｄａｌｔｏｓｉｌ　７５　−Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　４０　− ＵＳＡ図１：室温におけるＨ３Ａ５％（ゲル１００＋ｎ／Ｈ８Ａ３寓ｌ）を有す るメチレンブル−（１０μＭ）の吸着動力学 例１３ 血漿タンパク質溶液からＭＢのカラムクロマトグラフィーによる除去 この実験においては、光オキシダントの吸着除去がクロマトグラフィーでも行な うことができるか否かを見出そうとするものである。背景は、容器、たとえば１ つの血液バッグ中で色素を光と共に用いるウィルス不活性化を実施し、次いで血 漿タンパク質溶液を、中間に接続された、吸着剤を含有する小さい分離カラムを 経て別の容器、たとえば第２の血液バッグ中へ移す思想である。第１バッグ−吸 着カラム−第２バツグのユニットをあらかじめ製造すれば閉鎖系が利用され、極 めて僅かな汚染の危険下に簡単に、ウィルス不活性化された血漿タンパク質製剤 （個々の供与者からのものも）を製造することができる。

このために、５％アルブミン溶液２５０　ｍｌを種々の速度で、ケイ酸ゲル（孔 径４０オングストローム）５ｍｌを含有する分離カラムに通した。１０＋＋Ａ’ の両分を捕集し、その６６０ｎｍにおける吸光値を測定した。

第１０表から認められるように、アルブミン溶液の全量を５ないしは７　、５　 ｘｉ／　１ａｉｎの貫流速度でカラムに通し、その際貫流両分中に残存ＭＢは検 出できなかった。従って、溶液２５０８１から色素を除去するための時間的経過 は、最高３０〜３５分であった。

実験の結果は、光オキシダントのクロマトグラフィーによる分離は問題がないこ とを示し、他面で、個々の供与者のウィルス不活性化された血漿製剤の上述した 製造は可能であることが立証された。

出発物質＋ＭＢ　貫流速度（ｍｌ／ｍ１ｎ）５７．５ 吸光（６６０ｎｍ）　＋　０．０６７　吸光（６６０ｎａ＋）両分番号：　ｔ　 Ｏ，００２ｏ、ｏｏｔ３　０．０００　０．００１ ５　０．０００　０．００２ ７　０．００２　０．００３ ９　０．００１　０．００１ １１　０．０００　０．００１ １３　０．０００　０．００１ １４　０．００２　０．００１ 第１３表・５％のアルブミン溶液（ＭＢ濃度１μＭ）からのＭＢのクロマトグラ フィー による分離 国際調査報告 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．処理すべき溶液ないしは懸濁液にフェノチアジン色素を加え、引き続き光で 照射する、血液ないしは血液物質中のウイルスを不活性化する方法において、フ ェノチアジン色素を０．１〜１０μＭの濃度で使用し、照射を直接に、採血およ び保存のために使用される、血液バッグのような透明な容器中で行なうことを特 徴とする血液および血液物質中のウイルスの不活性化方法。
2. ２．フェノチアジン色素を０．１〜２μＭの濃度で使用することを特徴とする請 求項１記載の方法。
3. ３．フェノチアジン色素としてトルイジンブルーまたはメチレンブルーを使用す ることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. ４．それぞれの色素の吸収最大の範囲内の可視光で照射することを特徴とする請 求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. ５．処理すべき溶液ないしは懸濁液を差当り深冷冷凍し、次いで照射前に再び解 凍することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. ６．色素を凍結工程前に添加することを特徴とする請求項５記載の方法。
7. ７．色素を解凍後で照射前に添加することを特徴とする請求項５記載の方法。
8. ８．照射を行なった後、血液ないしは血液物質を、色素を除去するために吸着剤 に通すことを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. ９．中間に接続されたフェノチアジン色素の吸着剤を含有する分離カラムを有す る、採血のために適当な２つの容器により実施することを特徴とする請求項８記 載の方法。
10. １０．吸着剤としてケイ酸ゲルまたはポリスチロール・ジビニルベンゾールまた はアクリルエステル重合体を主体とするものを使用することを特徴とする請求項 ８または９記載の方法。