JPH05500902A - ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系産業上の利用分野 本発明は、化学的発光分析による試験溶液中の被分析物の測定用の改良された系 に関する。より詳しくは、本発明は、ハロペルオキシターゼ（ハライド：過酸化 水素オキサイドレデウーターゼ、　ＥＣ１，１１，ｉ、オキシダントおよび発光 基質を試験検体における被分析物の存在または量の化学的発光シグナル表示を発 生するのに利用する酸ｐＨ至適、ハライド依存被分析体分析系に関する。

背景技術 高い精度で試験検体中での１種類またはそれ以上の被分析物の濃度を測定する検 定系が屡必要とされる。これらの検定系は、工業廃棄物中の毒性物質の測定から 食品供給における潜在的汚染に至るまでの幅広い用途範囲を見出す。体液中の被 分析物、例えば血清、血漿、尿等の検定系の発展は、診断および治療活性を補助 するための患者の生理学的条件に関する正確な現在の情報に対する医師の要求の 故に非常に注目されてきている。その結果、高い精度を有する体液中の種々の被 分析物の濃度を測定するための系が発展している。

か＼る系の１つは、被分析物の類縁体に接合された放射線標識を利用する周知の 放射線免疫検定である。その古典的な形態において、既知の量の被分析物の放射 線標識された類縁体を被分析物に特異の制限量の抗体に対する被分析物と競合さ せる。別の形態において、放射線標識は、試験検体中に存在する被分析物ととも に「サンドイッチ」を形成する被分析物−特異抗体と接合し得る。試験フォーマ ットに無関係に、被分析物または残りの溶液中の遊離物と結合した放射線標識は 、試験検体における被分析物の量に直接または間接的に関連する表示として測定 される。高感度の放射線標識に基づく系が開発されているが、放射線活性物質、 特別の操作法または特別の装置の要求および放射線活性廃棄物の製造が放射線標 識に基づく検定の使用を続けると拡散していくという重大な欠点がをもたらす検 定技術における放射線活性物質に対する要求は、放射線標識の代わりに酵素標識 物質の使用により低減されている。代表的な酵素免疫検定は、例えば対応する放 射線免疫検定に利用されるものと非常に類似した検定プロトコルに従うが、発光 法で測定された酵素活性の貴紙が試験検体中の被分析物の量により直接的または 間接的に変化する。酵素標識系の拡がった使用は、臨床学的検定目的に別に利用 されるが屡検定感度の損失、高いバックグランドレベルおよび多用の検定結果と なる。

より最近、その他の別の従来の検定系に放射線標識または酵素標識の代わりに使 用する発光表示反応が提案されている。検定系生成物便により散乱した光の測定 に基づく発光反応が、検定フォーマットにおける放射線活性および酵素標識の代 用のためのおよびオキシダーゼおよびホドロラーゼの基質のための検定のける等 の従来の発光またはスペクトル発光表示の代用として研究されている。当該技術 は、検定系−発光反応および化学的発光反応に有効な２種類の発光表示が一般に 認識されている。蛍光検定系において発光分子は、エネルギーの光源により製造 された入射放射線から発光分子へのエネルギーの移動により励起エネルギーに促 進される。しかる後この分子は、系に存在する発光分子の量に依存する方法およ び量で光の散乱により低いエネルギー状態に開放する。しかしながら化学的発光 検定において、入射放射線が必要とされない。化学的発光は、２種類またはそれ 以上の化学的反応体して光の散乱により低エネルギー状態（例えば基底状態）に 開放する電気的に励起したエネルギー富化反応生成物を得る反応のエネルギー生 成物として広義に定義される。化学的発光技術を使用した溶液中の被検体を測定 する方法が当該技術分野において確立されている。種々の化学的発光検定系を記 載する特許の例を、以下に記載する。

［１１１１１１１１１の米国特許第３．６８９．３９１号明細書は、化学的また は電気化学的反応を使用して電気的に励起した、エネルギー富化状態の分子を得 、そしてこれらの分子から　（エネルギードナー）から反応体分子（エネルギー レセプター）へエネルギーを移動し、次いで散乱光を得る光化学的転移を受ける ことを記載している。

ＭＳＩｅｔ、Ｉｒの米国特許第４．１０１．０２９号明細書は、水性反応混合物 中で興味ある化合物を含有すると疑われる媒体、化学的発光標識されたリガンド およびリガンドとおよび化学的発光標識されたリガンドと結合することができる 可溶性レセプターとを化合することによる体液中の生物学的活性化合物の検定の 操作を記載している。次いで、このリガンドおよび化学的発光標識されたリガン ドを、リガンドレセプター　（抗体）と競合させる。平衡後、レセプター　（抗 体）を、媒体から単離し、そして化学的発光、検定される溶液中の非標識リガン ドの量と関連する抗体に結合された化学的発光体標識されたリガンドの量につい て測定する。

Ｌｌｌ　１ｍｚｎの米国特許第４．１６０．６４５号明細書は、リガンド類縁体 に接合された化学的発光体標識、一つの電子移動により反応する第１のレドック ス系反応体および二つの電子移動により反応する第２のレドックス系反応体を利 用する第１および第２の反応体および化学的発光体標識の反応の速度と既知量の 非分析物中の対応する速度を比較することによる触媒媒体競合タンパク質結合検 定を記載しているＵｌｌｍａｎの米国特許第４，１６１．５１６号明細書は、リ ガンドに結合された発光体およびの量が未知検体に存在するルガノドの量および 非結合蛍光体と抗体に結合された蛍光体との相違に関連する発光体に接合された リガンド類縁体を利用する二重レセプター蛍光体免疫検定を記載している。

１１ｘｇｇｉｏの米国特許第４．２２０．４５０号明細書および同第４．２７７ 、４３７号明細書は、化学的標識が免疫学的対の一員と接合し、消去剤分子が免 疫学的対の別の一員と接合し、そして検定媒体に存在する被分析物の量が媒体か ら散乱した光を観察することによって測定される化学的発光体競合タンパク質結 合検定を記載している。

Ｖｏｇｅｌｈｏｌの米国特許第４．２３１．７５４号明細書は、固形キャリヤー 、反応生成物を製造する被分析物の存在に応答性のある第１の試薬系を含有する 第１の層および発光を製造する反応生成物の存在に応答性のある第２の試薬系を 含有する第２の層を含む多層式化学的発光試験装置を記載している。第２の試薬 系は、環式ヒドラジド、多ルミノール、第二鉄イオン、ヘモグロビン、ヘマチン またはマイクロベルオキシターゼ生成物触媒および化学的発光反応媒体の９）１ を８６５ないし１２．５に保持する緩衝液を含むことができる。

Ｂｏｇｕｌｘ山等の米国特許第４．２３８．１９５号明細書は、蛍光標識を化学 的に励起しそして標識により散乱した光を測定することによってリガンド、例え ば抗体または抗原を測定する特異結合検定を記載している。蛍光標識は、高エネ ルギー中間体、例えば過酸化水素およびオキシルクロライド、オキサミドまたは ビスオキサレートエステルのいずれかに曝露することによって化学的に励起され る。

Ｆｕｎｋの米国特許第４．２６９．９３８号明細書は、検体をジアセチルフルオ レセインおよび過酸化水素源と接触させて蛍光生成物を形成することによって行 われるオエルオキシターゼを記載している。ベルオキシターゼが過剰に存在する 場合、蛍光増加の速度が検定される検体中のベルオキシターゼの量に関連する。

Ｈｘｌ＋ｕｎｎ等の米国特許第４．３０２．５３４号明細書は、化学的発光が過 酸化水素とフェノール性化合物、例えばピロガロール、レソルシノール、フォロ グシノールまたはハイドロキノンとの間の酵素触媒されたレソックス反応によっ て製造される異質免疫検定を記載している。この検定において、ホースラディッ シュペルオキシターゼ、ラクトペルオキシターゼ、ターニップペルオキシターゼ またはポテトペルオキシターゼを抗原または抗体と接合し、この接合体を検定と 反応させ、過剰の接合体を除去し、発光基質を添加し、次いで系から散乱した光 を測定する。

Ｍｏｄｅｌｌ等の米国特許第４．３７２．７４５号明細書は、被分析物に特異な 免疫学的結合パートナ−に接合されたマイクロカプセル化された蛍光体材料、カ プセルを破壊する手段および蛍光体を活性化することができる電磁放射線以外の エネルギー源を包含する生物的被分析物の決定用の系を記載する。

化学的検定系、特にホースラデツィシュベルオキシターゼにより触媒されるもの が広く報告されており、そして当該技術分野に共通に使用されるその他の従来の シグナル標識を上回る数多くの著しい利点、例えば比較的高感度、低価格、拡張 された線的範囲、比較的単純なシグナル測定装置および放射線活性同位体の欠如 を有しており、従って安全装置および特別の操作法を排除することが知られてい る。これらの利点にも係わらず、化学的発光検定系は、問題がある。例えば、ル ミノールのベルオキシターゼ触媒酸化は、ｐＨの変化に高感度である。従来のホ ースラデッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰＩ化学的発光ルミノール酸化は、代表 的には約８ないし１２のｐ＋＋で行われるが最も効率的な化学的発光は約ＩＯ２ ４ないし１１．５のｐＨでもたらされる。化学的発光をもたらすためのＩＩＲＰ −触媒されたジオキシ化は、第１の錯体（錯体■）を形成するＨＲＰと過酸化水 素との反応、そして該第１の錯体を順ににルミノールと反応させて第２の錯体（ 錯体１１）および酸化ルミノールラジカルを得ることを包含する高度の錯化法で ある。次いで、錯体１１を第２のルミノール分子と反応させ、その初期状態で第 ２酸化ルミノールラジカルとする。

要するに、２つのルミノール分子（２ＬＨ２）を、以下の反応に従ってヒドラジ ドから脱水素して２つのルミノールラジカル（２ＬＨ＋　）　とする。

ＨＲＰ ２ＬＨ２（ヒドラジド）＋ＨｚＯ２→　２ＬＨ”＋２Ｈ２０次いで、このラジカ ルが付加的な過酸化水素と反応して、以下の通り窒素の放出およびフォトン（ｈ ν）の散乱を伴ってアミノフタレートを形成する。

２ＬＨ”″＋Ｈ２Ｏ２→ＬＨ，＋アミノフタレ−１−＋Ｎプ＋ｈシ発光反応は、 Ｈ２Ｏ２が接合体塩基形態、ＨＯ２−中に存在する際に最良に達成される。しか しながら、比較的に高いｐＫｚ（１１，Ｉｉ；　Ｌｓｎｇ＋’　ｓ　［Ｉｕｄｂ ｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｂｅｍｉ＋１＋７．第１３版、　１９８６年）は、以下の通り に著しい量で存在する＋１０２−のための比較的に高いｐＨを記載している。

ｐｏ変化における［ＨＯ２−］と［Ｈ２０ｘ　］との比率ｐＨ［ＨＯ□−］　／ 　［Ｈｉ　０２］１２．６５　１０ 例えば、Ｈ２Ｏ２の１ミリモル溶液中の１１０２−の効率的濃度は、ｐＨ５，６ ５において１ナノモルである。従ってルミノールの効率的な酸化を得るために、 アルカリ性ｐＨレベルで、特に約７ないし１２のｐＨ１より一般には９ないし１ １のｐＨでＨＲＰ−触媒された酸化を行うことが一般的実施である。しかしなが ら、高いｐＨレベルにおいて、ルミノールは、触媒酵素の不存在下でも塩基触媒 された酸化を受け、過酸化物消費、高い背景化学的発光となりそしてしばしば適 用不能な低いシグナル一対ノイズ比となる。

これらのｐＨ要求は、臨床的および研究用途へのベルオキシターゼ触媒されたル ミノール発光広い使用に重大な制限を与える。例えば、ベルオキシターゼ触媒作 用は、７ないし９のｐＨ範囲にわたって最も効率的であり、９以上のｐＨで、ベ ルオキシターゼは、実質的に低い活性を示す。しかしながら、オキシターゼ酵素 反応は、約５ないし７の至適ｐｉｔ範囲を有している。オキシターゼ酵素反応を 利用してベルオキシターゼ触媒れた表示系による測定用の基本的酵素法をもたら す場合に、過酸化水素を製造する基本的酵素法は、発光反応（高いｐＨが最適で ある）と発光強度並びに酵素−触媒反応の速度の過酷な前提条件なしには同時に 生じない。

背景を増加することに加えて、ベルオキシターゼ触媒された発光反応に必要とさ れる比較的に高いｐＨレベルが生物学的検体中の過酸化水素と還元成分との反応 速度を促進し、これによってルミノールと反応する前に過酸化水素を消費し、系 から観察される発光を減少し、そして興味ある被分析物の正確な測定を人工的に 干渉する。５ｅｉｌｘ、Ｗ、Ｒ，Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔ ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎ＋７ｍｇ１１ｃｍ１１７　Ｇｅｎｅ窒≠狽■ ｄ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ’　Ｍｅｔｂ、　ＥｎＢｍｏｌ、、　５７　第４４５〜４ ６２頁（１９７８年）を参照のこと。

Ｋ＋ｉｃｋ＋等の米国特許第４．５９８．０４４号明細書は、発光反応からの全 光散乱が一定のフェノール化合物を発光反応混合物中に添加することによって増 加すると言われている　（またはシグナル／ノイズ比が高揚される）ベルオキシ ターゼ酵素、オキシダントおよび２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン の高められた発光反応を記載している。しかしながら、この高められた検定法は 、なおもアルカリｐＨで行うのが好ましい。その他の発光物質のベルオキシター ゼ触媒された酸化を高めるかあるいは促進するのにフェノール性化合物を使用す うことも米国特許第４．５２１゜５１１号明細書に記載されている。高揚剤の使 用が発光測定を改良するということが示されているが、検定簡素および乏しいシ グナル対ノイズ比は、これらの発光系を臨床環境で広範に使用するのを妨げ続け ている。　゛フェノール性高揚剤を光散乱を増加するのに使用する「高められた 」発光検定において、試薬を化学的発光反応を行うのに必要とされる高いｐＨで 保持した際検定に使用する試薬の保存安定性に関する別の問題が記載されている 。この問題点を解決するために、ヨーロッパ特許出願公開第２３５．９７０号明 細書は、使用前に試薬のｐＨを約３ないし６の範囲で保持することを記載してい る。しかしながら、このヨーロッパ特許出願に記載された検定系において、アル カリ緩衝液を使用して反応混合物のｐＨを７ないし９の範囲の値に増加して効率 的な光散乱を得なければならない。

上記のこととは別に、光散乱反応のｐＨ依存性は、従来の検定としてのベルオキ シターゼ触媒された化学的技術の有効性を著しく制限してきた。従来技術の化学 的検定に関連する問題点および制限を克服する改良された化学的発光表示系に対 する強い要望がある。

上記の発光分析法に加えて、化学的発光をもたらす化学的反応が種々の生物学的 系で自然に生ずることが知られている。例えばミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ ）は、５％程度の鴫乳類ポリモルホン核（ＰＭＮ）白血球を構成するオキサイド リダクターゼである。過酸化水素の存在下でのジフテリア毒上のＭＰＯの解毒活 性は、最初にＡｇｎｚｒ　（Ｎｘｔｕ＋ｅ、　Ｖｏｌ、　＋５９．　ｐ、　２７ １．１９４７）により、ハライド供因子に対するその依存どして（＾ｇｎｕ、］ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　Ｖｏｌ、７４．ｐ３３４．１９５０；＾ｇｎｅｒ、　Ｒｅ Ｉ、　ｌｏｗ、　ｃｈｉｆｆｉ、A　Ｖｏｌ 、７４．　ｐ、３７３．１９５５：＾ｇｎｅ＋、Ａｂ＋ｌｒ、Ｃｏａ＋ｍｏｏｓ 　４１ｈ　Ｃｏｎｇ＋、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｙｉｅｏａｓ、ｐA６４．１９ ５８）により記載された。Ｅｅｃｈｅ＋１ｃｈｉｔ　ｅｏｌｉまたはＬｘｅｌｏ ｂｇｃｉｌｌｕｓ　＊ｃｉｄｐｈｉｌｕｓに対するＭＰＯ、ハライドおよび過酸 化水素のの抗微生物作用は、原生（すなわち、化学的発光基質添加せず）化学的 発光（Ａｌｌｅｎ、　５ｌｏｄｉｅ＋　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　 ｏｆＥｌｅ　−ｃｌ＋ｏｎｉｅ　Ｅｚｉｃｉｔｅｄ　５ｌｘｔｅ　ｔｎ　Ｈｕｍ ｔｎ　Ｐｏ１７ｍｏｆｐｂｏｎｕｅｌｅｕ　Ｌｅｕｋｏｃ７１Ｃｓ　ｘｎｄ@Ｔ ｈｅｉ＋　Ｐ ｘｒｔｉｃｉｐｘｌｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｉｅ＋ｏｂｉｏｃｉｄｔｌ　ｅｔｉｗｉ１ ７．’　Ｄｉｓ＋ｅ＋１１１ｉｏａ、Ｔａｌ＊ｎｅυｎｉｗ■秩{ｉ１７゜ １９７３年７月１３印　に伴い、そしてこれはｐＨ依存性（Ａｌｌｅａ、　Ｔｈ ｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐＨｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈ６ｍｉｌｕＩＩｉｎｕｅｅｎｌ　 Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｌｂｅ　Ｍ７ｅ１ｏｐｅ＋ｏｘｉｄｔｓｅ−Ｈ＊１ｉ ｄｔ−ＨＯＯＨ＾獅鰍奄高奄メ{。

ｂｉｘｌ　ＳＳ７５ｌｅ、’　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｅｎｄ　Ｂｉｏｐｈ７ｔ　Ｒ ｅＩ　Ｃｏａｔ、　Ｙｏｌ、　６３　Ｎｏ、　３．　ｐｐ、@６８４−６９１． １ ９７５）およびハライド依存（Ａｌｌｅｎ、　Ｉｌ＊１ｉｄｅ　Ｄｅｐｅｎｄｅ ｎｃｅ　ｏＨＩ　ｔｈｅ　Ｍ７ｅｌｏｐｅｒｏｘ山ｓｅ−Ｍ！ｄｉｚｌｅｄ　Ａ ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｚｌ　Ｓｙ＋ｌｅｍ　ｏｌ　Ｐｏｌｙｍｏ＋ｐｈｏｎａｅ ｌｅ＊ｒ　Ｌｅａｋｏｃ７１ｅ　ｉｎ@ｔｈｅ　Ｐｈｅｎ ｏ＋ｕｎｏｎ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｅｘｅｉｌｇｌｉｃｎ、’Ｂｉｏｃｈ ｅ＋＊、ｔｎｄ　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ　Ｃｏ１ｎ、、@Ｖｏｌ、６３　Ｎ ｏ、　３．　ｐｐ、　６７５−６８３．１９７５）である。

オキサイドリダクターゼエオシノフィルペルオキシターゼ（ＥＰＯ）は、エオシ ノフィル中で高い濃度で存在し、モしてＩＪＰＯのものと同様な反粒子機能を有 していることが知られている（Ｃｚａｌｌｉｅｌｄ　＋ｔ　ｓｌ、、１．　Ｃａ １１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、８６．　ｐｐ、６４−７６．１９８０１゜ＥＰ Ｏは、酸性ｐＨでの過酸化水素の存在下での塩化物イオンの亜塩素酸への酸化を 触媒する（Ｂｅｎ　ｅｔ　！１．．Ｓｏｍｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｔ　Ｈ ｕｍａｎ　Ｅｏ＋１ｎｏｐｈｉｌ　Ｐｅ＋ｏｘｉｄ■ ｌｅ、＾　Ｃｏｍｐａｒｉ　！ｏｎ　Ｗｉｔｈ　１ａｔｈｅｒ　Ｐｅｒｏｘ　ｉ ｄ　！Ｉｅｓ、’　８ｉｏｃｈｉｎ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ７ｔ@Ａｃｔ＋、、Ｙｏ １ ７ａ４．ｐｐ１７７−１８６．　１９８４）。その他のクロロベルオキシターゼ が知られており、そして文献中で特徴付けられている。例えば、Ｐ、　Ｄ、　Ｓ ｈｇｗ　＋ｎｄ　Ｌ、　Ｐ、　Ｈｘｇｅ＋　（ＩＡＣ３，Ｙｏ１８１、Ｎｏ、　 １００１．　ｐ、　６５２７．１９５１ｊＢＣ，Ｖｏｌ、　２３４．　ｐ２５６ ０．１９５９．　Ｖｏｌ、　２３４．　ｐ、@２５６５．１９６０　オヨ びＶｏ１２３６、ｐ１６２６．１９６１）により記載れたモールドＣａ１ｄ＋ｉ ｏｍ７ｃｅｔ　ｆｕｍ＊ｇｏから単離されたものである。

生体内原生ＭＰＯ／ＥＰＯ−ハライド−１（００）１抗微生物系（化学的発光性 基質の添加なし）が研究され、そして文献に報告れているが、検体中の被分析物 の存在または量の測定のためのハロペルオキシターゼーハライドーオキシダント ー発光基質表示系が当該技術分野において報告または提案されていない。

発明の開示 高感度化学的発光表示系を利用して従来の化学的発光表示系に固有の数多くの欠 点なしに液状の検体中の被分析物の存在または量の測定することができるという ことを見出した。新規の酸指摘化学的発光表示系は、ハロベルオキシターゼ（ハ ライド：過酸化水素オキサイドレダクターゼ）、ハライド、オキシダントおよび 化学的発光性基質を含んでなる。か＼る表示系は、化学的発光性基質と反応し。

て励起状態の酸化反応生成物をもたらす高感度のシングレット分子酸素（１０２ ＋の合成剤として作用する。次いで、励起状態の反応生成物は、測定可能な光を 放出しながら低いエネルギー状態（すなわち、基底状態）に開放される。本発明 の表示系への使用に好適なハロベルオキシターゼして、ミエロペルオキシダーゼ （ＭＰＯ）、エオシノフィルベルオキシターゼ（ＥＰＯＩ　、ラクトベルオキシ ターセ（ＬＰＯ）およびクロロベルオキシターゼ（ｃｐｏ）が挙げられる。好適 なハライドとして、臭素、塩素または沃素が挙げられ、ハロペルオキシターゼが ＭＰＯまたはＣＰＯの場合に塩素が好ましく、モしてハロペルオキシターゼがＥ ＰＯまたはＬＰＯの場合には臭素が好ましい。オキシダントは、過酸化物である ことが好ましく、最も好まシ、（は過酸化水素である。有効な化学的発光性基質 として、シングレット分子酸素により、亜ハロゲン化物によりまたは亜ハロゲン 化物および過酸化物により接触的に酸化されて測定可能な光を放出しながら低い エネルギー状態に開放される励起状態酸化反応生成物を得るものが挙げられる。

好ましい化学的発光性基質として、エンドペルオキサイド先駆体、例えば環式ヒ ーラジン類およびジオキシエタン先駆体が挙げられる。

表示系により散乱した光の量は、反応溶液に存在する各反応関与物の量に関連す る。従って、既知の非速度制限量の３種の反応関与物を、検定系に提供して試験 検体における第４の反応関与物の存在または量を測定する。試験検体における第 ４の反応関与物は、興味ある被分析物であることができあるいは興味ある最終的 被分析物を包含する１種類またはそれ違法の予備的反応を通じた試験検体中で製 造または消賀することができるが、第４の関与物の量は試験溶液中の被分析物の 量に関連する。従って、本発明の表示糸種々の被分析物の測定に利用できる。

非常に高感度であることに加えて、本発明の表示系は、酸性ないし弱塩基生成物 のｐｉ（範囲にわたって最も効率的に操作でき、従つて記述の従来ぐじゅつ化学 的発光反応条件の問題点を避ける。好ましくは、本発明の表示反応は、約３ない し８のｐＨ範囲で行われ、より好ましくは約４．０ないし約７０である。

また、本発明の表示反応が利用できる種々の検定フォーマット並びに本発明のハ ロペルオキシターゼ／ハライド／オキシダント／発光基質表示系を利用する検定 を行うのに使用するキットも記載する。

図面の簡単な説明 図１は、過酸化水素を代表的オキシダントとして利用する本発明の表示系の略図 である。

図２は、本発明の表示系におけるピーク化学的発光速度に対する過酸化水素濃度 の効果を示すプロットである。

図３＾および３Ｂは、本発明の表示系における化学的発光速度（ＹＣＬ、光散乱 速度）に対する過酸化水素濃度の効果を示す二重逆数プロ・・・トである。図３ ＾は、関係が一次である場合期待されたようなＶＣＬ対過酸化水素濃度の標準二 重逆数プロ・ソトにおいて直線が得られなかったことを示している。図３Ｂは、 過酸化水素濃度対ＶＣＬの平方根の逆数のプロッティングにより得られた略直線 的関係、すなわち、この反応が過酸化水素濃度に関して二次位数であることを示 している。比較のため、図３０（従来技術）は、従来のホースラディッシュペル オキシターゼ（ＩＩＩＩＰ）触媒された系における過酸化水素濃度に関して一次 位数であることを示している。

図４は、本発明の表示系におけるミエロペルオキシダーゼ触媒された光散乱速度 に対するクロライド濃度の効果を示す二重逆数プロットである。

図５は、本発明の表示系におけるミエロペルオキシダーゼ（ｒＭ　Ｊ　）または エオシノフィルベルオキシターゼ（ｒＥＪ）により触媒された光散乱速度に対す るクロライド濃度の効果を示す二重逆数プロットである。

発明の詳細な説明 本発明は広義には、検体中の被分析物の存在または量の測定可能な化学的発光表 示を発生するのにハロペルオキシターゼ依存表示系を使用することに関する。

本発明の表示系における一次反応体は、オキシダント、ハライド供因子および化 学的発光性基質を含んでなる。ハロペルオキシターゼ、好ましくはミエロペルオ キシダーゼ（ＭＰＯ）またはエオシノフィルペルオキシターゼ（ＥＰＯ）は、酸 性ないし弱塩基性ｐＨ範囲で化学的発光の製造を触媒し、高いシグナル対ノイズ 比を有する高感度被分析物測定系を提供する。

本発明の実施に使用されるようなハロペルオキシターゼは、ハライド（Ｘ−）： 過酸化水素オキサイドリデウーターゼとして作用する。触媒された反応は、２種 類のレドックス半反応と見なＩ７得る。ハライドは、対応する亜ハロゲン化物（ Ｏｘ−）および２価の還元等量（Ｈ″’＋ｅ−）に酸化される。

ハロベルオキシターゼ Ｘ−＋Ｈ２０−”　ＯＩ−＋２Ｈ”　＋　２ｅ−（１）オキシダント、例えば過 酸化水素は、２価の還元等量により還元されて水を形成する。

Ｈ，０２−１−２Ｈ’″＋２ｅ−→　２Ｈ２０（２）ネット反応（すなわち、反 応１）および２）の合計）は、過酸化水素と／飄うイドからの亜ハロゲン化物の ハロベルオキシターゼ触媒された製造である。

ハロペルオキシターゼ Ｈ，０２＋Ｘ−→　ＯＸ−＋）Ｔ２Ｏ（ｌおよび２のネット）（３）表示系にお いて製造された亜ハロゲン化物は、図１に示す通り以下の２種類の交互経路を潜 在的に反応する。図１においてジグレット分子酸素として同定された第１の経路 において、亜ハロゲン化物は、付加的過酸化水素分子と反応し、てハライドおよ びシングレット多価分子酸素ｆ１０２）　［Ｋａ＋ｈａ　ｅｔ　ａｔ、、Ｔｈｅ 　Ｐｂ７＋ｉｃｓ、　Ｃｈｅｍｉ＋ｌｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ７　ｏｆ　Ｓ ｉｎｇｌｅｌ　Ｍａｌｅｅｕｌｕ　Ｏｔ７ｇｅｎ、’　Ａｒ＋ｎｘｌｓ　ｏｆｔ ｈｅ@Ｎｅｗ　Ｙｏ＋ ｋ　Ａｃａｄｅｍ７　ｏｆ　５ｅｉｅｏｅｅ＋、Ｖｏｌ、　１７１．　ｐｐ？− ２３，１９８０にの文献は参考文献として本明細書に取り込まれている）に記載 されたシングレット酸素の製造の反応機構に従って酸素化反応を認められたスピ ンにおける設電試薬として関与することができる酸素の高い反応性分子種１とな る。シングレット分子酸素の亜ハロゲン化物からの製造を以下に表す： Ｈ，０２＋ＯＸ−−Ｘ−＋Ｈ２０＋　１０２　（４）反応３）および４）から得 られるネット反応は、１分子のシングレット分子酸素をもたらすハロペルオキシ ターゼおよびハライド供因子の存在下の２分子の過酸化水素の反応である。

へロベルオキシターゼ／Ｘ− ２Ｈ２０２＝　２Ｈ２０＋　’０２　（３および４のネット）（５）次いで、こ の系で製造されたシングレット分子酸素を、好適な化学的発光基質（ＣＬＳ）　 、例えば環式ヒドラジドと反応させてエンドペルオキサイド中間体とするかある いは分子酸素と反応してジオキソエタンまたはジオキシエタノン中間体とする数 多くの公知の有機分子基質と反応させる。これらの高エネルギー、二酸化化中間 体は、分裂を受けて電子的に励起したカルボニル部分にのちのは１）光の散乱を 伴って低エネルギーに開放されるかあるいは２）そのエネルギーをその他の分子 に移動し、該分子は順に光の散乱を伴って低エネルギーに開放される）を得る。

図１におけるハロゲン化−過酸化経路として同定されるような別の経路において 、反応３）で製造された上記亜ハロゲン化物は、直接化学的発光基質と反応して ハロゲン化化学的発光基質（ＣＬＳ４１を製造し、このものは順に過酸化水素と 反応して高エネルギー、上記二酸化中間体となる。いずれかの経路に関して、基 質の酸化および光の製造は、以下の通りに示される。

ハロペルオキシターゼ、　ｌＩ＋　、　！−ＣＬＳ＋２Ｈ２０２→　ＣＬＳ−０ ２＋２Ｈ２０（６ｇ）ＣＬＳ−０２→　Ｐ”　（６ｂ） Ｐｏ　→　Ｐ＋ｈν　（７） 式中、ＣＬＳは化学的発光基質であり、ＣＬＳ−０２は二酸化化中間体（例えば 過酸化物、エンドペルオキサイド、ジオキシエタンまたはジオキシエタノン）で あり、２京は高エネルギー反応生成物であり、Ｐは低エネルギー状態反応生成物 であり、モしてｈνはフォトン　（または散乱光量）である。５）〜７）から得 られる本発明の表示系の全ネット反応は、以下の通りにして示される。

ハロペルオキシラーゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　→ｐ＋ｈν　（５〜７のネット）（８）表示系により散乱 した光の量、ｈνは、反応混合物中に存在する一次反応関与物（オキシダント、 へロベルオキシターゼ、ハライドおよび化学的発光生成物基質）の容量に関連す る。従って、既知の非−制限量のいずれか３つの一次反応関与物の好適な反応条 件下に提供することによって、第４の一次反応関与物の存在または量が、系から 散乱した光（エネルギー生成物）を測定し、そして既知量の制限反応体を含有す る標準からのものと用いて測定応答を比較することによってただちに測定できる 。第４の一次関与物のうちの一つに加えて、その他の被分析物が、以下に詳述す るように３つの一次関与物のうちの一つの製造または消費となる１種類またはそ れ以上の予備反応を通して本発明の表示系により測定し得る。上記の反応機構を 図１に略解する。但し、過酸化水素を目下の好ましいオキシダントとして説明し 、そして！−、ＯＫ−、ＣＬＳ　、Ｐ＊およびＰは上記に定義した意味を持つ。

本発明に有効なハロベルオキシターゼは、ノ１ライドが電子ドナーまたは還元剤 であり、過酸化物が電子レシーバ−またはオキシダントであるノ１ライド、過酸 化水素オキサイドリディウーターゼ（例えば、Ｉｎｔｕｕｌｉｏ＋ｎｌ　Ｕｎｉ ｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ１＋！下でＥＣＮｏ、　１．１１．１．７およ びＥＣＮｏ、　１．１１．１．１０）として定義される。好適な好適な化学的発 光性基質のハライド依存発光反応を触媒するいずれのもの、例えば２゜３−ジヒ ヒドロー１．４−フタラジンジオン、例えばルミノールを、本発明の実施に使用 してもよい。本発明で記載されるような好適なハロベルオキシターゼとして、ミ エロベルオキシターゼ（ＭＰＯ）、エオシノフィルペルオキシターゼ（ＥＰＯＩ 　、ラクトペルオキシターゼ（ＬＰＯ）およびクロロベルオキシターゼ（ＣＰＯ Ｉが挙げられ、目下のところ好ましいハロペルオキシターゼはミエロペルオキシ ターゼおよびエオシノフィルペルオキシターゼである。ＩＩＰＯおよびＣＩ’０ が同様なハライド依存応答を示しそして更に後述するようにＥＰＯおよびＬＰＯ が同様なハライド依存応答を示すということを見出した。

ベルオキシターゼ酵素が本発明の発光反応に加わる形態は、考慮される検定の種 類に依存するであろう。ハロベルオキシターゼが標識として使用される場合、ベ ルオキシターゼは、代表的にはリガンド、例えばタンパク質、ホルモン、レクチ ン、ヘプテン、ステロイド、核酸、代謝産物、抗原、抗体、核酸プローブ、バク テリオファージまたはウィルスとカップリングされる。一般に、ハロペルオキシ ターゼは、結合基または橋かけアームを通してカップリングされる。好適な結合 基または橋かけアームおよびカップリング法は、当業者に明らかであり、そして リガンドへの化学的発光基質のカップリングに関して本明細書に記載したものを 包含する。別の検定形態において、へロベルオキシターゼ酵素は、溶液中で遊離 しており、あるいは従来法を用いて固形層またはマトリックスに固定されている 。

上記のように表示反応が過酸化物とハライドと反応して亜ハロゲン化物を形成す る反応および過酸化物と亜ハロゲン化物と反応してシングレット分子酸素（１０ ２）を形成する反応を伴うので、本発明の実施に使用する化学的発光基質（ＣＬ ＳＩ　は、シングレット分子酸素（１０２）により、亜ハロゲン化物によりある いは亜ハロゲン化物および過酸化物により接触酸化して測定可能な光の散乱を伴 って低エネルギー状態に開放される励起状態の酸化反応生成物を得るいずれの基 質であってもよい。

ある目下好ましい説明用の実施態様において、化学的発光基質は、本明細書に記 載する反応条件下に過酸化物またはエンドペルオキサイド中間体を与える環式ヒ ドラジドであることができる。好適な環式ヒドラジドは、式：（式中、Ｒ１はア ミノ、アミド、置換アミノまたは置換アミドてあり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は互 いに独立して０１〜Ｃ６アルキルまたはアルケニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜ｃ６ア ルコキシ、カルボニル、アミノ、アミド、置換アミノまたは置換アミドてあり、 あるいはＲ１とＲ２は一緒になってベンゾ基のアミノ、アミド、チヵンアミノま たは置換アミド誘導体である）の化合物を包含する。目下特に好ましい本発明の 実施態様は、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン　（ル ミノール）、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン　（イ ソルミノール）および７−ジメチルアミノ−ナフチレンー１．２−ジカルボン酸 ヒドラジドである。

一般に、環式ヒドラジドは、シングレット分子酸素（１０２）の存在下に電子二 酸化を受けて不安定な過酸化物またはエンドペルオキサイド中間体を製造し、こ の中間体は対応する電子的励起フタレートに再配列し、そして励起状態のフタレ ートは、以下の反応機構に従って光の散乱により開放される。

（式中、Ｒ１−Ｒ４は上記の通りである）。

別の目下のことろ好ましい説明用の本発明の実施態様において、化学的発光性基 質は、シングレット分子酸素と反応して対応する不安定なまたは安定な１．２− ジオキシエタン化合物を製造するジオキシエタン化合物であってもよい。不安定 な１．２−ジオキシエタンの製造は、光の散乱により開放される電子的に励起し たカルボニル生成物を得る速やかなジオキシエタン分解に伴う。安定な１．２− ジオキシエタンは、以下に更に記載するように後の化合物分解の「誘発」および 化学的発光測定のために発生または保存することができる。本発明の実施におい て化学的発光生成物基質として使用する好適な１．２−ジオキシエタンは、Ｋｏ ｐｅｃｋ７．　５７ｎｆｈｕｉｌ　Ｏｆ　１．２−Ｄｉｏｘｅｌ＊ｎｅＩｌ’Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃ＊ｌ　Ｇｅ口ｕｘｌｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｃｉｌｅｄ　５ｌａｔｅ、 ＾ｃ＋ｄｅ{ｎｉｃ　Ｐ＋ｅ ｌｉ、ｐｐ、８５−１４４．　１９８２に記載のようなシングレット分子酸素と 以下の通りに反応して対応する１、２−ジオキシエンを製造する反応性アリル水 素原子およびエネミンを欠くアルカン類を包含する。

が＼るジオキシエタン先駆体の代表例は公知である。例えば、Ｗｉｅ＋ｉｎｇｓ 　ｅｌ　１＋、。

Ｔ＋ｌ＋ａｈｅｄ＋ｏｎ　Ｌｅｆｔ、、　ｐｐ１６９−１７２．１９７２；　Ｂ ｓ＋ｔｌｅｌｔ　ｅｌ　ｉｆ、、Ｉ、ＡＩｌ、　Ｃｈｅｍ、rｏｃ、、　Ｙ。

１．９６．ｐｐ６２７−６２９，１９７４；Ｓｃｈｇａｐ、　Ｔ＋ｔｒ！ｌｕｄ ＋ｏｎ　Ｌｅｆｔ、、　ｐ９．１２７０等、１９７７Ｈｚａ汲撃奄求I ！！　ａｔ、、Ｊ、Ａｍ、　Ｃｔｕｍ、　Ｓｏｃ、、Ｖｏｌ、　１０Ｇ、　ｐ９ ．３１８−３２（ｌおよびｐｐ、　４９１６−４９１Ｌ　１X７８；および ２＋ｋｌｉｋｉ　ｅｌ　ａｔ、、Ｐｈｏｌｏｃｈｅｍ、Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、、 　Ｖａｔ、３０．　ｐｐ、　３５−４４．１９７４を参照の■■ 。化学的発光性基質は、１１２−ジオキシエタン化合物に対して安定なアルキレ ン先駆体、例えばヨーロッパ特許出願公開第０２５０５１＾２に記載のものであ ってもよい。

例えば、化学的発光性基質は、式 （式中、＾ｒＯＲはＲの除去により酵素変性または化学変性された際に不安定な オキサイド中間体１，２−ジオキシエタンを形成するＲ−オキシ基で置換された アリール環を有するアリール基である）の化合物であってもよい。特に、１．２ −ジオキシエタン先駆体は、式 （式中、Ｒ１およびＲ２は一緒におよびＲ３およびＲ４はスピロ融着したアルキ レンまたはアリール環として結合でき、モしてＲ１はアルキル、アルコキシ、ア リロコシ、ジアルキルまたはアリールアミノ、トリアルキルあるいはシリルオキ シおよびＲ２とスピロ融着したアリール基を包含するアリール基からなる群から 選択され、Ｒ２はＲ１を包含できそして活性剤により活性化されてＲが除去され た際に不安定なオキサイド中間体である１、２−ジオキシエタン化合物を形成す るＲ−オキシ基で置換されてもよいアリール基であり、Ｒ３およびＲ４はスピロ 融着した多環式アルキルおよび多環式アリール基として一緒に結合できるアリー ル基およびアルキル基からなる群から選択され、Ｒ−オキシ基は、ヒドロキシ、 アルキルまたはアリールカルボニルエーテル、無機オキシ酸塩、アルキルまたは アリールシリルオキシまたは酸素ピラノシジルである）の化合物であることがで きる。この群の化合物の特定の例として、　（メトキシ（２−ナフチル）メチレ ン）アダマンタン、（５−ｔｅ＋１−ブチルジメチルシリルオキシ−２−ナフチ ル）メトキシメチレン）アダマンタン、［（６−＋ｅ＋ｌＢ＋チルジフェニルシ リルオキシ−２−ナフチル）メトキシメチレン］　アダマンタン、［（６−アセ トキシ−２−ナフチル）メトキシメチレン［アダマンタン、［（６−アセトキシ −２−ナフチル）メトキシメチレンｌ　、２−ｔｅｒ＋−ブチル−ジメトキシシ リルオキシ−９Ｈ−イリデンアダマンタン、２−ヒドロキシ−９■−フルオレン −９−イリデンアダマンタン、（３−ｔｅ＋ｌ−ブチルジメトキシシリルオキシ ）−９Ｈ−キサンチン−９−イリデンアダマンタン、３−ヒドロキシ−９Ｈ−キ サンチン−９−イリデンアダマンタン、３−アセトラシー９Ｈ−キサンチン−９ −イリデンアダマンタン、３−ホスフェート−９Ｈ−キサンチン−９−イリデン アダマンタン、ビス（テトラエチルアンモニウム）塩および［（３−１ｓｒｆ− ブチルメチルシリルオキシフェニル］メトキシメチレン１アダマンタンが挙げら れる。この種のアルケンジオキシエタンは、本発明の実施において製造されたシ ングレット分子酸素と反応して比較的長い半減期を有する安定なジオキシエタン を製造する。従って、この種のジオキシエタン先駆体を化学的発光性基質として 使用することによって、安定なジオキシエタンの製造が規定時間間隔本発明の表 示系の活性の化学的統一を提供するかへる時間にわたって保存できる。所望によ り、製造されたジオキシエタンの化学的発光活性を、無機または有機活性剤、例 えば酸、塩基片、酵素またはヨーロッパ特許出願公開第０２５４０５１Ａ２号明 細書に記載のようなジオキシエタンを不安定化して励起したカルボニル基および 関連する化学的発光活性を製造する触媒の添加によって誘発する。この方法で、 興味ある特定の被分析物に対する検定デザインを、ジオキシエタン堆積の時間間 隔および化学的発光放出のタイミングを制御することによって最適化できる化学 的発光性基質が本発明の発光に加わる形態は、考慮下の検定の種類に依存する。

基質を標識として使用する検定において、基質は、リガンド例えばタンパク質、 ホルモン、ヘプテン、ステロイド、レクチン、核酸、代謝産物、抗原、抗体、核 酸プローブ、バクテリオファージまたはウィルスとカップルしたＣＬＳの置換誘 導体であることができる。例えば、ＣＬＳのアミノ基を直接リガンドにカップル でき、あるいは結合基または橋かけアームを通してカップルできる。好適な結合 基、橋かけアームおよび基質をリガンドにカップルする方法は、米国特許第４゜ ３８０、５８０号明細書、同第４．１０４．０２９号明細書および英国特許出願 公開第２．００８．２７４号明細書に記載されている。別の種の検定において、 基質は、リガンドとカップルされなくてよい。この場合、基質は、溶液中遊離し ているかあるいは従来方法を使用して固形層またはマトリックス上に固定するこ とができる。

本発明の実施に使用するのに目下のところ好ましいオキシダントは、式％式％ （式中Ｒは水素原子または１〜３個の炭素原子を有する短鎖アルキル基である） で表される過酸化水素またはヒドロベルオキサイドを包含する。オキシダント活 性は一般に、以下の通りにＲ鎖長が増加するにつれて減少する。Ｒ＝Ｈ＞＞Ｃ１ （３＞　ＣＨ３ＣＨ２＞　ｃＨ３（ＣＩ（２）２゜目下のところ特に好ましいオ キシダントは、非常に効率的なオキシダント活性ゆえに過酸化水素（Ｈ２Ｏ２） である。化学的発光オキシダントが標識として使用されるリガンドに接合される 検定フォーマット、例えば免疫検定において、既知量のオキシダントを反応系に 添加することができる。別の検定フォーマット、特に本発明の反応系がオキシダ ント、特に過酸化水素を発生する一次反応系、例えばオキシダーゼ触媒された反 応系にカップリングされる検定フォーマットにおいて、オキシダントは、未知と して反応系に存在することができる。

更に別の検定フォーマットにおいて、オキシダントをリガンドとまたは通常の方 法を用いた固形層またはマトリックスにカップリングすることができる。

本発明の表示系は、好適なハライドイオンの存在に存在している。本明細書にお いて使用されておるハライドは、ブロマイド、クロライドまたはアイオダイドで あることができる。特定の用途に利用される／＼ライドの選択および量は、種々 の因子、例えば検定系に使用するノ１０ベルオキシターゼ、反応混合物のｐｉｆ および必要とする化学的発光応答等に依存する。系に利用するハライドが電子的 に陰性であればあるほどあるレベルの化学的発光応答を得るに必要とされるハラ イドの濃度が増加するということが見出されている。Ａｌｌ＋ｎ、Ｒ，Ｃ，、ｔ ｌａｌｉｄｅ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆ　Ｍ７＋１ｏｐｅ＋Ｏ工ｉｄａｕ−ｍ ｅｄｉａｌ＋ｄ　Ａｏｌｉｅ＋ｏｂｉｉｌ　ＳＳ７５ｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｏ １Ｔｏｏ＋ｐｈｏ獅浮モ撃■■ Ｌｅｕｋｏｃ７ｔ＋　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍ＋ｎｘ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒ ｏｎｉｃ　Ｅｘｅｉｌｘｌｉｏｎ、’　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａ獅п@Ｂｉｏｐｈ ｌｌ、Ｒ＋＋、　Ｃｏｍｍ、　、　Ｖｏｌ、　６３．　Ｎ、　６７５−６８３． １９７５を参照のこと。本発明の表示系におけるハライドイオンの活性は一般に 、Ｂｒ−＞　Ｃｌ−＞　Ｉ−＞＞　Ｆ−であり、フルオライドイオンは通常はと んどまたは全く応答を与えない。アイオダイドイオンの存在が測定可能な化学的 発光をもたらすが、アイオダイドおよびその酸化生成物の既知の発光消去活性が いくつかの用途への使用、特に高いレベルの感度が必要とされる際にその望まし さを制限する。更にハライドの選択は、表示系に存在するハロペルオキシターゼ に依存する。ハロゲンベルオキシターゼがＭＰＯまたはＣＰＯである場合、ハラ イドは、ブロマイド、クロライドまたはアイオダイドであり得、好ましくはブロ マイドまたはクロライドである。しかしながら、ハロベルオキシターゼがＥＰＯ またはＬＰＯである場合、供因子としてクロライドは比較的効率が悪く、従って 好ましいハライドはブロマイドである。好適なへロベルオキシクーゼ／ハライド の組み合わせを利用しそして表示系のその他の要員が速度制限てない場合、ハラ イド濃度と化学的発光との関係は、実験速度式：％式％ （式中、速度Ｃ１，は化学的発光応答のピー・り測定速度であり（Ｉｍｘｘ　％ 最大強度としても記載される）、ｋは比例定数または速度定数であり、Ｘ−は試 験ハライドである　（すなわち、ハロペルオキシターゼがＭＰＯまたはＣＰＯで ある場合Ｘ−はＣＩ−またはＢ＋−であり、ハロペルオキシターゼがＥＰＯまた はＬＰＯである場合Ｘ−はＢｒ−である）により記載される。指数用語「１」は 、その他の反応体が非速度制限濃度で存在する場合反応がハライド濃度に関して 第１オーダーで適用することを意味する。

本発明のある実施態様において、試験検体におりるＭＰＯおよびＥＰＯの存在が 測定でき、そして針０およびＥＩ’Ｏが本発明の表示系を使用１．た検体の化合 ［またＢ＋−一依存ＭＰＯおよびＥＰＯ発光活性を測定することによって識別さ れる　（すなわち、分別定量できる）。本質的にＥＰＯ−依存である検体のＣｌ 　−依存発光活性も測定される。測定の好適な条件下に、検体のＭＰＯ含量は、 直接測定されたＴｏ−一依存またはＣＩ−一依存発光に比例し、一方ＥＰＯ含量 は、検体のＢｒ−一依存活性マイナスＣＩ−−依存発光活性に直接比例する。別 に言うと、単独のノ１ライド供因子としてＢＴ−を使用する本発明の反応条件下 での試験検体の発光苛性は、試験検体における１ｔｌＰＯおよびＥＰＯの両方の 活性を定量的に反射し、一方供因子としてＣＩ−を使用する発光活性は、ＭＰＯ の活性を主として反射する。ＣＩ−−依存発光活性とＴｏ−−依存発光活性との 比率を形成することによって、ＭＰＯ活性が試験検体において顕著である際に統 一性に到達し、モしてＥＰＯ活性が支配する場合非常に少なくなる定量的測定が 得られる。測定値を既知量のＭＰＯおよびＥＰＯを含有する標準溶液からのもの と比較することによって、試験検体のＭＰＯおよびＥＰＯ含量を定量する高感度 法が得られる。

ＭＰＯがポリモルフォ核白血球（ＰＭＮＬ）および血液単球の主要成分であり、 そＩ７てＥＰＯがニオシッフイル白血球の主要成分であるので、ハライド−依存 分別および定量の能力を、生物学的検体、例えば血液または血液成分、組織生体 検査検体、浸出液並びに分泌物おｃｌ−び排出物（例えば、尿、唾液および便） 等におｉＪるＰＭＮＬ、単球および／またはニオシッフイル白血球の存在または 量の検定に利用でき、それによって炎症プロセスに関連する重要な診断情報を提 供する。体液に存在する好中球の量は、自ずと感染、例えば骨髄炎、肯炎媒体、 卵管炎、敗血病、淋病、心内膜炎、水痘、ヘルペスおよびロッキーマウンテイン スポット熱；心筋梗塞、火傷および癌によつ壇血壊死病；代謝疾患、例えば糖尿 病性アシド−シス、類子がん症、尿毒症および甲状腺中毒、急性出血、外科手術 、過労によるストレス、妊娠の第３分の１期および出産；および炎症性疾患、例 えばリウマチ性関節炎、痛風、脈管症および筋炎により増加され、そして放射線 および色素剤による骨髄変形；感染、例えばチフス、ツラレミア、プルセフ病、 肝炎、インフルエンザ、麻疹、おたふくかぜ、風疹および感染性単核細胞症；肝 臓または保存疾患からの牌機能冗進症；コラーゲン小管傍患、例えば系狼癒紅斑 症；および葉酸およびビタミンＢ２の欠乏症により自ずと減少される。これに対 して、体液中のエツジフィルの量は、アレルギー疾虫、例えば喘息、枯草熱、食 品および薬剤過敏症、血清症および血管神経組織浮腫；寄生物症、例えば施血出 症、鈎血症、回虫およびアメーバ−症１皮膚疾患、例えば湿疹、天庖癒、乾癖、 皮膚炎およびヘルペス。

腫瘍性疾患、例えば慢性ミエローマ細胞白血病、ホジキンス病、固体腫瘍の転移 およびメクローシスによりそしてコラーゲン子管疾患、副腎皮質機能低下、潰瘍 性大腸炎、多発関節結節症、牌摘後、悪性貧血、深紅熱および過労により自ずと 増加され、そして外傷、ショック、火傷、外科手術およびメンタルジストレスに よりそしてクツシン症候群により自ずと低下される。従って、本発明の表示系を よび定量は、貴重な診断情報、例えばバクテリア　（発熱源）感染対寄生物感染 等の診断において貴重な診断情報を提供できる。

同様な方法で、ＣＰＯおよびＬＰＯ、ＬＰＯおよびＣＰＯおよびＥＰＯを定量・ 分別できる。従って、二種類のハライド−分別ハロペルオキシターゼを使用する 検定は、多重検定測定を満たす。

本発明の更に別の実施態様において、既知に量のハロペルオキシターゼを利用し 、検体の化合したＭＯＰ−（またはｃｐｏ−１依存発光活性を測定し、そして検 体のＥＰＯ−（またはＬＰＯ−１依存活性を測定することによって試験検体中の ｔｂ−およびｃｌ−の存在および量を分別定量できる。好適な反応条件下に、検 体のＢ【−含量は、検体のＥＰＯ−（またはＬＰＯ−）依存活性またはＭＯＰ− １またはＣＰＯ−）依存活性のいずれかと直接比例関係にあり、一方検体の０１ −含量は、ＭＯＰ−（またはＣＰＯ−）依存活性マイナスＥＰＯ−（またはＬＰ Ｏ−１依存活性に直接比例関係にある。ＭＰＯおよびＥＰＯ分別測定と同様な方 法で、ＥＰＯ−またはＬＰＯ−依存活性（Ｂ＋−一依存）とＭＰＯ−またはＣＰ Ｏ−依存活性（ＣＩ−およびＢＴ−一依存）との比率が、試験検体中のブロマイ ドまたはクロライドの有効な尺度として形成できる。

ハライドが被分析物でない用途において、ハライドは一般に、反応混合物中に非 速度制限的に最適な量で、通常は塩、例えばナトリウムハライドまたはカリウム ハライド等として供給される。別の用途において、ハライドを、被分析物、例え ばテンカン治療に関連し、て血液または汗クロライドまたは血液ブロマイドであ ってよい。

本発明に従って測定される被分析は、通常液状媒体またｊｔ検体に存在するであ ろう。分析される検体は、被分析物を含有すると疑われた自然発生的または人工 的に形成された液体であり得る。多くの場合、液状検体は、体液または体液を処 理または希釈して得られた液体、例えば血清、血漿、尿、便および羊水、大脳皮 買液およびを髄液である。固形勧賞、例えば食品、便および生体組織並びに気体 を本発明によりこれらを液状に還元することによって、例えば液体中への溶解、 液体中への懸濁または液体中げの抽出によって検定できる。

従来化学的発光表示系、特にベルオキシターゼ（例えば、ホースラデツィシュペ ルオキシターゼ等）触媒ルミノール酸化を使用したものとの際立って対照的に、 本発明の表示系は、酸性ｐＨで効率的に作用する。好ましい実施態様において、 表示系は、約３ないし約８、より好ましくは約４ないし約７のｐＨで上記の反応 （１）ないしく８）に記載された表示反応の際に保持される。酸性ｐＨで操作す ることによって、高感度およびハロペルオキシダーゼ−特異性表示が、従来のベ ルオキシターゼ化学的発光系を困難にした塩基触媒バックグラウンド化学的発光 なしで得られる。従って、本発明の検定系は更に、表示反応の際に酸性ｐＨを保 持するのに好適な緩衝液、例えば酢酸エチル／酢酸緩衝溶液を含んでなる。反応 系に特に干渉しないいかなる緩衝液もこのたｔに使用できる。

本発明の発光表示系からの光またはフォトン散乱も、第２の因子、例えば試薬濃 度、混合速度および散乱光の測定法によって影響される。利用する正確な反応条 件は、酵素触媒活性、反応運動、装置制限、反応感度およびバックグラウンドノ イズ干渉を包含する全反応パラメータを最適化するように選択する。

本明細書で記載する発光反応から得られる光（フォトン）散乱の物性は、化学的 発光性基質の特賞に主として依存しモしてハロペルオキシターゼ、オキシダント およびハライドの特質に二次的に依存する。ルミノールを化学的発光性基質とし て使用する場合、最大スペクトル散乱は、４３０〜５０ＧＩｌ＋ａ　（青緑光） の範囲内である。検定法で製造された光散乱は、発光基質がその最大スペクトル 散乱を示す部分のスペクトルにおいて適当な感度を有する光感受性測定機により 測定できる。

一般には、３５０ないし６５ｈｍの範囲にわたって適当な感度を有する光電池、 光ダイオード、光抵抗またはビアルカリフォトマルチブライヤーが本発明の実施 に使用するのに好適である。

特定の時間点において散乱した光の強度は、反応系の反応速度に比例し、従つて 反応系における未知の量と関連する。反応系から散乱した光の速度（ｔｌｈν／ ｄ１）または強度（＋）は、反応成分および未知物質を混合した際に基底バック グラウンドレベルから最大値（Ｉｍａｘ　）またはピーク速度に増加し、従って 未知物質が消費されるにつれて基底バックグラウンドレベルに減少する。従って 、系のＩｍａｘは、反応混合物中の未知物質の存在または量の相対的尺度として 使用できる。Ｉｍａｘに加えて、系から散乱したその他の運動表示を使用して直 接的にまたは間接的に検体における未知物質の存在または量を測定することがで きる。例えば、全散乱光（すなわち、主要時間間隔にわたって散乱したフォトン の数の積分または和）、ピーク散乱光強度、光散乱のピーク加速度（すなわち、 ｄ２ｈν／（ｆｌｌ１２またはｄｖ／ｄｌまたはｄｌ／ｄ＋）または主要時間間 隔内での発光の速度または加速度の最高値を、測定尺度として使用できる。従っ て、検定系により散乱した光を測定するのに利用する装置は、データ、データ保 管、検定関数の尺度、誘導または統一を行うのに必要とされ望ましいので付加的 に好適な機械的または電子的装置を含んでなることができる。

本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、検体における被分析物の存在または量 の測定用のあるいは被分析物の局所化のための広い範囲の検定フォーマットおよ び環境に利用できる。例えば、ハロペルオキシターゼ反応系を、検定系の反応体 のうちの１つの存在または量の測定に、免疫検定およびタンパク質結合検定に、 ターンオーバー検定に組織的染色のため、再分布を行うトレース検定のためにま たは当該技術分野に周知のその他の検定に使用できる。

本発明のある実施態様において、ハロベルオキシターゼ検定系を利用して検体中 の存在または未知量のオキシダント、例えば過酸化水素を測定できる。図３０に 示すように過酸化水素に関して一次反応である過酸化反応によるルミノールの非 −ハライド依存ベルオキシターゼ触媒酸化とは際立って対照的に（Ｄｕｒｅ　ｃ ｌ　ｔｌ、ｍ５ｔｕｄｉｅ＋　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎ！５ｃｅｎｃｅ 　ｏｆ　Ｂ＊ｌ畠ｎｏｇｌｏｃｓａｓ　ｂｉｍｕｉｅｎｓｉ＊　ｂｔｎｃ撃刀A ’ ］、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、　２３９．　Ｎｏ、　７．１１９． ２３５１−２３５９．１９６４）、本発明のハロペルオキシ^ ーゼ発光表示系は、図３Ｂに示すように過酸化水素に関して二次反応である。こ の反応は、実験速度式： ％式％（１２） （式中、１ｍｘｒまたはピーク速度はピーク測定化学的発光強度（速度）であり 、ｋは速度定数または比例定数であり、［１１２０２］　は過酸化水素濃度であ る）によって表すことができる。次数「２」は、その他の反応成分が非速度制限 的である場合反応が過酸化水素に関して二次にあてはまることを示す。従って、 本検定系は、従来のベルオキシターゼ触媒系で得られた正比例とは反対に過酸化 水素濃度の平方に比例する高感度発光応答を提供する。

いくつかの適用において、自ずと検体に存在するオキシダント例えば過酸化水素 の存在または量を測定することが望ましい。付加的に、過酸化水素発生または消 費酵素の活性の尺度としての過酸化水素の測定または過酸化水素発生または消費 酵素に対する非分析基質の存在または量の測定に主として基づいている数多（の 診断検定系が公知である。例えば、種々の非分析物、例えばグルコース、ガラク トース、コレステロールおよび尿酸の測定は、特定のオキシターゼ酵素（例えば 、グルコースオキシターゼ、ガラクトースオキシターゼ、コレステロールオキシ ターゼおよびウリカーゼ）の作用に基づいて過酸化水素を製造し、製造された過 酸化水素の量の測定を行う。生成物過酸化水素と基質被分析物との比率が統一さ れると　（すなわち、Ｈ２Ｏ２の発生が基質被分析物に関して一次である際）、 例えばグルコース／グルコースオキシラーゼ反応の場合および一次酵素反応が制 限的でない場合、本発明のハロペルオキシターゼ表示系は、以下の実験式を得る 。

ｆｉｘｘ＝　ｋ　［被分析基賀コ’　（１３１（式中、　ｌｌ１１！およびｋは 既に定義された意味を持つ）。

全酸素並びにＰＯ２（酸素分圧）もこのアプローチを使用して測定できる。酸素 は、オキシダント、例えばグルコースオキシターゼ用の基質であり、そしてそれ ゆえ酸素消費の速度は、過酸化物製造の速度に定量的に比例する。系のその他の 成分が制限的でない場合、酸素をハロペルオキシターゼ表示系を使用して発光度 として定量できる。

従って、例えば興味ある被分析物が１種類またはそれ以上の酵素段階または非酵 素段階で反応して生成物を製造し、ついでこの生成物を１種類またはそれ以上の 付加的酵素段階または非酵素段階で反応して過酸化水素またはその他のオキシダ ントを主として得るまたは消費する際に（その存在および量を次いで本発明に従 って測定する）、その他の反応系を本発明のハロペルオキシターゼ表示系とカッ プリングできる。従ってこの実施態様において、本発明のハロペルオキシターゼ 表示系は、被分析物が１種類またはそれ以上の過酸化水素はたはオキシダント） を反応生成物として製造するかまたは反応体として消費する１種類またはそれ以 上の予備反応（または補助反応）に添加し、次いで反応混合物中に存在する過酸 化水素の量を検体に元々存在する被分析物の存在または量の測定として本明細書 に記載された方法に従って測定する。オキシダントを製造する本発明のカップリ ングされた反応は、以下の反応経路に従うであろう。

被分析物　＋０２　→　ＯＡ＋Ｈ２０□　（１４）ハロペルオキシラーゼ／ハラ イド ２Ｈ２０２＋　ＣＬＳ　→ｐ＋ｂν　（８）（式中、０＾は被分析物の酸化誘導 体であり、ＣＬＳおよびＰは上記に定義された通りである）。被分析物を、例え ば被分析物オキシダーゼの作用により直接酸化してもよい。代わりに、被分析物 を１種類またはそれ以上の反応生成物であってこれを反応（１４）に従って酸化 して過酸化水素を製造するその他の予備反応を行ってもよい。更に別の実施態様 において、被分析物は、その活性が本発明の表示系により説明される酵素、例え ばオキシダーゼであることができる。オキシダントを消費する本発明のカップリ ングされた反応は、例えば以下の反応経路であることができる。

被分析物　＋１１２０２　→Ｏ＾＋Ｈ２０（［５）ハロベルオキシラーゼ／ハラ イド ２Ｈ，Ｃｈ＋ＣＬＳ　−Ｐ　＋　ｂν　（８）（式中、混は被分析物の酸化誘導 体である）。再び、被分析物は、反応（１５）に従って過酸化水素と反応性のま たは過酸化水素を消費する１種類またはそれ以上の生成物を形成するその他の予 備的反応を行うことができる。被分析物が１種類またはそれ以上の予備的反応で 反応して過酸化水素を消費する場合、既知量の過酸化水素を、代表的に添加して 、そして過酸化水素の消費を表示反応（８）に従って監視または測定する。

種々の被分析物を測定するための本発明の表示系とカップリングした反応をもた らす予備的オキシダント反応の代表例は以下の通りである。

過酸化水素製造予備反応 被分析物：グルコース グルコースオキシターゼ グルコース＋０２→　グルカノ−δ−ラクトン　＋　Ｈ２Ｏ２ハロベルオキシタ ーゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　−ｋＰ　＋　ｈν被分析物：エタノール（およびその他の 第１アルコール）オキシダーゼ 第１アルコール＋０２→　アルデヒド　＋２Ｈ２ｏ２ハロペルオキシターゼ／ハ ライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｂν 被分析物：コレステロール オキシダーゼ コレステロール　＋　０２　→　コレステノン　十　Ｈ２０ｘハロペルオキシタ ーゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　−＊Ｐ　＋　ｈν被分析物：コリンステラーゼ アセチルコリンステラーゼ アセチルコリン　＋２Ｈ２０２→　アセテート　＋　コリンコリンオキシターゼ ハロペルオキシラーゼ／ハライド コリン　＋２０２　→　ベタイン　＋２Ｈ，０２２Ｈ２０２＋　ＣＬＳ　−”　 Ｐ　＋　ｂν被分析物：尿酸 ユリカーゼ ウレート　＋０２　→　アラントイン　＋　Ｈ２Ｏ２ハロベルオキシターゼ／ハ ライド ２Ｈ２０□　＋ＣＬＳ　４Ｐ＋ｈν 被分析物・乳酸（ラクテート） ラクテートオキシターゼ Ｌ−ラクテート　＋０２　→　ピルベート　＋　Ｈ２Ｏ２ハロベルオキシターゼ ／ハライド ２　Ｈｚ　０２　＋　ＣＬＳ　→ｐ＋ｈν被分析物・ピルビン酸（ピルベート） ピルベートオキシターゼ ビルベート＋ＰＯ４＋０２→アセチルオスフェート＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２ハロベル オキシターゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋　ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｈν被分析物：ピルビン酸（別経路）または ＮＡＤＩ（ピルベート　十Ｈ’　＋　ＩＩＡＤＩＩ　→　Ｌ−ラクテート　十Ｎ Ａ［ｌ”ラクテートオキシターゼ Ｌ−ラクテート　＋０．　→　ピルベート　＋　Ｈｔ　Ｏｘハロベルオキシラー ゼ／ハライド ２Ｈ２Ｃｈ　＋ＣＬＳ　−Ｐ　＋　ｂν被分析物：乳酸またはラクテートデヒド ロゲナーゼラクテート　デヒドロゲナーゼ し−ラフチー１−＋ＮＡＤ＋　時　ピルベート　＋１ｌＡＤｌｉ　＋　Ｈ’ビル ベートオキシターゼ ビルベート→−Ｐ０４＋０２−４アセチルホスフェート＋ＣＯ２＋Ｈ２０２ハロ ペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ，Ｏ，＋　ＣＬＳ　→Ｐ＋ｈシ 被分析物：血清グルタミンピルベートトランスアミラーゼ（ＳＧＰＴ）またはア ラニンアミノトランスフアーゼ（ＡＬＴＩ ＬＴ し−アラニン＋α−ケトグルタレート　−ゆ　ピルベート＋１．−グルタメート ピパレートオキシターゼ ピルベート→−ＰＯ４＋ｏ、→　アセチルホスフェート＋ＣＱ２＋Ｈ２０ｗハロ ベルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｈν 被分析物：血清グルタミンオキシ乳酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）またはア スパラテートトランスファーセ（＾ＳＴ） ＳＴ し−アスパラテート＋α−ケトグルタレート　→オキサロアセテート＋Ｌ−グル タメート オキサロアセテートオキシターゼ オキサロアセテート　−　ピルベート　＋ＣＯ２ピパレートオキシターゼ ピルベート＋ｐｏ、　＋ｏ２　→　アセチルホスフェート＋Ｃｏ２＋Ｈ，０２ハ ロペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ２０，＋ＣＬＳ　−４Ｐ　＋　ｈν被分析物：クレアチンキナーゼ（ＣＫＩ Ｋ クレアチンホスフェート　＋ＡＤＰ　→　クレアチニン　＋ＡＴＰグリセロール キナーゼ グリセロール＋＾ＴＰ→　グリセロール−３−ホスフェート　＋ＡＤＰグリセロ ール−３−ホスフニートオキシターゼグリセロールー３−１’０４＋ｏ２→ジヒ ドロキシアセトンホスフエート＋Ｈ７０２八ロベルオキシターゼ／ハライド ２Ｈｚ　０２　＋　ＣＬＳ　−＋Ｐ　＋　ｈν被分析物：クレアチニン クレアチニナーゼ クレアチニン　＋Ｈ，Ｏ→　クレｒチンクレアチンキナーゼ クレアチン　＋　ＡＴＰ→　クレアチンホスフェート　＋ＡＤＩ’ピルベートキ ナーゼ 八〇Ｐ＋　ホスフォエノールピルベート　→　ピルベート　＋ＡＴＰピパレート オキシターゼ ピルベート＋Ｐ０４＋０２　→　アセチルホスフェート＋Ｃｏ２＋Ｈ２０□ハロ ペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　−ｈＰ　＋　ｂｖ被分析物：クレアチニン（別経路） クレアチニナーゼ クレアチニン　＋Ｈ２０→　クレアチンクレアチニナーゼ クレアチン　→　サクロシン　＋尿素 サクロシンオキシターゼ サクロシン＋ｏ２→　グリシン　＋ホルムアルデヒド　＋Ｈ２０゜ハロペルオキ シラーゼ／ハライド ２Ｈ，０２＋ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｈν 被分析物：クレアチニン（別経路） クレアチニンイミノヒドラーゼ クレアチニン　→Ｎ−メチルヒダントイン　十ＮＨ３グルタミンデヒドロゲナー ゼ ＮＡＤＩＲ−ＮＨ４＋　＋２−オキサグルタラード　→ＮＡＤ＋　＋　Ｌ−ラク テートデヒドロゲナーゼ ＮＡＤＩＩ１−ラクテート　→ＮＡＤＨ＋　Ｈ＋＋ビルベートビルベートオキシ ターゼ ピルベート　＋　ＰＯ４＋Ｏ，→７−ｔ？チルホスフェート　＋Ｃｏｗ　＋Ｈ２ Ｃｈハロペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈｘ　Ｏｘ　＋　ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｈν被分析物：クレアチン クレアチニナーゼ クレアチン　→　サクロシン　＋尿素 サクロシンオキシターゼ サクロシン＋０２　→　グリシン　＋ホルムアルデヒド　＋Ｈ２０゜ハロペルオ キシラーゼ／ハライド ２Ｆ（２０２＋　ｃｔｓ　→ｐ＋ｈν 被分析物・アンモニア グルタミンデヒドロゲナーゼ ＮＨ４＋　＋　ＮＡＤＨ＋α−グルタミナーゼ→Ｌ−グルタメー１−＋　ＮＡＤ ＋　＋Ｈ，０ラクテートデヒドロゲナーゼ ＮＡＤＩＩＬ−ラクテート　→ＮＡＤＨ＋　ｌｌ＋＋ピルベートビルベートオキ シターゼ ピルベート十ＰＯ４＋　０２　→　アセチルホスフェート＋ｃｏ２＋Ｈ，ｏ□ハ ロペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ，０２＋ＣＬＳ　−４Ｐ　＋　ｈν被分析物：尿（血液尿素窒素ＢＲＩＭ） ウレアーゼ 尿→２ＮＨ４＋　＋　ＣＯ２ グルタミンデヒドロゲナーゼ ＮＨ４＋　＋　ＮＡＤＨ＋α−グルタミナーゼ→Ｌ−グルタメート＋ＮＡＤ＋　 ＋Ｈ２０ラクテートデヒドロゲナーゼ ＮＡＤＩＩＬ−ラクテート　→ＮＡＤＨ＋　Ｈ＋＋ビルベートビルベートオキシ ターゼ ピルベート＋　ＰＯ４＋０２　→　アセチルホスフェート＋ＣＯ□＋Ｈ，０２ハ ロペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋　ＣＬＳ　＝　Ｐ　＋　ｈシ一般に、本発明の表示系は、表示系で 操作可能な１またはそれ以上の反応段階でオキシダント、例えば過酸化水素を製 造する酵素反応とカップリングできる。

限定されるものではないがか＼る酵素の代表例は、グリコレートオキシターゼ、 グルコースオキシターゼ、ヘキソースオキシターゼ、コレステロールオキシター ゼ、アリールアルコールオキシターゼ、Ｌ−グロノアセトンオキシターゼ、ガラ クターゼ、ビラノースオキシターゼ、Ｌ−ソルボースオキシターゼ、ピリドキシ ンオキシターゼ、アルコールオキシターゼ、Ｌ−２−ｈドロキン酸オキシターゼ 、エクドソームオキシターセ、コリンオキシターゼ、アルデヒドオキシターゼ、 キサンチンオキシターゼ、ピルベートオキシターゼ、Ｄ−アスパラテートオキシ ターゼ、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ、アミンオキシターゼ、ピリドキサミンホス フエートオキシターゼ、Ｄ−グルタメートオキシターゼ、エタノールアミンオキ シターゼ、チラミンオキシターゼ、プラスシンオキシターゼ、サルコシンオキシ ターゼ、Ｎ−メチルアミノ酸オキシターゼ、トメチルリシンオキシターゼ、ヒド ロキシルニコチンオキシターゼ、ニトロエタンオキシターゼ、アセチルインドキ シルオキシターゼ、ウレートオキシターゼ、ヒドロキシルアミンアミンオキシタ ーゼおよびサルフィットオキシターゼを包含する。

種々の被分析物の存在を量を測定するための本発明の表示系とカップリングされ る予備オキシダント消費反応の代表例は、以下の通りである。

過酸化水素消費予備反応 被分析物：　ＮＡＤＨ ＮＡＤＨベルオキシターゼ ＮＡＤＩＩ　＋Ｈ２Ｏ２→ＮＡＤ＋　＋２Ｈ，０２ハロペルオキシターゼ／ハラ イド ２Ｈ，Ｏ，＋　ＣＬＳ　→ｐ＋ｈν 被分析物：　ＮＡＤＰＨ ＮＡ［ｌＰＨベルオキシターゼ ＮＡＤＰＨ＋Ｈ２Ｏ２→ＮＡＤＰ＋＋２Ｈ，０２ハロペルオキシターゼ／ハライ ド ２　Ｈ２０ｘ　＋　ＣＬＳ　→ｐ＋ｈシ被分析物：脂肪酸（例えばパリルミテー ト）脂肪酸ベルオキシターゼ 脂肪酸　＋２Ｈ２０２＝　脂肪アルデヒド　＋００２＋２Ｈ２０２ハロペルオキ シターゼ／ハライド ２Ｈ，０２＋ＣＬＳ　−＋Ｐ　＋　ｂν被分析物：フェロシトクロムＣ シトクロムＣ ２（フェロシトクロムｃ）＋Ｈ２０２→　２（７ｚｏシトクロムｅ）＋２Ｈ，０ ハロペルオキシターゼ／ハライド ２Ｈ，０２＋ＣＬＳ　４Ｐ　＋　ｈν 被分析物二カタラーゼ カタラーゼ ２Ｈ２０２→Ｑ２＋２Ｈ２０ ハロペルオキシラーゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋　ＣＬＳ　→Ｐ　＋　ｈｖ被分析物：ペルオキシターゼ ベルオキシターゼ ドナー　＋Ｈ２Ｏ２→　酸化ドナー　＋２Ｈ，Ｏ□八へベルオキシターゼ／ハラ イド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　−＊Ｐ　＋ｂν 被分析物：グルタチオン グルタチオンベルオキシターゼ ２（グルタチオン）＋Ｈ２０，→　酸化グルタチオン　＋２Ｈ７０ハロペルオキ シターゼ／ハライド ２Ｈ２０２＋ＣＬＳ　→ｐ＋ｈν 本発明のへロベルオキシターゼ表示系はまた、特定の結合検定、例えば本発明の 検定系により測定可能な標識基質を使用する免疫検定にも適用可能である。特定 の結合検定としては、ハロベルオキシターゼを当該技術分野に周知の均一または 不均賀検定系における標識として使用する系、例えば米国特許第３．６５４．０ ９０号明細書、同第３，８１７，８３７号明細書、同３．８３９．１５３号明細 書、同第３．８５０．７５２号明細書、同第３．８７９．２６２号明細書および 同第４．３８０．５８０号明細書に記載の系、または発光基質、オキシダントま たはハライドを同様に周知の系における標識として使用する系、例えば米国特許 第４．１３４．７９２号明細書、同第４．２３８．１９５号明細書、同第４．２ ３８．５６５号明細書、同第４．２７３．８６６号明細書、同第４．２７９．９ ９２号明細書、４、３７２．７４５号明細書、同第４．３８０．５８０号明細書 および同第４．３８３．０３１号明細書に記載の系が挙げられる。

免疫検定と関連して使用する場合、本発明の表示系を用いて検定しようとする被 分析物は、リガンドおよびリガンドレセプターを包含する免疫学的対の一員であ ってよい。本発明の表示系のうちの１つの成分を免疫学的対の１つに接合するこ とによって反応混合物中の被分析物の存在は、表示系によってもたらされる光の 性質または量を影響する。次いで、光の散乱が測定しようとする検体中の被文型 物の存在または量に定性的にまたは定量的に関連する。本発明の表示系は、当該 技術分野に周知の直接結合または競合結合免疫検定技術のいずれにも利用できる 。

直接結合技術において、被分析物（すなわち、リガンド）を含有する疑いのある 検体を、表示系および特定のリガンドのパートナ−を含んでなる接合体と接触さ せる。次いで、接合体の活性が検体中のリガンドと接合体における特定の結合パ ートナ−との結合の範囲に直接関連する。定量的結果を得るために、特定の結合 パートナ−接合体の量は、通常検体に存在すると考えられる全てのリガンドと結 合できるものの過剰量で用意する。

競合結合技術において、検体をリガンドの特定の結合パートナ−と、そしてリガ ンド（またはリガンド類縁体）と接合される表示系の成分と接触できる。検体に おけるリガンドが特定の結合パートナ−上の結合部位にお関するリガンド（また はリガンド類縁体）接合体と競合するので、複合特定結合パートナ−の化学的発 光活性は、検体におけるリガンドと特定の結合パートナ−との結合の範囲に反比 例して変化する。定量的結果を得るために、利用する特定の結合パートナ−の量 は、代表的には検体に存在すると考えられる全てのリガンドおよび表示系の成分 と接合する全てのリガンド（またはリガンド類縁体）と結合できるものより少な い。

直接または競合検定フォーマットのいずれかにおいて、表示系によりもたらされ た化学的発光は、検体中の被分析物の存在（定性）または量（定量）の表示であ る。被分析物の定性測定は、化学的発光反応の特徴を被分析物のない監視反応の ものと比較することを包含するが、相違は検体における被分析物の存在の表示で ある。検体の定量測定は、代表的に化学的発光反応の特徴を既知量の被分析物を 含有する監視反応のものと比較することを包含する。検定が被分析物とその特異 結合パートナ−との間で形成された複合体を反応混合物から分離する分離段階を 含んでなる場合、定性または定量的則的は、検定の分離または非分離成分のいず れかに対して行い得る。

免疫学的対の一員とは、検定が２種類の異なる分子であって分子のうちの一方が 特定の他方の分子の特定の空間的および／または極性組織と特異に結合する表面 上または孔中の領域を有する分子を包含することを意味する。免疫学的対または 特定の結合パートナ−は、当該技術分野において一般にリガンドまたはレセプタ ー　（またはアンチリガンド）と言われている。リガンドは、レセプターが自ず と存在するまたは製造できる有機化合物であることができ、代表的には抗原また はヘプテンである。レセプター（またはアンチリガンド）は、独立部分、例えば リガンドのエピトープ、を認識または特異に結合することができる化合物または 組成物であり、そして抗体、酵素Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸プローブ 等であることができる。

免疫検定等のいくつかの実施態様において、レセプター上の結合部位に対するリ ガンドと競合するリガンド類縁体を利用できる。リガンド類縁体は代表的には別 の分子を有する類縁体、例えば表示系の成分のうちの１つを接合する意味を有す る変性されたリガンドである。

本発明の免疫検定は、検体からの非分析物の分離を促進する固形相を含んでなる 。好適な固形相は、免疫額的対の一員をその表面に共有結合または非共有結合す ることができる多孔性または非多孔性表面であり得る。数多くの好適な固形相物 質、例えばポリマー状物質、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレ ン等が当該技術分野に公知である。多くの官能性基を、免疫学的対の一員の共有 結合用の非反応性固形相表面を変性するのに利用でき、ハライド、エポキシド、 非−オキシカルボニル部位、メルカプタン等を包含する。免疫学的対の一員の結 合は、直接的または例えば特定の結合対の仲介を介して間接的であることができ る。固形相は、例えばポリ　（アミノ酸）、例えばポリリシンで、検定の必要な 成分の固形相への結合を補助するために、あるいは検体成分の固形相への非特異 結合を禁止するための被覆してもしなくともよい。代表的な固形相として、コン テナー壁、例えばマイクロタイタープレートのウェル、パン、ビーズ、粒子、磁 性ビーズ、ゲル、計量棒、フィルター、好アルコールまたは非分アルコールマト リックス等が挙げられる。物質改良剤および形状を包含する固形相の特徴および 形状は、固形相が本発明の検定の性能に必要な性質を保持する化合物グリコール 本発明に臨界的でない。

上記から明らかな通り、本発明の表示系は、特定の検定に依存するものではなく 、そして当該技術分野に公知の数多くの従来の均質および不均質検定機構に広く 適用可能である。

本発明の更に別の実施態様において、使用の容易性、結果の再現性を促進しそし て検定表示系の感度を高めるためにキット形態で試薬が提供される。本発明のキ ットは、１種類またはそれ以上の第１表示系試薬、すなわち、ハロペルオキシタ ーゼ、ハライド、オキシダントおよび化学的発光性基質を規定の形態で希釈また は直接適用するのに好適な濃度で含んでなる。特定の検定系、例えば免疫検定に 使用するために、本発明のキットは更に、助剤、例えば緩衝液、希釈剤、不活性 タンパク質、安定剤等が特定の性能に必要とされる場合歯んでなる。

先の記載は、以下の代表的な実施例により良好に理解されるであろう。実施例は 、説明のために与えたものでありこれに限定されるものではない。

実施例 実施例の方法に使用する検定試薬のストック溶液は、実施例において特に断りの ない限り以下の通りにして製造した。

０．０５Ｍルミノールのジメチルスルホキシド溶液０．４ｍｌを５０ｄ酢酸緩衝 液、　ｐＨ５，０１１に添加することによって約０．２ｍＭルミノールストック 溶液を製造した。ルミノールの実際の最終濃度（すなわち、０．１７Ｉｌ１Ｍ） を、３４７ｎｍにおける７、　６　ｍＭ−１ｃｅ−１の消失係数を使用して測定 した（Ｌｅｅ、ＩおよびＨ，Ｈ，Ｓ！ｌｉｇｅ＋、Ｐｈｏｌｏｅｈｅｍ、Ｐｈｏ ｌｏｂｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　１５．　ｐｐ、　２２７−２３７．１９７２年）。

過酸化水素標準濃度溶液を、３０％Ｈ２Ｏ２ストック溶液を８２０で希釈するこ とによって調製した。実際の過酸化水素濃度を、３５０ｎｍにおける４３．６　 ｍＭ　−１ｅａ−１の消失係数を使用して測定した（Ｎｏｂｅｌ、　Ｒ，Ｗ、お よびＱ、　ｌ（、Ｇｉｂ＋ｏｎ、　１．　Ｒｉｏｔ、　Ｃｌｕｍ、　Ｖｏｌ、　 ２４５D　Ｐ ｐ、　２４０９−２４１３．１９７６）。

ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）およびエオシノフィルペルオキシターゼ（Ｅ ＰＯ）を、ブタ白血球から調製した。クロロｐｔｌｌ　（ＣＰＯ，Ｅ、　Ｃ，Ｎ ｏ、　１．１１．１．１０）、ラクトペルオキシターゼ（ＬＰＯ）およびホース ラデツィシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社 （米国、ミズリー州５　セントルイス）からの凍結粉末として得、そＬテＭＰＯ 、ＥＰＯ、ＬＰＯおよびＨＲＰを０５％　ツイーン８ｏを含有する０、　１５ｍ Ｍハライドのない燐酸緩衝液中で再構成し、同一のハライドのない燐酸緩衝液で 透析し、そして使用まで４℃で保存した。ＣＰＯを、透析しない以外は同様の方 法で再構成および操作した。各ハロペルオキシターゼ（ＸＰＯ）製剤は、ベルオ キシターゼまたはベルオキシターゼまたはその他のヘメ含有タンパク質の汚染が 実買的にないことを測定した。実際の最終濃度は、ＭＰＯについては４７３ｎｍ で５０ｍＭ−１ｃｍ−１、ＥＰＯおよびＬＰＯについては４５０ｎｍで５６ｍＭ −１ｃｍ−１の吸収−差異消失係数を使用してジチオニット還元対酸化差異吸収 スペクトルにより測定した（Ｗｅｖｕ、Ｒｅｌ　ｉｆ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｌｌ ！ｔｓ、　Ｖｏｌ、　１２３．　ｕ、　３２７−３３１．１９８１）　。ＨＲＰ を４Ｇ３ｎｍで９０ｍＭ−１ｃｍ−１の吸収消失スペクトルを用いて直接吸収に より測定した（Ｋｅｉｌｉｎ、Ｄ、およびＨｕ＋ｅｅ、　Ｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　１．　Ｖｏｌ、　４９．　ｐ８ｇ、　＋９５１）。

他に断りのない限り、すべての反応混合物は、５０ｍＭ酢酸緩衝液、　ｐＨｓ中 の１ｍｌの最終容量を有し、そしてすべての測定を、Ｂｅｒｌｈｏｌｄ　Ｃｌｉ ＣｌｌｎｉＬｕ　ＬＢ９５２発光計（Ｂｅ＋１ｈｏｌｄ　Ａｎｘ１７０ｃｔｌ　 Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、米国、　ニューハンプシャー州）を用いて周囲 温度、約２２℃で行った。

例１ 過酸化水素の測定 ０．０１１ないし１．４０７μモルの範囲の量の過酸化水素を含有する標準０． １１溶液を、上記の通りにＨ２Ｏ２ストック溶液を希釈することによって調製し た。ポリスチレン製試験管内の標準過酸化水素溶液にストックルミノール溶液０ ．５　ｍｌ　（８５ａモルルミノール）を添加した。酢酸緩衝液、ｐｉｔｓ中の ＭＰＯ（７ｂモル）およびクロライドイオン（１００μモルＮ５Ｃ１換算）を含 有するハロベルオキシラーゼ／ハライドイオン溶液０．３ｍｌを各試験管に添加 することによって発光表示反応を開始し、そして化学的発光速度（毎秒の相対カ ウント）をハロベルオキシラーゼ／ハライドイオン溶液の過酸化水素／ルミノー ル溶液への添加の後にＩＯないし６０秒間測定した。

最終反応容量を０．９１とした。ピーク速度（マＣＬ）を、下記表１に示す。

表１ ［ＨｚＯ２コ　ｙｅｔ （μモル）　（キロカウント７秒） １、４０７　４３０．２９ ０、７０３　１５４．９６ ０、３５２　４８．５６ ０、１７６　Ｎ、　１５ ０、０８ｇ　３．４５ ０、０４４　Ｇ、　８？ ０、０２２　Ｇ、　１９ ０、０１１　０．０５ 図２に記載のようにこの表示系に対する過酸化水素濃度の関数としてピークＣＬ 速度（マＣＬ）のプロットは、双曲線となる。この表示系に関する速度等式の計 算マＣＬ＝ｋ［Ｈ２Ｏ２］　ｉ　＋ｉ、ｋ＝３００．８キロカウント／秒であり 、そしテｉ　＝１．９０ｔ’あり（ここで１は過酸化水素に関する反応のオーダ ーである）、測定の係数（ｒ２）は０゜９９である。過酸化水素濃度に関するこ の反応の略２次性質も、このデータの二重逆数プロットにより同定される。ミカ エル−メンテン運動が図３＾に表した標準プロットに従って作用する。しかしな がら、二次反応に関して、！＝　ｅ　［Ｈ２Ｏ２１１（式中、Ｃは過酸化水素濃 度と速度の平方根に関する比例定数である）が式マ＝ｋ［Ｈ２Ｏ２ｊ２に等しく 、そして、略直線関係が過酸化水素濃度の逆数の関数としてｙｃＬの平方根の逆 数をプロットすることによって図３Ｂに示した通り略直線関係が得られる。すな わち、化学的発光応答は、表示系のその他の成分が速度制限的でない際に過酸化 水素濃度に関して二次にあてはまる。Ｇ、　Ｎ、　Ｗｉ　１ｋｅｎｕｎ、　Ｂｉ ｏｃｈｔｍ、　１．　Ｖｏｌ、　８０、　ｐｌｌ、　３２４等の方法を使用して マＣＬの平方根の逆数に関する値および過酸化水素濃度の逆数を使用してｋｍお よび概算最大速度マｍ！！を計算し、２８２±０．０５　（ＳＥ）のｋｍおよび ３９００±ｌ　（ＳＥ）キロカウント７秒のマａＵＸ　にこで、ＳＥは標準誤差 である）を得る。

上記のハロペルオキシラーゼ／ハライド溶液中のクロライドをブロマイドイオン （５μモルＮｉＢ＋換算）に置換し、そしてハライドとしてクロライドまたはブ ロマイドのいずれかを使用してハロペルオキシラーゼ／ハライド溶液中のＭＰＯ をＥＰＯ（３９９モル）に変えて上記の操作を繰り返した。比較の目的で、ホー スラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ、　ＩＱｐモル）、非ハロペルオキシ ターゼを反応系にハロペルオキシターゼに対して付加的に置換した。結果を以下 の表２に示す。

表２　変数としての過酸化水素 反応条件　反応式：　ミカエル−メンテン酵素　［Ｋ−］　［範囲］　ｙ＝　ｋ ［Ｈ２Ｏ２］ｉ　Ｊ動データＭＰ０．７＋＋　５ｒ−０５０，０１１−１，４１ ６１６，５１，５１０，９８＋１．５Ｂ±０．０３　２９３２±２ＥＰ０．３９ 　Ｃド、１００　０．０１１−１４３９．２　１，０６　０．９０　葺０１２± ０．０１　３１土０ＥＰ０．３９　Ｂｒ”、５　０．０１１−１．４　１０７３ ．４　１．ａｓ　Ｏ，９９１１１，４５±０．１０　５３１０±１０Ｈ日Ｐ、Ｉ ＯＣＩ−，１０００，０１１−１，４８，９１，０３０，９９３１，０２±６． １４　２８０±５５ＨＲＰ、ＩＱ　叶−，５０，０１１−１，４１１，６１，０ ３０，９９１７，４９±３．８４　１５６±３４反応は５５ｎモルのルミノール を含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液、　０．９ｍｌ最終容量中である。温度は２２℃ である。Ｔ’ｍｘｘおよび速度（マ）は、キロカウント７秒として表す。京は運 動計算が速度の平方根に基づいていることを示す。

表２に記載された通り、ピークＣＬ速度（マ）は、（ｉ）ＭＰＯおよびＥＰＯ表 示系に関して過酸化水素濃度の平方に定量的に比例し、すなわち表２においてア スターリスク　（ネ）で示さ４］たように系のその他の成分が速度制限的でない 場合化学的発光応答が過酸化水素濃度に関して二次オーダーにあてはまる。また 表２から、クロライドイオンがＥＰＯ表示系における供回子として実質的に有効 性が少ないことも明らかである。更に表２に示すように、化学的発光応答は、ホ ースラディシュベルオキシターゼ（ＨＰＯ）系に対する過酸化水素濃度に関して 二次オーダーでなく、しかして計算は、標準ミカエル−メンテン運動に基づいた 。この結果は、更に従来に二重逆数プロットが直線にあてはまりこの関係が一次 であることを示しくＤｕ＋ｅ　ｅｔ　ａｌ、　、］、　Ｂｉｏ１．　Ｃｌｕｍ、 　Ｖｏｌ、　２３９．　Ｎｏ、　７．　ｐｐ、　２３５１等、　＋９６４を確認 ）、そ■■{明細 書のハロペルオキシターゼ表示系と異なることを示す図３ｃに示される。

例２ クロライドの決定 クロライド濃度に対する表示系の依存およびクロライド定量へのこの依存の潜在 的使用を、ルミノール溶液（５０ｎモルルミノール）（１，３ｍｌ、ＭＰＯに関 して０２ないし７７μモルのクロライドイオン（ＮａＣｌ換算）またはＥＰＯお よびＨＲＰに関して０１モルの般に０．２ないし１０００μモルのクロライドイ オン　（ＮａＣ１換算）　、ＭＰＯ、ＥＰＯまたはＨＲＰＧ、　３ｍｌを含有す る酢酸緩衝液、ｐｌｌ５．Ｇ中のハライド有するおよび駅０３ｍ１を使用しそし て０１６ないし６ＪＯμモルの範囲の量の過酸化水素を含有する標準０３の１溶 液を添加して表示系を誘発して例１の基礎的方法に従って測定した。

反応混合物中の酢酸緩衝液の最終濃度は、５０ｍＭ、　ｐＨ５，０とした。結果 を下記表３に示す。

表３　−次変数としてのクロライド、二次変数としての過酸化水素反応条件　反 応式・　ミカエル−メンテン酵素　［Ｈ２Ｏ２］　［範囲］　ｖ＝ｋ［ｃｌ−Ｉ ｉ　運動データルモルｕ％ｈ　［Ｃｌ−１，μモル［ｋｌ　（ｉｌ　（＋２）　 ｋ−±ＳＥ　Ｖ、、、　＋ＳＥ反応は５０ｎモルルミノールを含有する５０ｍＭ 酢酸緩衝液、　ｐｌｌ　５．０．　１ｍｌ最終容量中である。Ｖ　ｍｉｘおよび 速度（ｖｌ　は、キロカランｉ・７秒として表す。

表３に示した結果から、反応混合物中のクロライドの存在が同定されそしてクロ ライドの量がハロペルオキシターゼとしてＭＰＯを使用して本発明の表示系を用 いて測定できるということが直ちに明らかとなる。クロライドをハロゲン供因子 として使用する場合、ＭＰＯを使用する表示系は、ＥＰＯを使用する表示系より もより効率的である。ＭＰＯを使用する反応はクロライド濃度に関して一次であ り、そして図４に示す通り標準ミカエル−メンテン運動に従う。ＥＰＯおよびＩ ＩＲＰデータも図３に考慮したが、これらのデータは、プロット範囲に入らなか った。更に図３に示すように、ＩＩＰＯおよびＥＰＯの両者は、これらの反応条 件下に反応次数−１の負の世インで示されるようにクロライドの存在にょち実際 に禁止されたらしいＨＲＰよりも効率的である。

例３ ブロマイドの決定 ブロマイド濃ざに対する表示系の依存およびブロマイド定量へのこの依存の潜在 的使用を、Ｍｌ’Ｏに対して００１５ないし０９８μモルのブロマイドイオン　 （Ｎ　山換算）　、ＥＰＯに対１７て０．０１５ないし０９４９μモルのブロマ イドイオンおよびＨＲＰに対して０．０１５ないし１０００μモルのブロマイド イオン酵素／ハライド溶液を例２におζプるクロライドイオンの代わりに使用し て例２の方法に従って測定した。結果をＦ記載４に示す。

表４　−次変数としてのブロマイド　二次変数としての過酸化水素反応条件　反 応式　ミカエル−メンテン酵素　［Ｈ２Ｏ２］　［範囲ｊ　ｖ＝　ｋ　［Ｂ＋− ｌｉ　運動デー２９％歩　μモル　ＦＢＩ−１，μモルｉｋｌ　（ｉ）　ｂ２） 　ｋ、　＋ＳＥ　Ｖ、、、、　＋ＳＥ反応は５０１１モルルミノールを含有する ５０ｍＭ酢酸緩衝液、　ｐＨ５，０，１ｍｌ最終容量中である。ｖ１１１！およ び速度（マ）は、キロカラ２８フ秒として表す。

表４に示す通り、反応混合物中のブロマイドイオンの存在およびブロマイドの量 が同定され、そしてブロマイドの量が表示反応のハロベルオキシターゼ成分とし てＭＰＯまたはＥＰＯのいずれかを使用して直ちに測定できる。しかしながら、 例２の結果とは著しく対照的に、ＭＰＯおよびＥＰＯの両者は、ハライド供因子 としてブロマイドを使用した場合に非常に効率的である。ＥＰＯがブロマイドの 存在舌でしか効率的に操作できないがハライド供因子としてクロライドまたはブ ロマイドのいずれかを効率的に利用するＭＰＯの能力を、試験検体におけるこれ らのハライドの分別分析に並びにＭＰＯまたはＥＰＯあるいはこれらの由来細胞 （例えば、ＭＰＯに関しては好中球顆粒細胞および血液単球およびＣＰＯに関し てニオシッフイル）の分別定量に使用できる。ＭＰＯ系におけるクロライド依存 と同様にして、反応は、ＭＰＯに対するおよびＥＰＯに対するブロマイド濃度に 関して一次である。図５は、ＭＰＯｆ図５中ｒＭＮで示す）またはＥＰＯを図５ 中「鳳で示す）にまるブロマイドに対して標１ミカエルーメンテン運動特性を示 したがｆｌＲＰ　（図４のプロ、ト範囲に入るＨＩＩＰなし）については示さな い。利用した反応条件下において、ＭＰＯおよびＥＰＯの両方は、非ハロペルオ キシターゼＨＲＰより４倍のオーダーで化学的発光活性を示す。

例４ ハロペルオキシターゼの測定 ２５μモルの過酸化水素を含有する標準過酸化水素溶液を使用して表示系を誘発 し、そして１２５μモルのルミノールを含有するルミノール溶液０．３ｍｌおよ びハロベルオキシターゼ溶液（０，１ｍ１）および０．８６ないし２２０μモル の範囲の量のＭＰＯおよび６．３．２５または１００μモルのクロライド、０． ０２４ないしｏｏｐモルの範囲の量のＭＰＯおよび６．３．２５またはＩｎμモ ルのブロマイド、Ｉ３８ないし２２［１μモルの範囲の量のＭＰＯおよびハライ ドなし　（対照）、および２，７ないし３４４μモルの範囲の量のＣＰＯおよび ６Ｊ、２５または１００μモルのタロライドまたは６．３．２５またはｌＯ［１ μモルのブロマイドを含有するハライド溶液を使用して例２に従って、表示系の ハロベルオキシターゼ濃度に対する依存およびハロペルオキシターゼ定量に対す るこの依存の使用を、ハライド供因子としてブロマイドおよびクロライドを効率 的に利用できるハロペルオキシターゼＭＰＯおよびＣＰＯに関して測定した。結 果を下記表５に示す。但し、Ｖｍｘｘはキロカラ２８フ秒として表す。

表５　−次変数としてのハロペルオキシターセ　二次変数としてのハライド反応 条件　反応式：　ミカエル−メンテン酵素　［ハライドコ　［範囲］　ｖ＝　ｋ 　［酵素コ１　運動データ８モル　（酵素］、ｐモル［ｋｌ　（ｉ）　（＋２） 　Ｌ　＋ＳＥ　Ｖ、、、、　±ＳＥ反応は５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５，Ｑ中ミ エロペルオキシターゼ（ＭＰＯ）またはフンガルクロロベルオキシターゼ＋ＣＰ Ｏ）のいずれがを含有する。１ａ１最終容量中である。ｌ’ｍｌｌおよび速度（ マ）は、キロカウント／１０秒として表す（初期）。ミカエル−メンテン運動計 算は、速度■の平方根に基づく。

表５に示したように、試験検体中のＭＰＯまたはＣＰＯの存在または量は、本発 明の表示反応の発光測定により供因子としてブロマイドまたはクロライドのいず れかを使用して広い範囲の酵素濃度にわたって測定できる。発光応答は、ＭＰＯ およびＣＰＯ濃度に関して二次である。上記例記載の条件下で、ＭＰＯはＣＰＯ より効率的であるが、上記の通りクロライドもブロマイドも表示系に添加しない ハライドの不存在下ではＭＰＯもＣＰＯも効率的に作用しない。

８５ないし２２０μモルの範囲の量のＭＰＯおよび６．３．２５または１００μ モルのクロライド；ｏ、　０２４ないし２２０μモルの範囲の量のＭＰＯおよび ６．３．２５または１００μモルのブロマイド、１３８ないし２７２μモルの範 囲の量のＭＰＯおよび６．３．２５または１００μモルのクロライドまたは１３ ．８ないし２７２μモルの範囲の量のＥＰＯおよび６．３．２５または１００μ モルのブロマイド、４０ないし２５８μモルの範囲のＬＰＯおよび６．３．２５ または１００μモルのクロライド１２．０ないし２５８μモルの範囲のＬＰＯお よび６３．２５または１００μモルのブロマイドを含有するハライド溶液を使用 してハロペルオキシターセ／ハライド溶液を使用してＣＰＯおよびＬＰＯに関し て上記方法を続けた。

結果を表６に示す。

表６　−次変数としてのハロベルオキシターゼ：二次変数としてのｐＨ反応条件 　反応式：　ミカエル−メンテン酵素　［ハライド］　［範囲］　ｖ＝ｋ［酵素 １１　運動データ８モル　［酵素］、ｐモルＩｋｌ　（ｉｌ　（＋２）　ｋ、　 ＋ＳＥ　Ｖｍｔｘ　＋ＳＥ（表注） 反応は５０ｍＭの酢酸緩衝液中にニオシッフイルペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）又 はラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）のいずれかを含有する。

反応はまず８２０□２．５μモルの注入で開始した。Ｉ’ｌｌｆおよび速度Ｖは キロカウント／１０ｉｅｃ　（初期値）として表わす。

ミカエルメンテン運動計算は速度Ｖの平行根に基づく。

表６はここでもＥＰＯとＬＰＯを共にブロマイド依存発光の関数として定量決定 されるある程度の発光活動が塩素を共通因子として得られたものの、ＥＰＯとＬ ＰＯはブロマイドが存在した場合発光度からいって一層効果的な発光性能を示し た。

今回使用した反応条件下ではブロマイド又はクロライドのいずれかを共通因子と して使用した場合ＥＰＯがＬＰＯより一層効果的な発光性能を示した。

表示反応の基質濃度に対する依存度は下記実施例１の基本的手順で決定した。

この手順は表７に示す如く、使用ルミノール０．００１８から１５．０ｍｍｏｌ の範囲のルミノール量を含むルミノール溶液０．３ＩＩｌのハロペルオキシダー ゼ／ハライド溶液で液中にＩＯＰモルのＭＰＯ，ＥＰＯ又は１（ＲＰを含み、１ ５０ｍモルの酢酸緩衝液又は燐酸緩衝液中にそれぞれ１．０［１μモルのクロー ライド１０μモルのブロマイド、又はハライドを含まず、２．５μモルの過酸化 水素を含む過酸化水素溶液０．３■１を添加することで発光性能を示現する。

この場合、最終的反応量は０９ｍ１であった。

さらに反応溶液のＰＨはいずれも最終濃度５０ｍモルで酢酸緩衝液Ｐ）１４．９ 又は５９のもの、あるいは燐酸緩衝液でＰＨ５，８又は７．０を実施例１のＰＩ （Ｓ、　ＩＪの酢酸緩衝液の代りに使用して変化せしめた。

結果表７に示す。

表７ 酵素　バッファ　［範囲］　ｖ＝ｒ（ルミノール胃　運動データ反応混合物は、 各々５０ｍ１ｉ酢酸（ＡＢ）または燐酸（ＦＢＩ緩衝液中ＩＨμモルのＣＩ−， １０μモルのＢｒ−を含有しそしてミエロペルオキシダーゼＩＪＰＯＩ　、エシ ソフィルペルオキシターゼ［ＥＰＯ］　およびホースラディッシュペルオキシタ ーゼ［ＨＲＰｌ　についてはハライドを含有しない。反応は、先ず２５μモルの Ｈ２Ｏ２の注入により開始した。最終容量は、０．９ｍｌとした。Ｖ　Ｉｌｌ！ および速度（マ）は、キロカウント７秒として表す。宴は運動計算が速度の平方 根に基づいていることを示す。

表７に記載された通り、ルミノール濃度は、４９ないし７．０のｐＨ範囲にわた ったＭＰＯおよびＥＰＯ発光表示系により定量的に測定された。著しく対照的に 、ルミノールは、非−ペルオキシダーゼＩＩＰＲを用いてより酸性条件下に効率 的に定量されなかった。発光反応は、ＭＰＯおよびＥＰＯ表示反応において一次 であったが、ＨＲＰ反応系においては二次であり、表７に示すミカエル−メンテ ン運動データの前に示した通りＤａｒｅ　ｅｆ　ｇｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ ａ、Ｖｏｌ、２３９．　Ｎｏ、７．ｐｐ、２３５１等１９６４を確認した。図１ に示した提案されたハロｐ旧反応と一致して、これらの運動差異は、非ハロベル オキシターゼからハロペルオキシダーゼえを分離すう機構相違を強調する。

例６ ＤＨへの依存 ２５μモルの過酸化水素を含有する標準過酸化水素溶液、を使用して表示系を誘 発し、１００μモルのクロライド（ＮａＣｌ換算）および表８に示した通り１゜ フないし７６１１ｐモルの範囲の酵素の濃度を宵する酵素／ハライド溶液を使用 し、そして５０　ｍ、ｉＪ酢酸緩衝液、ｐＨ３，７または３．７．５．０または ５．９あるいは５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ５，８゜６９、または８．２を使用し て表示系のｐＨを反応および発光測定の際に表示ｐＨて保持して表示系の反応混 合物のｐＨに対する依存を更に測定した。キロカウント７１０秒として測定した 結果を表８に示す。

表８ニー次変数としてのｐＨ二二次変数としての１００μモルＣＬ−反応条件 酵素　５０ｄ酢酸緩衝液、　ｐｌ＋　５０　ｍｌＪ燐酸緩衝液、　ｐＨｐモル　 ３．７　５．０　５．９　５．８　６．９　８．２反応データは、キロカウント ７１０秒である８バソクグラウ゛／ド（暗色）カウントは、０１３キロカウント ／１０秒どした。反応を２５μモルＨ２Ｏ２の注入により開始した。

上記のクロライドの代わりに２．５μモルのブロマイド（ＮａＢ＋換算）を含有 する酵素／ハライド溶液を使用して上記の操作を続けた。キロカウント／１０秒 として測定【、た結果を再び表９に示す。

表９ニー次変数としてのｐＨ二次変数としての２５μモルＢｒ−反応条件 酵素　５０ｗＭ酢酸緩衝液、　９）１　５（ｌ　ｍＭ燐酸緩衝Ｗ、　ｐｉｔｐモ ル　３．７　．５．０　５．９　５．１１　６．９．　８．２反応データは、キ ロカウント／１０秒である。バックグラウンド（暗色）カウントは、０．１３− １ｏカウンＩ−／１０秒とした。反応を２．５μモルＨ２Ｏ２の注入により開始 した。

表８および表９に示す通り６クロライドまたはブロマイドを持つ１ｌＰｏプロマ イドブロマ′、イドを持・つＥＰＯの両者は、試験した酸性ｐｌ＋範囲において ルミノール発光を効率的に触媒した。事実、ハロペルオキシターゼ依存発光活性 が定量され、モしてｐＨＬ　２でさえも比較的に充分に保持された。、ＩＩＲＰ 系の感度は、ｌＩＨに従って増加する。しかしながら、禁止活性は、高いＨＰＲ 濃度で際立っていた。ハロペルオキシターゼ依存発生応答とは異なって、ｕｐ発 光は、ハライドの存在により本質的に影響されない。非酵素、塩基触媒された発 光活性を試験した高いＤＨで決定する。か＼る活性は、ＨＲＰが最も活性な高い ｐＨ値でシグナル対ノイズ比を悪く制限する。

例７ グルコースオキシターゼ測定 カップリングされた一次反応を通した試験検体における被分析物の存在または量 の測定への表示系の使用を、以下の方法でグルコース濃度について分析すること によって測定した。表１０に示すように０．０Ｏ３３ないし４．４４の範囲の量 のグルコースを含有する試験検体１００μｍを、好適量のグルコースを５ｈＭ酢 酸緩衝液、ｐＨ５゜４に溶解することによって調製した。各試験溶液溶液をルミ ノール（ｌ汁μモル）水溶液３００μｍに併せそしてポリエステル試験管に配置 した。各試験溶液に、２゜３ないし１４４μモル（ｌｐモルは０．０２８単位で ある、但し１単位はｐＨ５，Ｉおよび３５℃で１分間当たりＤ−グルコースを０ −グルコン酸に酸化する）の範囲のグルコースオキシターゼ（ｒＧＯＩ　Ｊ　、 ＴＦｐ！χ１．　＋５０．０００単位／１．　Ｇ−７１４１５１ｇｍＭＣ１＋ｃ ｍｉｅ＊ｌ＋、米国、ミズリー州、セントルイス）を表１０に示したような量を 含有する（Ｈｄ酢酸緩衝液ｐＨ５，４中のグルコオキシターゼ３００μｍを添加 した。次いで、試験検体を、発光計に直ちに配置し、そして周囲温度で８．５な いし４９９分の規定インキュベート時間（インキュベート時間１表１０）インキ ュベートした。規定インキュベート時間の終了の際、５０ｍＭ（１ｍ１反応反応 物中の最終濃度）酢酸緩衝液ｐＨ５，４中に３０μモルのＭＰＯおよび５０μモ ルのクロライドイオン　（ＮｔＣ１換算〕を含有する溶液３００μｍの添加によ り蛍光反応を誘発した。結果を表１０に示す。蛍光応答がグルコース濃度に関し て二次であり、従って化学的発光速度の平方根が例Ｊ、の方法を使用して各反応 についてｖＩｍ１！およびＫｍを測定するための計算に利用された。表１０にお いて、’ｌｍ５ｘは、はキロカラ２５フ秒として表す。

表１０　−次変数としてのグルコース二二次変数としてのグルコースジオキシタ ーゼ（ＧＯＸ） 反応条件　反応式、　ミカエル−メンテンＧＯ”　ＥＷｆｔｕ）　ＶｃＬ＝Ｋ　 ［ＧＩｕｌ　’　４動デ一タ検体を規定時間酢酸緩衝ｆｉｐｌ＋５．４中でＧＯ ｘでインキュベートした。反応を３０μモルＭＰＯ＋５ＱμモルＣＩ−、１ｍｌ 最終濃度の注入により開始した。温度は２２℃きした。Ｖａｔおよび速度（マ） は、キロカウント／１０秒（初期）として表す。ミカエル−メンテン運動計算は 、速度Ｖの平方根に基づいている。

表１Ｏに記載されたように、本発明の表示系は、幅広い範囲のグルコースおよび グルコースオキシターゼ濃度にわたって試験検体中のグルコース濃度を測定する 高感度の手段を提供する。グルコースのグルコースオキシターゼ触媒酸化が消賀 された各分子当たり過酸化水素１分子の製造をもたらし、そして先に記載した通 りに表示系における発光の製造が過酸化水素濃度の平方に比例するので、測定さ れた発光は、このカップリングした反応系を使用して試験検体中のグルコースの 濃度の平方に比例する　（すなわち、発光反応はグルコース濃度に関して二次で ある）。この結果は、表１０に示された結果により確認される。

１モルのグルコースの酸素が１モルの酸素を消賀するので、上記グルコース／グ ルコースオキシター上カップリングされた反応またはその他のオキシターセ反応 は、既知の非速度制限量のオキシターゼおよび基′１１（例えばグルコース）を 提供し、従ってカップリングされた反応系に可変の未知量として酸素を放出する ことによって試験検体中の酸素に関する高＠度の検定としてハロペルオキシター セ／ハライド発光表示系により使用できる。

？？ｐモルのグルコースオキシターゼを含有するグルコースオキシターゼ溶液お よび００１６ないし３３３μモルのグルコース（表１１に記載）を含有するグル コース検体溶液および１．９ないし６０μモルのＭＰＯ（両者とも表１１に記載 ）および１゜６ないし５０μモルのクロライドを含有するＭＰＯ／クロライド溶 液を使用して上記操作を続けた。結果を表１１に記載する。但し、Ｙ　＋ｕｘは 、はキロカラ２５フ秒として表す表１１　−次変数としてのグルコース・二次変 数としてのミエロベルオキシターゼ（ＭＰＯ＋ 反応条件　反応式、　ミカエル−メンテン酵素　［ＣＩ−］　［範囲］　Ｖ＝Ｋ 　（Ｇｌｕｔ　’　１ｌｌｌ／ｌチ一！表示量のＭＰＯおよびＣＩ−を射出し、 続いて！２５ｎ２５μルミノール、を含有する５０１μＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，４ １ｍｌ最終容量中の７７１１モルＧＯＸで以下の検体をインキュベートした。温 度は２２℃とした。Ｖｍａｘおよび速度（ｖ）は、キロカウント７１０秒（初期 ）として表す。ミカエル−メンテン運動計算は、速度Ｖの平方根に基づいている 。

表１１の結果は、表示系が幅広い範囲のＭＰＯおよびクロライド濃度に渡ってグ ルコース濃度のカップリングした測定に関して高い程度の安定性を示すことを表 す例８ サルモネラに関する固形免疫検定 ラビット抗サルモネラ抗血清のγ−グロブリンフラクションの調製バクトサルモ ネラＯ抗血清（ポリＡ−＋およびＶｉｌ　およびバクトサルモネラＨ抗血清（ポ リ１−り　（Ｄｉｌｃｏ　Ｌｓｂｏｎｔｏ＋ｉｏ米国、ミシガン州、デトロイト ）のγ−グロブリンフラクシランをＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７ ．　Ａ　Ｌｘｂｏｒｅｌｏ＋７　Ｔｅｘｔ　ｌｏｔ　Ｉｎ５ｌ＋ｗｅｌｉｏｎ　 ｓａｄ　Ｒｅ＋ｅｘｒＣｈ、第３版、　Ｊ、　Ｓ、　Ｇａｎｅ７．　Ｎ、　Ｅ、 　Ｃｒｅｍｅｒおよび１１．　Ｈ，５ｏｕｄｏ{Ｉ、　ｐｐ、　２１ ８−２１９．１９７７、　Ｗ、Ａ、　Ｂｅｎ１５ｍ１ｎ、Ｉｎｃ、米国、マサツ セチュー州、リーディング）ニ記率は３対１とし、そして得られた溶液の全グロ ブリンタンパク質濃度は３ｈｇ／　ｍｌであった。

抗サルモネラ抗体と磁性粒子とのカップリングサルモネラ０およびＨ抗血清のグ ロブリンフラクションを、Ｉ、　Ｌ、ＧｕｅｓｄｏｎおよびＳ、　Ａ、　ｔｓ＋ ＋ｅ＊　（１＋ｅｍａｎｏｃｂｕ＋ｉｓ＋＋７．　Ｍｏ１．１４．　９９．４４ ３−４３７．１９７１）のゲルタールAルデ ヒド法により磁性粒子とカップリングした。２種類の源の磁性粒子を試験した。

すなわち、１）。０．５〜１．５　ミクロンサイズ範囲のＢｉｏ−ＭｓＨ４１０ Ｇ末端アミン磁性粒子、　５０１１！／　ｍｌ懸濁液（Ａｄｖｕｃｅｄ　Ｍｓｇ ｏｅｔｉｃｓ、米国、マサツセッチュー州、ケンブリッジ、ムーニー６１）およ び２）４Ｇ　〜８０ミクロンサイズ範囲のＭＨａｏ（ｅｌ　ＡＣＡ　４４磁性粒 子、　１０ｈｇ／　ｍｌ懸濁液（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔｅｅｘｈｎｉｅ＋、フランス 、ビレニュー　ラ　ガーレン）である。

抗サルモネラ抗体のビオチン化 サルモネラ共通構造抗原Ｃ３＾−１に特異性のある親和生成抗体２．０ｍｇ　（ Ｋｉ＋ｋｅｇｕｄｕｎｉ　Ｐｅｔｒｙ　Ｌｘｂｏ＋ｘｌｏ＋ｉｏ、米国、メリー ランド州、ゲイサーブルグ）を、Ｏ，１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，３１ ，０ｍｌに溶解した。この抗体溶液に、ジメチルポルムアルデヒド（ＤＭＦｌ　 １００μｍ中のビオチンーアミノカブロエートトヒドロキシサクシンイミドエス テル（ＢＡＣ−ＮＩＩＳ、　Ｓｉｇｍｔ　Ｃｂｅｍｉｃｘｌ＋ｌ　Ｏ，ＳｌＩｇ を添加し、そしてこの混合物を室温で１時間放置した。この混合物を２回緩衝液 を変えて一晩０．０５Ｍ燐酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，２に対して透析し、次い で４℃で更に使用するまで保存した。上記の通りにして調製した精製ラビット抗 すルモネラγ−グロブリンを使用して上記方法を繰り返した。

バクテリオファージのビオチン化 １当たり約１０１１ないし１０１２プラーク形成単位［ｐ＋ｕ）を含有するバク テリオファージΦ２７８６９−βｌ（＾ｉｅ＋ｉｃｇｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国、メリーランド州、ロックビレ）１０１を２ 回緩衝液を変えて４℃で１６時間０．０５Ｍ燐酸緩衝生理食塩水、ｐＨ３４に対 して透析した。透析物質にＤＭＦ　４ＧＧμｍ中のＢＡＣ−ＮＨ３７５ｍｇを添 加し、そしてこの混合物を傾斜台上で１５分間室温で攪拌した。次いで、懸濁液 を５ｍＭ　ＭｇＳＯ４および８０ｄ　ＮＩＣ＋を含有する０、０５Ｍ燐酸緩衝生 理食塩水、ｐＨ５，３で２０ｍ（とじ、そして１６時間３回緩衝液を変えて燐酸 緩衝液に対して透析した。透析物質を４℃で更に使用するまで保存した。

アビジン化グルコースオキシターゼの調製親和精製アビジン（ＳｉｇｍＩＣｈｅ ｍｉｃｔｌ＋、Ｎｏ、Ａ−９２７５）　ＩｈｇをＯ，１Ｍ燐酸緩衝液、　ｐＨ６ ８０，５ｍｌに溶解し、２９ｈＯ＋ｍにＮ５Ｃ１で調節し、次いで７回緩衝液を 変えて４℃で１８時間Ｇ、　１．５Ｍ　Ｎ＊Ｃｌに対して透析した。透析溶液１ ．１）＋ｌに０．１５Ｍ　ＮＩＣ＋に溶解したグルコースオキシターゼ２５ＩＩ ｇおよび１．０Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９，５を添加した。

この混合物を室温で２時間、次いで４℃で一晩反応させた。

検定プロトコール 表示した（表１３）のコロニー形成単位（ＣＦｔｌ）のＳａ１ｍｏ＋ｕｌｌａ　 １７ｐｈｉｕ＋ｉ＋＋ｍ　ＡＴＣＣＮｏ、　１４Ｇ２８　（＾ｍｕｉｃｓｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国、メリーランド州、ロッ クビレ）を含有する溶液ｌ、０１を上記の通りにして調製した抗すルモネラγ− グロブリンフラクション被覆Ｂ１０−Ｍ５ｇ粒子の種々の希釈により３０分間イ ンキュベートした。インキュベーション懸濁液を磁性分離機上に配置して粒子を 分離し、そして粒子を２度０．１Ｍ燐酸緩衝ｉ＆ｐＨ７、３で洗浄して非結合バ クテリアを除去した。次いで粒子を少しの（約２００ないし５００μｍ）容量の 洗浄溶液に再腎濁し、次いで１２００希釈度のストックビオチン化抗サルモネラ γ−グロブリンフラクションで３５℃で３０分間インキュベートした。ビーズを 上記のとおりにして再び溶液から分離し、そして７度洗浄した。１２５希釈度の 上記アビジン化グルコースオキシターゼ５００μｍを粒子に添加し、そして混合 物を３０分間３５℃でインキュベ−１−した。

ビーズを上記のとおりにして再び溶液から分離し、そして二度洗浄し、次いで３ ３μモルのＤ−グルコースおよび３．０ｎモルのルミノールを含有する０、１λ ｆ燐酸緩衝液６００μ＋に再讐濁した。次いで粒子を発光針（Ｂｅ＋＋ｈｏｌｄ 　ｍｏｄｅｌ　９５２）に配置し、そして暗所で３０分間室温でインキュベート した。ＭＰＯ（約１０１１モル）およびＥＰＯＦ約ｌＯｍモル）およびブロマイ ド（１５Ｍモル、　ＮｇＴｏ換算）を含有する溶液３００μｍをこの懸濁液に添 加し、モしてＶＣＬを２０秒間測定した。結果を表１２に示す。

表１２ 一次変数としてのサルモネラチフィムリンのＣＦＵ二次変数としての抗すルモネ ラ被覆磁性粒子抗サルモネラ 被覆磁性粒子 （Ｂｉｏ−Ｍｘｇ）　ＣＦ［Ｉサルモネラチフイムリンの数／試験検体ストック の希釈度　Ｉ　Ｇｏｏ　１００　１０　０−−１＋１．０２４　２６５．３±１ ０．２　２９６．６±２７．８　５２４．５±３８７．５　０．３±ｏ、。

１：２，０４８　５１．９ｔｈＯ，５５２，４土Ｑ、５　３９．６±９．１　０ ．３±ｏ、。

１；４，０９６　０．７±０．１　０．８±０．２　０．５±０．０　０．３± ｏ、。

１：８，１９２　０．４土Ｑ、ｌ　［１，３±０．０　０．３±［１，００，３ ±ｏ、。

単位・キロカウント７２０秒（初期）士検体標準偏差（δｎ−１）バックグラウ ンド：ダークカレンｌ−０，２８キロカウント７２０秒１：２０Ｏｏ希釈度の上 記の通りにして調製されそして抗サルモネラ抗体で被覆されたあるいは未被覆対 照のストック１１ｇｇｎｏｇ＋　ｌＡＣ人４人泣４粒子用し、を使用し、１０５ 　ＣＦＬＩのＳチフィムリンを含有するおよびなにも含有しない　（対照として ）およびビオチン化すルモネラ結合種として１１００またはｌ：ｉｏ［ＩＯ希釈 度のエーテルビオチン化親和精製抗サルモネラ血清、ビオチン化抗すルモネラγ −グロブリンフラクションまたはビオチン化バクテリオファージΦ２７８６９− ５ｌを含有する試験検体を使用し、上記の操作を続けた。キロカウント７１０秒 （初期）と（２て測定した結果を表１３に示す。

表１３　サルモネラファージおよび抗サルモネラ抗体の比較１：２ＱＯＯ希釈度 のスットクのＭｓｉｎｏｇｅｌ　ＡＣＡ　４４粒子ビオチン化種　被覆Ｗ／抗サ ルモネラ抗体　抗体なしビオチン化親和精製抗サルモネラ血清 １：１００希釈度　２７８８±３６７　２９４±２５１：１０００希釈度　９８ ０±１１５　２３６±７９なし　３±０　４±１ ビオチン化抗サルモネラγ−グロブリン抗すルモイネラ抗体１１００希釈度　１ １５５±２００　１１６±５８１：１０００希釈度　４９９±１４６　１４５＋ ３７なし　１４±０　１±０ ビオ千ン化バクテリオフアージΦ２７８６９−β１１：ＩｏＯ希釈度　１５８５ ±旧８　８１±３５１：１０００希釈度　４０５±１９８　８５±４［なし　１ ４±０　６２±４６ 単位二キロカウント／１０秒（初期）士検体標準偏差（δｎ−１）バックグラウ ンド：ダークカレント０．１２キロカウント／１０秒表１２および１３の実験デ ータは、バクテリア決定する方法としてリガンド−（抗サルモネラ）特異性抗体 と組み合わせた表示系の感度を表す。ハロペルオキシダーゼ／ハライド発光表示 系は、本質的にリガンド／リガンドバインダー検定に適合する。表１３において 、サルモネラ決定は、抗体−またはバクテリオファージ−特異性機構を介してい る。ビオチン化リガンドバインダーをビオチンを介してグルコースオキシターゼ に結合する。非速度制限濃度のグルコースでのインキ、べ−ションは、グルコー スオキシターゼ濃度に比例して、従って検体に存在するサルモネラに比例して過 酸化水素を発生する。ハロベルオキシターゼ／ハライド表示系を一定にかつ非速 度制限的に保持しそして決定した発光は、上記結合リガンド−酵素関係に比例す る。

本発明の表示系の種々の変更および適用が上記から当業者から明らかである。

か＼る変更および用途は、従来技術により予め排除されない限り添付の請求範囲 の範囲内に入ることを意図する。

ぐ　く　ハ ４１２３ｐ、２．　［Ｈ２Ｏ２］、　ＬＪｍＯ１国際調査報告

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．未知量の被分析物を含有する疑いのある検体中に過酸化物、ハライド、ハロ ペルオキシダーゼ酵素、上記酵素用の過酸化水素基質または１種類またはそれ以 上の予備反応で上記過酸化物、ハライド、酸素または化学的発光基質を製造また は消費できる被分析物からなる群から選択された被分析物の存在または量を測定 する方法において、 ａ．検体を既知の非速度制限量の上記群の別の要因からなる検定溶液に接触させ 、 ｂ．検定溶液のｐＨを約８未満に保持し、ｃ．少なくとも１種類の検定溶液によ り散乱した光の特性を測定し、そしてｄ．上記の測定した光の特性を検体におけ る被分析物の存在または量の尺度として既知量の分析物を含有する標準溶液のも のと比較することを含んでなる、上記方法。
2. ２．検定溶液が均一検定溶液である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．検定溶液が非均質溶液であり、そして試薬系が更に不溶性の相、該不溶性の 相上に固定され、そして検体に対する結合特異性を有する第１の特異結合物質お よびハロペルオキシダーゼにまたは過酸化物を発生できるオキシダーゼにあるい は化学的発光性基質に接合した第２の特異結合物質を含んでなり、該第２の特異 結合物質が非分析物に対する結合特異性を有する請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．更に、固定された第１の特異結合物質を検体とそして第２の特異結合物質と 接触させ、可溶性の相を不溶性の相から分離し、そして可溶性または不溶性の相 における光の測定を測定することを含んでなる請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．更に、上記の散乱光の特性を測定するのに先立って、検定溶液のｐＨを約３ から約８に調整することを含んでなる請求の範囲第１項から第４項のいずれかに 記載の方法。
6. ６．被分析物が過酸化物かあるいは１種類またはそれ以上の予備反応で過酸化物 を製造または消できる被分析物である請求の範囲第１項から第５項のいずれかに 記載の方法。
7. ７．過酸化物が過酸化物が反応生成物であり被分析物が反応対である１種類また はそれ以上の予備反応で検体中で製造される請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．過酸化物が過酸化物および被分析物が反応体である１種類またはそれ以上の 予備反応で検体中で製造される請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．被分析物がハライドまたは１種類またはそれ以上の予備反応でハライドを製 造または消できる被分析物である請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載 の方法。
10. １０．被分析物がハロペルオキシダーゼである請求の範囲第１項から第５項のい ずれかに記載の方法。
11. １１．以下の、すなわち ａ）ハロペルオキシダーゼ； ｂ）過酸化物； ｃ）ハライド； ｄ）化学的発光生成物基質；および ｅ）約３ないし約８の範囲内の検定のｐＨを保持するための緩衝溶液のうち少な くとも３種類を含んでなる化学的発光または化学的発光測定に使用するためのキ ット。
12. １２．過酸化物が過酸化水素である請求の範囲第１項から第１０項記載の方法ま たは請求の範囲第１１記載のキット。
13. １３．ハロペルオキシダーゼがミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エオシノフ ィルペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）またはク ロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）である上記請求の範囲のいずれか一つに記載の 方法またはキット。
14. １４．ハロペルオキシダーゼがＭＰＯまたはＣＰＯでありそしてハライドがブロ マイドまたはクロライドである請求の範囲第１３項記載の方法またはキット。
15. １５．検体が体液であり、検体中のＭＰＯの量が検体中のポリモルフォヌクレア ー白血球または血液単球の量の尺度として測定される範囲第１４項記載の方法ま たはキット。
16. １６．ハロペルオキシダーゼがＥＰＯまたはＬＰＯであり、そしてハライドがブ ロマイドである範囲第１３項記載の方法またはキット。
17. １７．検体が体液であり、検体中のＥＰＯの量が検体中のエオシノフィルの量の 尺度として測定される範囲第１６項記載の方法またはキット。
18. １８．ハライドがブロマイドまたはクロライドである上記請求の範囲のいずれか に記載の方法またはキット。
19. １９．被分析物がクロライドであり、そして更に、検定系により散乱した光のＭ ＰＯ−またはＣＰＯ−依存特性マイナス検体におけるクロライドの存在または量 の尺度としての光のＥＰＯ−またはＬＰＯ−依存特性を測定することを含んでな る請求の範囲第９項記載の方法。
20. ２０．被分析物がブロマイドであり、そして更に、検定系により散乱した光のＥ ＰＯ−またはＬＰＯ−依存特性マイナス検体におけるクロライドの存在または量 の尺度としての光のＭＰＯ−またはＣＰＯ−依存特性を測定することを含んでな る請求の範囲第９項記載の方法。
21. ２１．化学的発光性基質が環式ヒドラジドまたはジオキシエタンあるいはシング レット多重酸素と反応してジオキシエタンまたはジオキシエタノンを製造するこ とができるジオキシエタン先駆体である上記請求の範囲のいずれか１つに記載の 方法。
22. ２２．環式ヒドラジドが２，ａ−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン例えばル ミノールまたはイソルミノールである請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．以下の試薬、すなわち ａ）ハロペルオキシダーゼ； ｂ）過酸化物； ｃ）ハライド；または ｄ）化学的発光生成物基質； あるいはこれらのうちの１つを製造することができる試薬のうち少なくとも３種 類を第４番目の試薬の決定用のっけんてい溶液の製造に使用する方法。