JPH05501267A

JPH05501267A - Ｓｍ―Ｄ抗原ペプチド、及び、特に全身性エリテマトーデスを診断するための該ペプチドの使用

Info

Publication number: JPH05501267A
Application number: JP3510553A
Authority: JP
Inventors: バン・レジヤンモルテル，マルク; ミユレール，シルビアンヌ; ブリアン，ジヤン―ポール; バラカ，サミラ; ウエベール，ジヤン―クリストフ
Original assignee: パストウール・サノフィ・ディアグノステイク
Priority date: 1990-06-06
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1993-03-11
Also published as: FR2663034A1; CA2064576A1; EP0491014B1; FR2663034B1; ATE142224T1; US5407833A; DE69121861D1; EP0491014A1; WO1991018920A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｓｍ−Ｄ抗原ペプチド、及び、特に全身性エリテマトーデスを診断するための該ペプチドの使用本発明の目的は、生物体液中、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹患したヒトまたは動物の血清中に存在する抗体によって認識され得るペプチドを提供することである。

本発明の目的はまた、これらのペプチド及びペプチド含有組成物をヒトＳＬＥのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に使用すること、並びに、診断用セット即ち「キットＪを構成するために使用することである。

本発明の目的は更に、これらのペプチドを、上記疾患に対する免疫原性組成物及びワクチン組成物を調製するために使用することである。

本発明の目的は最後に、免疫原性であるかまたは免疫原性にされたこれらのペプチドによってｆｎ　ｖｆｖｏで誘発され得る抗体を提供すること、これらの抗体及び抗体含有組成物をヒトＳＬＥ患者のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に使用すること、並びに、この疾患に対する医薬を調製することである。

細胞構成成分に対する自己抗体の存在は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症（Ｓｃｌン、多発性筋炎及び結合組織病（ＭＴＣＤ）のような自己免疫疾患の一般的特徴である（Ｍｏｒｒｏｗ　ｅｔ　Ｉｓｅｎｂｅｒｇ、、１９８７；Ｔ　ａ　ｎ他、１９８８）、これらの患者で同定された多数のタイプの自己抗体のうちで、Ｓｍ抗原と反応する自己抗体は、ＳＬＥ患者の２０〜３０％に存在するが、その他の全身性自己免疫結合組織病の患者にはめったに存在しないので、極めて有効なマーカーである。

ＳｍｖＬ原はＲＮＰと呼ばれる特定クラスのリボ核タンパク質に結合する。これらのリボ核タンパク質はＵｌ、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５及びＵ６（Ｌｅｒｎｅｒ　ｅｔ　５ｔｅｉｔｚ。

１９７９；Ｂｒｕｎｅｔ他、１９８５）と命名された５種類のウリジンに富むＲＮＡを含有し、各ＲＮＡ中で７つのタンパク質が同定された。これらのタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動移動度に従って、バンドＢ′（２９Ｋｄ）、バンドＢ（２８Ｋｄ）、バンドＤ（１６Ｋｄ）、バンドＤ’　（１５，５Ｋｄ）、バンドＥ（１２Ｋｄ）、バンドＦ（１１Ｋｄ）及びバンドＧ（９Ｋｄ）と命名された。共通様を形成するこれらのタンパク質以外に、Ｕｌ−ＲＮＡ粒子は、３つの非反復ポリペプチド７０Ｋｄ、３４Ｋｄ（Ａ）、２２Ｋｄ（Ｃ）を含有し、Ｕ２−ＲＮＰ種は、２つの非反復ポリペプチドＡ′（３３Ｋｄ）、Ｂ″（２８，５Ｋｄ）を含有している。抗ＲＮＰ抗体または抗Ｕ１−ＲＮＰ抗体は、粒子Ｕ１の構成成分だけを沈殿させ、抗Ｓｍ抗体は、粒子Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５及びＵ６と反応する。

更に、イムノプロット（Ｉｍｍｕｎｏｂ　１ｏｔ）試験によれば、抗Ｕ１−ＲＮＰ抗体は、ポリペプチドＡ、Ｃ及び７０Ｋｄと反応し、抗Ｓｍ抗体は、ポリペプチドＢ′、Ｂ及びＤと反応することが判明した。抗Ｓｍ抗体は更に、ときにはバンドＥ、Ｆ及びＧも認識する（Ｐｅｔｔｅｒｓ−ｓｏｎ他、１９８４；Ｒｅ１ｃｈｌｉｎ　ｅｔ　Ｈａｒｌｅｙ、１９８７；Ｈｏｃｈ、１９８９；Ｃｏｍｂｅ他。

１９８９）。

リボ核タンパク質の複数のポリペプチドの配列決定は、組換えＤＮＡ法で行なわれた（Ｔｈｅｉｓｓｅｎ他。

１９８６　；Ｈａｂｅｔｓ他、１９８７；５ｔａｎｆｏｒｄ他、１９８７；Ｓｉ　ｌ　Ｉｅｋｅｎｓ他、１９８７，１９８９；Ｙａｍａｍｏｔｏ他、１９８８；Ｒｏｋｅａｃｈ他。

１９８９）、欧州特許出願第２９５７１９号は、Ｓｍ−Ｄ抗原をコードするＤＮＡのクローニングを記載している（Ｒｏｋｅａｃｈ他、１９８８）；この遺伝子は、複数の塩基性領域を含む１１９個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードしている。上記文献の著者達は、Ｃ−末端に局在し９回反復しているグリシン− アルギニン単位がＳｍ−Ｄ抗原の抗原決定基を構成すると考えている。単離ＤＮＡから推定されたこの配列は、これまでに配列決定された別のポリペプチドとの類似性をほとんど有していない。

欧州特許出願第２９５７１９号は更に、クローニングされたＳｍ−Ｄ抗原を使用したＳＬＥの検出方法を記載している。

出願人は、１１９個のアミノ酸を含むＳｍ−Ｄポリペプチドの配列に関して研究し、このＳｍ−Ｄポリペプチドから選択されたいくつかのペプチド配列がＳＬＨの検出に特に重要であることを確信した。出願人は、Ｓｍ−Ｄポリペプチドに由来のいくつかのペプチドが、ＳＬＥ患者に存在する抗体によって完全に特異的に認識されることに注目した。これらのペプチドはＳＬＥ以外の自己免疫疾患の患者に存在する抗体によって認識されない。

このような観察は、上記のごときペプチドがＳＬＥのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に有用であることを示す。

図１は、Ｓｍ−Ｄポリペプチドのペプチド配列を示す。

アミノ酸と文字コードとは以下のごとく対応する。

Ｄ　アスパラギン酸Ｅ　グルタミン酸 ■　バリンＷ　トリプトファン本発明は、全身性エリテマトーデス患者の生物学的サンプル中に存在するＳｍ− Ｄポリペプチドに対する抗体と反応し得る１５〜４０個のアミノ酸から成るペプチドに関する。これらのペプチドは、Ｓｍ−Ｄポリペプチドの配列の一部に対応するかまたはその変異配列に対応する。

本発明の好ましいペプチドは、式：％式％（１）（［［）で示される配列のうちの１つの配列の全部もしくは一部から構成されるか、または、その変異配列から構成される装置上記の式中、一基Ｘは、遊離ＮＨ２基、または炭素原子数１〜５の１つもしくは２つのアルキル基でアミド化されたＮＨ２基を示すか、または、１〜５個のアミノ酸から成りＮ末端アミノ酸自体が遊離ＮＨ２基もしくは上記のアミド化Ｎ　Ｈ、基を有しているペプチド基を示しており、 −基Ｚは、遊離ＯＨ基、または炭素原子数１〜５のアルキル基を含むアルコキシル基を示すか、または、１〜５個のアミノ酸から成りＣ末端アミノ酸が遊離ＯＨ基もしくは上記のアルコキシル基を有しているペプチド基を示す。

Ｘ及び／またはＺが１〜５個のアミノ酸から成るペプチド基を示している場合には、これらのペプチド基は、該ペプチド基が除去された後のペプチドの免疫特性、場合によっては免疫原性を本質的に変化させず、むしろ増進させ得るものである。

本発明の好ましいペプチドは、式（１）、（ｎ）、（Ｉ［［）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＴ）及び（■）で示される配列において、式中のＸがＮＨ，基を示し２がＯＨ基を示すペプチドであるか、または、Ｘ及びＺの各々が、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させずむしろ増進させるような１〜５個のアミノ酸から成る基を示すペプチドである。

式中のＸが遊離ＮＨ２基でありＺが遊離ＯＨ基である式（１）のペプチドＩは、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基１〜２０に対応する。

Ｚが１〜５個のアミノ酸がら成る基を示す式（１）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−ＤポリペプチドのＣ末端が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＺは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｎ、ＮＧ、ＮＧＴ、ＮＧＴＱ、ＮＧＴＱＶがら成るグループから選択されるのが有利である。

式中のＸが遊離ＮＨ，基でありＺが遊離ＯＨ基である式（ｎ）のペプチド■は、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基１７〜３５に対応する。

Ｘ及びＺの各々が１〜５個のアミノ酸から成る基を示す式（ＩＩ）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−Ｄポリペプチドの両側が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＸは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｔ、ＶＴ、ＴＶＴ、ＥＴＶＴ、ＨＥＴＶＴから成るグループから選択されるのが有利であり、Ｚは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｍ、ＭＮ、ＭＮＴ、ＭＮＴＨ，ＭＮＴＨＬから成るグループから選択されるのが有利である。

式中のＸが遊ＭＮＨ２基でありＺが遊＠ＯＨ基である式（ＩＩＩ＞のペプチド■ は、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基３３〜５１に対応する。

Ｘ及びＺの各々が１〜５個のアミノ酸を含む基を示す式（ＩＩＩ）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−Ｄポリペプチドの両側が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＸは、１〜５個のアミノ酸を含む基■、ＧＶ、ＴＧＶ、ＩＴＧＶ、ＴＩＴＧＶから成るグループから選択されるのが有利であり、Ｚは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｐ、ＰＶ、ＰＶＱ、ＰＶＱＬ、ＰＶＱＬＥから成るグループから選択されるのが有利である。

式中のＸが遊離ＮＨ２基であり２が遊離ＯＨ基である式（■）のペプチド■は、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基４４〜６７に対応する。

Ｘ及びＺの各々が１〜５個のアミノ酸から成る基を示す式（ＩＶ）に対応する好ましいペプチドは、図１の５ｒｎ−Ｄポリペプチドの両側が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従って、Ｘは、１〜５個のアミノ酸を含む基■、ＡＶ、ＫＡＶ、ＬＫＡＶ、ＨＬＫＡＶから成るグループから選択されるのが有利であり、Ｚは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｆ、ＦＩ、ＦＩＬ、ＦＩＬＰ、ＦＩＬＰＤから成るグループから選択されるのが有利である。

式中のＸが遊離ＮＨ２基でありＺが遊離ＯＨ基である式（Ｖ）のペプチドＶは、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基６４〜８４に対応する。

Ｘ及びＺが１〜５個のアミノ酸から成る基を示す式（Ｖ）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−Ｄポリペプチドの両側が対応する１へ５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＸは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｎ、ＧＮ、ＲＧＮ、ＩＲＧＮ、５ＩＲＧＮから成るグループから選択されるのが有利であり、Ｚは、１〜５個（７）７ミ／酸を含む基Ｐ、ＰＫ、ＰＫＶ、ＰＫＶＫ、ＰＫＶＫＳから成るグループから選択されるのが有利である。

式中のＸが遊離ＮＨ，基でありＺが遊離ＯＨ基である式（Ｗ）のペプチド■は、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基７７〜９６に対応する。

Ｘ及びＺの各々が１〜５個のアミノ酸から成る基を示す式（Ｖｌ）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−Ｄポリペプチドの両側が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＸは、１〜５個のアミノ酸を含む基り、ＰＬ、ＬＰＬ、５ＬＰＬ、ＤＳＬＰＬから成るグループから選択されるのが有利であり、Ｚは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｇ、ＧＲ，ＧＲＧ、ＧＲＧＲ，ＧＲＧＲＧから成るグループがら選択されるのが有利である。

式中のＸが遊離ＮＨ，基でありＺが遊離ＯＨ基である式（■）のべ７チド■は、図１に示すＳｍ−Ｄポリペプチドの残基９７〜１１９に対応する。

Ｘが１〜５個のアミノ酸から成る基を示す式（■）に対応する好ましいペプチドは、図１のＳｍ−ＤポリペプチドのＮ末端が対応する１〜５個のアミノ酸によって延長されたペプチド■である。従ってＸは、１〜５個のアミノ酸を含む基Ａ、ＶＡ、ＡＶＡ、ＥＡＶＡ、ＲＥＡＶＡから成るグループから選択されるのが有利である。

変異配列なる用語は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入及び／または欠失及び／またはｚｍによって修飾された前記ペプチド配列であってその抗原性または免疫原性が変性していない配列を意味する。特に、前記ペプチド配列の一部分から成り、Ｓｍ−Ｄポリペプチドと反応する抗体に対する免疫特性、この場合免疫原性を保持しているような短縮された配列を使用することも可能である。

変異配列なる用語はまた、ペプチド結合（−Ｃ〇−ＮＨ−）が、構造−Ｃ〇−Ｎ　（ＣＨ、Ｌ−１−ＣＦ（２−ＣＨ２−１−Ｃ○−ＣＨ２−によって置換された配列、またはペプチド骨格が基−ＣＨ２−１−ＮＨ−１−０−のような１つまたは複数の挿入基を有する配列を意味する。また、不斉炭素を有するＤ形またはＬ形のアミノ酸を含むペプチドも本発明に包含される。

本発明はまた、本発明のペプチドと、生理学的に許容される無毒性の任意の担体分子との結合によって得られた結合体を提供する。担体分子の例としては、破傷風アナトキシン、アルブミンまたは血清アルブミンなどの天然タンパク質がある。

本発明のペプチドは抗原性を有しており、従って、ＳＬＥ患者の判定または追跡のための詮所方法で使用され得る。

従って本発明はまた、前記ペプチド、前記ペプチドの混合物、または担体分子に結合した前記ペプチドを含有しており、ＳＬＥ患者の血清またはその他の生物体液中に存在する自己抗体によって認識され得る組成物に関する。ペプチド−抗体複合体をｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出するためには、ＥＬＩＺＡのような免疫酵素法、免疫蛍光法、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降法、またはイムノトランスファー（イムノプロットまたはドツトプロット）法などで試験する。

これらの試験を行なうために、本発明は、ビオチンまたはその誘導体、ペルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光ラベル、放射性ラベル、などの適当なラベルによって標識されているかまたは非標識の寒冷ペプチドを提供する。

かかる試験は例えば以下の段階を含む。

一本発明のペプチドもしくはペプチド結合体を含有する所定量の組成物をマイクロタイタープレートのウェルに入れるか、または、ニトロセルロースビーズもしくはニトロセルロース膜のような別の担体に付着させる、−被検生物体液をウェルに入れるか、または、飽和剤の存在中もしくは活性化した担体を予め飽和した後で被検生物体液をビーズもしくは膜と共にインキュベートする、−マイクロタイタープレートまたはビーズのインキュベーション及び洗浄後に、形成されたペプチド−抗体複合体の有無を検出する系をウェルに付着させるかまたはビーズと共にインキュベートする。

この種の試験の別の実施態様では、一方でＳＬＥ患者の血清中に存在する抗体を認識し他方で別の自己免疫疾患に罹患した患者の血清中に存在する抗体を認識するペプチド混合物を使用する。

本発明は更に、本発明のべ１チドに対して形成された抗体を提供する。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から成り得るこの抗体は、抗原によってｉｎ　ｖｉｔｒＯ活性化された膵臓細胞または本発明のペプチドの１つに対して免疫された動物に由来の膵臓細胞とミエローマ細胞系の細胞とを従来の方法で細胞融合させて調製した任意のハイブリドーマから産生される。

本発明のペプチドはＳＬＥ患者の抗体に対して特異性を有しているので、これらのペプチドから調製された抗体はまた、ＳＬＥのＳｍ−Ｄ抗原の極めて特異的なプローブを構成する。

更に、本発明のペプチド及び該ペプチドと反応する患者の自己抗体に対して形成された抗体は、アフイニテイクロマトグラフィーで処理した後に、初期抗原性ペプチドの正確なコピーを部分的に構成しており、従ってＳＬＥ患者で観察される自己抗体に結合し得る抗イデイオタイプ抗体を調製するために使用され得る。

従って本発明によれば、これらの抗イデイオタイプ抗体及び該イディオタイプ抗体含有組成物が提供され、ＳＬＥで観察される自己抗体の存在を検出するためのヒトの１ｎｖｉｔｒｏ診断方法で使用される。

最後に本発明は、任意に担体分子に結合した少なくとも１つの本発明のペプチドまたは本発明の抗イデイオタイプ抗体を活性成分として含み、該ペプチドに対する抗体の産生を誘発し、ＳＬＨの病理及び／または発病（ｍａｎｉ−ｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ　ｃｌｉｎｉｑｕｅｓ）を抑制し得るワクチンの製造に関する。ワクチンとして使用される本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドを１０μｇ　／　Ｋ　ｇ〜１００ｍｇ／Ｋｇの範囲の用量で投与し得る注射またはその他の経路で投与可能な溶液または懸濁液から成る。

実施例に関する以下の記載及び添付図面を参照することによって本発明のその他の特徴及び利点が明らかになるであろう、勿論、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは理解されよう。

１１Ｌペプードのム　び　ヤークタリゼーション本発明のペプチドは、従来の固相ペプチド合成法によって、例えば、アミノ酸残基を所要順序で順次縮合させるか、複数のアミノ酸残基を適正順序で既に含むように予め形成したフラグメントにアミノ酸残基を縮合させるか、または、予め調製した複数のフラグメントを縮合させることによって調製され得る。いずれの場合にも、縮合の際に形成されるペプチド結合に関与するアミン官能基及びカルボキシル官能基を除いて、その他のアミノ酸残基またはフラグメントによって担持されたすべての反応性官能基を予め保護するように配慮する。

本発明のペプチドの好ましい調製方法では、ＲＡＭ樹脂を使用する。付加されるアミノ酸のアミン官能基はｔ−ブトキシカルボニル（Ｂ　ｏ　ｃ　）基によって保護されており、三官能アミノ酸の側鎧は例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸ではシクロヘキシル基、トレオニン及びセリンではベンジル基、リシンでは２−クロロベンジルオキシカルボニル基、チロシンでは２．６−ジクロロベンジル基、アルギニン及びヒスチジンではｐ−トルエンスルホニル基によって保護されている。メチオニンは、ｔ−ブトキシカルボニル（○）スルホキシドメチオニンの形態で導入され、無水フ・ン化水素酸の作用によって樹脂のペプチドが最終的に開裂されるときにメチオニンに還元される。Ｂｏｃアミノ酸は、対称無水物の形態で導入されるＢｏｃヒスチジンを除１）で、ベンゾトリアゾールエステルの形態で結合する。

結合に要する総時間は約４５分である。必要な場合には二重結合から成り得る十分な結合が得られたことを確認するためにニンヒドリンテストを使用する。

合成の終わりに、最終脱保護段階の後で、樹脂を洗浄し乾燥する。配列中の（○ ）メチオニンの有無に応じて、樹脂のペプチドの脱保護及び開裂のためのフ・ン化水素酸処理を強くしたり弱くしたりする。

凍結乾燥後に粗生成物を１０％酢酸に溶解し、中圧クロマトグラフィーで精製する０次いで高圧液相クロマトグラフィーでペプチドを特性決定し、質量分析によってそのアミノ酸組成を分析する。

！無ＪじＬ吟１」１Ｕ腓１１ａ−活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹患した１６５人の患者を試験し、強皮症（Ｓｃｌ）に罹患した３２人の患者、混合結合組織病（ＭＴＣＤ）に罹患した１４人の患者、多発性筋炎に罹患した２人の患者、サルコイド症に罹患した１３人の患者、シエーグレン症候群に罹患した５人の患者、慢性関節リウマチ（ＲＡ＞に罹患した３５人の患者及び若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）に罹患した８６人の患者に比較した。

ｂ−５３の健常供血者血清を対照として使用した。

Ｃ−また、イムノプロットでＳｍｖｃ原のバンドを認識する１８のヒト血清及び５つのマウスモノクローナル抗体も使用した。これらの５つの抗体は夫々、バンドＢ′、Ｂ及びＤと反応するクローンＨ１２６（Ｒｅｕｔｅｒ　ｅｔＬｕｅｈｒｍａｎｎの記載；１９８６）、及び、ノくンドＢ′、Ｂ、Ｄ及びＥと反応するクローンＹ１２（Ｐｅｔｔｅｒｓ−ｓｏｎ他の記載、１９８４）、及び、バンドＢ１及びＢと反応するクローンＨ５７（Ｒ，Ｌｕｅｈｒｍａｎｎの記載）、及び、ポリペプチドＤと結合するクローン２−７３（抗ＵＩ　ＲＮＰ）及び７−１３（抗Ｓｍ）（Ｂ　ｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ｎｇｓ他の記載、１９８２及び１９８５）に由来のものである。

ｄ〜ペプチド１．ｎ、ｍ、■、■、■及び■を実施例１に記載の方法で合成した。これらのペプチドの純度は８５％ペプチドＩ、■、■、■、■、■及び■と種々の血清の抗体との間の免疫反応をＥＬ　Ｉ　ＳＡによって以下の手順で測定した。

−ｐＨ９，６の０．０５Ｍの炭酸塩バッファ溶液に希釈した１〜２μＭの各ペプチドを、温度３７℃でマイクロタイタープレートのウェルに入れる。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７，４のＰＢＳバッファ中に１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液（Ｐ　Ｂ　５−Ｔ−ＢＳＡ）と共に、プレートを３７℃で１時間インキュベートする、 −ＰＢＳ−Ｔバッファで３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡバッファで１／１０００に希釈した患者の血清をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートする、−複数回洗浄後、ヒトＩｇＧ特異的ビオチン結合体と共に３７℃で１時間のインキュベーション、次いでペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン結合体と共に同じく３７°Ｃで１時間のインキュベーションを順次行なって反応を検出する。

酵素反応の検出は、２，２′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）（Ａ　Ｂ　”ｒ　Ｓ　）のごときペルオキシダーゼの基質を３７℃で１時間添加することによって行なう６分光光度計によって４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）の値を測定する。また、血清のインキュベーション後に、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ結合体を添加しく３７℃で３０分間）、次いで基質（ＴＭＢ、３．３′、５’テトラメチルベンジジン）を３７℃で１５分間添加することによって１段階で検出してもよい、２ＭのＨＣＩを添加して反応を阻害し、４５０ｎｍのＯＤを読取る。

試験の陽性閾値を決定するために、５３の健常ヒト血清から成る１組のサンプルを１／１０００に希釈し、マイクロタイタープレートのウェルに入れた１μＭ及び２μＭのペプチド■及び■と共に試験した。４０５ｎｍの平均吸光度は０．１０で標準偏差は０．０８４である。血清のＯＤ値が平均と標準偏差の２倍との和を上回るとき、即ちＯＤが０．３のとき、血清が陽性であると判定することにする。

この閾値を使用すると、健常ヒト血清の１．８％が２つのペプチドについて陽性であることが判明した（図２）、○Ｄ平均債と標準偏差の５倍との和を閾値にとると、試験は完全にＳＬＥ特異的になる。

３　イムノプロットでバンドＤを蛍−る１８の、　Δに１これらの血清のうちの１２サンプル、即ち６７％はペプチド１と反応しくＯＤが０．３０〜０．８１．０Ｄ平均値０．４７及び標準偏差値０．１５）、１６サンプル即ち８９％がペプチド■と反応しくＯＤが０．３０〜１．２０．０Ｄ平均値０．５７及び標準偏差値０．２５＞、６サンプル即ち３３％がペプチド■と反応した（ＯＤが０．３０〜０．７３；ＯＤ平均値０．４６及び標準偏差値０．１６）。

ペプチドＩ及び／またはペプチド■と反応したすべての血清はまた、ペプチド■ とも反応した。これらの血清はいずれもペプチド■、■、■及び■と反応しなかった。

従って、イムノプロットでバンドＤと反応する血清の多くは、ペプチド■だけと反応させるＥＬＩＳＡによって同定される。

更に、イムノプロットでＳｍｖＬ原のいくつかのバンドと反応するマウスの５つのモノクローナル抗体をペプチドＩ、■、■、■、Ｖ、Ｗ及び■で試験した。

クローン２−７３及び７−１３の抗体はＥＬＩＳＡでペプチド■と反応した。その他の３つの抗体は７つのペプチドのいずれとも反応しなかった。

４　ＳＬＥ患　び　の　のりウマ　生　の　゛の１６５人のＳＬＥ患者のうちの５９％が、ペプチドＩと反応し得る抗体＜ＯＤ値０．３０〜１．６７　；　ＯＤ平均ＭＯ，７７）を有し、３７％がペプチド■と反応し得る抗体（ＯＤ値０．３０〜０．５８．０Ｄ平均値０．５８）を有し。

１６５の試験血清以外の２つの血清がペプチド■と反応し、どの血清もペプチド ■、■、■及び■と反応しなかった（図２、表Ｉ）。

ペプチドＩ及び■は、ＳＬＥ以外のリウマチ性疾患に罹患した患者の血清の抗体によって認識されることはめったにない、ＲＡ患者の血清の６％が、ペプチドＩ（ＯＤ値０．３０〜０．３９）及びｌ’Ｖ（ＯＤ値０．３０〜０．４１）の１つと反応した。強皮症患者の血清は、６％だけがペプチド■と反応しくＯＤ値０．３０〜０．３６）、ペプチド■とは全く反応しなかった。

ペプチド■及び■に関する結果を以下の表■に示す。患者の血清を１／１０００に希釈し、マイクロタイタープレートに吸着させた１μＭのペプチド■及び２μ Ｍのペプチド■と接触させた。数値は、試験血清総数に対する陽性血清のパーセンテージを示す、酵素に結合したヒト抗ＩｇＧを該酵素の基質と共に１暗闇インキュベートした後のＯＤ値が０．３以上のときくこれは５３の健常ヒト血清の○ Ｄ平均値と標準偏差の２倍との和に対応する）、血清が陽性であると判定する。

ｍＬＵＬＬ　ｍＪＬＩＬ＜１Δつ江Ｌ　ＳｚＪ」ＬＬＳＬＥ　１６５　５８．８％　３７．０％強皮症　３２　６．３　０混合結合組織病　１４　０　０多発性筋炎　２　０　０サルコイド症　１３　０　０シ工−グレン症候群　５０　０慢性間節リウマチ　３５　５．７　５．７若年性慢性関節炎　８６　１．２　１．２健常者　５３　１．８　１．８添付の図２はこれらの結果を別の表し方で示している。

ＥＬＩＳＡにおいてペプチド■に陽性を示す全部の血清がペプチドＩに対しても陽性であるから、ペプチドＩを使用するＥＬＩＳＡによって全身性エリテマトーデス患者の約６０％を同定し得る。添付の図３は、ＳＬＥ患者の血清中に存在する自己抗体とペプチドＩ及び■との結合を示す。

支Ｉ漣１ウ　″られる　′の＝　Ｊ　び０１　′の＝　１ペプチドＩ、■、■、■、■、■及び■に対する抗血清がウサギで得られる。フロインドアジュバントを存在させた生理食塩水溶液（Ｖ／Ｖ）に入れた形層で毎回１００μｇのペプチドをウサギに注射する。ペプチドあたり２羽のウサギを使用し、連続皮下注射を毎月２回ずつ４箇月投与する。

３回目の注射以後、各注射の１週間後にウサギの血液を定期的に採取し、血清抗体レベルをＥＬＩＳＡで測定する。

じユＬ直ウサギ抗体と７つのペプチドとの結合を前記と同様の方法（実施例２の第２項参照）と同様の方法によってＥＬＩＳＡで測定する。但し、免疫反応を検出するために、ヤギで調製しペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗イムノグロブリンを添加する。

更に、モノクローナル抗体を試験するために、ハイブリドーマの培養上清をＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡバッファで１１５０に希釈し、ペプチドと接触させる０反応を検出するために、ウサギで調製したマウス抗イムノグロブリン及びヤギで調製し前記同様にペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗イムノグロブリンを順次添加する。

Ｃユ１艮ウサギに対する３回の注射後にペプチドＩ、ＩＩ、■、■、■及び■に対する強力な応答が得られる（１１５０００及び１／１００００に希釈した抗血清と共に基質を６０分間インキュベーションした後の４０５ｎｍのＯＤ値が２．０を上回る）。

これらの結果は、ペプチド■、■、■及び■が患者の血清と反応できない原因（前出の表■参照）が、ＥＬｒＳＡプレートにこれらのペプチドが吸着され難いからでないことを示す、ペプチド■だけに対してはウサギの応答がもう少し穏やかである（１／２５０及び１１５００に希釈した抗血清と共に６０分間インキュベーションした後のＯＤ値が２．０である）。このように抗血清がペプチド■に比較的弱い反応性を示す原因は、このペプチドがＥＬＩＳＡプレートに吸着され難いからではない。何故なら、モノクローナル抗体２−７３及び７−１３はこのペプチドと強力に反応していた〈実施例２の第３項参照）。

え１１先ＳＬＥ　ＤＮＡ　とボリペブ　ドＤのペプチドに・　るのヨの　に　る０また、ＥＬＩＳＡで天然二重鎖ＤＮＡと反応する抗体の存在を決定するためにＳＬＥ患者の血清を試験した。抗ＤＮＡ抗体の存在とペプチド■または■と反応する抗体の存在との間にいかなる相関間係も証明できなかった。

東」ｌＩｊ− Ｓｍ−Ｄ　の　１　の　゛使用した方法では、タンパク質の一次構造の短いセグメントの親水性及び移動度のごときいくつかのパラメータに基づくアルゴリズムを用いる（Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ　ｅｔ　Ｄａｎｅｙ　ｄｅ　Ｍａｒｃｉｌｌａｃ。

１９８８）。

得られた結果は意外にも、Ｓｍ−Ｄポリペプチドの残基１〜２０にわたるペプチドＩがポリペプチドの決定エピトープを含むことを示さない。これらの結果を図４に示す。

以下は前記の説明を補足する図面の説明である。

−図１は、ｃＤＮＡによるＳｍ−Ｄポリペプチドの推定配列を示す。

−７２は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおけるペプチドＩ及び■の結合を示す、健常被験者の５３の血清（Ｎ　ＨＳ　）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の１６５の血清、強皮症（Ｓｃｌ）患者の３２の血清、侵性閏節リウマチ（ＲＡ）患者の３５の血清で抗ＩｇＧ−ペプチドの活性を測定する。全部の血清を１／１０００に希釈し、基質を６０分面前水分解した後の４０５ｎｍの光学濃度（ＯＤ）単位で抗体レベルを表す。

−図３は、全身性エリテマトーデス患者の６つの血清（１、ｎ、ｓ、ｍ、ｒ、ｓ）及び健常被験者の１つの血清（ｕ）がＥＬ　ｒ　ＳＡでペプチドｒ（グラフＡ及びＣ）及びペプチド■（グラフＢ及びＤ）と結合した結果を示す、グラフＡ及びＢでは、血清を１／１０００に希釈し、種々の濃度のペプチドＩと接触させる。グラフＢ及びＤでは、種々の濃度の血清を夫々１μＭ及び２μＭのペプチドｒ及び■と接触させる。

−７４は、以下のスクール、即ち、Ａ：Ｐａｒｋｅｒｆｆ！！（１９８６）、Ｂ：Ｈｏｐｐ　ｅｔ　Ｗｏｏｄｓ（１９８１）、Ｃ：Ｋａｒｐｌｕｓ　ｅｔ　５ｃｈｕｌｔｚ（１９８５）のスケールに夫々従って構築され！、２３　ｍ　−Ｄポリペプチドの抗原性の予測７０フイルを示す、これらのスケールは、Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ及びＤａｎｅｙ　ｄｅＭａｒｃ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ａｃ（１９８８）によって標準化されたものである。４番目の残基とｎ−３残基との間でグラフをトレースする。ＳＬＥ患者の抗体によって認識されるエピトープを太線で示す。

前記の実施例で報告された結果を総合すると、Ｓｍ−Ｄ抗原に由来のペプチドが、ＳＬＨの極めて高感度の定量的診断試験を行なうために特に有用であることがはっきりと判る。

得られた結果から判断すると、ペプチドＩに関しては、ＳＬＥ患者の５９％がこのペプチドを認識するＩｇＧ型抗型全体している。他方、ＥＬＩＳＡでペプチド ■と反応する割合は、別の自己免疫疾患に罹患した患者の血清の６％であり、健常被験者の血清の４％未満である。従ってペプチドＩは、任意にペプチド■と共に使用されて、全身性エリテマトーデスの特に有効なプローブを構成する。

はぼ６０％にあたるこのパーセンテージは、精製タンパク質に関してこれまでに記載されていた値を上回っている。

下記の文紋１より彫通省中１２引門さ怠たものである：ｃ五Ｌｎ　Ｐｒｖｇｒ、　：’ｄｏｔ、　５ｕｉｙｃｒ！１．　Ｅｉｏｌ、　Ｖｏｌ、９．　Ｆ、Ｅ、　 −ｎ、　Ｄｊ、　Ｋｏｐｅ：３ｃｏA　”ＶＥ、Ｃ：。

ミＳζ＝Ｓこ５．Ｃ；ｉ八、１三：ｐ、Ｉｎソー北ｏｉ、７５：　ｔ３゜二’、 −５ｍ−’、　Ｃｆ１ｒ＋−１ｎ・、ｅ：：−７５：　：’２ＴＯ−）（ｇｃｌｉｎ、Ｊ、八、！９８６．Ｔ正　１ｕｐＬ！ｓ　：ｕ［ｏ：Ｉｎｔｉｇ＝ｈｓ　ユｎｃ　ｔｉｄｅ　ｐコｊｔｏｇ＝、ｅｓｉｓ　盾秩@ｓｙｓ：：＝ｉｃ　ｌｕｐピＳ３ミｃｃ：＋、　５．０．　！９８９．　Ａｐｐｌｉｃユｒｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｖｔｃ４ｎ　ｂｌｏａｉＤｇ　ｔｏ　山Ｃ５τ１コｄｙ　Ｏ■@ａｕ＋ｏｉｒｎｍｕｎａ　ｄｉｓｅ＆ｓｅ。

Ｔｉｒｏｒｔｉ／ＩＥｌｏｒｒｉｎｇ、　ｒ’１ｅｒｈｏｄａ１０（ｙ、　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｉｎｇｎｏｓｒｉｃ　ａｐ、ｏｉ奄モ≠氏fｏｒｕ、　Ｅ−Ｌヨ硅ワ。

三：ＬＴｏｖｅ７．　Ｓ、　Ｋ１ｔｒｇｃ＝　ＡＧ、　Ｂｕｅ！、　ｐ、　１４０−１６４゜三〇ｐｐ、τ−Ｆ、ｒｄ　Ｗ（）ｃ３ｄ５．に−Ｒ−ｒ９１！１．Ｐ＝５ｃｉｏｎ　ｏｆｐｒｏｗ’ｎ　ｕｚ６ｇ＝ｉｃ　Ｏ＝：：＝コ１１k罎３．ｉｃ。

−ｏ　２１：Ｉｄ　５ｑｕｃ＝ｃ；ｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｉ’Ｖ’（：？／、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：　３８２４゜ス―ヒＳｅ：：、三、Ｃ＋］ｃｓｃｐｔｔ、ＲＬ、Ｂｏｓｓｉｈ＝ｅ＝、ＣＪ）、ｕｚｄ　Ｃ：ｏｋ、Ｐ工　１９７０．Ｃｏ１ｏｒ　ｒｓ＋@Ｅａｒ　Ｃニー　：０１０１　：＝＋：；ｉコ白ｏ　”：ｒＯｕｐＳ　’２　五ｃ　５Ｏ１ｉＱ　ｐｎＳＳ％凸ＣｎＳ　Ｏｒ　ｐ＝ｐＣＣ＝５．．４ｒ−’、ＥｒｃAシーｊＪＣ：ＪｒＮ！ｊｊｅｌ’１ｊＣｒ＄１．”＋７２：　：　に。

’−ｖｃ：、＼Ｌｌ　ａｎｄＳ（ｃ：二Ｊ−Ａ−ｉＳ７９．　、ＡＩＪ１αｏｏａｉｅｓ　：ｏ　ｓ−ｍ　ｉｕｃ：：ｙ　ＦＬ’に、ｓ　ｃ鴻jｐｉｅニー罰５ｐｒｏ【：’、二ｓ　ｙｃ　ｐｒｏｄＵｃ＝ｉ　ｂｙ　ｐ＝ｅ：：ｒｕ　ｕりｒ　ｓｙｓ：二−ｉｃ　！ｕｐｕＳ　こ：ｙｒＣ＝ｐ−＋ｏｓ魔刀AＰｒｏｃ、ＮｃｉＡｃｃ＝ど、Ｓｃｆ、ＵＳＡ７６二５４９５゜きイ；Ｃｑ７＝Ｙ、に、、Δ、、、９．５：：、Ｕ、ｌ、ヨ＝：＝ｅ、Ｍ、Ｌ　ｚｒ、ど　Ｐミｓｃ：ｓ’ｑ、Ｄ、Ｓ、！９８二、！ｎｄ＝G：：：ｄ二：＋：：、ｐ＝ｓｓ’、ｏｎ　ｏｒｚＵ【ｏｂｉこ’ｒｃｉｃｓ　Ｅ！１　ｓｙｓ：二ｍｃ　１ｕｐｑｘ　ニアｒｒｉ、ｃ＝１ヱｔｏｓ＊ｓ、ＪAＲｋｅｍ　９：　６９ｉ。

Ｎ！：：ｉ’：：：ｃ、１３．！９６Ｅ、Ｓ：ｒｕｔｌ　ｐｆｉ２ｊ：　ｐニアｒ；ｄ：　ｓ＄＝ｓ’、ｓ、　工、：ｒ＋＝　５ｙ＝ｒ：ｓf、＝　ｓｒ　ユニニー＝；：；’：：、　Ｊ。

’、ｔｒ：ｔ：、Ｃ，脅：＝、Ｓａｃ、３５：ニニー二９゜入イごπロＷ、３．１ｎｄＩｓ二＝、ｃニアｇ、Ｄ、、ニー、１９８７．５ｙＳτ二ｒｊｃ　Ｌ＝ｐｕｓ　三−りｈ＝コｔ：ｏｓ＊ｓ、Ｌｉ@Ａｕ：ｏｉ、〒ンー：ｔｒ、ｔＲ）二を二ｖｒ：：：ｉｔ　Ｄｉｙｚｅｓ、　：：＋：ｐ、　３．Ｅｌｘｍｅ！Ｉ　Ｓｃ森ｃｊミｃ　？ｐｏｉ、、ｐｐ、４３゜Ｍ−：ｉニア、５．、　？！：ｕ：、Ｓ、、Ｃｓ＊Ｐｃｔ−Ｘ（、＝＝ｃ　ＶユｎＲ二ｇ＝、：ａｏｒ＝’＝：、’Ｍ、３ミ、〜’、：９８U．Ｃｖｒ＝ｐ＝−、ｓ口＊　りｅ（：：Ｉ’：：：ユニ：ｊ、、二山ｃｃＪ？ｏｒｉｃ：＝ｉｉ＝、−４！ｎＱｇ：：ＩＫ＝ｉｃｎｓ：ｎｈ１５：Ｏ蜘：”−二、ユ１９．し■nｉｔ：、１ｒ− ＝朋ｏ？。

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三。

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Ｓｙｓ：ｚ＝ｉｃ　Ｌ：ｔｐｕｓ　、三’、＋：；ｒｉ、ｔ、７ｘｒｏｓｗ、！、５．Ｓｃｒ＋ｏｉ＝、、Ｃ，ＣＺ二：４：ｎｓ辷、：’ｓA５ｐ：：＊ｇ＝ｒ〜’Ｃ７二ｚｇ６’ｏｏｎａｃ三：口ｐｒＯｘ二’；、（：ｔ’ζＰ）’；＜＝ｃ＝ｓ　＝　ｐ筐＝＝ｒ　ｏｒｒ、ｉ’ｏｏｄｙ　ｒ；：；＝５巳ａｅｓ　F：、ｚｎｃ−＝− ３ｉｃ　ｖｅ：’、：：ｒ、；−５Ｏ：ｎｄ　＝、ｊ−Ｌ’？　＝：口１ｒｘｕｒ、ｅ　ｒｑｐｏｎｓｅ　＝ｉ２：ａ６＝：、ｕ　ｗｉｇ　ｌ＊ｐｕｓ　＝７：６F＝：【ｏｓ＝ｓ。

ｏｒ　コｈｕｒ：：ｎ　ｓｒ、：ｌＪｌ　ｎ＊ｃ：二＝二ｃｏｎａｃ二：ｏｐｒｏ＋ｃｉｎ　ｐｃｉ４＝ｐｒｉＣ：　二ｓ　ｃ＝ｊｕｃ＝ａ@’ｏｙ　ｃＤＮｒＡ−ユｎコ１ｙｓｉｓｏｆ　ｔｈｃ　’ｎｕｍｍ　Ｕｌ　５ｕＲａ’ＪＡ−ａｘｓｏｃ’、ｘｕシ１Ａ　ｐｒｏｕ＝’ｓ　：　ｅｘｔｅｒｕｉｖｅ　ｈｏｏｏｏｌ盾■凾ｂモ凾メ＜RＵｌ　ａｎｄＵ２　ｓｎＲ，’＋’Ｐ−ｓｐｅｃｉａｉｃ　ｐｒｏｃｅｉｒｕ、τ辰ＥＭＢＯＪ、　６：　３８４１゜５ｕｌｅ！ｃ：：１５．　Ｐ、τ、Ｇ−，Ｂｅ１ｊｅ：、ＦＬ？、、　Ｈｘｂｃ＊、　Ｗ、Ｊ、　ａｘｒＯＶａｎ　Ｖｅ：ｕｎｏｉｊ、　Ｗi−１９ｇ９．　Ｍｏ１ｅ＝ａｌｘとｏｎｉｎｇｏＥ山ｅｃＤＮ人Ｆｏｒ　ｍｅ　：ｚｕ＝ユｎＵ２　ｓｎＦヒＮＡ −；ｅ’ｆｉｃ　Ａ’　ｐｒｏｗ’ｎ、Ｎｕｔ！、Ａｅ＝　qｔｓ− ５ａｓｉｏｒビーＤ３．、、ＲｏΩ１ｅ＆τ、Ａ、、Ｎｃｉｓｗｕｒｇ＝、Ｌ　ａｎｃｉ　Ｗｉｅｂｅｚ、王ＥＤ、１９８７．ＤＮＡ　ｓｃGｕ＝、：：　ｏｒｔ　：ａｗｍｎ　Ｓｒｎ　ａｕｒｏｉｍｏｕｎｅ　ｘ：；ｇ：コ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃムフ、　２６２：　９９：　Ｌ■−Ｊ−Ｐ、、ｒミニ：ｔｈ、Ｗ、ｒ、ｕｒｒｉ　Ｍｅ＝’ｊｅＥｄ、Ｒ−Ｂ、１９８：、ＳＨ２＊ｐｒｏｃ＝：ｃｎ　ｏｒｓｙｎｒ：、ｃ≠メ@ｐ＝ｐｔｉｔｉ＝ｓｗｉ出ｔ　ｌｏｗｃｏｎｃ＝ｚｔｒｕｉｏｎ　ｏＥ：ＴＦ　’Ｊｌ　ｄｉｍｅｔｙｌ　ｒ＝ヒ五ｒ：＝　：　ｅｖｉ１ニニｃ：　ｒ、ｄａｐ垂奄奄メFｃａｎ’ ｓ　；三ｒｉＣ：５ｙｎ１．Ｐ、ｃｓｉｓ、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　ＣＡｙ：、　Ｓａｃ、　１０５％μｍＴｈｎ、　Ｅ−’ｖＬ、　ＣＬ２Ｊ１．Ｅ、Ｘ二り、、５ｕｉｌｉｖｍＫ３．ａｎｄ　Ｒ−ｏｉｎ、ＬＬ、１９８３．Ａ、＋１ｕｃｉｅ：ｒ浮窒刀fｃｃａ＝ｓ丁Ｌ１１．Ｅ、Ｍ、＠ｎｄ　Ｋｕｎｋ：！、己Ｃ，１９６６、Ｃ’：ｒｍｃ：：：１ｓｉｃｓ　ｏｆ　ｔ　５ｏｉｕｂｌｅ　ｎｕｃ二：：；@ｗｉｚ：：ｒｐｒ＝：ｐｉｃｃムコｇ　ｗｉｔｈ　５ｃｒｘ　ｏｒ　ｐａ己二コｔｓ　ｗ’、ｉｑ　５ｙｓｔｅ＝三：　！ｏｐ’ｓ　ｅ：＞＝二＝ａｔｏ唐浴AＪ、　Ｌクツ７−ムーコ１．　９６：Ｌ−＝コｌＬ　ｕｒｄ　ＰｉｐＳｏａ、二１９８６．　Ｃ１ｏｒｉ＝ｇ　ｏｉ　６＝　）ｍｒ、＝ｎ　ｃＤＮ、へｆｏｒ　社ど１℃仏− ユ５ｓｏｃ：：【＝ｉ　７０Ｋ　ｐｒｏｅｉｎ、ｒ；ｖ二ＷＥＯＪ、５：　３二Ｑ９゜Ｔｕａｉｌｌｏｎ、Ｎ、、　Ｍｕｌｌｅｒ、Ｓ、、Ｐｐａｕ＝ｉｉ、Ｊ上、Ｅ、ｐｒ＋ｉｉｇｏｎｉ−Ｐ、、”、ｏｕｉｎｏｕ、Ｐ、、ｌ；P（：　’ＩユｎＲ：ｇｃｒ、ｒｒ：ｏｎ：ｉ、Ｍ、Ｈ，Ｖ、１９９０．Ａｎｃｉｂｏ凸ｓ　斤ｃ＝、　三コｃｉｃ＊ｃｓ　ｗｉｒ　ｒｉｅ＋＝＋ａｔｏｉａ@ｗ：ｖｒ、：ａ　：ｕｘｉｊｕｖｅｈｉｉｅ　ｃｍｏｎｉｃ　ユｒ「ｕ−ｉｓ　ユｎｄｙｚｄ　ｗｉｊｔ　ｃｖｒ：：、ミｓ：ｏｎｅ　ｓｙ＋ｍ＋ｅ：ｃ　ｐｅ７ｃｉр■刀AＩｎｃ　、入ｉｚ、、へＩ＋。

Ｗｉｎｉト＝Ｄ、Ｇ、、Ｃｈｘｌ＝ｓ、　ＰＪ、　ａｎｄ　Ｍｍｉ　Ｆ？−〆、 −１９８８，Ｐｒｅｐａｒａｍｖｃ　１ｓｏｈｃｉｏａ　ｏ■@ｐ６７、　ｆｉ −Ｅ。

Ｂ’　ｓｂｄ　Ｄ　＆ｏｍ　ｎＲ＋ＮＰ／Ｓｏ　ａｐｄ　Ｓｒｎ　ａｎｏｇｃｉｓ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｉｕｓｅ　ｃｈｒｏｒｎｘｒ盾■獅吹fｏｙ−Ｊ。

Ｉｍｒｒａｕｖｙｌ、　Ｈｅｒｂ、　ＩＩ３：　２５゜Ｙ−二ｏ＋ｏ、　Ｋ−、Ｍｍｚ　Ｈ，、Ｍａｒｏｒ、　Ｙ、、　Ｙｏｓ’ｎ１ｎｏｙａ、　Ｓ−１ＧＯ［Ｏ，Ｍ、、　Ｎｉｓ圧ｏｋｚ　２Ｃ|ｕ＝ｄＭｉｙａｍｏＣｏ、丁、１９８ｇ、ｌ５ｏｌａｒｉｏｎ　ａｒｒｄ　ｃｂａｒｘｃ：；、ｚｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｏｘｐｌｅ＋：、＋浮窒凵@ＤＮ、Ａ− ｃ；謙ｐＨ：ｓｓＬｒｇ　ｈｕａｗ　Ｕｌ　ｓｍｌ　ｃｕｅ！ｅｘ　ｒｉｂｏｎｕｃ三二〇ｐｒｏ＋ｅｉｚ　ＣＰ＋Ｉｙｐｅｐｎ（ミニ＝、i、　ノンＩＬクワ；１ｎａｉ。

１４０：３ｉｉ− Ｌ二コ■延りよ１　ＭＫＬＶＲＦＬＭＫＬＳＨＥＴＶＴ１７　工　ＥＬＫＮＧＴＱＶＨＧＴ　工　ＴＧＶ３３　Ｄ　Ｖ　Ｓ　Ｍ　Ｎ　Ｔ　ＨＬ　Ｋ　Ａ　Ｖ　Ｋ　Ｍ　Ｔ　Ｌ　Ｋ２Ｓ　Ｎ　ＲＥ　Ｐ　Ｖ　Ｑ　Ｌ　Ｅ　Ｔ　Ｌ　Ｓ　工ＲＧＮＲ６５工　ＲＹ　Ｆ　工　Ｌ　Ｐ　Ｄ　Ｓ　Ｌ　Ｐ　Ｌ　Ｄ　Ｔ　工　Ｒ８１ＶＤＶＥＰＫＶＫＳＫＫＲＥＡＶＡ９７　Ｇ　ＲＧ　ＲＧ　ＲＧ　ＲＧ　ＲＧ　ＲＧ　ＲＧ　Ｒ１１３Ｇ　ＲＧ　Ｇ　Ｐ　ＲＲＬ区田ＢＥ−１Ｆ工ＧＵＲＥ　３Ｌ息ヨ■郵＝Ａ八　基要約本発明は、全身性エリテマトーデス患者の生物サンプル中に存在するＳｍ−Ｄポリペプチドに対する抗体と反応可能な１５〜４０個のアミノ酸を含むペプチドに関する。これらのペプチドはＳｍ−Ｄポリペプチドの配列の一部に対応する。本発明は、全身性エリテマトーデスの診断及びワクチン製造に使用される。

国際調査報告し丁す！！ｉ際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．全身性エリテマトーデス患者の生物サンプル中に存在するＳｍ−Ｄポリペプチドに対する抗体と反応可能な１５〜４０個のアミノ酸を含み、Ｓｍ−Ｄポリペプチドの配列の一部に対応することを特徴とするペプチド。
２．式：【配列があります】（Ｉ）【配列があります】（ＩＩ）【配列があります】（ＩＩＩ）【配列があります】（ＩＶ）【配列があります】（Ｖ）【配列があります】（ＶＩ）【配列があります】（ＶＩＩ）〔式中、 −基Ｘは、遊離ＮＨ２基、または炭素原子数１〜５の１つもしくは２つのアルキル基でアミド化されたＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず、場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸から成りそのＮ末端アミノ酸自体が遊離ＮＨ２基もしくは上記のアミド化ＮＨ２基を有しているペプチド基を示しており、 −基Ｚは、遊離ＯＨ基、または炭素原子数１〜５のアルキル基を含むアルコキシル基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず、場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸から成りそのＣ末端アミノ酸が遊離ＯＨ基もしくは上記のアルコキシル基を有しているペプチド基を示す〕で示される配列のうちの１つの配列の全部もしくは一部から構成されるか、または、その変異配列から構成されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
３．式：【配列があります】（Ｉ）〔式中、Ｘは遊離ＮＨ２基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｎ、ＮＧ、ＮＧＴ、ＮＧＴＱ、ＮＧＴＱＶから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
４．式：【配列があります】（ＩＩ）〔式中、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｔ、ＶＴ、ＴＶＴ、ＥＴＶＴ、ＨＥＴＶＴから成るグループから選択されたペプチド基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｍ、ＭＮ、ＭＮＴ、ＭＮＴＨ、ＭＮＴＨＬから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
５．式：【配列があります】（ＩＩＩ）〔式中、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｖ、ＧＶ、ＴＧＶ、ＩＴＧＶ、ＴＩＴＧＶから成るグループから選択されたペプチド基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｐ、ＰＶ、ＰＶＱ、ＰＶＱＬ、ＰＶＱしＥから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
６．式：【配列があります】（ＩＶ）〔式中、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｖ、ＡＶ、ＫＡＶ、ＬＫＡＶ、ＨＬＫＡＶから成るグループから選択されたペプチド基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｆ、ＦＩ、ＦＩＬ、ＦＩＬＰ、ＦＩＬＰＤから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
７．式：【配列があります】（Ｖ）〔式中、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｎ、ＧＮ、ＲＧＮ、ＩＲＧＮ、ＳＩＲＧＮから成るグループから選択されたペプチド基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｐ、ＰＫ、ＰＫＶ、ＰＫＶＫ、ＰＫＶＫＳから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
８．式：【配列があります】（ＶＩ）〔式中、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｌ、ＰＬ、ＬＰＬ、ＳＬＰＬ、ＤＳＬＰＬから成るグループから選択されたペプチド基を示し、Ｚは、遊離ＯＨ基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ｇ、ＧＲ、ＧＲＧ、ＧＲＧＲ、ＧＲＧＲＧから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
９．式：【配列があります】（ＶＩＩ）〔式中、Ｚは遊離ＯＨ基を示し、Ｘは、遊離ＮＨ２基を示すか、または、ペプチドの免疫特性を本質的に変化させず場合によっては増進させるような、１〜５個のアミノ酸を含む基Ａ、ＶＡ、ＡＶＡ、ＥＡＶＡ、ＲＥＡＶＡから成るグループから選択されたペプチド基を示す〕の配列の全部または一部またはその変異配列から成ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
１０．請求項１から９のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチドによって認識されることを特徴とするＳｍ−Ｄ抗原に対する抗体。
１１．全身性エリテマトーデス患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体を特異的に認識することを特徴とする請求項１０に記載の抗体に対して形成された抗イディオタイア抗体。
１２．全身性エリテマトーデス患者の生物体液、特に血清中に存在する自己抗体と免疫的に反応することを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチドを含有する抗原性組成物。
１３．請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは該ペプチドと担体分子との結合体を含有し、Ｓｍ−Ｄ抗原を認識し得る抗体の産生を誘発することを特徴とする免疫原性組成物。
１４．生物体液中で全身性エリテマトーデスをｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するために、 −該生物体液と、請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは該ペプチドと担体分子との結合体または請求項１１に記載の抗イディオタイプ抗体とを、免疫複合体の形成可能条件下に接触させる段階と、−前記生物体液中の抗原−抗体免疫複合体または抗体−抗イディオタイプ抗体複合体の存在を物理的または化学的方法によって検出する段階を少なくとも含むことを特徴とする全身性エリテマトーデスのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法。
１５．−請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド、または該ペプチドと担体分子との結合体、または請求項１１に記載の抗イディオタイプ抗体と、−ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体と生物サンプル中に存在し得る自己抗体との間の免疫的反応に適した媒体を構成する試薬と、 −形成された免疫複合体を検出するための、１つまたは複数のペプチドまたは抗イディオタイプ抗体と反応し得る任意に標識された１つまたは複数の試薬と、− 任意に、健常被験者の血清のような対照生物媒体とを含むことを特徴とする全身性エリテマトーデスのｉｎｖｉｔｒｏ診断用キット。